JP2010220586A - 妊孕性診断方法、妊孕性診断キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】精子における卵子への融合能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断方法、並びに該方法に用いられるポリヌクレオチド及び妊孕性診断キットの提供。
【解決手段】ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする妊孕性診断方法、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＡＬＤＯＡ遺伝子の塩基配列または当該遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、妊孕性と相関性の高い一塩基置換変異の変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、及びヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キット。
【選択図】なし

Description

本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものである。具体的には、妊孕可能性と相関性のある遺伝子の欠損又は変異を検出し、妊孕可能性を診断する方法、並びに、該方法に用いることができるキット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体に関する。

近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもなく、有効な不妊治療法の開発が強く望まれている。

不妊症の原因は男女同率であるが、男性不妊症は精子形成メカニズムの複雑さから、その治療法も含めて未解明の部分が多く、ヒト精子数の減少や生殖力の低下など生殖にまつわる問題の多くは原因不明である。体外受精（ＩＶＦ；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能となってきているものの、不妊の背後にある分子メカニズムの詳細は依然として明らかになっておらず、適切な治療法の選択が困難な場合や、十分な治療効果が得られない場合も多い。従って、より負担の少ない不妊治療のためには、不妊メカニズムの理解に立った遺伝子診断・生殖補助医療の開発が強く望まれている。

非特許文献１によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
一方、精子形成過程の減数分裂後に起こる形態学的変化には、エネルギー代謝に利用される酵素において、精子細胞特異的な構造もしくは機能変化が認められるとされ、精子特異的なｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ（非特許文献２参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（非特許文献３参照。）、ａｌｄｏｌａｓｅ（非特許文献４参照。）、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（非特許文献５参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ（非特許文献６参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ（非特許文献７参照。）、ｅｎｏｌａｓｅ（非特許文献８参照。）などが活性化される。非特許文献５では、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのノックアウトマウス（オス）が不妊となり、精子の運動不良が認められることから、これら精子特異的な解糖系の酵素機能における異常は不妊の原因となる可能性が示唆される。

ＡｌｄｏｌａｓｅのＡ ｉｓｏｆｏｒｍ（ＡＬＤＯＡ）は、精子においてｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａ（ＬＤＨＡ）やｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｓｅ，ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ（ＧＡＰＤＨＳ）などと共に精子の線維鞘に強固に結合し、精子運動に必要とされるＡＴＰの局所的な供給に関与している（非特許文献９参照。）。一方、ＡＬＤＯＡ欠損は、遺伝性溶血性貧血と関連した常染色体劣性疾患の原因であることが知られている。例えば、ＡＬＤＯＡの（開始コドンに対応するメチオニン残基を−１位とした時の）１２８位のアスパラギン酸がグリシンに（非特許文献１０参照。）、２０６位のグルタミン酸がリジンに（非特許文献１１参照。）、３０３位のアルギニンのコドン終始コドンに（ナンセンス変異）、３３８位のシステインがチロシンに（非特許文献１２参照。）、３４６位のグリシンがセリン（非特許文献１３参照。）に、それぞれ変化する突然変異が報告されている。

マザック（Matzuk）、外１名、ネイチャー・セル・バイオロジー（Nature Cell Biology）、２００２年、第４（Ｓｕｐｐ１）巻、Ｓ４１〜Ｓ４９。 モリ（Mori）、外４名、モレキュラー・リプロダクション・アンド・デベロップメント(Molecular reproduction and development)、１９９６年、第４４巻第１号、第１４〜２２ページ。 ブール（Buehr）、外１名、ジャーナル・オブ・リプロダクション・アンド・ファーティリティ（Journal of reproduction and fertility）、１９８１年、第６３巻第１号、第１６９〜１７３ページ。 ベムガンチ（Vemuganti）、外５名、デベロップメンタル・バイオロジー（Developmental biology）、２００７年、第３０９巻第１号、第１８〜３１ページ。 ミキ（Miki）、外８名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、２００４年、第１０１巻第４７号、第１６５０１〜１６５０６ページ。 マッカレイ（McCarrey）、外６名、デベロップメンタル・ジェネティックス（Developmental genetics）、１９９６年、第１９巻第４号、第３２１〜３３２ページ。 ブロセノ（Broceno）、外４名、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European journal of biochemistry）、１９９５年、第２２７巻第３号、第６２９〜６３５ページ。 フォース（Force）、外４名、ジャーナル・オブ・アンドロロジー（Journal of andrology）、２００４年、第２５巻第５号、第８２４〜８２９ページ。 クリスファルシ（Krisfalusi）、外３名、バイオロジー・オブ・リプロダクション（Biology of reproduction）、２００６年、第７５巻第２号、第２７０〜２７８ページ。 キシ（Kishi）、外５名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９８７年、８４巻第２３号、第８６２３〜８６２７ページ。 クレンダー（Kreuder）、外９名、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（New England journal of medicine）、１９９６年、第３３４巻第１７号、第１１００〜１１０４ページ。 ヤオ（Yao）、外６名、ブラッド（Blood）、２００４年、第１０３巻第６号、第２４０１〜２４０３ページ。 エスポシオ（Esposito）、外８名、バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical journal）、２００４年、第３８０巻、第５１〜５６ページ。

