JP5002748B2 - β遮断薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型 - Google Patents

Description

本発明は、被検者の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬に対する反応性を予測する方法に関するものである。本発明は、特に、心不全治療などの心機能の改善を目的とした薬物治療における検査、診断に有用な技術を提供するものである。

心不全治療に用いられる主要な薬剤として、利尿薬、血管拡張薬、ジギタリス剤のほかに、現在ではβ遮断薬（βブロッカー）が挙げられる。β遮断薬は、交感神経系のβ受容体（βアドレナリンレセプター）機能を抑制するため、心収縮力や心拍数を低下させると考えられ、心機能が低下した心不全症状に対してβ遮断薬を使用することは従来むしろ禁忌とされていた。しかし、１９９０年代に入ってから複数のβ遮断薬について心不全患者に対する臨床試験が実施され、患者の死亡率の低下やその他β遮断薬の有効性を裏づける数多くのエビデンスが報告されるようになり、現在ではβ遮断薬は慢性心不全治療の重要な薬剤と考えられている。

こうしてβ遮断薬の有効性は確実なものとなったが、安全で有効な治療を行うには適応となる患者を正しく選定することが必須である。特に、β遮断薬の効果は個人差が非常にあり、しかも症状の改善は通常β遮断薬の投与開始後数週間から数ヶ月、遅い場合は半年程度経ってからようやくあらわれる。そのため、治療初期にはβ遮断薬に対する患者の応答性（反応性）、即ち患者がβ遮断薬に対して効果を示すレスポンダー（responder）であるか、効果を示さないノンレスポンダー（non responder）であるかを判断できず、長期投与した結果ノンレスポンダーであったと判断されることもおこりえた。したがって、心不全患者に対するβ遮断薬治療においては、患者のβ遮断薬反応性を投与前に予測することの重要性が特に指摘されているが、β遮断薬の心機能改善効果がどのような作用機序によるものか、その薬理作用が未だ明らかになっておらず、このことが予測を一層困難なものにさせていた。

上記の点に関連して、下記の特許文献１・２には、β₁アドレナリン受容体およびβ₂アドレナリン受容体における多型の検出方法、さらに、そのような方法を心血管系疾患、肥満、糖尿病の診断、治療などのために使用することが開示されている。
特表２００１−５２００２１号公報 国際公開ＷＯ９９／１９５１２号パンフレット

本発明は、上記の問題点、即ちβ遮断薬反応性を投与前に予測することの重要性に鑑みなされたものであり、その目的は、被検者の遺伝子多型（polymorphism）に基づいてβ遮断薬に対する反応性を予測する方法を提供することにある。

