CN116837091A - 检测gck基因或蛋白变异的试剂在制备筛查青少年发病的成人型糖尿病患者的产品的应用 - Google Patents
检测gck基因或蛋白变异的试剂在制备筛查青少年发病的成人型糖尿病患者的产品的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本公开描述了一种检测GCK基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查青少年发病的成年型糖尿病患者的产品的应用,GCK基因变异为GCK c.296G>A,GCK蛋白变异为GCK p.W99X。本发明还公开了一种检测GCK基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估青少年发病的成年型糖尿病易感性的产品的应用。根据本公开,能够提供新的青少年发病的成年型糖尿病的致病基因位点或青少年发病的成年型糖尿病高风险的突变位点,有助于青少年发病的成年型糖尿病的诊断、治疗与预防。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种检测GCK基因或蛋白变异的试剂在制备筛查青少年发病的成人型糖尿病患者的产品的应用。
背景技术
青少年发病的成人型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young,MODY)是由胰腺β细胞功能障碍引起的一种以常染色体显性遗传模式和发病年龄早为特征的单基因糖尿病。临床特征包括通常在25岁之前发病、胰腺自身抗体阴性、非胰岛素依赖性糖尿病和常染色体显性遗传。人类GCK基因定位于染色体7p13,包含10个外显子,跨度45168bp,编码465个氨基酸的葡萄糖激酶,分子量为52191Da。在人体中,葡萄糖激酶主要在胰腺β细胞和肝细胞中表达。胰岛β细胞中的GCK通过控制胰岛素分泌来维持葡萄糖平衡,因此被认为胰腺β细胞中的葡萄糖传感器。在肝细胞中,通过GCK,葡萄糖磷酸化为葡萄糖6磷酸,产生ATP(腺嘌呤核苷三磷酸),随后以糖原的形式储存起来并且抑制糖异生。人类葡萄糖激酶由两个结构域组成,称为大结构域和小结构域。序列1–64和206–439属于大结构域,序列72–201和445–465属于小结构域,序列65–71、202–205和440–444属于连接结构域的三个环。大小结构域之间有一个很深的裂缝,形成磷酸化的活性位点,也是葡萄糖结合的区域。GCK基因杂合失活突变导致一种青少年发病的成年型糖尿病亚型,即MODY2。
检测出青少年发病的成人型糖尿病相关的致病基因位点,能够有利于疾病的正确诊断、治疗以及遗传咨询。虽然现在已有较多MODY2与GCK基因突变位点的研究,但是,目前该疾病致病基因突变的筛选和验证分析工作远远不够,仍存在许多未知致病基因位点。
因此,鉴定出新的青少年发病的成人型糖尿病的致病基因位点,具有重要意义。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成,其目的在于提供一种青少年发病的成人型糖尿病的致病突变位点或青少年发病的成人型糖尿病高风险的突变位点,有助于青少年发病的成人型糖尿病的诊断、治疗与预防。
为此,本公开第一方面提供了一种检测样本中GCK基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查青少年发病的成年型糖尿病患者的产品的应用,所述GCK基因变异为GCK c.296G>A,所述GCK蛋白变异为GCK p.W99X。
本公开第一方面中,通过家系研究鉴定出GCK c.296G>A突变(也即GCK基因的DNA序列第296位G碱基被A碱基取代,导致GCK蛋白在第99位氨基酸由色氨酸(W)处发生提前终止,即GCK p.W99X),并通过功能研究证实GCK c.296G>A(GCK p.W99X)突变会影响葡萄糖激酶(GCK)活性,由此,提供了新的青少年发病的成年型糖尿病的致病基因位点或青少年发病的成年型糖尿病高风险的突变位点,通过检测样本中是否携带GCK c.296G>A(GCK p.W99X)突变,能够辅助筛查青少年发病的成年型糖尿病患者。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,所述试剂包括用于扩增GCK基因的引物对和/或用于检测所述GCK基因变异的探针。由此,能够通过引物对和/或探针对GCK基因变异c.296G>A进行捕获和/或检测。