CN112176058A - 检测肿瘤生物标志物的探针库、方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种检测肿瘤生物标志物的探针库，其包括针对人类全外显子的蛋白编码区设计的野生型探针、针对第一特定基因的全长序列设计的野生型探针、针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针、针对第二特定基因的突变位点设计的突变型探针以及针对微卫星不稳定性位点设计的野生型探针，第一特定基因包括EGFR、MET、ERBB2、BRCA1、BRCA2、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2和AR，插入和/或缺失突变位点包括表1所示的位点，第二特定基因包括如表2所示的基因，微卫星不稳定性位点包括NR21、NR25、NR27、BAT25和BAT26。根据本公开能够提供一种能够提高准确性且能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定的检测肿瘤生物标志物的探针库。
Description
技术领域
本公开特别涉及一种检测肿瘤生物标志物的探针库、方法及试剂盒。
背景技术
肿瘤的免疫疗法是一种新型的肿瘤治疗手段，但仅10％-30％的肿瘤患者可以从该疗法中获益，而通过合适的生物标志物能够高效筛选出获益患者，比如肿瘤突变负荷(TMB)和微卫星不稳定性(MSI)是已被确认的免疫疗法的生物标志物。
肿瘤突变负荷代表蛋白编码区的非同义突变分布的密度，理论上，肿瘤突变负荷越高，肿瘤细胞产生的新抗原的种类和数量越多，被免疫系统识别的概率越高，免疫检查点抑制剂激活机体自身的抗肿瘤免疫应答反应后，杀伤这些肿瘤细胞的概率越大。微卫星不稳定性是指和正常组织细胞相比，肿瘤组织的基因组微卫星(DNA基因组中2-6个核苷酸的简单重复序列，又称短串联重复)长度发生改变。
目前，对于肿瘤突变负荷的检测通常采用全外显子组测序法，而对于传统的微卫星不稳定性检测通常采用的是多重PCR方法，因此需要通过不同平台分别进行检测，无法一次性检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性。另外，在全外显子组测序法中，肿瘤突变负荷的检测通过针对全外显子组上的蛋白编码区的非同义突变对肿瘤突变负荷进行定性，然而全外显子组测序经常存在覆盖不均一等问题，导致肿瘤突变负荷检测的准确性不足。
发明内容
本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种能够提高准确性且能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定的检测肿瘤生物标志物的探针库、方法及试剂盒。
为此，本公开第一方面提供了一种检测肿瘤生物标志物的探针库，所述肿瘤生物标志物包括肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性，所述探针库包括多条捕获探针，其包括针对人类全外显子的蛋白编码区设计的野生型探针、针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针、针对第一特定基因的全长序列设计的野生型探针、针对第二特定基因的突变位点设计的突变型探针以及针对微卫星不稳定性位点设计的野生型探针，所述第一特定基因包括EGFR、MET、ERBB2、BRCA1、BRCA2、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2和AR，所述插入和/或缺失突变位点包括表1所示的位点，所述第二特定基因包括如表2所示的基因，所述微卫星不稳定性位点包括NR21、NR25、NR27、BAT25和BAT26，并且在所述多条捕获探针的上游设置有第一附加序列，在所述多条捕获探针的下游设置有与所述第一附加序列不同的第二附加序列，所述第一附加序列和所述第二附加序列均具有与通用引物结合的位点。
在本公开中，探针库在外显子组探针的基础上增加了针对第一特定基因的全长序列设计的野生型探针、针对第二特定基因的突变位点设计的突变型探针和针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针，在这种情况下，既能够增加探针库的检测位点，也能够提高探针库对于突变位点的捕获效率，从而能够提高覆盖均一性，并有利于提高检测的准确性。另外，探针库还包括针对微卫星不稳定性位点设计的野生型探针，由此，探针库能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性。
另外，在本公开第一方面所涉及的探针库中，可选地，所述第一附加序列为TCGTCGGCAGCGT，所述第二附加序列为CCGAGCCCACGAGAC。由此，多条捕获探针能够进行扩增。
另外，在本公开第一方面所涉及的探针库中，可选地，在所述探针库中，针对所述插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针的探针密度最大。由此，能够进一步提高探针库对插入和/或缺失突变的捕获效率。
另外，在本公开第一方面所涉及的探针库中，可选地，所述第二特定基因的突变位点包括位于蛋白编码区的第一类突变位点和位于非蛋白编码区的第二类突变位点。由此，探针库能够检测更多的突变位点，从而能够有利于提高肿瘤突变负荷检测的准确性。
另外，在本公开第一方面所涉及的探针库中，可选地，所述第一类突变位点包括表3所示的突变位点，所述第二类突变位点包括CD74-exon7-ROS1-exon33融合、TPM3-exon7-ROS1-exon33融合、EML4-exon13-ALK-exon20融合、EML4-exon6-ALK-exon20融合、EML4-exon18-ALK-exon20融合、RANBP2-exon18-ALK-exon20融合、EML4-exon20-ALK-exon20融合、IGH-chr14-exon1-MYC-chr8-exon2融合、KIF5B-exon16-RET-exon12融合、KIF5B-exon15-RET-exon12融合。由此，能够检测更多有意义的突变位点。
另外，在本公开第一方面所涉及的探针库中，可选地，所述微卫星不稳定性位点包括如表4所示的位点。由此，能够有助于提高微卫星不稳定性检测的准确性。
本公开第二方面提供了一种检测肿瘤生物标志物的方法，其特征在于：(a)准备样本DNA并构建DNA文库；(b)将所述DNA文库与上述任一项所述的探针库进行杂交以获得杂交文库；并且(c)扩增所述杂交文库以获得捕获文库，并对所述捕获文库进行测序，以检测肿瘤生物标志物。在这种情况下，利用该探针库进行肿瘤生物标志物检测，能够提高准确性且同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定。
另外，在本公开第二方面所涉及的方法中，可选地，所述样本DNA提取自人源样本，并在步骤(b)中，使用人源性DNA封闭剂对人类基因组重复序列进行封闭。由此，能够封闭人类基因组重复序列，减少人类基因组重复序列与目标基因的结合。
另外，在本公开第二方面所涉及的方法中，可选地，步骤(a)中，所述样本DNA经片段化处理，接着进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行扩增获得所述DNA文库；并且在步骤(b)中，使用接头封闭剂对所述测序接头进行封闭。由此，能够封闭测序接头序列，减少测序接头与目标基因的结合。
本公开第三方面提供了一种检测肿瘤生物标志物的试剂盒，其包括上述任一项所述的探针库。由此，能够提高准确性且同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定。
根据本公开能够提供一种能够提高准确性且能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定的检测肿瘤生物标志物的探针库、方法及试剂盒。
附图说明
图1是示出了本公开的示例所涉及的检测肿瘤生物标志物的方法的流程示意图。
具体实施方式
以下，参考附图，详细地说明本公开的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。
在本公开中，检测肿瘤生物标志物的探针库可以简称为“探针库”，检测肿瘤生物标志物的方法可以简称为“检测方法”，检测肿瘤生物标志物的试剂盒可以简称为“试剂盒”。另外，肿瘤生物标志物可以包括肿瘤突变负荷(TMB)和微卫星不稳定性(MSI)。
本公开所涉及的探针库可以利用捕获探针(例如包括野生型探针和突变型探针)捕获目的基因。另外，目的基因可以位于全外显子区域、非蛋白编码区域等。此外，目的基因可以包括与免疫治疗相关的基因、与癌症发生相关的基因、与微卫星不稳定性相关的基因等。
本公开所涉及的探针库可以包括针对全外显子区域设计的捕获探针以及全外显子以外的非蛋白编码区设计的捕获探针。
在一些示例中，探针库中的捕获探针可以将目的基因及其两侧的侧翼序列作为目标区域。在这种情况下，能够设计与目标区域杂交的捕获探针以捕获目的基因。在另一些示例中，侧翼序列可以为目的基因两端5bp-30bp范围的序列。由此，能够提高探针的特异性。
在一些示例中，目的基因的基因序列可以通过数据库、公开报道等方式来获取。例如，可以根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列为参考，获得全外显子区域；可以根据美国FDA批准的药物信息，美国NCCN发布的恶性肿瘤临床实践指南，癌症体细胞突变目录(COSMIC)涵盖的与癌症相关的体细胞突变，PharmGKB数据库提供的基因和药物间的关联及基因SNP与化疗药物的关联信息，与疾病相关的人类基因组变异数据库ClinVar以及海普洛斯自建数据库以及针对癌症治疗的文献和报道，整合筛选与免疫治疗、癌症发生、微卫星不稳定性等相关的基因序列，以确定全外显子以外的非蛋白编码区的目的基因等。