本発明者は、これまでの研究結果などを踏まえ、心機能またはβ受容体（特にβ₁受容体）の機能に関係すると考えられる遺伝子を多数抽出し、これらの遺伝子に存在する各多型とβ遮断薬反応性との相関について網羅的な解析を行った。その結果、β遮断薬に対する反応性予測に有用な複数の遺伝子多型を見出すと共に、これらの遺伝子多型を用いてβ遮断薬反応性を高精度に予測できることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｏ）の発明を包含するものである。
Ａ） ノルエピネフリントランスポーター（Norepinephrine transporter）、ＢＮＰ（Natriuretic peptide precursor B：Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）、エンドセリン１（Endothelin 1）、エンドセリン受容体Ａ（Endothelin rececptor A）、アンギオテンシン受容体２（Angiotensin II receptor type2）、アデニル酸シクラーゼ９（Adenylate cyclase 9）、インターロイキン１０（Interleukin 10）、Ｇ蛋白βサブユニット４（G-protein βsubunit 4）、マトリックスメタロプロテアーゼ８（Matrix Metalloproteinase 8）、アドレナリンα１Ｂ受容体（Adrenergic receptor α1B）、ミネラルコルチコイド受容体、ＴＮＦ（Tumor necrosis factor-α：腫瘍壊死因子）、リアノジン受容体３、アデゥーシン１、アデノシン１リン酸脱アミノ酵素１、アドレナリンα２Ｃ受容体、エンドセリン受容体Ｂ、アンギオテンシン受容体１、リアノジン受容体２、βアレスチン１、パラオキソナーゼ２、ＳＯＤ（superoxide dismutase）２、アドレナリン受容体β３，エンドセリン２、ＡＮＰ、パラオキソナーゼ１、ＧＡＴＡ６、ＡＤＲＢＫ１（アドレナリン受容体βＫ１）、およびアドレナリン受容体α１Ａをそれぞれコードする遺伝子群から選ばれる１又は２以上の遺伝子の多型を検査し、その結果に基づき、被検者のβ遮断薬に対する反応性を予測する方法。
Ｂ） 心不全治療その他心機能の改善を目的とした薬物治療において、β遮断薬に対する患者の反応性予測に使用する、上記Ａ）記載の方法。
Ｃ） 上記Ａ）記載の方法において、２以上の遺伝子多型に基づいて被検者のβ遮断薬反応性を予測する方法であって、各遺伝子多型についてそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、これらの値の合計値に基づき、β遮断薬反応性を予測する方法。
Ｄ） 上記Ａ）記載の方法において、２以上の遺伝子多型に基づいて被検者のβ遮断薬反応性を予測する方法であって、各遺伝子多型について判別係数を設定すると共にそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、各値にそれぞれの判別係数を乗じた値の合計値に基づき、β遮断薬反応性を予測する方法。
Ｅ） 上記判別係数は、各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連を示す先のデータその他の情報を考慮して設定され、新たな情報に応じて適宜更新されることを特徴とする、上記Ｄ）記載の方法。
Ｆ） 上記Ａ）記載の方法において、２以上の遺伝子多型に基づいて被検者のβ遮断薬反応性を予測する方法であって、２以上の遺伝子多型によって決定木を構成すると共に各遺伝子多型についてそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、上記決定木にしたがってβ遮断薬反応性を予測する方法。
Ｇ） 上記Ｃ）〜Ｆ）のいずれかに記載の方法を用いて、被検者のβ遮断薬反応性予測をコンピュータに実行させる、β遮断薬反応性予測用プログラム。
Ｈ） 上記Ａ）記載の方法において、遺伝子多型の検査は、被検者から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増幅断片をもとに遺伝子型を決定する工程とを含む方法。
Ｉ） 上記Ａ）記載の方法において、ＤＮＡチップ等の遺伝子多型検査器具を用いて遺伝子多型を検査する方法。
Ｊ） 上記Ｋ）記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用オリゴヌクレオチド。
Ｋ） 上記Ａ）に記載される分子のいずれかを標的（創薬ターゲット）とした心機能改善薬のスクリーニング方法。
Ｌ） 上記Ａ）〜Ｆ）のいずれかに記載の方法によるβ遮断薬反応性を予測のために使用する遺伝子多型マーカー。
Ｍ） 上記Ａ〜Ｆ）のいずれかに記載の方法によるβ遮断薬反応性を予測するための遺伝子多型の使用。
Ｎ） 上記Ａ〜Ｆ）のいずれかに記載の方法によるβ遮断薬反応性を予測して、前記β遮断薬を投与するβ遮断薬の投与方法。
Ｏ） 上記Ａ〜Ｆ）のいずれかに記載の方法によりβ遮断薬反応性を予測して、β遮断薬を投与するか否かを診断する診断方法。

本発明によれば、遺伝子多型に基づいてβ遮断薬に対する反応性を簡易迅速かつ客観的に予測することができるので、β遮断薬を用いた心不全治療その他心機能の改善を目的としたβ遮断薬治療において、β遮断薬に対する患者の反応性予測に好適に使用することができる。前述のように、β遮断薬の効果は個人差が非常にあり、しかも治療初期にはβ遮断薬に対する患者の反応性を判断することが困難であった。本発明は、投与前に患者のβ遮断薬反応性を予測することを可能とし、有効で安全なβ遮断薬治療を実現するものである。

各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連性を示す図（その１）である。 各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連性を示す図（その２）である。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その１）である。表中、下線部が多型部位に相当する。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その２）である。表中、下線部が多型部位に相当する。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その３）である。表中、下線部が多型部位に相当する。 本発明の実施形態における、判別分析による予測方法を説明する図である。 本発明の実施形態における、決定木１による予測方法を説明する図である。 本発明の実施形態における、決定木２による予測方法を説明する図である。 本発明の実施形態における、決定木１を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。 本発明の実施形態における、決定木２を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。 各遺伝子多型の位置を示す数値等の決定方法を説明する図である。 各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連性を示す図（その３）である。 各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連性を示す図（その４）である。 各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連性を示す図（その５）である。 本発明の実施形態における、判別分析による予測方法を説明する図である。 本発明の実施形態における、決定木３による予測方法を説明する図である。 本発明の実施形態における、決定木３を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。 本発明の実施形態における、決定木４による予測方法を説明する図である。 本発明の実施形態における、決定木４を構成する遺伝子多型の一覧を示す図である。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その４）である。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その５）である。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その６）である。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その７）である。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その８）である。 各遺伝子多型について、多型部位およびその近傍配列を示す表（その９）である。