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,所述引物对根据人基因组中GCK基因编码区第296位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到,所述探针根据人基因组中GCK基因编码区第296位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此,引物能够与GCK基因编码区第296位上下游区域的序列结合、探针能够与GCK基因编码区第296位及上下游区域的序列结合,以对该区域进行检测。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,所述试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此,能够提供反应底物、催化酶和缓冲液,以便于对GCK c.296G>A进行检测。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,所述试剂包括使用以下方法中的至少一种来检测所述GCK蛋白变异的试剂:蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。由此,能够提供试剂来对GCK蛋白变异(也称为氨基酸变异)GCKp.W99X进行检测。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,所述试剂包括可识别具有GCKp.W99X突变的GCK蛋白的抗体。由此,能够利用可识别具有GCK p.W99X突变的GCK蛋白的抗体,来对具有GCK p.W99X突变的GCK蛋白进行检测。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,所述产品还包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。由此,能够便于对GCK c.296G>A或GCK p.W99X进行检测。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,检测的样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种,且所述GCK基因变异是指GCK基因的胚系变异,所述GCK蛋白变异是指GCK蛋白的胚系变异。由此,能够通过检测被检测者的外周血、唾液和/或组织样本,对受检者的GCK基因的胚系突变(胚系突变是指在人的胚胎发育期已经携带的变异,身体内每个细胞都携带)进行检测。
在本公开第一方面所涉及的应用中,可选地,所述GCK基因变异为杂合突变,所述GCK蛋白变异为杂合突变。
本公开第二方面提供了一种检测GCK基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估青少年发病的成年型糖尿病易感性的产品的应用,所述GCK基因变异为GCK c.296G>A,所述GCK蛋白变异为GCK p.W99X。
本公开第二方面中,通过家系研究鉴定出GCK c.296G>A突变,并通过功能研究证实GCK c.296G>A突变会影响葡萄糖激酶(GCK)活性,由此,提供了新的青少年发病的成年型糖尿病的致病基因位点或青少年发病的成年型糖尿病高风险的突变位点,通过检测样本中是否携带GCK c.296G>A(GCK p.W99X)突变,能够辅助评估青少年发病的成年型糖尿病的易感性。
根据本公开,能够提供一种青少年发病的成年型糖尿病的致病突变位点或青少年发病的成年型糖尿病高风险的突变位点,有助于青少年发病的成年型糖尿病的诊断、治疗与预防。
附图说明
图1是示出了本发明实施例所涉及的先证者及其父母基因测序峰图。
图2是示出了本发明实施例所涉及的先证者的家系图。
图3是示出了本发明实施例所涉及的GCK在不同物种间的氨基酸序列对比图。
图4是示出了本发明实施例所涉及的野生型和突变型GCK蛋白的三维结构预测图。
图5是示出了本发明实施例所涉及的野生型GCK蛋白电泳及色谱结果图。
图6是示出了本发明实施例所涉及的突变型GCK蛋白电泳及色谱结果图。
图7是示出了本发明实施例所涉及的反应时间5min时的NADH标准品曲线图。
图8是示出了本发明实施例所涉及的反应时间25min时的NADH标准品曲线图。
图9是示出了本发明实施例所涉及的先证者的胰岛素/C肽曲线。
图10是示出了本发明实施例所涉及的先证者母亲的胰岛素/C肽曲线。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施方式,所述实施方式的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的,仅用于解释本发明,而不能解释为对本发明的限制。