本实施方式所涉及的检测肿瘤生物标志物的探针库可以包括多条捕获探针。在一些示例中，探针库可以包括野生型探针和突变型探针。
在一些示例中，探针库可以包括针对人类全外显子的蛋白编码区设计的野生型探针。由此，能够特异性捕获蛋白编码区的序列。也就是说，野生型探针可以包括针对人类全外显子的蛋白编码区设计的野生型探针。
在一些示例中，探针库可以包括针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针。由此，能够提高插入和/或缺失突变序列的捕获效率。也就是说，野生型探针可以包括针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针。
在一些示例中，插入和/或缺失突变位点可以为长片段插入和/或缺失突变。在另一些示例中，插入和/或缺失突变位点可以包括如表1所示的突变位点。另外，表1与表a相同。
表1
在一些示例中，与表1中的位点相应的变异基团的序列如SEQ ID NO︰1-SEQ IDNO︰218所示。在另一些示例中，针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针可以为针对如SEQ ID NO︰1-SEQ ID NO︰218所示的变异基团设计的野生型探针。
在一些示例中，探针库可以包括针对第一特定基因的全长序列设计的野生型探针。由此，能够特异性捕获第一特定基因的序列。换言之，野生型探针可以包括针对第一特定基因的全长序列设计的野生型探针。
在一些示例中，第一特定基因可以包括EGFR、MET、ERBB2、BRCA1、BRCA2、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2和AR。
在一些示例中，探针库可以包括针对第二特定基因的突变位点设计的突变型探针。由此，能够提高针对第二特定基因的突变位点的捕获效率。换言之，突变型探针可以包括针对第二特定基因的突变位点设计的突变型探针。
在一些示例中，第二特定基因可以包括常见基因、肿瘤热点基因等。在另一些示例中，第二特定基因可以包括如表2所示的基因。另外，表2与表b相同。
表2
在一些示例中，第二特定基因的突变位点可以包括位于蛋白编码区的第一类突变位点和位于非蛋白编码区的第二类突变位点。由此，探针库能够检测更多的突变位点，从而能够有利于提高肿瘤突变负荷检测的准确性。
在一些示例中，第一类突变位点可以包括表3所示的突变位点。由此，能够检测更多有意义的突变位点(例如致病突变的位点、具有用药指导意义的突变位点等)。另外，表3与表c相同。
表3
在一些示例中，第二类突变位点可以为融合突变。在另一些示例中，第二类突变位点可以包括发生在内含子区域的融合突变，即融合断点位于内含子位置。
另外，在一些示例中，第二类突变位点可以包括ROS1基因融合、ALK基因融合、MYC基因融合、RET基因融合，例如CD74-ROS1融合、TPM3-ROS1融合、EML4-ALK融合、RANBP2-ALK融合、IGH-MYC融合、KIF5B-RET融合等。
在一些示例中，ROS1基因融合可以包括CD74-exon7-ROS1-exon33融合(CD74基因的6号外显子与ROS1基因的34号外显子融合)和TPM3-exon7-ROS1-exon33融合。另外，ALK基因融合可以包括EML4-exon13-ALK-exon20融合、EML4-exon6-ALK-exon20融合、EML4-exon18-ALK-exon20融合、RANBP2-exon18-ALK-exon20融合和EML4-exon20-ALK-exon20融合。在另一些示例中，MYC基因融合可以包括IGH-chr14-exon1-MYC-chr8-exon2融合。此外，RET基因融合可以包括KIF5B-exon16-RET-exon12融合和KIF5B-exon15-RET-exon12融合。
在一些示例中，探针库可以针对微卫星不稳定性位点设计的野生型探针。由此，能够捕获含微卫星不稳定性位点的序列。换言之，野生型探针可以针对微卫星不稳定性位点设计的野生型探针。
在一些示例中，微卫星不稳定性位点可以包括常用的微卫星不稳定性位点。在另一些示例中，微卫星不稳定性位点可以包括NR21、NR25、NR27、BAT25和BAT26。
在一些示例中，微卫星不稳定性位点可以如表4所示的位点。由此，能够有助于提高微卫星不稳定性检测的准确性。另外，表4与表d相同。
表4
在一些示例中，如上所述，探针库可以包括多条捕获探针。在一些示例中，捕获探针可以以叠瓦式设计，并且各条捕获探针之间可以具有重叠部分。由此，能够有利于提高探针库的覆盖度。另外，捕获探针之间的重叠部分可以为5至20个碱基。例如，捕获探针之间的重叠部分可以为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、15个、18个或20个碱基。
在一些示例中，针对各个目标区域设计的捕获探针以叠瓦式设计并通过叠式探针筛选算法来确定序列。由此，能够提高探针库的覆盖均一性，从而有利于提高检测的准确性。
在一些示例中，各条捕获探针的长度可以为50至300bp。由此，能够有利于捕获探针更好地捕获基因。例如，各条捕获探针的长度可以为50bp、55bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、120bp、150bp、180bp、200bp、250bp或300bp。
在一些示例中，各个捕获探针的3'末端可以标记有生物素。由此，能够有利于后续富集目的片段。在另一些示例中，生物素可以标记在3'末端的倒数第1位至第5位的至少任意一个位置。由此，能够减少生物素的标记对捕获探针的影响。
在一些示例中，捕获探针的序列可以通过Nimble Design或Hyper Design软件来设计。
在一些示例中，捕获探针的上游和下游可以分别设置有附加序列。也就是说，捕获探针的5'和3'端可以分别设置有附加序列。具体而言，在捕获探针的上游可以设置有第一附加序列，在捕获探针的下游可以设置有第二附加序列。另外，通过附加序列能够对捕获探针进行扩增。
在一些示例中，第一附加序列可以与第二附加序列不同。在另一些示例中，各条捕获探针的上游可以均设置有相同的附加序列。另外，各条捕获探针的下游可以均设置有相同的附加序列。
在一些示例中，捕获探针的附加序列可以与通用引物结合，从而能够进行扩增。另外，在一些示例中，第一附加序列和第二附加序列可以均具有与通用引物结合的位点。
在一些示例中，附加序列可以为非真核生物序列(或非人源序列)。由此，能够减少附加序列在捕获探针进行捕获时的干扰。在另一些示例中，附加序列的具体序列可以源于细菌或人为设计。
在一些示例中，第一附加序列可以为TCGTCGGCAGCGT，第一附加序列可以为CCGAGCCCACGAGAC。由此，多条捕获探针能够进行扩增。在另一些示例中，捕获探针可以利用通用引物进行扩增。另外，通用引物的上游引物序列可以为AATGATACGGCGACCACCG AG，下游引物序列可以为CAAGCA GAAGACGGCATACGAGA。
在一些示例中，在多条捕获探针的上游可以设置有第一附加序列，在多条捕获探针的下游可以设置有第二附加序列。
在一些示例中，在探针库中，针对各个目标区域设计的捕获探针的数量可以在50条至500条之间，例如可以为50条、100条、150条、200条、250条、300条、350条、400条、450条、500条等。
在一些示例中，在探针库中，针对不同目标区域设计的捕获探针的探针密度可以是不同的。由此，能够有利于提高覆盖的均一性。
在一些示例中，在探针库中，可以根据针对各个目标区域设计的捕获探针的捕获效率进行探针密度平衡。例如，可以增加捕获效率低的目标区域的捕获探针的探针密度。由此，能够提高覆盖的均一性。
在一些示例中，在探针库中，针对各个目标区域设计的捕获探针根据探针密度可以分类为基期探针和富集探针。在另一些示例中，令基期探针的探针密度为1倍(1X)，富集探针的探针密度可以为基期探针的探针密度的2至5倍，比如2倍(2X)、3倍(3X)、4倍(4X)、5倍(5X)等。
在一些示例中，基期探针的探针密度可以为2至6条。例如，基期探针的探针密度可以为2条、3条、4条、5条或6条。
在一些示例中，基期探针可以包括针对野生型设计的捕获探针，富集探针可以包括针对插入和/或缺失突变位点设计的捕获探针、针对第二类突变位点设计的捕获探针。
在一些示例中，在探针库中，针对部分目标区域设计的捕获探针的探针密度可以如表5所示。
表5
在一些示例中，在探针库中，针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针的探针密度最大。由此，能够进一步提高探针库对插入和/或缺失突变的捕获效率。
在本实施方式中，探针库在外显子组探针的基础上增加了针对第一特定基因的全长序列设计的野生型探针、针对第二特定基因的突变位点设计的突变型探针和针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针，在这种情况下，既能够增加探针库的检测位点，也能够提高探针库对突变位点的捕获效率，从而能够提高覆盖均一性，并有利于提高检测的准确性。