以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面において、塩基・アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、例えば以下のとおりである。

ＤＮＡの塩基の表記については、Ａまたはａ：アデニン、Ｇまたはｇ：グアニン、Ｃまたはｃ：シトシン、Ｔまたはｔ：チミン、Ｒまたはｒ：アデニンまたはグアニン、Ｍまたはｍ：アデニンまたはシトシン、Ｗまたはｗ：アデニンまたはチミン、Ｓまたはｓ：グアニンまたはシトシン、Ｋまたはｋ：グアニンまたはチミン、Ｙまたはｙ：シトシンまたはチミン、である。

アミノ酸については、ＧまたはＧｌｙ：グリシン、ＡまたはＡｌａ：アラニン、ＶまたはＶａｌ：バリン、ＬまたはＬｅｕ：ロイシン、ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン、ＳまたはＳｅｒ：セリン、ＴまたはＴｈｒ：スレオニン、ＣまたはＣｙｓ：システイン、ＭまたはＭｅｔ：メチオニン、ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸、ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸、ＫまたはＬｙｓ：リジン、ＲまたはＡｒｇ：アルギニン、ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン、ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン、ＹまたはＴｙｒ：チロシン、ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン、ＰまたはＰｒｏ：プロリン、ＮまたはＡｓｎ：アスパラギン、ＱまたはＧｌｎ：グルタミンである。

また、多型部位の位置を示す数値は、DDBJ/EMBL/GenBank databasesなどの主要データベースに掲載されている遺伝子配列（及びアミノ酸配列）に付された数値を参酌して解釈されるものとする。

［１］β遮断薬の反応性予測に有用な遺伝子多型とそれを利用した予測法
本発明者は、前述のように、解析対象として抽出した候補遺伝子に存在する各多型とβ遮断薬反応性との関連性の有無について網羅的な解析を行った結果、β遮断薬に対する反応性予測に有用な複数の遺伝子多型を見出した。図１及び図２はその結果の一例（Ａ）であり、図１２〜図１４は、その他の例（Ｂ）である。

解析方法は概略以下のとおりである。即ち、拡張型心筋症と診断された患者のうち、β遮断薬が投与されている患者から今回の解析について承諾を得た後、血液を採取した。血液を採取した患者数は，例（Ａ）では６９名であり、例（Ｂ）では８０名であり、このうちβ遮断薬に対して効果を示したレスポンダー（responder）は、例（Ａ）では４７名、β遮断薬に対して効果を示さなかったノンレスポンダー（non responder）は２２名であり、例（Ｂ）では、レスポンダーが５３名であり、ノンレスポンダーが２７名であった。ここでは、％ＦＳ（左室内径短縮率）が３％以上回復したかどうかをレスポンダーの基準とした。

採取した血液からＤＮＡ試料を調製後、各遺伝子多型を検査し、各多型部位における塩基及びそれによって規定される遺伝子型を決定した。検査方法については後述するが、Primer extension法（プライマー伸長法）により正確性を向上させると共に、PCR-RFLP法、Allele-specific PCR法、SSCP法、direct sequence法を用いたバリデーションを行うことで、誤判定が極力起こらないよう配慮した。

上記方法により各遺伝子多型を検査し、それぞれの多型部位によって規定される遺伝子型を決定後、各遺伝子多型において、遺伝子型の相違に応じて、レスポンダーとノンレスポンダーとの間の比率に有意差の生じるものをχ二乗検定により検出した。その結果、複数の遺伝子多型について、遺伝子型の相違とβ遮断薬反応性の有無との間に有意差ある高い相関が認められた。例えば、ノルエピネフリントランスポーター（Norepinephrine transporter）遺伝子の多型「-182 T/C」については、多型部位の塩基がＴのアレルを有する遺伝子型ではレスポンダーの比率が高く、多型部位の塩基がＣのアレルをホモで有する遺伝子型「C/C」ではレスポンダーの比率が低かった（図１参照）。この場合、単独解析におけるｐ値は「0.001」であり、この遺伝子多型単独でβ遮断薬反応性の予測可能な程度に高い有意差を示した。なお、多型部位の表記「-182 T/C」とは、当該遺伝子の第−１８２番目の塩基が「Ｔ」又は「Ｃ」のいずれかである多型を示す。多型部位の表記の詳細については、後述する。また、図１、図２、図１２、図１３および図１４において、「ｎ」は各遺伝子型の患者数を示し、「ＩＶＳ」はイントロンを示す。