本领域技术人员可以理解,除非另外定义,这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。
还应该理解的是,诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义,并且除非像这里一样定义,不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本领域技术人员可以理解,除非特意声明,这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是,本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件,但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件和/或它们的组合。
为便于理解本发明,下面结合附图以具体实施例对本发明作进一步解释说明,且具体实施例并不构成对本发明实施例的限定。本领域技术人员应该理解,附图只是实施例的示意图,附图中的部件并不一定是实施本发明所必须的。
在本实施方式中,涉及下述任一种应用:
一种检测GCK基因变异的试剂在制备筛查青少年发病的成年型糖尿病2型(MODY2)患者的产品中的应用;
一种检测GCK氨基酸突变的试剂在制备筛查青少年发病的成年型糖尿病2型患者的产品中的应用;
一种检测GCK基因变异的试剂在评估青少年发病的成年型糖尿病2型易感性的产品中的应用;
一种检测GCK氨基酸突变的试剂在评估青少年发病的成年型糖尿病2型的易感性的产品中的应用。
MODY2(青少年发病的成年型糖尿病2型)是MODY(青少年发病的成年型糖尿病)的一种亚型,因此,检测GCK基因突变或GCK氨基酸突变的试剂可以用于筛查MODY或MODY2的患者,检测GCK基因突变或GCK氨基酸突变的试剂可以用于评估MODY或MODY2的易感性。易感性是指由遗传基础所决定一个个体患病的风险,也可以理解为在相同环境下,不同个体患病的风险。
本发明提供的新的突变位点补充了青少年发病的成年型糖尿病或青少年发病的成年型糖尿病2型的遗传突变谱,能够有利于对青少年发病的成年型糖尿病或青少年发病的成年型糖尿病2型患者进行诊断以便于进行治疗,以及对家系中的携带者进行基因诊断以便于进行健康管理,同时能够根据父母双方基因型指导生育,以便于规避致病基因位点的遗传,指导优生优育。
在本实施方式所涉及的上述试剂中,可以包括对GCK基因变异或GCK氨基酸突变进行检测的试剂。在一些示例中,GCK基因变异为GCK c.296G>A,GCK c.296G>A是指野生型的GCK基因的编码区的第296位碱基由G(鸟嘌呤)突变为A(腺嘌呤);GCK氨基酸突变(也即GCK蛋白变异)为GCK p.W99X,GCK p.W99X是指GCK蛋白第99位氨基酸由色氨酸(W)变异为终止密码子(X)。
在本实施方式中,通过家系研究鉴定出GCK c.296G>A突变,还通过功能研究证实GCK c.296G>A(GCK p.W99X)突变会影响葡萄糖激酶(GCK)活性。在一些示例中,GCK c.296G>A(GCK p.W99X)突变导致GCK活性下降。由此,提供了新的青少年发病的成年型糖尿病的致病基因位点或青少年发病的成年型糖尿病高风险的突变位点,通过检测样本中是否携带GCK c.296G>A(GCK p.W99X)突变,能够辅助筛查青少年发病的成年型糖尿病患者。
在一些示例中,可以使用焦磷酸测序技术、Sanger测序法、NGS测序法、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析、TaqMan探针法中的至少一种对GCK基因变异进行检测。在一些示例中,GCK基因变异可以为GCK c.296G>A。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂可以包括用于扩增GCK基因的引物对和/或用于检测GCK基因变异的探针。由此,能够通过引物对和/或探针对GCK基因变异进行捕获和/或检测。在一些示例中,试剂还可以包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。由此,能够提供反应底物、催化酶和缓冲液,以便于对GCK基因变异进行检测。