另外，探针库还包括针对微卫星不稳定性位点设计的野生型探针，由此，探针库能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性。此外，多条捕获探针的上游和下游分别具有与通用引物结合的位点的第一附加序列和第二附加序列，由此能够利用引物对多条捕获探针进行扩增，从而能够有助于降低成本。
在本实施方式中，利用探针库进行捕获并测序，能够检测基因变异(例如，点突变、基因片段插入/缺失、拷贝数变化、融合/基因重排等)，从而能够计算肿瘤突变负荷和判断微卫星不稳定性。
以下，结合图1，详细地描述本实施方式所涉及的检测肿瘤生物标志物的方法。
在一些示例中，如图1所示，检测肿瘤生物标志物的方法可以包括准备样本DNA并构建DNA文库(步骤S10)。
在一些示例中，在步骤S10中，样本DNA可以经由DNA提取而获得。在另一些示例中，样本DNA可以提取自人源样本。例如。人源样本可以包括体液、活检组织、石蜡包埋组织和血细胞等组织或细胞。另外，样本DNA可以提取自肿瘤样本。
在另一些示例中，在步骤S10中，样本DNA可以为从活检组织、石蜡包埋组织等组织或细胞中提取的全基因组DNA。
在一些示例中，在步骤S10中，可选地，样本DNA经片段化处理,接着可以进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行PCR扩增以获得DNA文库。
在一些示例中，在步骤S10中，可以采用物理方法(比如超声破碎仪)、生物方法(比如片段化酶)进行片段化处理。另外，片段化处理后样本DNA的长度可以为100至300bp。
在一些示例中，在步骤S10中，样本DNA可以为从体液(例如血浆、脑脊液、羊水等)中提取的游离DNA。在另一些示例中，在步骤S10中，若样本DNA为游离DNA，则DNA文库可以由样本DNA进行连接测序接头并进行扩增而获得。
在一些示例中，在步骤S10中，可以包含纯化处理。例如，加A尾之前可以经过纯化处理、连接测序接头之前可以经过纯化处理、扩增之前可以经过纯化处理等。在另一些示例中，纯化处理可以为磁珠纯化。
在一些示例中，测序接头的第一核苷酸单链序列可以为3’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-5’，第二核苷酸单链序列可以为5’PHO-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。
在一些示例中，在步骤S10中，还可以包括准备对照样本。在另一些示例中，对照样本可以提取自正常人体组织样本或人血液白细胞样本。
在一些示例中，如图1所示，检测肿瘤生物标志物的方法可以包括将DNA文库与上述探针库进行杂交以获得杂交文库(步骤S20)。
在一些示例中，在步骤S20中，DNA文库可以与探针库进行杂交反应以形成杂交文库。另外，探针库中的捕获探针能够捕获DNA文库中的目的片段，从而能够有利于去除未结合的非目的片段，富集目的片段。此外，关于检测方法中探针库的具体描述可以参照上文探针库的描述。
在本实施方式中，利用上述探针库能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性，并且能够提高检测灵敏度。
在一些示例中，在步骤S20中，在杂交反应前，DNA文库可以经过预处理。具体而言，DNA文库可以先加入人源性DNA封闭剂和接头封闭剂混合并进行蒸干处理，接着可以加入杂交缓冲液和杂交组分混合并进行变性处理。
在一些示例中，在步骤S20中，DNA文库可以通过人源性DNA封闭剂对人类基因组重复序列进行封闭。也就是说，在步骤S20中，可以使用人源性DNA封闭剂对人类基因组重复序列进行封闭。
在一些示例中，人源性DNA封闭剂可以为人源性反义寡核苷酸水溶液。在另一些示例中，人源性反义寡核苷酸的序列可以为人Cot-1 DNA。
在一些示例中，在步骤S20中，DNA文库可以通过接头封闭剂对测序接头进行封闭。也就是说，在步骤S20中，可以使用接头封闭剂对测序接头进行封闭。
在一些示例中，接头封闭剂可以为根据测序接头序列设计的反义寡核苷酸水溶液。在另一些示例中，根据测序接头序列设计的反义寡核苷酸的序列可以为AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT和CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCA GACGTGTGCTCTTCCGATC。
在一些示例中，在步骤S20中，杂交缓冲液可以包括Tris-HCl的工作液浓度可以为50-500mM、氯化钠的工作液浓度可以为50-500mM和乙二胺四乙酸二钠盐的工作液浓度可以为50-500mM。
在一些示例中，在步骤S20中，杂交组分可以为dNTP。其中，dNTP可以为dTTP、dATP、dGTP和dCTP的等量混合物。
在一些示例中，在步骤S20中，DNA文库结束变性处理后，可以与探针库混合并进行杂交反应以形成杂交反应产物。在另一些示例中，杂交反应产物经过洗脱纯化而形成杂交文库。
在一些示例中，可以利用亲和素处理的磁珠对杂交反应产物进行纯化。在这种情况下，亲和素能够与生物素专一结合，从而达到纯化作用。
在一些示例中，在步骤S20中，可以利用强洗脱缓冲液、第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液、磁珠清洗缓冲液和链霉亲和素磁珠来进行洗脱纯化。其中，磁珠清洗缓冲液可以用于清洗链霉亲和素磁珠。另外，强洗脱缓冲液和第一缓冲液可以经过预热处理(例如恒温金属浴预热至47℃)。
具体而言，洗脱纯化的步骤可以为：将杂交反应产物与链霉亲和素磁珠混合并在特定温度(例如47℃)下反应一段时间(例如45分钟)，然后去上清；接着与第一缓冲液混合并进行磁珠吸附，再去上清；然后与强洗脱缓冲液混合并进行磁珠吸附，再去上清；接着前两步重复一次(与第一缓冲液混合并进行磁珠吸附，再去上清；然后与强洗脱缓冲液混合并进行磁珠吸附，再去上清)；接着与第一缓冲液混合并进行磁珠吸附，再去上清；然后与第二缓冲液混合并进行磁珠吸附，再去上清；接着与第三缓冲液混合并进行磁珠吸附，再去上清；最后加入无核酸酶水。
在一些示例中，在步骤S20中，磁珠清洗缓冲液可以包括乙二胺四乙酸二钠盐的工作液浓度可以为50-500mM和Tris-HCl的工作浓度可以为50-500mM。强洗脱缓冲液可以包括Tris-HCl的工作液浓度可以为10-5000mM和乙二胺四乙酸二钠盐的工作液浓度可以为10-5000mM。
在一些示例中，在步骤S20中，第一缓冲液可以包括Tris-HCl的工作液浓度可以为50-500mM和异硫氢酸胍的工作液浓度可以为50-500mM。第二缓冲液可以包括NaCl的工作液浓度可以为50-500mM和异硫氢酸胍的工作液浓度可以为50-500mM。第三缓冲液可以包括异硫氢酸胍的工作液浓度可以为50-500mM和乙二胺四乙酸二钠盐的工作液浓度可以为50-500mM。
在一些示例中，如图1所示，检测肿瘤生物标志物的方法可以包括扩增杂交文库以获得捕获文库，并对捕获文库进行测序，以检测肿瘤生物标志物(步骤S30)。
在一些示例中，在步骤S30中，可以将杂交文库与扩增反应液和扩增引物混合并进行PCR扩增以获得捕获文库。在另一些示例中，在步骤S30中，捕获文库可以经过纯化处理而获得。例如，捕获文库可以经由磁珠纯化处理而获得。
在一些示例中，扩增反应液可以包括氯化钾的工作液浓度可以为10-50mM、硫酸铵的工作液浓度可以为20-100mM、高保真DNA聚合酶的工作液浓度可以为0.5-10U、TS-UNG的工作液浓度可以为0.5-10U、RNase Inhibitor的工作液浓度可以为0.5-10U、Tris-HCl的工作液浓度可以为10-100mM和氯化镁的工作液浓度可以为5-50mM。
在一些示例中，扩增引物的上游引物序列可以为AATGATACGGC GACCACCGAG，上游引物序列可以为CAAGCAGAAGACGGCATA CGAGA。其中，扩增引物的上游引物的工作浓度可以为0.2-2mM，下游引物的工作浓度可以为0.2-2mM。
在一些示例中，在步骤S30中，可以将捕获文库进行测序，并对测序结果进行数据分析，以获取基因变异的情况。另外，基因变异可以包括点突变、基因片段插入/缺失、拷贝数变化、融合/基因重排。
在一些示例中，在步骤S30中，对样本DNA的测序深度可以在500×至800×，对对照样本的测序深度可以为100×至200×。
在一些示例中，在步骤S30中，数据分析可以包括对测序结果去除低质量数据、对数据进行剪裁以及去除polyN误差信息。由此，能够有利于提高测序结果的准确性。
在一些示例中，数据分析可以包括去除mapping质量为Q10的数据、剪裁去除reads最后8-10nt以及去除数据中连续20个以上的polyN数据。由此，能够有利于进一步提高测序结果的准确性。
在一些示例中，不合格数据还可以包括连续20个以上同一碱基的polyN数据。在这种情况下，可以剔除产生错误的数据，进一步提高结果的准确性。
在一些示例中，在步骤S30中，可以根据基因变异情况获得肿瘤标志物检测结果。例如，可以根据基因变异的情况判断微卫星不稳定性，计算肿瘤负荷突变。
在一些示例中，对照样本可以以与样本DNA相同的方式进行检测。由此，能够利用对照样本和样本DNA的测序结果来提高检测的准确性。
本实施方式所涉及的检测肿瘤生物标志物的试剂盒可以包括上述探针库。由此，既能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定，也能够提高准确性、降低成本。
在一些示例中，试剂盒还可以包括扩增引物，扩增反应液，强洗脱缓冲液，第一缓冲液，第二缓冲液，第三缓冲液和磁珠清洗缓冲液。
在一些示例中，试剂盒可以包括人源性DNA封闭剂、接头封闭剂、杂交缓冲液和杂交组分。