同様に、エンドセリン１（Endothelin 1）遺伝子の多型「198 Lys/Asn」は、当該多型に応じて、コードされる第１９８番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はリジンとなるアミノ酸置換を伴うものであるが、多型部位の塩基がＴのアレルを有する遺伝子型ではレスポンダーの比率が低く、多型部位の塩基がＧのアレルをホモで有する遺伝子型「G/G」ではレスポンダーの比率が高かった。この場合も、単独解析におけるｐ値は「0.008」と高い有意差を示した。

このように、図１、図２、図１２、図１３、図１４に掲げる遺伝子多型については、いずれもβ遮断薬反応性との間に高い相関を示したので、各遺伝子多型単独で被検者のβ遮断薬反応性を高精度に予測することが可能である。なお、図２に掲げるアンギオテンシン受容体２（Angiotensin II receptor type 2）遺伝子はＸ染色体上に存在するため、男女（maleとfemale）を分けて解析した。

図１、図２、図１２、図１３、図１４に掲げる遺伝子多型を含め、今回の解析によりβ遮断薬の反応性予測に有用と判断された遺伝子多型を下記の表１〜表９に掲げた。また、図３〜図５および図２０〜図２５にはこれらの各遺伝子多型について、多型部位及びその近傍配列（検査のため増幅した配列）を示した。

表１〜表３には、合計２１個の遺伝子と、その遺伝子上に存在する２５個の遺伝子多型を示した。また、表４〜表9には、合計３５個の遺伝子多型を示した。ただし、表１〜９において、重複して遺伝子多型を示しており、遺伝子多型の合計は、４２個である。本発明は、これらの遺伝子多型のうち、１又は２以上の遺伝子多型に基づいて被検者のβ遮断薬反応性を予測する方法を包含するものであるが、本発明はこれに制限されるものではない。例えば、上記の遺伝子は今回の解析によりβ遮断薬反応性との関連性が認められた遺伝子群であり、これらの遺伝子上に存在する他の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬反応性を予測することも十分可能である。特に、上記４２個の何れかの遺伝子多型と連鎖し、ハプロタイプを形成するような他の遺伝子多型については、同様にβ遮断薬の反応性予測に利用することができる。これらの遺伝子多型は、β遮断薬の反応性予測のための遺伝子多型マーカーとして使用できる。また、これらの遺伝子多型によりβ遮断薬の反応性を予測して、この予測に基づき、β遮断薬を投与することもでき、また、投与のための診断にも利用できる。

また、今回の解析と同様の解析を行うことでβ遮断薬の反応性予測に有用な遺伝子多型を上記の遺伝子以外からも発見できる可能性がある。その場合は、上記の遺伝子以外の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬反応性を予測することができる。

表１〜表９、図３〜図５および図２０〜２５中の各遺伝子多型のＩＤ番号には便宜上「SNP」の語を付しているが、遺伝子多型は１塩基多型に制限されるものではない。例えば、ＩＤ番号「SNP_017」のアドレナリンα２Ｃ受容体遺伝子上の多型、及び、「SNP_018」のアンギオテンシン変換酵素遺伝子上の多型については、１塩基多型ではなく、欠損部分の有無による多型である（図４参照）。即ち、前者の多型は「GGGGCGGGGCCG」の１２塩基の有無によって当該１２塩基を有する「挿入型（ins又はＩ）」とこの部分を欠く「欠失型（del又はＤ）」との間の多型である。また、後者の多型は、図４の該当欄下線部に示される長さ２８８塩基の欠損部分を有する「挿入型（ins又はＩ）」とこの部分を欠く「欠失型（del又はＤ）」との間の多型である。本発明は、１塩基多型に限らず、このような欠損部分の有無による遺伝子多型に基づいてβ遮断薬反応性を予測してもよいし、転位など他の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬反応性を予測してもよい。