在一些示例中,引物对可以根据人基因组中GCK基因编码区第296位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到,探针可以根据人基因组中GCK基因编码区第296位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。由此,引物能够与GCK基因编码区第296位上下游区域的序列结合、探针能够与GCK基因编码区第296位及上下游区域的序列结合,以对GCK c.296G>A进行检测。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,也可以包括对GCK c.296G>A(GCKp.W99X)以外的其他GCK基因突变进行检测的试剂。在一些示例中,其他GCK基因突变可以包括青少年发病的成年型糖尿病目前已知的GCK基因的全部致病突变和疑似致病突变。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,也可以包括对GCK基因以外的其他与青少年发病的成年型糖尿病相关的基因进行检测的试剂。在一些示例中,与青少年发病的成年型糖尿病相关的基因可以包括HNF4A、HNF1A、PDX1、NEUROD1、KCNJ11。由此,能够对青少年发病的成年型糖尿病的相关基因位点均进行检测,有利于对青少年发病的成年型糖尿病进行一次性的、更加全面的筛查。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,也可以包括对其他疾病相关的基因或蛋白进行检测的试剂。例如,也可以包括对遗传性代谢疾病(如家族性高脂血症等)相关的基因或蛋白进行检测的试剂。由此,能够同时对被检测者进行多种疾病的筛查。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂,可以包括使用以下方法中的至少一种来检测GCK蛋白变异(也称氨基酸变异)的试剂:蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。由此,能够对GCK蛋白变异进行检测。在一些示例中,GCK蛋白变异是指GCK p.W99X。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述试剂也可以包括检测GCK p.W99X变异的蛋白之外的GCK蛋白的试剂。例如,也可以包括检测携带其他已知的致病/疑似致病位点的GCK蛋白变异体的试剂。
在一些示例中,蛋白质和肽段的序列分析技术可以包括N末端序列测定的化学方法、Edman法、C末端酶解方法和C末端化学降解法。
在一些示例中,质谱相关的蛋白质检测技术可以包括基质辅助激光解吸电离、飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS)和电子喷雾电离质谱测量法(electro sprayion-ization mass spectrometry,ESI-MS)。
在一些示例中,抗体检测技术可以包括制备可识别不同突变体的抗体法,免疫印迹(western blot)法和酶联免疫吸附(ELISA)法。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述产品的形式,可以为试剂、试剂套装或试剂盒的形式。在一些示例中,产品还可以包括仪器所组成的系统。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述产品也可以包括对GCK基因变异或GCK氨基酸突变进行检测的仪器所组成的系统。例如,产品可以是由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统,或者是由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的模块以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统,或者是由探针、PCR引物对以及连接酶检测反应(LDR)所需要的其他试剂和仪器组成的系统,或者是由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪、进行基因分型的模块和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。由此,能够便于对GCK基因或GCK蛋白进行检测。
在一些示例中,本实施方式所涉及的上述产品也可以包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。由此,能够便于进行基因检测或蛋白检测。
在一些示例中,在本实施方式所涉及的上述应用中,可以通过检测被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种样本对GCK基因或GCK蛋白进行检测。换言之,所检测的样本可以来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种。