在一些示例中，试剂盒还可以包括阴性对照品和阳性对照品。另外，阴性对照品可以为人类细胞系提取的DNA(例如人类白细胞提取的DNA)且不含有任何突变位点。此外，阴性对照品的纯度(OD260/280值)可以为1.6至2.2，浓度可以大于或等于2ng/μL。
在一些示例中，阳性对照品可以为人类细胞系提取的DNA且TMB值大于3，同时存在MSI-H。另外，阳性对照品的纯度(OD260/280值)可以为1.6至2.2，浓度可以大于或等于2ng/μL。
根据本公开能够提供一种能够提高准确性且能够同时检测肿瘤突变负荷和微卫星不稳定的检测肿瘤生物标志物的探针库、方法及试剂盒。
为了进一步说明本公开，以下结合实施例对本公开提供的构建mRNA文库的方法进行详细描述，并结合对比例对本公开实现的有益效果进行充分说明。
[实施例1]
在本实施例中，探针库的捕获探针由罗氏诊断产品有限公司合成。本实施例设置有不同样本来源的A组、B组和C组，每组分别具有实验组和对照组，其中A、B组实验组的DNA样本提取自结直肠癌患者的石蜡切片样本，对照组的DNA样本提取自该患者的白细胞，C组为肿瘤突变负荷检测国家参考品(C组为DNA样本)，其中实验组为TMB-1-1，对照组为TMB-1-0。
TMB-1-0、TMB-1-1突变比例VAF>1％、VAF>3％及VAF>5％的突变计算的TMB标准值见下表6。
表6
| 样本名称 | 1％标准TMB | 3％标准TMB | 5％标准TMB |
| TMB-1-0 | / | / | / |
| TMB-1-1 | 15.65 | 0.29 | 0.11 |
(1)首先，通过德国QIAGEN公司的GeneRead DNA FFPE Kit试剂盒提取A组和B组的实验组的DNA样本(C组为DNA样本)，通过天根血液基因组DNA提取试剂盒提取A组和B组的对照组的DNA样本，提取结果如下表7所示。
表7
(2)接着，分别取1000ng的A、B、C三组DNA样本使用covaris超声打断仪破碎成150-250bp并分别取500ng于1.5mL离心管(以下简称样本管)中，然后分别使用KAPA HTPLibrary Perparation Kit试剂盒来进行文库构建，具体步骤如下：
(a)按表8所示配制末端修复反应体系，向每个样本管内加入20μL末端修复反应体系，混匀后，在20℃孵育30min。
表8
(b)配制80％乙醇(40mL乙醇+10mLddH2O)，80％乙醇应现用现配。
(c)末端修复完成后，开始DNA纯化，具体步骤如下：
(c-1)每个样本管加入120μL混合均匀的磁珠并涡旋混匀，置于室温10min，使DNA与磁珠充分结合；
(c-2)将样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；
(c-3)小心移除上清液(为避免吸入磁珠，可以在管底留存20uL上清液)，再加入500μL 80％乙醇，180度旋转样本管使磁珠穿过溶液吸至另一侧管壁，旋转2-3次，静置15s后弃上清液，在此过程中，样本管一直保持在磁力架上；
(c-4)重复步骤c-3一次；
(c-5)将样本管从磁力架上取下，快速离心，然后置于磁力架上再次分离、移除残留的酒精溶液；将样本管自磁力架上取下，打开管盖，常温下干燥磁珠(大约2至3min)，挥发乙醇。
(d)取出KAPA A-tailing buffer和KAPA A-tailingenzyme试剂，置于冰盒上解冻待用，并将金属浴温度调至30℃待用，然后按表9配制加A尾反应体系，接着每个样本管中加入50μL加A尾反应体系重悬磁珠充分混匀，置然后于30℃的金属浴孵育30min，反应结束后，按照上述步骤c(步骤c-2至c-5)进行DNA纯化。
表9
(e)取出KAPA Ligation buffer和KAPA T4 DNA Ligase试剂,置于冰盒上解冻待用，并将金属浴温度调至20℃待用，然后按表10配制测序接头连接反应体系，接着每个样本管中加入45μL测序接头连接反应体系重悬磁珠充分混匀，并根据上机安排记录本各个样本管相应的接头信息，分别加入5μL接头试剂并用Nuclease-Free water补齐体积至5μL，充分涡旋混匀后置于20℃的金属浴反应15min，反应结束后，按照上述步骤c(步骤c-2至c-5)进行DNA纯化。
表10
(f)接着进行双筛，具体步骤如下：
(f-1)每个样本管内加入100加入TE缓冲液，涡旋混匀，室温静置5min；
(f-2)每个样本管内再加入60μL KAPA PEG/NaCl SPRI solution，室温静置10min，使大于450bp的DNA片段吸附于磁珠上；
(f-3)准备新的1.5mL离心管(以下简称离心管Ⅰ)，管盖标注相对应的编号，加入20μL混合均匀的磁珠；
(f-4)将样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清(约1-2min)；
(f-5)小心取出155μL上清液，移至对应编号的含磁珠的离心管Ⅰ中，充分涡旋混匀，室温静置10min，使大于250bp的DNA片段吸附于磁珠上；
(f-6)双筛结束后，开始进行DNA纯化，具体操作同上述步骤3；
(f-7)每个离心管Ⅰ内加入22μL Nuclease-Free water，重悬浮磁珠，充分混匀后室温静置5min。
(f-8)准备新的0.2mLPCR管(以下简称PCR管Ⅰ)，管盖标注对应的样本编号。
(f-9)将离心管Ⅰ置于磁力架，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应编号的PCR管Ⅰ中，作为PCR实验的模板。
(f-10)配置Qubit Buffer 199μL，加入1μL DNA样本，涡旋混匀,避光静置2min，测试浓度分别为6.19ng/μL(A组实验组)、6.96ng/μL(A组对照组)、6.26ng/μL(B组实验组)、6.83ng/μL(B组对照组)、6.66ng/μL(C组实验组)、6.81ng/μL(C组对照组)。
(g)每个PCR管Ⅰ加入30μL如表11所示PCR扩增反应体系，涡旋混匀后置于PCR仪中，然后按照表12所示设置PCR扩增过程温度和时间参数，反应结束后，按照上述步骤c(步骤c-2至c-5)进行DNA纯化，接着每个PCR管Ⅰ加入22μL无核酸酶水混匀室温静置5min，然后将PCR管Ⅰ置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应的新的写有样本信息的1.5mL离心管(以下简称离心管Ⅱ)，接着配置Qubit Buffer 199μL，加入1μL DNA样本涡旋混匀，避光静置2min，测试浓度，并利用Agilent 2100检测DNA文库的片段大小，检测结果如表13所示，文库符合质量合格标准。
表11
表12
表13
(3)然后，将上述DNA文库与探针库进行杂交，去除未结合的DNA，富集目标基因DNA片段，具体步骤如下：
(i)采用含有不同Index序列的文库进行混合杂交捕获，并根据文库浓度和投入量，计算文库的投入体积，将同一分组的样本分别取对应体积加入到一个样本管中，涡旋混匀，做好标记。
(ii)分别向离心管Ⅲ中加入5μL人源性DNA封闭剂和5μL接头封闭试剂，充分混匀并置于真空浓缩仪中蒸干液体，设置温度为60℃，蒸干后，取出离心管Ⅲ，盖上管盖，并将恒温金属浴温度调至95℃待用。
(iii)分别向加入离心管Ⅲ中7.5μL杂交缓冲液和3μL杂交组分并在涡旋混匀仪上彻底混匀，然后将离心管Ⅲ置于95℃金属浴中进行10分钟变性处理，并预热梯度PCR仪，顶盖温度设为57℃，反应温度设为47℃，体系15μL。
(iv)变性反应结束后，取出离心管Ⅲ，置于冰盒上，将反应产物转移至新的0.2mLPCR管(以下简称PCR管Ⅲ)中，同时加入4.5μL捕获探针，轻轻涡旋混匀，然后将PCR管转移至已经预热的PCR仪上进行杂交捕获反应，反应时间为16h。
(v)根据表14，使用Nuclease-Free Water配制洗脱所需的缓冲液，将金属浴的温度调至47℃，并将配制好的1×第一缓冲液、1×强洗脱缓冲液置于恒温金属浴预热至47℃。
表14
(iv)分别取100μL链霉亲和素磁珠至各1.5mL离心管(以下简称离心管Ⅳ)中，将离心管Ⅳ置于磁力架上去除磁珠保存液，分别200μL 1×磁珠清洗缓冲液，在涡旋混匀仪上混匀10秒，再将离心管Ⅳ置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液，保留链霉亲和素磁珠，并重复一次该步骤，然后取100μL1×磁珠清洗缓冲液对链霉亲和素磁珠进行重悬，涡旋混匀10秒，再将离心管Ⅳ置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液。
(v)从梯度PCR仪取出PCR管Ⅲ，不关闭梯度PCR仪，将PCR管Ⅲ中的杂交反应产物转移至离心管Ⅳ中，充分溶解链霉亲和素磁珠，再全部转移回PCR管Ⅲ中，置于梯度PCR仪中反应45分钟，期间每隔15分钟混匀3秒，并准备新的1.5mL离心管(以下简称离心管Ⅴ)，分别加入100μL已预热至47℃的1×缓冲液Ⅰ。
(vi)从梯度PCR仪取出PCR管Ⅲ，然后将反应产物加入到离心管Ⅴ中，涡旋混匀10秒，进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液，接着每个离心管Ⅴ加入200μL已预热至47℃的1×强洗脱缓冲液，涡旋混匀后置于47℃恒温金属浴上反应5分钟，再进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液，并重复本步骤一次。