男性不妊を診断するための有効な遺伝子診断方法は未だ十分に確立されていない。男性不妊の原因は生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な病態の原因を特定できる診断法が望まれている。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、精子運動におけるエネルギー供給に関わる酵素機能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断方法を提供することを目的とする。

これまでに、ＡＬＯＤＡの機能障害に起因する精子の運動能低下やＡＬＤＯＡ欠損と男性不妊症との関連は報告されていないが、ＡＬＤＯＡ機能の低下が妊孕性の低下に関係する可能性は否定できない。
そこで、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、精子に含まれるＡＬＤＯＡが機能的に低下すると精子運動におけるエネルギー供給が減少し、受精に至る確率が低下すると考えられることから、ヒトにおける精子中のＡＬＤＯＡ分子が妊孕性に関連し、ＡＬＤＯＡタンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす(或いは引き起こしやすい)と考え、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子配列を解析し、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子配列と男性不妊症の関連性を検討した結果、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子に男性不妊症に関連した変異を見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の、第−２９位の塩基、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第５７位の塩基、第６９位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２３０位の塩基、第２５７位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１４５２位の塩基、第１４６４位の塩基、第１４９０位の塩基、第１４９８位の塩基、第１５３３位の塩基、第１５４８位の塩基、第１５５２位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第１７３８位の塩基、第１７６１位の塩基、第１７７４位の塩基、第１７８９位の塩基、第１８１３位の塩基、第１８２５位の塩基、第１８７６位の塩基、第１９０４位の塩基、第１９１４位の塩基、第１９５６位の塩基、第１９６０位の塩基、第１９６１位の塩基、第２００３位の塩基、第２０４３位の塩基、第２０９９位の塩基、第２１１８位の塩基、第２１４９位の塩基、第２２０５位の塩基、第２２４１位の塩基、第２２４２位の塩基、第２２５３位の塩基、第２２６５位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３４位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２４１２位の塩基、第２４５５位の塩基、第２４８７位の塩基、第２５０７位の塩基、第２５１１位の塩基、第２５１４位の塩基、第２５２４位の塩基、第２５６９位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、第２７３２位の塩基、第２８４１位の塩基、及び第２９０２位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列において、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２６２位の塩基が置換されており、この置換された塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
また、本発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２６２位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キットを提供することを目的とする。

本発明の妊孕性診断方法や妊孕性診断キットを用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を、高精度かつ簡便に行うことができる。

インベーダー法の原理を説明する模式図である。

本発明に係る妊孕性診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有することを特徴とする。ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損や特定の塩基の変異は、男性不妊との相関性が高い。したがって、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＡＬＤＯＡ遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。

配列番号１は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＮＧ＿００８０１０で登録されている野生型ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域を抽出したものである。このうち、３０１〜４１２番目の領域、４９６〜７０７番目の領域、１６９２〜１７４６番目の領域、１８６４〜２０２４番目の領域、２３５２〜２４３５番目の領域、２５４５〜２７１９番目の領域、２８７６〜３０５５番目の領域、及び３１６３〜３２５８番目の領域が翻訳領域である。配列番号１に示すように、野生型ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子は、１０７５ｂｐ及び８つのエクソンからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、野生型ヒトＡＬＤＯＡタンパク質のアミノ酸配列を示すものである。

本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＡＬＤＯＡ遺伝子において塩基が置換している患者がいることを見出した。これらのうち、６４個の塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では見られなかった。また、２個の塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からも検出されたが、男性不妊症患者からなる集団のほうが、検出頻度が有意に高かった。

ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子に上記の置換変異が起こると、正常なタンパク質が発現しなくなったり、発現効率が低下するおそれがある。それゆえ、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の置換変異は、正常なＡＬＤＯＡタンパク質の翻訳量が低下することにより不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。

本発明において、変異とは、遺伝子の塩基配列において、塩基が欠失・置換・挿入されていることを意味する。本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において検出されるＡＬＤＯＡ遺伝子の変異は、男性不妊との相関性が高い変異である。具体的には、以下に述べる６４個の変異を検出することにより、検出工程に用いられた生体サンプルを採取されたヒトが、妊孕させやすいか否か、不妊症であると診断されている場合には、不妊症の原因がＡＬＤＯＡ遺伝子の変異によるものであるか否かを判断することができる。なお、「ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第Ｘ位の塩基」とは、「翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第Ｘ位の塩基」を意味する。