在一些示例中,被检测者可以为普通人群、疑似患有青少年发病的成年型糖尿病的个体或青少年发病的成年型糖尿病高风险人群。在一些示例中,疑似患有青少年发病的成年型糖尿病的个体可以为年轻的糖尿病患者(发病年龄低于40岁),尤其是青少年发病的糖尿病患者(发病年龄低于25岁)。在一些示例中,青少年发病的成年型糖尿病高风险人群可以为具有糖尿病家族史尤其是青少年发病糖尿病家族史的人群,例如至少一名直系家属被确诊为青少年发病的糖尿病的个体。
在一些示例中,可以对样本中的GCK基因的胚系突变进行检测。胚系突变又叫生殖细胞突变,是来源于精子或卵子等生殖细胞所携带的突变。在一些示例中,可以通过提取被检测者的gDNA(基因组DNA)并对基因组DNA进行检测,来获得GCK基因的胚系突变结果。
在一些示例中,可以对GCK基因的编码区的第296位碱基进行检测。进一步地,可以对GCK c.296G>A突变进行检测。换言之,可以检测被检测者是否携带GCK c.296G>A突变。
在一些示例中,被检测者的GCK基因中只要存在一个GCK c.296G>A突变,就可以辅助诊断该被检测者为青少年发病的成年型糖尿病患者。换言之,当检测到被检测者的GCKc.296G>A为杂合突变时,可以辅助诊断该被检测者为青少年发病的成年型糖尿病患者。
在本实施方式中,通过GCK c.296G>A这一基因变异作为标志物,能够对青少年发病的成年型糖尿病患者进行筛查,进而提供一种检测样本中GCK基因变异的试剂在制备筛查青少年发病的成年型糖尿病患者的产品中的应用。同样地,还能提供一种检测样本中GCK基因变异的试剂在制备评估青少年发病的成年型糖尿病的易感性的产品中的应用。同样的,还能提供一种检测样本中GCK氨基酸突变的试剂在制备筛查青少年发病的成年型糖尿病的产品中、在制备评估青少年发病的成年型糖尿病的易感性的产品中的应用。
下面,结合实施例进一步对本发明所涉及的上述应用进行详细的解释,但是不应把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[实施例]
本实施例中,对可能涉及到的专业术语的英文简称或符号进行说明,如表1所示。
表1 专业术语说明
英文缩写 | 英文全称 | 中文全称 |
MODY | maturity-onset diabetes of the young | 青少年发病的成年型糖尿病 |
GCK | glucokinase | 葡萄糖激酶 |
HbA1c | hemoglobin A1C | 糖化血红蛋白 |
BMI | body mass index | 体重指数 |
ICA | islet cell antibody | 抗胰岛素细胞抗体 |
IAA | insulin autoantibody | 胰岛素自身抗体 |
GAD | Glutamic Acid Decarboxylase | 谷氨酸脱羧酶 |
GADA | glutamic acid decarboxylase antibody | 谷氨酸脱羧酶抗体 |
OGTT | oral glucose tolerance test | 口服葡萄糖耐量测试 |
HOMA | Homeostasis model assessment | 稳态模型 |
DM | diabetes mellitus | 糖尿病 |
IFG | impaired fasting glucose | 空腹血糖受损 |
SDS-PAGE | sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis | 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
临床案例:
(1)案例信息
MODY2患者共2名成员,包括先证者、先证者母亲。具体地:
先证者,男,4岁8个月,发现血糖升高9天来诊。无意中测空腹指尖血糖6.7mmol/l,到医院就诊,查空腹静脉血6.8mmol/l,糖化血红蛋白6.2%。睡眠活动好,无其它不适。既往身体健康。出生体重3.7kg,生长发育良好。体格检查:身高111.5cm(0~+1SD),体重18.5kg(0~+1SD),体重指数(BMI)14.88kg/m2,发育正常,无畸形。心、肺、腹部查体未见异常,双下肢无水肿。血常规、尿常规、肝肾功、尿酸、血脂、血生化均未见异常。糖化血红蛋白5.9%;ICA、GAD、IAA均为阴性。双眼眼底未见异常。