(vii)在常温下，每个离心管Ⅴ加入200μL 1×第一缓冲液，涡旋混匀2分钟，再进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液，接着加入200μL 1×第二缓冲液，涡旋混匀1分钟，再进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液，然后加入200μL 1×第三缓冲液，涡旋混匀30秒，再进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液，接着分别吸取20μL Nuclease-FreeWater充分重悬浮链霉亲和素磁珠，并分别转移至新的PCR管(以下简称PCR管Ⅳ)。
(viii)将PCR管Ⅳ中的捕获产物与扩增反应液和扩增引物配置成如表15所示的反应体系，并按照表16设置PCR程序进行扩增。
表15
| 成分 | 反应体系(μL) |
| 扩增反应液 | 25 |
| 扩增引物 | 5 |
| 捕获产物 | 20 |
| 总体系 | 50 |
表16
(ix)PCR扩增完成后，取出扩增产物加入至新的1.5mL离心管(以下简称离心管Ⅵ)中，同时加入核酸纯化磁珠即AMPure XP Beads90μL，充分涡旋混匀后，室温静置10分钟，再进行磁珠吸附，直至溶液澄清，去除上清液；然后加入500μL 80％乙醇中，上下颠倒混匀，澄清后弃上清液，并重复本步骤一次；接着常温静置，待乙醇彻底挥发，直至磁珠表面无明显液体，取43μL Nuclease-Free Water将磁珠重悬，充分混匀后室温静置5分钟，再进行磁分离，直至澄清后，将上清液转移至新的1.5mL离心管中，备注样本信息；然后配置QubitBuffer 199μL，加入1μL DNA样本，涡旋混匀,避光静置2min，测试浓度，并利用Agilent2100检测捕获文库的片段大小。
(x)采用Illumina公司Nextseq 500/550Kits v2试剂盒，在Nextseq 500测序平台对捕获文库进行测序，具体流程参照说明书的标准流程。
(xi)对测序结果进行生物信息学分析，包括去除低质量数据、对数据进行剪裁以及去除polyN误差信息，去除低质量数据包括去除mapping质量为Q10的数据，对数据进行剪裁包括剪裁去除reads最后8-10nt，去除polyN误差信息包括去除数据中连续20个以上的polyN数据，目标基因的变异情况分析最终结果如表17所示。
表17
[对比例1]
(1)从4℃冰箱取出纯化DNA所用的磁珠(SeqCap Pure Capture Bead Kit AMpureXP Beads)，室温平衡至少30min供后续使用，同时从-20℃冰箱内取出KAPA PEG/NaCl SPRIsolution，室温平衡至少30min供后续使用，并配制80％乙醇。
(2)取实施例步骤(1)中提取的DNA样本，并分别取1000ng的A、B、C三组DNA样本以与实施例相同的方式进行破碎，然后分别取500ng进行文库构建，具体步骤如下：
(a)打开金属浴，将其置于4℃冰箱内，温度调至20℃，待用；从-20℃冰箱内取出试剂，置于冰盒上解冻，待用；按照表18配制末端修复反应体系，并向每个样本管内加入50μL末端修复反应体系，混匀后，在20℃孵育30min。
表18
| 组分 | 1个反应 |
| Nuclease-free water | 33.2μL |
| 10×End Repair Buffer(clear cap) | 10μL |
| dNTP Mix(green cap) | 1.6μL |
| T4 DNA Polymerase(purple cap) | 1μL |
| Klenow DNA Polymerase(yellow cap) | 2μL |
| T4 Polynucleotide Kinase(orange cap) | 2.2μL |
| Total | 50μL |
(c)末端修复完成后，开始DNA纯化，具体步骤如下：
(c-1)每个样本管加入180μL混合均匀的磁珠并涡旋混匀，置于室温10min，使DNA与磁珠充分结合；
(c-2)将样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；
(c-3)小心移除上清液(为避免吸入磁珠，可以在管底留存20uL上清液)，再加入500μL 80％乙醇，180度旋转样本管使磁珠穿过溶液吸至另一侧管壁，旋转2-3次，静置15s后弃上清液，在此过程中，样本管一直保持在磁力架上；
(c-4)重复步骤c-3一次；
(c-5)将样本管从磁力架上取下，快速离心，然后置于磁力架上再次分离、移除残留的酒精溶液；将样本管自磁力架上取下，打开管盖，常温下干燥磁珠(大约2至3min)，挥发乙醇。
(d)将金属浴调整至37℃待用，然后按表19配制加A尾反应体系，接着每个样本管中加入50μL加A尾反应体系重悬磁珠充分混匀，置然后于37℃的金属浴孵育30min，反应结束后，加入90μL KAPA PEG/NaCl SPRI solution，涡旋混匀10s，室温静置10min，然后按照上述步骤c(步骤c-2至c-5)进行DNA纯化。
表19
(e)将金属浴温度调至20℃待用，然后按表20配制测序接头连接反应体系，接着每个样本加入50μL测序接头连接反应体系重悬磁珠,充分涡旋混匀后置于20℃的金属浴反应15min，反应结束后，加入50μL KAPA PEG/NaCl SPRI solution，涡旋混匀10s，室温静置10min，然后按照上述步骤c(步骤c-2至c-5)进行DNA纯化。
表20
| 成分 | 1个反应体系 |
| Nuclease-free water | 28.5μL |
| 5×T4 DNA Ligase Buffer(green cap) | 10μL |
| SureSelect Adaptor Oligo Mix | 10μL |
| T4 DNA Ligase(red cap) | 1.5μL |
| Total | 50μL |
(f)接着进行双筛，具体步骤如下：
(f-1)每个样本加入100μL TE缓冲液，涡旋混匀，室温静置5min；
(f-2)接着加入80μL KAPA PEG/NaCl SPRI solution，室温静置10min，然后按照上述步骤c(步骤c-2至c-5)进行DNA纯化；
(f-3)每个样本加入25μL Nuclease-Free water，重悬浮磁珠，充分混匀后室温静置2min，并准备一批新的0.2mLPCR管，管盖管壁标注对应的样本编号。
(f-4)将样本置于磁力架进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应编号的PCR管中，作为PCR实验的模板。
(f-5)配置Qubit Buffer 199μL，加入1μL DNA样本，涡旋混匀，避光静置2min，检测DNA浓度，分别为6.23ng/μL(A组实验组)、5.98ng/μL(A组对照组)、6.33ng/μL(B组实验组)、6.02ng/μL(B组对照组)、6.07ng/μL(C组实验组)、6.16ng/μL(C组对照组)。
(g)每个PCR管加入27.5μL如表21所示PCR扩增反应体系，涡旋混匀后置于PCR仪中，然后按照表22所示设置PCR扩增过程温度和时间参数，反应结束后，加入50μL混合均匀的磁珠，充分涡旋混匀后，室温静置5min，然后按照上述步骤c(步骤c-2至c-5)进行DNA纯化，接着加入22μL无核酸酶水混匀室温静置5min，然后置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应的新的写有样本信息的1.5mL离心管，然后配置QubitBuffer 197μL，加入3μL DNA样本涡旋混匀，避光静置2min，测试浓度，并利用Agilent 2100检测DNA文库的片段大小，检测结果如表23所示，文库符合质量合格标准，而且配制Aglient4200D1000反应体系，3μL D1000B Buffer加入1μL DNA样本，进行安捷伦4200检测。
表21
表22
表23
(3)然后，将上述DNA文库进行Agilent杂交，具体步骤如下：
(i)SureSelect Hyb 1、SureSelect Hyb 2、SureSelect Hyb 4无需解冻，SureSelect Hyb 3室温解冻，其他试剂均于冰上解冻；
(ii)试剂盒中的96板试剂为SureSelect 8bp Indexes，使用前，解冻后吸取至新0.2mL PCR管中，短暂离心，置于冰盒上备用，另外，捕获探针储存于-80℃，使用前置于冰盒上解冻；
(iii)取上述DNA文库，采用含有不同Index序列的文库进行混合杂交捕获，并根据文库浓度和投入量，计算文库的投入体积，将同一分组的样本分别取对应体积加入到一个样本管中，涡旋混匀，做好标记。
(iv)按照表24配制SureSelect Block Mix(使用前置于冰盒上)，每个文库加入5.6μL SureSelect Block Mix，吹吸10次混匀，然后放入PCR仪，按照表25设置杂交前预处理程序，热盖105℃。
表24
| 组分 | 1个反应 |
| SureSelect Indexing Block 1(green cap) | 2.5μL |
| SureSelect Block 2(blue cap) | 2.5μL |
| SureSelect ILM Indexing Block 3(brown cap) | 0.6μL |
| Total | 5.6μL |
表25
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1 | 95℃ | 5min |
| 2 | 65℃ | 5min |
| 3 | 65℃ | ∞ |
(v)按照表26配制杂交缓冲液体系，室温放置待用，并且按照表27配制SureSelectRNase Block稀释液，冰盒放置待用。