男性不妊との相関性が高い変異として、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１１位のアデニンがシトシンに置換している変異がある。この塩基置換によって、推定アミノ酸配列の第４位のグルタミンがプロリンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第５０位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって、推定アミノ酸配列の第１７位のセリンがフェニルアラニンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第９１位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１位のロイシンがメチオニンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２１３位のシトシンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４４位のロイシンがバリンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２６２位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第６０位のアルギニンがロイシンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第３０７位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７５位のグリシンがグルタミン酸にコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第３５８位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第９２位のアルギニンがロイシンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１５９９位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３９位のリジンがグルタミン酸にコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１６１５位のアデニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４４位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１６４８位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１５位のグリシンがグルタミン酸にコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１７１６位のチミンがシトシンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１７８位のシステインがアルギニンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２１１８位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２０３位のグルタミンをコードするコドンが、終止コドンになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２２７０位のチミンがシトシンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１７位のロイシンがプロリンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２２９９位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２２７位のスレオニンがアラニンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２３３６位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２３９位のアラニンがバリンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２３８３位のアデニンがシトシンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２５５位のスレオニンがプロリンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２６４８位のシトシンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２９１位のプロリンがロイシンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２６８４位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３０３位のグリシンがアスパラギン酸にコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２７３０位のグアニンがチミンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１８位のリジンがアスパラギンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２７３２位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１９位のグルタミン酸がグリシンにコードされるようになる。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第５７位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第１３８位の塩基は、推定アミノ酸配列の第１９位のイソロイシンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第６９位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第５７位の塩基は、推定アミノ酸配列の第２３位のイソロイシンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２３０位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第２３０位の塩基は、推定アミノ酸配列の第４９位のスレオニンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２５７位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第２５７位の塩基は、推定アミノ酸配列の第５８位のフェニルアラニンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２０９９位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第２０９９位の塩基は、推定アミノ酸配列の第１９６位のアスパラギン酸をコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２２５３位のチミンがアデニンに置換している変異がある。当該第２２５３位の塩基は、推定アミノ酸配列の第２１１位のアラニンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２２６５位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第２２６５位の塩基は、推定アミノ酸配列の第２１５位のリジンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２３３４位のチミンがシトシンに置換している変異がある。当該第２３３４位の塩基は、推定アミノ酸配列の第２３８位のヒスチジンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２４１２位のチミンがシトシンに置換している変異がある。当該第２４１２位の塩基は、推定アミノ酸配列の第２６４位のアラニンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化しない。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１４９０位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。当該第１４９０位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１７６１位のチミンがシトシンに置換している変異がある。当該第１７６１位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１８２５位のアデニンがチミンに置換している変異がある。当該第１８２５位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１９０４位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。当該第１９０４位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１９１４位のチミンがグアニンに置換している変異がある。当該第１９１４位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１９６０位のチミンがシトシンに置換している変異がある。当該第１９６０位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１９６１位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第１９６１位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２００３位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第２００３位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２０４３位のグアニンがチミンに置換している変異がある。当該第２０４３位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２２０５位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第２２０５位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２２４２位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第２２４２位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２５１１位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。当該第２５１１位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２５１４位のアデニンがチミンに置換している変異がある。当該第２５１４位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２５２４位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。当該第２５２４位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第−２９位のグアニンがチミンに置換している変異がある。当該第−２９位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１４５２位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。当該第１４５２位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１４６４位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第１４６４位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１４９８位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第１４９８位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１５３３位のアデニンがチミンに置換している変異がある。当該第１５３３位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１５４８位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。当該第１５４８位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１５５２位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。当該第１５５２位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１７３８位のチミンがシトシンに置換している変異がある。当該第１７３８位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１７７４位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第１７７４位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１７８９位のシトシンがアデニンに置換している変異がある。当該第１７８９位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１８１３位のチミンがアデニンに置換している変異がある。当該第１８１３位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１８７６位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第１８７６位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第１９５６位のアデニンがグアニンに置換している変異がある。当該第１９５６位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２１４９位のチミンがアデニンに置換している変異がある。当該第２１４９位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２２４１位のシトシンがチミンに置換している変異がある。当該第２２４１位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２４５５位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第２４５５位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２４８７位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第２４８７位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２５０７位のチミンがシトシンに置換している変異がある。当該第２５０７位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２５６９位のチミンがシトシンに置換している変異がある。当該第２５６９位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２８４１位のシトシンがグアニンに置換している変異がある。当該第２８４１位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

また、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２９０２位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。当該第２９０２位の塩基は、非翻訳領域に存在する塩基である。

本発明に係る妊孕性診断方法においては、特に、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第６９位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２３０位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第２１１８位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、及び第２７３２位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することが好ましく、第２６２位の塩基から選択される変異の有無を検出することがより好ましい。より妊孕性との相関性が高いためである。また、本発明に係る妊孕性診断方法においては、上記の変異のうち、１種類の変異を検出するものであってもよく、複数種類の変異を検出するものであってもよい。