表１〜表９に掲げた各遺伝子多型の検査は、患者の血液から調製したＤＮＡ試料中のゲノムＤＮＡを鋳型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅し、得られた増幅断片をもとにプライマー伸長法などで遺伝子型を決定することにより行った。遺伝子の増幅にはＰＣＲ法を使用した。各遺伝子多型について、ＰＣＲ法に使用したプライマー配列、および、プライマー伸長法に使用したプローブ配列を配列表に記載した。表１〜表９には、各配列が記載される配列表中の配列番号が示される。

表１〜表９に示すように、ＰＣＲ法により増幅した各配列についても配列表に記載した。配列表に記載した各増幅配列は、基本的に図３〜図５および図２０〜図２５に記載の配列と同じであるが、多型部位の塩基をそれぞれユニバーサルコードにより表記した点で異なる（１塩基多型の場合）。前述した欠損部分の有無による遺伝子多型の場合は、配列表には挿入型の塩基配列を記載した（配列番号６７と７０など）。

表中の「アクセッション番号など」の欄には、各遺伝子について、データベースに登録・掲載されているｍＲＮＡのアクセッション番号、コンティグ（contig）のアクセッション番号、及び同アクセッション番号における遺伝子多型の位置を示す番号をそれぞれ、上段、中段、下段に記載した。また表中、ＩＤ番号の下段には、遺伝子多型の番号（rs no.）を記載した。

多型部位の位置を示す各数値等は、下記（i）〜（iii）の方法にしたがって定め、表記することとした（図１１参照）。
（i）翻訳開始点より下流に存在し、エキソン上にある遺伝子多型の場合：
各多型の数値は、翻訳開始点から当該遺伝子多型までのmRNA上における塩基数を示す。
たとえば、多型（イ）は「C2507T」と特定され、表記される。
（ii）翻訳開始点より下流に存在し、イントロン上にある遺伝子多型の場合：
各多型は、イントロンの番号と、そのイントロンの末端から当該遺伝子多型までの塩基数で示される。正の数の場合は、イントロンの上流末端から当該遺伝子多型までの塩基数、負の数の場合は、イントロンの下流末端から当該遺伝子多型までの塩基数を示す。たとえば、多型（ロ）は「イントロン3 A+60G」、多型（ハ）は「イントロン5 A-13C」とそれぞれ特定され、表記される。
（iii）翻訳開始点より上流に存在する遺伝子多型の場合：
各多型の数値は、翻訳開始点から当該遺伝子多型までの塩基数を負の数で示す。たとえば、多型（ニ）は「T-182C」、多型（ホ）は「G-1387A」とそれぞれ特定され、表記される。

例えば、前述したように（図１〜図２参照）、ノルエピネフリントランスポーター、ＢＮＰ、エンドセリン１、エンドセリン受容体Ａ、アンギオテンシン受容体２、アデニル酸シクラーゼ９、インターロイキン１０、Ｇ蛋白βサブユニット４、マトリックスメタロプロテアーゼ８、及びアドレナリンα１Ｂ受容体の各遺伝子多型については、単独解析におけるｐ値が0.05未満と高い有意差を示したので、各遺伝子多型単独での反応性予測が可能である。勿論、複数の遺伝子多型の検査結果を組み合わせてβ遮断薬の反応性予測を行ってもよい。ただし、この場合は予測方法があまり複雑にならないよう留意することが好ましい。

２以上の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬反応性を予測する１つの好ましい方法は、各遺伝子多型について判別係数を設定すると共にそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、各値にそれぞれの判別係数を乗じた値の合計値に基づき、β遮断薬反応性を予測する方法である。この予測方法の具体例について図６を参照しながら説明する。なお、図１５も同様である。

ここでは、１２個の遺伝子多型の検査結果を組み合わせてβ遮断薬の反応性予測を行う方法について説明する（これらの遺伝子多型は、表１〜表３の「判別分析」の欄に○印が付されている）。各遺伝子多型には、今回の解析結果を踏まえて、判別係数（重み）が付与される。また、各遺伝子多型において、それぞれの遺伝子型に対して固有の値が割り振られる。固有の値は互いに異なる値としてもよいし、一部共通する値としてもよい。図６に示す例では、「ノルエピネフリントランスポーター T-182C」の遺伝子多型に、判別係数「6.85」が付与されると共に、「TT」「TC」「CC」の各遺伝子型にそれぞれ「１」「２」「３」の値が割り振られている。