先证者母亲:女,32岁,4年前妊娠期间发现血糖升高,诊为“妊娠期糖尿病”。妊娠期间采用饮食控制,未应用降糖药物以及胰岛素。产后血糖一直偏高,测空腹血糖6-7mmol/l,餐后2h血糖7-9mmol/l。体格检查:身高158cm,体重48kg,体重指数(BMI)19.23kg/m2,发育正常,无畸形。心、肺、腹部查体未见异常,双下肢无水肿。血常规、尿常规、肝肾功、尿酸、血脂、血生化均未见异常。糖化血红蛋白6%;ICA、GAD、IAA均为阴性。双眼眼底及四肢神经传导速度均未见异常。
(2)样本检测:
a)采集先证者、先证者母亲的空腹外周血,进行糖化血红蛋白、ICA、GAD、IAA的检测;进行口服葡萄糖耐量试验、胰岛素/C肽释放实验;采集先证者、先证者母亲的晨尿进行尿常规、尿白蛋白肌酐比值的检测。
b)提取先证者、先证者父亲、先证者母亲的基因组DNA(gDNA)进行基因检测。具体地,采集先证者及其父母的外周血(2ml,EDTA抗凝)。送北京迈基诺基因科技有限责任公司进行糖尿病Panel基因检测并对先证者的父母进行相应突变位点的一代验证。
本实施例中,所有数据的获取都在符合法律规范、用户同意的基础上,是对数据的合法应用。先证者及家属均同意并且在知情同意书上进行了签字。此外,如未特别指明,本实施例所用试剂或仪器均为市售。
(3)检测结果:
图1是示出了本发明实施例所涉及的先证者及其父母基因测序峰图。图2是示出了本发明实施例所涉及的先证者的家系图。如图1和图2所示,先证者及其母亲存在GCK杂合突变GCK c.296G>A(p .W99X),I-2(先证者母亲)、II-1(先证者)均携带共同的突变(GCKc.296G>A(p .W99X)),且为杂合子,先证者父亲DNA测序未发现该基因突变。本实施例中,发现的杂合突变(GCK c.296G>A)的携带情况与携带者的临床表型相符,因此推测该突变可能会削弱GCK的活性,其可能是MODY2的致病突变。为了进一步研究该突变的致病性,后续进行了功能研究。
功能研究:
(1)在发现GCK基因新的突变位点(GCK c.296G>A)后,对GCK c.296G>A进行功能预测,具体地:
利用NCBI数据库下载多个物种的蛋白质序列,利用序列对比网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/)进行多个物种的序列对比。图3是示出了本发明实施例所涉及的GCK在不同物种间的氨基酸序列对比图。如图3所示,多个氨基酸序列比对表明p.W99在不同物种间是保守的。因此,预计该位点上的突变会导致GCK蛋白功能受影响。
图4是示出了本发明实施例所涉及的野生型和突变型GCK蛋白的三维结构预测图。其中,图4中的(a)部分是GCK野生型的,图4中的(b)部分是GCK突变型的,突变位点为GCKc.296G>A(p .W99X)。如图4所示,三维结构预测结果显示GCK突变型失去了完整的结构,失去了与葡萄糖的结合位点。因此,预计该突变会导致GCK蛋白功能受影响。
(2)对新发现的GCK突变体进行功能分析:
整体流程包括:构建质粒、载体构建、大肠杆菌表达、蛋白质纯化、对提纯后的蛋白质进行鉴定、通过采用己糖激酶检测试剂盒测定葡萄糖激酶(GCK)活性。具体地,包括:
1)质粒购自诺贝希生物公司,使用Mut Express® MultiS Fast MutagenesisKit V2(Vazyma #C215)进行点突变。重组产物转化。挑单克隆,测序。摇菌提取质粒。
2)载体构建: 将人GCK编码序列亚克隆到pET41a载体中,用于大肠杆菌细胞表达。具体的序列信息包括:(pET41a-His-Flag-TEV-GCK FL;pET41a-His-Flag-TEV-GCK(1-98))
3)大肠杆菌表达: 用pET41a载体转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃的LB培养基中生长至A600为0.8,然后将温度降至18℃,并加入IPTG至终浓度为0.4mM。诱导后16-24小时,收获细胞。
4)蛋白质纯化的具体步骤如下:
1.将细胞颗粒重悬于缓冲液A(25mM Na HEPES,pH 7.2,50mM NaCl,1mM TCEP,10%甘油,PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中。
2.使用超声波仪裂解细胞,并以13000转/分的转速离心以去除细胞碎片。
3.将上清液装载到Anti-Flag柱上。用缓冲液B(25mM Na HEPES,pH 7.2,50mMNaCl,1mM TCEP,10%甘油)洗涤Anti-Flag柱,并用补充有100μg/ml Flag肽的缓冲液B洗脱。
4.用TEV蛋白酶以1:10(w/w)的比例切割来去除洗脱蛋白质的N-末端的His-Flag标签。
5.在4℃下孵育过夜后,将样品置于Ni柱中以去除TEV蛋白酶和His-Flag标签。