本発明に係る妊孕性診断方法は、これらの一塩基変異を、妊孕性の遺伝子マーカーとして用いるものである。たとえば、これらの塩基の変異が検出されなかった場合、検出工程に用いられた生体サンプルが回収された被験者は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者が不妊症患者である場合は、不妊症の原因が、ＡＬＤＯＡ遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。一方、変異が検出された場合は、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。また、被験者が不妊症患者であれば、その原因がＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異により、ＡＬＤＯＡ分子の機能欠損による可能性が高いと判定できる。したがって、そのような被験者に対して、たとえばＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｓｐｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；精巣生検−顕微授精）等の適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。すなわち、本発明に係る妊孕性診断方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした診断方法ともいえるものであり、該方法により、不妊症の診断を行う上で重要な情報が提供されるため、被験者に対して、現存の治療法の中から適格な選択を提示することができる。このため、本発明に係る妊孕性診断方法等は、低妊孕性又は不妊症の診断において好ましく用いることができる。

本発明に係る妊孕性診断方法において用いられる生体サンプルは、ヒトから採取されたものであって、ＡＬＤＯＡ遺伝子由来の核酸やタンパク質を含有することが期待できるサンプルであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、血液、血清、血漿、頬の内側等の粘膜、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を挙げることができる。ここで、ＡＬＤＯＡ遺伝子由来の核酸とは、ＡＬＤＯＡ遺伝子のゲノムＤＮＡや、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ等を意味する。また、ＡＬＤＯＡ遺伝子由来のタンパク質とは、ＡＬＤＯＡ遺伝子から発現されるタンパク質であるＡＬＤＯＡ分子やその分解物等を意味する。特に、ＡＬＤＯＡ遺伝子由来のタンパク質を検出対象とする場合には、生体サンプルとして、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を用いることが好ましい。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊等されることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。

なお、生体サンプルを適宜希釈等することによりそのまま検出工程に用いてもよく、該生体サンプルから予め抽出したゲノムＤＮＡ等のＤＮＡを用いてもよい。また、該生体サンプルからｍＲＮＡ等のＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により該ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを検出工程に用いてもよい。

本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程において、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、たとえば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、Ｔａｑｍａｎプローブ法、ＳＭＭＤ法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＡＳＡ法、及び塩基伸長法、並びにそれらを改変した方法等を用いることができる。検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法等のように、変異部位を特異的に認識する塩基配列を有するプローブやプライマーを用いて検出する方法であることが好ましい。

ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプローブやプライマーは、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列に基づき、常法により設計し、合成することができる。なお、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子及びその周辺の塩基配列は、たとえばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（ＮＣＢＩ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／）等の公知のデータベースから当業者であれば容易に入手することができる。

たとえば、ゲノムＤＮＡを用いて、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２６２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第２６２位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列は、ＡＬＤＯＡ遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２６２位の塩基に相当する。

一方、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡを用いて、ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の第２６２位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列の３４〜２０１番目の塩基からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列の３４番目の塩基以降が、翻訳領域である。

このように、上述する各変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることができる。これらのポリヌクレオチドの長さとしては、１０〜７０塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましく、１０〜３０塩基長であることがさらに好ましい。なお、変異の有無の検出精度が改善されるため、該ポリヌクレオチド中、当該変異部位の塩基と対合し得る塩基の位置は特に限定されるものではないが、３’末端から１〜５塩基以内にあることが好ましく、３’末端にあることがより好ましい。

なお、ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性診断キットを用いることにより、本発明に係る妊孕性診断方法をより簡便に行うことができる。本発明に係る妊孕性診断キットとしては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の、第−２９位の塩基、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第５７位の塩基、第６９位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２３０位の塩基、第２５７位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１４５２位の塩基、第１４６４位の塩基、第１４９０位の塩基、第１４９８位の塩基、第１５３３位の塩基、第１５４８位の塩基、第１５５２位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第１７３８位の塩基、第１７６１位の塩基、第１７７４位の塩基、第１７８９位の塩基、第１８１３位の塩基、第１８２５位の塩基、第１８７６位の塩基、第１９０４位の塩基、第１９１４位の塩基、第１９５６位の塩基、第１９６０位の塩基、第１９６１位の塩基、第２００３位の塩基、第２０４３位の塩基、第２０９９位の塩基、第２１１８位の塩基、第２１４９位の塩基、第２２０５位の塩基、第２２４１位の塩基、第２２４２位の塩基、第２２５３位の塩基、第２２６５位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３４位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２４１２位の塩基、第２４５５位の塩基、第２４８７位の塩基、第２５０７位の塩基、第２５１１位の塩基、第２５１４位の塩基、第２５２４位の塩基、第２５６９位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、第２７３２位の塩基、第２８４１位の塩基、及び第２９０２位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることが好ましく、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第６９位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２３０位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第２１１８位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、及び第２７３２位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることがより好ましく、第２６２位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることがさらに好ましい。また、これらの変異のうちの、１種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよく、複数種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよい。

これらの塩基の変異を検出するための試薬としては、たとえば、当該塩基を含む核酸領域をＰＣＲ等により増幅させるためのプライマーの組と、得られた増幅産物の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。該塩基配列決定試薬としては、たとえば、上述したヒト野生型ＡＬＤＯＡ遺伝子の塩基配列又はその翻訳領域の塩基配列において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、予め蛍光色素等により標識したハイブリダイゼーションプローブ等が挙げられる。その他、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異を検出する方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である場合には、該ＲＦＬＰ法において用いられる制限酵素であってもよい。