表26
| 组分 | 1个反应 |
| SureSelect Hyb 1(orange cap or bottle) | 6.63μL |
| SureSelect Hyb 2(red cap) | 0.27μL |
| SureSelect Hyb 3(yellow cap or bottle) | 2.65μL |
| SureSelect Hyb 4(black cap or bottle) | 3.45μL |
| Total | 13μL |
表27
| 组分 | 1个反应 |
| RNase Block | 0.5μL |
| NF水 | 1.5μL |
| Total | 2μL |
(vi)按照表28配制杂交混合液体系(冰盒放置)，并在PCR仪上，将20μL杂交混合液加入到文库样本中，吹吸10次混匀，盖好管盖，确保密封，然后继续在PCR仪上65℃孵育16h。
表28
| 组分 | 体积 |
| 杂交缓冲液 | 13μL |
| SureSelect RNase Block稀释液 | 2μL |
| Agilent捕获探针库≥3.0Mb | 5μL |
| Total | 20μL |
(vi)准备2个金属浴，调至65℃，取SureSelect Wash Buffer 2置于65℃中预热，每个文库需要600μL(备用)，链霉素亲和性磁珠室温放置30min，平衡待用，使用前涡旋振荡1min。
1.1(vii)分别取50μL磁珠到，并加入200μL SureSelect Binding Buffer吹吸混匀，接着置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清，移除上清液，使用SureSelectBinding Buffer洗涤磁珠3次，结束后加入200μLSureSelect Binding Buffer吹吸混匀。
(viii)将PCR仪的样本快速转移到65℃金属浴上，将反应体系全部转移至磁珠中，缓慢吹吸混匀，室温1500rpm混匀30min，混匀后，短暂离心，接着置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清，移除上清液；再加入200μL SureSelect Wash Buffer 1吹吸混匀，室温静置15min后短暂离心，然后置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清，移除上清液；然后加入200μL 65℃预热的SureSelect Wash Buffer 2，吹吸10次混匀，接着65℃孵育10min，简短震荡后离心后置于磁力架，溶液澄清后，去上清；重复使用SureSelect Wash Buffer 2清洗2次；接着加入14μL NF水，吹吸混匀磁珠，带磁珠转移到新的0.2mLPCR管中。
(ix)按照表29配置加Index PCR缓冲体系，并向各个PCR管中加入31μL加IndexPCR反应体系和5μL SureSelect 8bp Indexes，记录编号，涡旋混匀10s，短暂离心，按照表30进行PCR扩增。
表29
表30
(x)PCR反应完成后，取出反应产物50μL加入至新的1.5mL离心管中，同时加入回收磁珠Ampure XP Beads 50μL，涡旋混匀10s后，短暂离心，静置10min，再置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清，移除上清液；然后加入200μL 80％乙醇，旋转2次，30s后弃去上清液，并重复一次；接着从磁力架上取下，快速离心，然后置于磁力架上再次磁回收，再常温静置等待乙醇彻底挥发，直至磁珠表面无明显液体；然后加入25μL NF H2O将磁珠重悬，涡旋混匀10s后，短暂离心，室温静置2min；接着准备一批新的离心管，管盖上标注分组及探针，接头信息，post-PCR，洗脱日期；管壁上标注接头信息，洗脱日期；然后置于磁力架上进行磁珠吸附，直至溶液澄清，将上清液转移至新的1.5mL离心管中；接着进行文库质检：Qubit测试浓度，Aglient 4200D1000进行4200检测。
(xi)采用Illumina公司Nextseq 500/550Kits v2试剂盒，在Nextseq 500测序平台对全外显子文库进行测序，具体流程参照说明书的标准流程。
(xii)对测序结果进行生物信息学分析，包括去除低质量数据、对数据进行剪裁以及去除polyN误差信息，去除低质量数据包括去除mapping质量为Q10的数据，对数据进行剪裁包括剪裁去除reads最后8-10nt，去除polyN误差信息包括去除数据中连续20个以上的polyN数据况，目标基因的变异情况分析最终结果如表31所示。
表31
[对比例2]
在本对比例2中，MSI检测试剂盒组成如表32所示：
表32
(1)在样本准备区进行取出取实施例步骤(1)中提取的DNA样本，涡旋混匀后，根据原浓度稀释至终浓度为5.0ng/μL。通过紫外分光光度计测定DNA纯度，OD260/OD280的值应在1.8～2.1之间，质控合格后的样本稀释液应放置在4℃暂存。
(2)按照表33准备五个检测位点的Primer Mix配置体系，并准备PCR管写好编号，将配制好的除模板外的PCR预混液，充分混匀离心后在PCR管中每孔加入47μL，然后分别加入3μL稀释后的DNA模板配制成表34配制PCR反应Mix(50μL/Sample)，充分混匀并简单离心后置于PCR仪，并按照表35设置PCR反应程序，扩增结束后，将样本转移至新的PCR管。
表33
| 位点名称 | 引物浓度(μM) | 反应引物体积(μL) |
| NR-21 | 10 | 1.90μL |
| NR-24 | 10 | 1.05μL |
| NR-27 | 10 | 1.65μL |
| BAT-25 | 10 | 1.40μL |
| BAT-26 | 10 | 1.80μL |
| 总体积 | / | 7.8μL |
表34
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| Template | 3.0μL | - |
| Primer Mix | 2.5μL | - |
| 10X TransStart Top Taq Bufer | 5.0μL | 1X |
| 2.5mM dNTPs | 4.0μL | 200μM |
| DNA Polymerase | 0.5μL | 1.25units |
| H2O | 35μL | - |
| 总体积 | 50μL | - |
表35
(3)检测机构反馈结果后，对数据进行解读，质控判读标准如表36所示，MSI位点检测结果如表37所示。
表36
| 分子标记 | 正常长度(bq) |
| NR-21 | 135-139 |
| NR-24 | 122-128 |
| NR-27 | 88-92 |
| BAT-25 | 150-156 |
| BAT-26 | 182-187 |
表37
根据表17和表31可知，实施例中A组的TMB检测结果为45.1Muts/Mb，B组的TMB检测结果为28.63Muts/Mb，对比例1中A组的TMB检测结果为40.1Muts/Mb，B组的TMB检测结果为26.63Muts/Mb，由此可见，实施例中获得的TMB检测结果高于对比例1中的TMB检测结果，换言之，实施例中TMB检测的准确性高于对比例1的TMB检测。另外，根据表17和表37可知，实施例和对比例2的MSI检测结果一致，也就是说，实施例的MSI检测水平与对比例MSI检测水平一致。
虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。
序列表
<110> 深圳市海普洛斯生物科技有限公司
<120> 检测肿瘤生物标志物的探针库、方法及试剂盒
<160> 218
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcggcag cgttctgtca tagggactct ggatcccaga aggtgagaaa gttaaaattc 60
ccgtcgctat caaaacatct ccgaaagcca acaaggaaat cctcgatgtg agtttctgct 120
ttgctgtgtg gggccgagcc cacgagac 148
<210> 2
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgtcggcag cgtctgtcat agggactctg gatcccagaa ggtgagaaag ttaaaattcc 60
cgtcgctatc aagacatctc cgaaagccaa caaggaaatc ctcgatgtga gtttctgctt 120
tgctgtgtgg gggccgagcc cacgagac 148
<210> 3
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtcggcag cgttgtcata gggactctgg atcccagaag gtgagaaagt taaaattccc 60
gtcgctatca aggcatctcc gaaagccaac aaggaaatcc tcgatgtgag tttctgcttt 120
gctgtgtggg ggtccgagcc cacgagac 148
<210> 4
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtcggcag cgtgtcatag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg 60