検査により各遺伝子多型における遺伝子型が決定される。これによって各遺伝子多型の値が決定されるので、各値にそれぞれの判別係数をかけ、すべてを合計することで個人の判別値を求める。本例では更に定数項「22.29」を加えた合計値を個人の判別値とした。そして、この判別値が正であればノンレスポンダー、負であればレスポンダーと判定した。この方法により今回のＤＮＡ試料について予測した場合、誤判定率は3/69=0.043であった。このように、各遺伝子多型をスコア化した判別分析の手法によって、複数の遺伝子多型の検査結果から簡易に、しかも精度良く被検者のβ遮断薬反応性を予測することができる。

上記判別分析による予測方法において、各遺伝子多型に付与される判別係数は、各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連を示す既存のデータなどを考慮して任意に設定することができる。また、この判別係数は、新規データに応じて随時更新されることが好ましい。

２以上の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬反応性を予測する他の好ましい方法は、決定木などの分類モデルを用いた予測方法である。例えば、２以上の遺伝子多型によって決定木を構成すると共に各遺伝子多型についてそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、上記決定木にしたがってβ遮断薬反応性を予測する。この予測方法の具体例について図７及び図８を参照しながら説明する。なお、図１６及び図１８も同様である。

図７に示す例は、エンドセリン受容体Ａ遺伝子の多型「C1363T」を先頭とした６個の遺伝子多型によって決定木１を構成してβ遮断薬の反応性予測を行う方法である。これらの遺伝子多型は、表１〜表３の「決定木１」の欄に○印が付されている（決定木１の先頭になる遺伝子多型は◎印で示している）。一方、図８に示す例は、エンドセリン１遺伝子の多型「198 Lys/Asn」を先頭とした７個の遺伝子多型によって決定木２を構成してβ遮断薬の反応性予測を行う方法である。これらの遺伝子多型は、表１〜表３の「決定木２」の欄に○印が付されている（決定木２の先頭になる遺伝子多型は◎印で示している）。

各遺伝子多型においては、今回の解析結果を踏まえて、それぞれの遺伝子型に対して固有の値が割り振られている（図９及び図１０参照、図１６および図１８の場合は、図１７および図１９参照）。検査により各遺伝子多型における遺伝子型を決定し、これにより各遺伝子多型の値を決定した後、決定木１・２にしたがってβ遮断薬反応性を予測する。決定木１を用いた予測の場合、図７に示す決定木１にしたがって先頭から順番に最後の枝まで進み、レスポンダーであるかノンレスポンダーであるかを決定する。図中○印を付した枝は誤判定が生じた場合でそれぞれ誤判定数が付されている。それ以外の枝では誤判定はなく、レスポンダーであるかノンレスポンダーであるかをすべて正しく予測することができた。誤判定率は5/69=0.072であり、精度良くβ遮断薬反応性を予測することができた。

同様に、決定木２を用いた予測の場合、図８に示す決定木２にしたがって先頭から順番に最後の枝まで進み、レスポンダーであるかノンレスポンダーであるかを決定する。図中○印を付した枝は誤判定が生じた場合でそれぞれ誤判定数が付されている。それ以外の枝では誤判定はなく、レスポンダーであるかノンレスポンダーであるかをすべて正しく予測することができた。誤判定率は6/69=0.087であり、精度良くβ遮断薬反応性を予測することができた。

以上説明した各予測方法をプログラムを利用して行うことは好ましく、本発明はこのようなβ遮断薬反応性予測用プログラムを包含するものである。即ち、本発明の予測用プログラムは、前述した少なくともいずれか１つの予測方法をコンピュータに実行させ、これにより検査結果から被検者のβ遮断薬反応性予測を実行させるものである。本発明のプログラムは、これを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体として提供することができる。このような記録媒体としては、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−ＲＷ等の光学記憶媒体、ＲＡＭやＲＯＭ等の電気記憶媒体、およびＭＯ等の磁気／光学記憶媒体を例示することができるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、心不全治療その他心機能の改善を目的とした薬物治療において、β遮断薬に対する患者の反応性予測に好適に使用することができる。心不全治療のほかに、高血圧症、虚血性心疾患、不整脈などの各症状、疾患に対してβ遮断薬を使用する場合、その他β遮断薬を用いた治療一般に有効と考えられる。β遮断薬は、β₁受容体機能の抑制作用を有するものであればよく、更に他の作用を有するもの（例えば、α受容体にも作用する等）であってもよい。例えば、現在ではカルベジロール（carvedilol）、メトプロロール（metoprolol）、ビソプロロール（bisoprolol）などのβ遮断薬が心機能の改善を目的として使用されているが、その他のβ遮断薬を使用する際に本発明を利用してもよいし、今後得られるβ遮断薬を使用する際に本発明を利用してもよい。