6.用缓冲液C(25mM Na HEPES,pH 7.2,50mM NaCl,1mM TCEP)通过Superdex 200/75凝胶过滤进行进一步纯化。
7.使用离心浓缩器以30kDa为截点值浓缩最终纯化的样品,并通过分光光度计、SDS-PAGE和SEC-HPLC进行鉴定。
5)对提纯后的蛋白质进行鉴定:
图5是示出了本发明实施例所涉及的野生型GCK蛋白电泳及色谱结果图。图6是示出了本发明实施例所涉及的突变型GCK蛋白电泳及色谱结果图。重组蛋白采用考马斯亮蓝R250染色进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析,结果如图5中的(a)部分、图6中的(a)部分所示。采用高效液相色谱法(SEC-HPLC)进行野生型及突变型蛋白质的纯度分析,结果如图5中的(b)部分、图6中的(b)部分所示。
6)按照己糖激酶检测试剂盒(SIGMA-Aldrich)说明书的具体检测步骤及试剂盒中的葡萄糖激酶(GCK)活性的计算方法检测酶的活性:
利用比色法测定并计算出野生型及突变型葡萄糖激酶(GCK)活性。图7是示出了本发明实施例所涉及的反应时间5min(分钟)时的NADH标准品曲线图。表2表示反应时间为5min时各组样品的吸光度值。
表2 反应时间为5min时各组样品的吸光度值
图7可以看到NADH标准品的吸光度值符合线性曲线,R2大于0.98,线性较好。表2可以看到反应时间为5min时,野生型GCK蛋白的吸光度值在阳性对照组的吸光度值范围内,而突变型GCK蛋白质的吸光度值在空白对照组的吸光度值范围内。
图8是示出了本发明实施例所涉及的反应时间25min时的NADH标准品曲线图。图8可以看到NADH标准品的吸光度值符合线性曲线,R2大于0.98,线性较好。表3表示反应时间为25min时各组样品的吸光度值。从表3可以看到,即使随着时间延长,野生型GCK蛋白的吸光度值在阳性对照组的吸光度值范围内,而突变型GCK蛋白质的吸光度值在空白对照组的吸光度值范围内。
表3 反应时间为25min时各组样品的吸光度值
综上,通过检测可以得知突变型GCK完全丧失了酶活性。由此可见,GCK c.296G>A突变会损害GCK的活性。
临床症状随访:
本实施例中对两个病例的临床检查及随访情况如表4、表5、表6、表7、图9、图10所示,图9是示出了本发明实施例所涉及的先证者的胰岛素/C肽曲线,图10是示出了本发明实施例所涉及的先证者母亲的胰岛素/C肽曲线。
HOMA-IR是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标,正常个体的HOMA-IR指数是1,胰岛素抵抗水平越高,HOMA-IR的指数越高。利用公式:空腹血糖水平(mmol/l)×空腹胰岛素水平(uIU/ml)÷22.5计算HOMA-IR指数。
HOMA-β是用于评价个体胰岛β细胞功能的指标,正常个体的HOMA-β指数是100%,胰岛β细胞功能降低,则该数值降低;胰岛β细胞功能增强,则该数值升高。利用公式:20×空腹胰岛素水平(uIU/ml)÷(空腹血糖水平(mmol/l)-3.5)(%)计算HOMA-β指数。
携带GCK基因突变的先证者的OGTT结果如表4所示,显示为IFG(空腹血糖受损)。
表4 先证者的OGTT结果
时间 | C肽(ng/ml)(0.81-3.85) | 胰岛素(uIU/ml)(3-25) | 血糖(mmol/l)(3.9-6.1) |
0h | 0.33 | 2.53 | 6.16 |
1h | 1.79 | 12.43 | 9.59 |
2h | 0.8 | 4.27 | 7.18 |
3h | 0.32 | 1.22 | 5.67 |
先证者的胰岛素/C肽曲线如图9所示,从图9和表4可以看出,空腹C肽水平低于正常参考值范围,在葡萄糖刺激后C肽水平可升高,1h(小时)达到高峰,大约是空腹时的5.4倍,并在3h后恢复至基础水平;另外,空腹胰岛素也低于正常参考值范围,在葡萄糖刺激后1h,胰岛素上升至高峰,大约是空腹时的4.9倍,并在3h后恢复到基础水平。
先证者的临床随访情况如表5所示。仅通过饮食控制,患者一直保持轻度空腹高血糖状态,糖化血红蛋白都在正常范围内,并没有出现血糖控制的恶化。
表5 先证者的随访检查结果
时间 | 空腹血糖(mmol/l)(3.9-6.1) | 空腹胰岛素(uIU/ml)(3-25) | 空腹C肽(ng/ml)(0.81-3.85) | HOMA-IR | HOMA-β(%) | 糖化血红蛋白(%)(4-6) | 血酮体 | 尿白蛋白肌酐比值 |
2021/5/13 | 6.16 | 2.53 | 0.33 | 0.69 | 19.02 | 5.9 | / | / |