また、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。たとえば、上記妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、被験者のヒトＡＬＤＯＡ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよく、被験者のヒトＡＬＤＯＡ遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。

より具体的には、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子内の領域のうち、上記の各変異部位（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。

この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。

被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲを行うことにより、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行うことにより、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、たとえば、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.）等を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。

また、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のプライマーを、塩基配列の決定に用いられるプライマーとして用いてもよい。すなわち、妊孕性診断キットには、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組と、塩基配列の決定に用いられるプライマーとを含んでいてもよい。

上記のＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。

また、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。

さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。

なお、それぞれのプライマーは、ＡＬＤＯＡ遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。ＡＬＤＯＡ遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、ＡＬＤＯＡ遺伝子の各変異部位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。

上記のプライマーの組としては、たとえば、配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーとからなる組、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーとからなる組、または配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーとからなる組を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）等を用いてプライマーを設計することができる。
各プライマーは、たとえばホスホロアミダイト法等の公知の方法によって合成することができ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.の３９２型シンセサイザー等を取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。

なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼ等がさらに含まれていてもよい。

一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無を、インベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。

図１は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダーオリゴ２及びアレルオリゴ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される（いずれの塩基とも相補的な塩基ではない）。一方、アレルオリゴ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに相補するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
このように設計されたインベーダープローブ２とアレルオリゴ３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子１に対してアレルオリゴ３とインベーダープローブ２が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位１ａにおいてインベーダープローブ２がアレルオリゴ３の下に１塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）」ともいう）４がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ３を重なった塩基の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、 ３’末端がフラップ遊離体３ｃと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３進入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。

従って、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無をインベーダー法により検出するものであってもよい。この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、インベーダープローブ２、アレルオリゴ３及びフレットプローブ５等が含まれることが好ましい。

置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合には、インベーダープローブ２は、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型ＡＬＤＯＡ遺伝子の各変異型塩基と対応するように設計される（但し、相補的でない）。また、アレルオリゴ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型ＡＬＤＯＡ遺伝子の上記の変異型塩基と相補するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記アレルオリゴ３が変異型ＡＬＤＯＡ遺伝子とハイブリダイズしてインベーダープローブ２による侵入構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
上記の構成により、被験者のＡＬＤＯＡ遺伝子において上記の塩基が変異型置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド３ａの５’末端にインベーダープローブ２の３’末端が侵入することにより、ヌクレオチド３ｃが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のＡＬＤＯＡ遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド３ｃが切り出されないため蛍光が生じない。

また、上記の例では、被験者の有するＡＬＤＯＡ遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＡＬＤＯＡ遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、或いは野生型と変異型で異なった蛍光色素を使用するなど様々に改変することができる。
なお、上記の各方法において、ＡＬＤＯＡ遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。

本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無をタンパク質レベルで検出するものであってもよい。すなわち、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて、正常なヒトＡＬＤＯＡタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、異常なヒトＡＬＤＯＡタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。ここで、正常タンパク質とは、ヒト野生型ＡＬＤＯＡポリペプチドであり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。一方、異常タンパク質とは、たとえば、ヒト野生型ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、一塩基置換変異等の変異が生じているポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは異なるポリペプチドを意味する。具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６０番目のアルギニンがロイシンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられる。

なお、生体サンプル中に含まれているヒトＡＬＤＯＡタンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出する方法としては、特に限定されるものではないが、たとえば、ヒトＡＬＤＯＡタンパク質の正常タンパク質と異常タンパク質のいずれか一方のみを認識する抗体を用いることにより、生体サンプル中に含まれているヒトＡＬＤＯＡタンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出することができる。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＡＬＤＯＡの異常タンパク質と結合し、かつ、正常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いてもよい。なお、このような抗体は、ヒトＡＬＤＯＡの異常タンパク質を抗原として、常法により作製したポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の中から、ヒトＡＬＤＯＡの正常タンパク質と交差しないものを選択することにより、作製することができる。

このような抗体は、具体的には、上述した各変異のうち、アミノ酸の置換変異の発現タンパク質であるヒト変異型ＡＬＤＯＡポリペプチド又は変異部分を含むそのフラグメントを抗原として、実験動物を免疫処置することにより製造することができる（たとえば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；Francis, M. J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照のこと。）
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキシド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型ＡＬＤＯＡポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型ＡＬＤＯＡポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型ＡＬＤＯＡタンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型ＡＬＤＯＡポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。

このように、一実施形態において、本発明に係る妊孕性診断方法及び妊孕性診断キットは、上述した各変異のうち、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第２１１８位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、及び第２７３２位の塩基の塩基からなる群の少なくとも一の塩基置換を含むヒト変異型ＡＬＤＯＡ遺伝子によってコードされるヒト変異型ＡＬＤＯＡタンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型ＡＬＤＯＡタンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型ＡＬＤＯＡタンパク質が発現しているかを判定するものであってもよい。
上記抗体を用いてヒト変異型ＡＬＤＯＡタンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型ＡＬＤＯＡタンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の異常に起因していると推定することができる。