［２］各遺伝子多型の検査方法
本発明において、各遺伝子多型を調べる方法は特に制限されるものではなく、遺伝子上の多型を直接的または間接的に調べることが可能な従来公知の方法を適用することができ、今後開発される方法を使用してもよい。今回の解析に用いた、ＰＣＲ法により各遺伝子多型を検査する方法は簡易な方法であり、精度も良好であるので、以下ではこの方法について簡単に説明する。

検査に供するＤＮＡ試料は、被検者の任意の器官・組織・細胞（血液、羊水中の細胞、採取した組織等を培養した細胞を含む）から常法に従ってＤＮＡを精製・抽出すればよい。なお、ＰＣＲ法による遺伝子増幅が可能な限りにおいて、ＤＮＡの精製・抽出工程は省略又は簡略化してもよい。

次に、多型部位に基づく遺伝子型の同定（遺伝子タイピング）のため、上記の方法で調製したＤＮＡ試料中のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法を行い、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する。その後、得られた増幅断片をもとに、Primer extension法（プライマー伸長法）、PCR-RFLP法、または電気泳動により増幅断片の長さを調べる方法などによって遺伝子型を決定する。

上記ＰＣＲ法における各条件、使用する試薬・プライマーなどは特に制限されるものではないが、各遺伝子多型の検査においてＰＣＲ法に使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーの配列は、前記表１〜表９記載の各配列番号に示したとおりである。表１〜表９には、プライマー伸長法に使用したプローブの配列を記載した各配列番号についても示される。なお、「SNP_017」のアドレナリンα２Ｃ受容体遺伝子上の多型については、PCR-RFLP法によりタイピングを行った。また、「SNP_018」のアンギオテンシン変換酵素遺伝子上の多型については、電気泳動により増幅断片の長さを調べる方法によってタイピングを行った。

勿論、各遺伝子多型の検査は、ＰＣＲ法以外の方法を使用してもよい。遺伝子上の多型を直接的または間接的に検定可能な方法であれば、一塩基多型（ＳＮＰ）における塩基を検定する方法（ＳＮＰタイピング）、欠損部分の有無による多型を検定する方法、など従来公知の種々の方法を適用することができる（例えば、文献「ポストシークエンスのゲノム科学（１） ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」（中山書店）参照）。

一例として、ＤＮＡチップ等の遺伝子多型検査器具を用いた検査方法を挙げることができる。この方法は、前記２５個の遺伝子多型のうち１又は２以上の多型を検定するためのプローブを基板上に配置したＤＮＡチップ（または同種の器具）を作製し、このＤＮＡチップ等を用いて被検者からの遺伝子試料とプローブとのハイブリダイゼーションシグナルの有無により、遺伝子のタイピングを行う方法である。プローブには、前記２５個の各遺伝子多型について、多型部位の塩基を含む近傍の塩基配列またはその相補配列等からなるオリゴヌクレオチドを用いることができる。尚、ここで、「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイを使用してもよい。

その他にも、各遺伝子多型の検査方法として、PCR-SSCP法などの点変異検出法を用いてもよいし、PCR法以外の他の増幅方法（例えば、RCA法など）を用いてもよい。また、ＤＮＡ増幅後に塩基配列決定装置（シークエンサー）などで直接増幅断片の塩基配列を決定し、遺伝子のタイピングを行ってもよい。

勿論、各遺伝子のタイピングは、タンパク質をコードするコード配列以外に、イントロン配列や制御配列などに存在する多型に基づいて決定してもよい。また、多型（変異）がコード配列上の変異であれば、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡをもとに、当該多型（変異）を検出することも可能である。さらに、アミノ酸置換を伴う多型（変異）であれば、タンパク質のアミノ酸配列などから当該多型（変異）を検出してもよい。

［３］本発明のスクリーニング方法
前述のように、心不全治療におけるβ遮断薬の有効性は現在認められているところであるが、しかし、β遮断薬の心機能改善効果がどのような作用機序によるものか、その薬理作用は依然として明らかになっていない。