tcgctatcaa ggaatctccg aaagccaaca aggaaatcct cgatgtgagt ttctgctttg 120
ctgtgtgggg gtcccgagcc cacgagac 148
<210> 5
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgtcggcag cgttcatagg gactctggat cccagaaggt gagaaagtta aaattcccgt 60
cgctatcaag gaaccaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg 120
ctttgctgtg tgggccgagc ccacgagac 149
<210> 6
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgtcggcag cgtcataggg actctggatc ccagaaggtg agaaagttaa aattcccgtc 60
gctatcaagg aatcgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg ctttgctgtg 120
tgggggtcca tggccgagcc cacgagac 148
<210> 7
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgtcggcag cgtctccttc tggccaccat gcgaagccac actgacgtgc ctctccctcc 60
ctccaggaag ccttccagga agcctacgtg atggccagcg tggacaaccc ccacgtgtgc 120
cgcctgctgg gcatctgcct cacctccgag cccacgagac 160
<210> 8
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgtcggcag cgtctggcca ccatgcgaag ccacactgac gtgcctctcc ctccctccag 60
gaagcctacg tgatggccag cgtggccagc gtggacaacc cccacgtgtg ccgcctgctg 120
ggcatctgcc tcacctccac cgccgagccc acgagac 157
<210> 9
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgtcggcag cgtcgaagcc acactgacgt gcctctccct ccctccagga agcctacgtg 60
atggccagcg tggccagcgt ggacaacccc cacgtgtgcc gcctgctggg catctgcctc 120
acctccaccg tgcagctcat caccgagccc acgagac 157
<210> 10
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgtcggcag cgtaagccac actgacgtgc ctctccctcc ctccaggaag cctacgtgat 60
ggccagcgtg gacagcgtgg acaaccccca cgtgtgccgc ctgctgggca tctgcctcac 120
ctccaccgtg cagctcatca cgccgagccc acgagac 157
<210> 11
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgtcggcag cgttgacgtg cctctccctc cctccaggaa gcctacgtga tggccagcgt 60
ggacaacccc cacaaccccc acgtgtgccg cctgctgggc atctgcctca cctccaccgt 120
gcagctcatc acgcagctca tgccgagccc acgagac 157
<210> 12
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgtcggcag cgtgtgtgtg gtctcccata ccctctcagc gtacccttgt ccccaggaag 60
catacgtgat ggcatacgtg atggctggtg tgggctcccc atatgtctcc cgccttctgg 120
gcatctgcct gacatccacg gtgcaccgag cccacgagac 160
<210> 13
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgtcggcag cgttgtggtg tttgggggtg tgtggtctcc cataccctct cagcgtaccc 60
ttgtccccag gaagcatacg tgatggcata cgtgatggct ggtgtgggct ccccatatgt 120
ctcccgcctt ctgggcatct gcctgccgag cccacgagac 160
<210> 14
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgtcggcag cgttaatgac tgagacaata attattaaaa ggtgatctat ttttcccttt 60
ctccccacag aaacagtgga aggttgttga ggagataaat ggaaacaatt atgtttacat 120
agacccaaca caaccgagcc cacgagac 148
<210> 15
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgtcggcag cgtttattaa aaggtgatct atttttccct ttctccccac agaaacccat 60
gtatgaagta caggagataa atggaaacaa ttatgtttac atagacccaa cacaacttcc 120
ttatgatcac aaaccgagcc cacgagac 148
<210> 16
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgtcggcag cgtaaaccca tgtatgaagt acagtggaag gttgttgagg agataaatgg 60
aaacaattat gttccttatg atcacaaatg ggagtttccc agaaacaggc tgagttttgg 120
tcagtatgaa acaccgagcc cacgagac 148
<210> 17
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgtcggcag cgtgaaaatg gacaggggtc atagtcgttc ctccagggct cacagactga 60
tgacccacag gggtcagggt cttttcccca ggggtcacag actgataacc cacaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 18
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgtcggcag cgtaaatgga caggggtcat agtcgttcct ccagggctca cagactgatg 60
actccagggg tcagggtctt ttcccacagg ggtcacagac tgatgaccca caggggtcag 120
ggtcttttcc ccaggccgag cccacgagac 150
<210> 19
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcgtcggcag cgtacagggg tcatagtcgt tcctccaggg ctcacagact gatgactcac 60
agggtcaggg tcttctgtcc agtgggtcac agactgatga cccacagggg tcagggtctt 120
ttccccaggg gtcacccgag cccacgagac 150
<210> 20
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgtcggcag cgtgtgtttt aagtaaatgt agataatgtc tggtacatat ataacatttt 60
ttccgccccc accccctgaa ggttcagttg ttatttatta acaaattcgc ttttagacca 120
atgagccgag cccacgagac 140
<210> 21
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcgtcggcag cgttgtttta agtaaatgta gataatgtct ggtacatata taacattttt 60
tcccgccccc acccctgaag gttcagttgt tatttattaa caaattcgct tttagaccaa 120