また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトにおいて正常なヒトＡＬＤＯＡタンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、正常なヒトＡＬＤＯＡタンパク質の発現量の多寡を判定するものであってもよい。
より具体的には、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程が、ヒト野生型ＡＬＤＯＡタンパク質と結合し、かつ、異常ヒトＡＬＤＯＡタンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中にヒト野生型ＡＬＤＯＡタンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒト野生型ＡＬＤＯＡタンパク質と結合し、かつ、異常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体（抗ＡＬＤＯＡ抗体）を用いてもよい。
抗ＡＬＤＯＡ抗体を用いてヒトＡＬＤＯＡタンパク質の発現の有無や発現量を調べ、被験者においてヒトＡＬＤＯＡタンパク質が発現していないと判定された場合や、ヒトＡＬＤＯＡタンパク質の発現量が遺伝子変異が生じていない被験者よりも少ないと判定された場合には、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＡＬＤＯＡタンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。

抗体を用いて、生体サンプル中のヒト野生型ＡＬＤＯＡタンパク質またはヒト変異型ＡＬＤＯＡタンパク質を検出する手法は、特に限定されず、公知のいずれの手法を用いてもよい。たとえば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）等が挙げられる。
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用する妊孕性診断方法に好適なキットである場合、妊孕性診断キットには、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、抗ヒト野生型ＡＬＤＯＡタンパク質抗体又は抗ヒト変異型ＡＬＤＯＡ抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼ等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

［実施例１］
本実施例においては、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子配列を解析し、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子に男性不妊症に関連した変異の検出を行った。
［解析対象者］
非閉塞性不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝７６０）を、精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１３％は非閉塞性無精子症であり、３１％は重症精子過少症（＜５×１０^６細胞／ｍＬ）であり、３３％が運動無力症であり、残り２３％が形態的に異常のないものであった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。コントロール群（Ｎ＝３２５）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親であり、妊孕性が確認された男性とした。全ての提供者からは、サンプルがゲノムＤＮＡ解析に使用される旨のインフォームドコンセントを取得した（大阪大学病院泌尿器科）。

［変異スクリーニング］
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理とフェノール抽出により血液サンプル又は精液サンプルから単離し調製した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。血液由来ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅したＤＮＡを使用した。
ＡＬＤＯＡ遺伝子のタンパク質をコードする翻訳領域を含むＤＮＡを、表１に示したプライマーＦ及びプライマーＲを用いて、表２に示したＰＣＲ反応条件に従って増幅した。

得られたＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＭＰｕｒｅ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した。この精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを鋳型とし、それぞれのアンプリコンを増幅した際に使用したプライマーを用いて、シーケンシング反応を行った。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、ＢｉｇＤｙｅ Ｘｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社製）にて精製した反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３７３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。