今回の解析により、前記２１個の遺伝子上に存在する各多型とβ遮断薬反応性との関連性が認められた。このことは、これらの遺伝子によってコードされる分子（タンパク質）がβ遮断薬による心機能改善効果に関係している可能性を示すものといえ、上記いずれかの分子について、その活性、機能、発現量、他の物質との結合などに影響を与える物質を探索することによって、効率の良い心不全治療薬を含めた心機能改善薬の開発が期待できる。本発明は、このような上記いずれかの分子を標的（創薬ターゲット）とした心機能改善薬のスクリーニング方法を包含するものである。

本発明のスクリーニング方法としては、遺伝子・タンパク質の発現量、タンパク質の活性変化等を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。in vitro及びin vivoスクリーニング系のいずれであってもよいし、cell-free systemでスクリーニングを行ってもよい。また、スクリーニングに使用する遺伝子・タンパク質は、ヒト由来のもののほか、マウスその他の動物由来のものを使用してもよい。勿論、タンパク質の立体構造に関する情報を利用してスクリーニングを行ってもよい。

本発明は、以上のように、被検者の遺伝子多型に基づいてβ遮断薬に対する反応性を予測する方法に関するものであり、前述したとおり、β遮断薬を用いた心不全治療その他心機能の改善を目的としたβ遮断薬治療における検査、診断などに利用することができる。

Claims (8)

1. 下記12種の遺伝子多型：
   ノルエピネフリントランスポーター（Norepinephrine transporter） T-182C、
   アンギオテンシン受容体２（Angiotensin II receptor type2） A-1342G、
   Ｇ蛋白βサブユニット４ イントロン１ C-1809G、
   ＢＮＰ（Natriuretic peptide precursor B：Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド） T-381C、
   ミネラルコルチコイド受容体 Ile180Val（A538G）、
   アンギオテンシン変換酵素 イントロン16 I/D、
   インターロイキン１０ A-1082G、
   アドレナリンα２Ｃ受容体 Del 322-325、
   アデゥーシン１ イントロン４ +1548 G/C、
   リアノジン受容体３ Ile731Val（A2191G）、
   アデノシン１リン酸脱アミノ酵素１ -1724 C/T、および
   ＴＮＦ（Tumor necrosis factor-α：腫瘍壊死因子） C-1037T
   について判別係数を設定すると共にそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、各値にそれぞれの判別係数を乗じた値の合計値に基づきβ遮断薬反応性を予測する方法。
2. 上記判別係数は、各遺伝子多型とβ遮断薬反応性との関連を示す先のデータその他の情報を考慮して設定され、新たな情報に応じて適宜更新されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 下記(ａ)の６種の遺伝子多型又は（ｂ）の７種の遺伝子多型によって決定木を構成すると共に各遺伝子多型についてそれぞれの遺伝子型に対して固有の値を割り振り、各遺伝子多型の値を検査により決定した後、上記決定木にしたがってβ遮断薬反応性を予測する方法。
   遺伝子多型（ａ）：
   エンドセリン受容体Ａ（Endothelin rececptor A） C2507T、
   ノルエピネフリントランスポーター（Norepinephrine transporter） T-182C、
   エンドセリン受容体Ｂ A831G、
   リアノジン受容体２ イントロン33+91 G/A、
   アンギオテンシン受容体１ C-43646T、
   エンドセリン１（Endothelin 1） Lys198Asn（T594G）；
   遺伝子多型（ｂ）：
   エンドセリン１（Endothelin 1） Lys198Asn（T594G）、
   アンギオテンシン受容体２（Angiotensin II receptor type2） イントロン１ A-29G、
   リアノジン受容体２ イントロン33+91 G/A、
   ノルエピネフリントランスポーター（Norepinephrine transporter） イントロン７ A-13C、
   リアノジン受容体２ T1359C、
   βアレスチン１ G1279A、
   アデニル酸シクラーゼ９（Adenylate cyclase 9） イントロン９ G+60A
4. 心不全治療その他心機能の改善を目的とした薬物治療において、β遮断薬に対する患者の反応性予測に使用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を用いて、被検者のβ遮断薬反応性予測をコンピュータに実行させる、β遮断薬反応性予測用プログラム。
6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、遺伝子多型の検査は、被検者から調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、多型部位を挟む遺伝子領域を増幅する工程と、得られた増幅断片をもとに遺伝子型を決定する工程とを含む方法。
7. 請求項１〜４又は６のいずれか１項に記載の方法において、遺伝子多型検査器具を用いて遺伝子多型を検査する方法。
8. 請求項７記載の方法に使用される、遺伝子多型検査用オリゴヌクレオチド。

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