2022/7/18 | 4.91 | 0.91 | 0.19 | 0.20 | 12.91 | 6.4 | 阳性 | / |
2023/2/3 | 6.26 | 0.99 | 0.83 | 0.28 | 7.17 | 6.2 | 弱阳性 | 0.01 |
携带相同GCK基因突变的先证者母亲的OGTT结果如表6所示,显示为糖尿病。
表6 先证者母亲的OGTT结果
时间 | C肽(ng/ml)(0.81-3.85) | 胰岛素(uIU/ml)(3-25) | 血糖(mmol/l)(3.9-6.1) |
0h | 0.67 | 2.65 | 6.29 |
1h | 3.77 | 25.14 | 13.26 |
2h | 5.66 | 30.13 | 13.3 |
3h | 3.34 | 11.71 | 10.14 |
先证者母亲的胰岛素/C肽曲线如图10所示,从图10和表6可以看出,先证者母亲的空腹C肽水平低于正常参考值范围,葡萄糖刺激后C肽水平可升高,在2h达到高峰,大约是空腹时的8.4倍,并且3h时依然没有恢复至基础水平。另外,空腹胰岛素也低于正常参考值范围,在葡萄糖刺激后2h,胰岛素上升至高峰,大约是空腹时的11.4倍,并且在3h时依然没有恢复到基础水平。
先证者母亲的临床随访情况如表7所示。仅通过饮食控制,患者保持长期空腹高血糖的状态,糖化血红蛋白控制在6.5%左右,没有出现血糖控制的恶化。
表7 先证者母亲的随访检查结果
综上,根据实施例的上述研究及研究结果显示,GCK c.296G>A突变或GCK p .W99X突变会损害GCK的酶活性。GCK c.296G>A突变或GCK p .W99X突变是本实施例中的MODY2/MODY2家系的致病突变。本实施例发现GCK c.296G>A(p .W99X)是新的MODY/MODY2的致病基因,且呈常染色体显性遗传。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明,但是可以理解,上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化,这些变形和变化均落入本公开的范围内。
Claims (10)
1. 一种检测GCK基因变异或蛋白变异的试剂在制备筛查青少年发病的成年型糖尿病患者的产品的应用,其特征在于,所述GCK基因变异为GCK c.296G>A,所述GCK蛋白变异为GCK p.W99X。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂包括用于扩增GCK基因的引物对和/或用于检测所述GCK基因变异的探针。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述引物对根据人基因组中GCK基因编码区第296位碱基的上下游的核苷酸序列进行设计得到,所述探针根据人基因组中GCK基因编码区第296位碱基及其上下游的核苷酸序列进行设计得到。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂包括使用以下方法中的至少一种来检测所述GCK蛋白变异的试剂:蛋白质和肽段的序列分析技术、质谱相关的蛋白质检测技术、抗体检测技术。
6. 根据权利要求1或5所述的应用,其特征在于,所述试剂包括可识别具有GCK p.W99X突变的GCK蛋白的抗体。
7.根据权利要求2或5所述的应用,其特征在于,所述产品还包括核酸提取试剂和/或蛋白质提取试剂。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,检测的样本来自于被检测者的外周血、唾液、组织样本中的至少一种,且所述GCK基因变异是指GCK基因的胚系变异,所述GCK蛋白变异是指GCK蛋白的胚系变异。
9.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述GCK基因变异为杂合突变,所述GCK蛋白变异为杂合突变。
10. 一种检测GCK基因变异或蛋白变异的试剂在制备评估青少年发病的成年型糖尿病易感性的产品的应用,其特征在于,所述GCK基因变异为GCK c.296G>A,所述GCK蛋白变异为GCK p.W99X。
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- 2023-07-13 CN CN202310860198.XA patent/CN116837091A/zh active Pending
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