［シークエンス解析結果］
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、各プライマーＦとＲ（Ｆ３とＲ６、Ｆ４とＲ５、Ｆ２とＲ３）で増幅されるアンプリコンの塩基配列を解析したところ、表３〜５に示すように、置換変異が合計７９個検出された。
このうち、アミノ酸の変化を伴う置換変異は２３個であり、このうちの２０個は妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった。この妊孕性確認被験者からは検出されなかった２０個の置換変異うち、５個はホモ接合型であった。
一方、アミノ酸の変化を伴わない１０個の塩基置換のうち、７個は妊孕性確認被験者には置換変異は全く検出されず、２個は妊孕者にも１人ずつ見出されたが不妊症被験者ではいずれも９人と比較的多かった。
さらに、塩基配列が決定できたエクソンに隣接する非翻訳領域の一部にも４６個の置換変異が検出され、このうち３５個は妊孕性確認被験者で置換変異が全く検出されなかった。この妊孕性確認被験者からは検出されなかった３５個の置換変異うち、１４個はホモ接合型であった。
以下、アミノ酸置換を伴う２０個の置換変異（妊孕性被検者には検出されない）と、アミノ酸置換を伴わない９個の置換変異（２つで妊孕性被検者にも検出）、非翻訳領域に検出された１４個のホモ接合型の置換変異（１つはヘテロ接合型も含む）、及び２１個のヘテロ接合型の置換変異について、それぞれ説明する。
なお、以下、「第Ｘ番目の塩基」とは、配列番号１の塩基配列（ＡＬＤＯＡ遺伝子の転写領域の部分領域）において、３０１番目のアデニンを第１位の塩基としたときの第Ｘ位の塩基を意味する。配列番号１の塩基配列の３０１番目のアデニンが、ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳開始コドンのアデニンに相当する。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第１１位のアデニンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者７４８人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４位のグルタミンがプロリンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７６人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第５０位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７４６人の中に２人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１７位のセリンがフェニルアラニンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２８９人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第９１位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７５９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１位のロイシンがメチオニンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２９３人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２１３位のシトシンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者７５２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４４位のロイシンがバリンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７２人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２６２位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者４２２人の中に３６人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第６０位のアルギニンがロイシンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２５８人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第３０７位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者３９２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第７５位のグリシンがグルタミン酸にコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２４０人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第３５８位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者１３３人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第９２位のアルギニンがロイシンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者４７人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第１５９９位のアデニンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０６人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１３９位のリジンがグルタミン酸にコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第１６１５位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０６人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１４４位のアスパラギン酸がバリンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２４人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第１６４８位のグアニンが両方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０２人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１１５位のグリシンがグルタミン酸にコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３１１人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第１７１６位のチミンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者６４９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１７８位のシステインがアルギニンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２８４人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２１１８位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６９８人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２０３位のグルタミンをコードするコドンが、終止コドンになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２９９人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２２７０位のチミンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１７位のロイシンがプロリンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２２９９位のアデニンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２２７位のスレオニンがアラニンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２３３６位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２３９位のアラニンがバリンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２３８３位のアデニンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者７０７人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２５５位のスレオニンがプロリンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２６４８位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２９１位のプロリンがロイシンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２４人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２６８４位のグアニンが両方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６８０人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３０３位のグリシンがアスパラギン酸にコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者３１７人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２７３０位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６０１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１８位のリジンがアスパラギンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２６１人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２７３２位のアデニンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者６００人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第３１９位のグルタミン酸がグリシンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２６１人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第５７位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７５４人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９位のイソロイシンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者２９３人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第６９位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７４５人の中に９人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２３位のイソロイシンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者２９０人中に１人見出された。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２３０位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７３０人の中に９人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４９位のスレオニンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７１人中に１人見出された。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２５７位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６７０人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第５８位のフェニルアラニンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者２６１人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２０９９位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６８０人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１９６位のアスパラギン酸は変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者２９２人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２２５３位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１１位のアラニンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２２６５位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２１５位のリジンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２３３４位のチミンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２３８位のヒスチジンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域にある第２４１２位のチミンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者７０３人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２６４位のアラニンは変化しない。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１４９０位のアデニンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０５人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１７６１位のチミンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者６０６人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７８人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１８２５位のアデニンが両方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６１７人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７９人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１９０４位のアデニンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者６２２人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７９人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１９１４位のチミンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者６２２人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７９人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１９６０位のチミンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者６２３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７７人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１９６１位のシトシンが両方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６２３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７７人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２００３位のグアニンが両方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６２４人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２０４３位のグアニンが両方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者６２３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７４人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２２０５位のシトシンが両方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０６人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２２４２位のシトシンが片方のアレル、若しくは両方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人ずつ見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２５１１位のアデニンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２５１４位のアデニンが両方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２５２４位のアデニンが両方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第−２９位のグアニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７３２人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２６１人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１４５２位のアデニンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者７００人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２３人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１４６４位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７００人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２３人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１４９８位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０５人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１５３３位のアデニンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０５人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１５４８位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０６人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１５５２位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０６人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１７３８位のチミンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者６２４人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２８０人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１７７４位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６０６人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２８０人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１７８９位のシトシンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６１１人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２８０人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１８１３位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６１１人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２８０人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１８７６位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６２０人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７９人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第１９５６位のアデニンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者６２３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２７８人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２１４９位のチミンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０６人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２３人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２２４１位のシトシンが片方のアレルにおいてチミンに置換している被験者が、不妊症被験者７０９人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２４５５位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者６９９人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２２人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２４８７位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者７０３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２５０７位のチミンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者７０３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２５６９位のチミンが片方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者７０３人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者３２５人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２８４１位のシトシンが片方のアレルにおいてグアニンに置換している被験者が、不妊症被験者４９６人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２０７人には見出されなかった。

ＡＬＤＯＡ遺伝子の非翻訳領域にある第２９０２位のグアニンが片方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者５２４人の中に１人見出された。この置換変異は、妊孕性確認被験者２０９人には見出されなかった。

これらの置換変異の中でも、特に、第２６２位の塩基の置換変異の出現率が高く、男性不妊症との相関性が高かった。

上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＡＬＤＯＡのタンパク質の翻訳量が低減したことにより、ＡＬＤＯＡタンパク質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。なお、妊孕性確認被験者では全く検出されなかったアミノ酸置換を伴わない置換変異（第−２９位の塩基、第５７位の塩基、第２５７位の塩基、第１４５２位の塩基、第１４６４位の塩基、第１４９０位の塩基、第１４９８位の塩基、第１５３３位の塩基、第１５４８位の塩基、第１５５２位の塩基、第１７３８位の塩基、第１７６１位の塩基、第１７７４位の塩基、第１７８９位の塩基、第１８１３位の塩基、第１８２５位の塩基、第１８７６位の塩基、第１９０４位の塩基、第１９１４位の塩基、第１９５６位の塩基、第１９６０位の塩基、第１９６１位の塩基、第２００３位の塩基、第２０４３位の塩基、第２０９９位の塩基、第２１４４位の塩基、第２２０５位の塩基、第２２４１位の塩基、第２２４２位の塩基、第２２５３位の塩基、第２２６５位の塩基、第２３３４位の塩基、第２４１２位の塩基、第２４５５位の塩基、第２４８７位の塩基、第２５０７位の塩基、第２５１１位の塩基、第２５１４位の塩基、第２５２４位の塩基、第２５６９位の塩基、第２８４１位の塩基、及び第２９０２位の塩基の置換変異）は、転写産物の安定性や翻訳効率に影響を与えるか、或いは他の変異とリンクした変異である可能性がある。

本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＡＬＤＯＡ遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。

本発明に係る妊孕性診断方法等を用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を行うことができ、妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。

１…ターゲット遺伝子、１ａ…変異（又は一塩基多型）検出部位、２…インベーダーオリゴ、３…アレルオリゴ、３ａ…ヌクレオチド、３ｂ…フラップ、３ｃ…フラップ遊離体、４…フラップエンドヌクレアーゼ、５…フレットプローブ、５ａ…ヌクレオチド、５ｂ…蛍光色素、５ｃ…クエンチャー（発光抑制体）。

Claims (11)

1. ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおけるＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、
   前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域の、第−２９位の塩基、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第５７位の塩基、第６９位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２３０位の塩基、第２５７位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１４５２位の塩基、第１４６４位の塩基、第１４９０位の塩基、第１４９８位の塩基、第１５３３位の塩基、第１５４８位の塩基、第１５５２位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第１７３８位の塩基、第１７６１位の塩基、第１７７４位の塩基、第１７８９位の塩基、第１８１３位の塩基、第１８２５位の塩基、第１８７６位の塩基、第１９０４位の塩基、第１９１４位の塩基、第１９５６位の塩基、第１９６０位の塩基、第１９６１位の塩基、第２００３位の塩基、第２０４３位の塩基、第２０９９位の塩基、第２１１８位の塩基、第２１４９位の塩基、第２２０５位の塩基、第２２４１位の塩基、第２２４２位の塩基、第２２５３位の塩基、第２２６５位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３４位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２４１２位の塩基、第２４５５位の塩基、第２４８７位の塩基、第２５０７位の塩基、第２５１１位の塩基、第２５１４位の塩基、第２５２４位の塩基、第２５６９位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、第２７３２位の塩基、第２８４１位の塩基、及び第２９０２位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする、妊孕性診断方法。
2. 前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域の、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第６９位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２３０位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第２１１８位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、及び第２７３２位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１記載の妊孕性診断方法。
3. 前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域の第２６２位の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする請求項１記載の妊孕性診断方法。
4. 下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
   （ａ）配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列。
   （ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
5. 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第２６２位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
7. 請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しないことを特徴とする抗体。
8. ヒトから採取された生体サンプルを用いて、前記ヒトにおいて発現しているＡＬＤＯＡポリペプチドの変異の有無を、請求項７に記載の抗体によって検出する検出工程を有することを特徴とする、妊孕性診断方法。
9. ヒトの妊孕性を診断するためのキットであって、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
10. 翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＡＬＤＯＡ遺伝子の翻訳領域の第−２９位の塩基、第１１位の塩基、第５０位の塩基、第５７位の塩基、第６９位の塩基、第９１位の塩基、第２１３位の塩基、第２３０位の塩基、第２５７位の塩基、第２６２位の塩基、第３０７位の塩基、第３５８位の塩基、第１４５２位の塩基、第１４６４位の塩基、第１４９０位の塩基、第１４９８位の塩基、第１５３３位の塩基、第１５４８位の塩基、第１５５２位の塩基、第１５９９位の塩基、第１６１５位の塩基、第１６４８位の塩基、第１７１６位の塩基、第１７３８位の塩基、第１７６１位の塩基、第１７７４位の塩基、第１７８９位の塩基、第１８１３位の塩基、第１８２５位の塩基、第１８７６位の塩基、第１９０４位の塩基、第１９１４位の塩基、第１９５６位の塩基、第１９６０位の塩基、第１９６１位の塩基、第２００３位の塩基、第２０４３位の塩基、第２０９９位の塩基、第２１１８位の塩基、第２１４９位の塩基、第２２０５位の塩基、第２２４１位の塩基、第２２４２位の塩基、第２２５３位の塩基、第２２６５位の塩基、第２２７０位の塩基、第２２９９位の塩基、第２３３４位の塩基、第２３３６位の塩基、第２３８３位の塩基、第２４１２位の塩基、第２４５５位の塩基、第２４８７位の塩基、第２５０７位の塩基、第２５１１位の塩基、第２５１４位の塩基、第２５２４位の塩基、第２５６９位の塩基、第２６４８位の塩基、第２６８４位の塩基、第２７３０位の塩基、第２７３２位の塩基、第２８４１位の塩基、及び第２９０２位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することを特徴とする請求項９記載の妊孕性診断キット。
11. 前記試薬が、抗ＡＬＤＯＡ抗体であることを特徴とする請求項１０記載の妊孕性診断キット。

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