tgagaccgag cccacgagac 140
<210> 22
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgtcggcag cgtatatata tgagatatat atatcagcta tagatatata tgagatatat 60
atatcagata tagatatata tgagatatat atatatcaga tatatatgat atatccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 23
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcgtcggcag cgtctcatgc ccacctccaa tctcttcctg ctgtggctcc agctctgggg 60
gctgctgtag ctctgggggc tgtggttgct gcagctctga gggaggtggc tgctgcctga 120
gccaccacag acccgagccc acgagac 147
<210> 24
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcgtcggcag cgttcctgct gcagcgtcag ctccggaggc tgctgtggct ccagctctgg 60
gggcctgctg cagctctggg ggtgctgcag ctctgggggt ggtggctgct gcagctctgg 120
gggaggcggc tgccgagccc acgagac 147
<210> 25
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcgtcggcag cgtaggctgt accaaggtcc ctgagccagg ctgtaccaag gtccctgagc 60
caggttgtac caaggtccct gagccaggct gtaccaaggt ccctgagcca ggttccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 26
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcgtcggcag cgttggacgg gctggctctg gagttgggcg agctgagaca ggggatgcgg 60
tggcgctgct gctgctgctt gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 120
aagctgcggc cgagcccacg agac 144
<210> 27
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcgtcggcag cgtagctgag acaggggatg cggtggctgc tgctgctgct gctgctgctg 60
ctgcctgctg ctgctgctgt gctgctgctg ctgaagctgc ggaggctgag gctgcagcga 120
gggtcccagc cgagcccacg agac 144
<210> 28
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcgtcggcag cgttgagaca ggggatgcgg tggctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 60
ctgcctgctg ctgctgtgct gctgctgaag ctgcggaggc tgaggctgca gcgagggtcc 120
caggggccga gcccacgaga c 141
<210> 29
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcgtcggcag cgttttccca ttagttattt caaagtatct ttattatctt caaattttct 60
tcccctttgc cagtaaactc tagtctccat atgatttccc agcaaatttt tcttccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 30
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcgtcggcag cgtttgagca gagatccaga ggtcttcttc atccttcttc ttcttcttct 60
tcttgttctt ctctggctgc tggcccctct tgcctggtgg gctccagcag caatccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 31
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tcgtcggcag cgtagcagag atccagaggt cttcttcatc cttcttcttc ttcttcttct 60
tctttcttct ctggctgctg gcccctcttg cctggtgggc tccagcagca atggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 32
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcgtcggcag cgtgaacgcc gcccgaccca cctgcggcag cggcaggagc ggcaggagcg 60
gcagcagcag ccgcagtccg cgggcggcca gcggcccccg ggccatgctc tgagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 33
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcgtcggcag cgtttttaaa ctaaagacct caatgcaaag cttatctgat agatatgtaa 60
caaactgaaa ctggtttact tggtgatgtt tacactgatc agcttaaata tctaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 34
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcgtcggcag cgtcccctcg caggcgacca gcccaacttg ggctgctcac gctactgccg 60
ctgccactgc cgctgctact attcagcctg cgccggccgc tccgccagcc cccgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 35
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcgtcggcag cgtgcggacg agacagcggg gatcatggcc gcgcaggtcg cccccgccgc 60
cgccgccgcc ctcggagctg aagaaagccg agcagcagca gcgggaggag gcggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 36
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tcgtcggcag cgttgggcag tcggtcccgg ccgcgagccg cagcgccagc agcgccagca 60
gcgctagacc cgggacgccg ctcggcgggc tagagacgag gcgccagcgt cgaaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 37
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcgtcggcag cgtaaacggc acatgatccc ctgcacagct ccagcagcac agctccagca 60
gcaccagctc cagcagcaag ctccagcagc agtgcagtca gagcctctgg gaaggagcca 120
ctctgttccc gagcccacga gac 143
<210> 38
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tcgtcggcag cgttgctcaa gaatgtgagg aacaccagta ctgtccatgg gagtagtacg 60
gaacgcacgc tagggaagag agaggaatgt gcacgctagg gaaggagaat gaccagaacg 120
caaaaggttc agcttagtgc cgagcccacg agac 154
<210> 39
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcgtcggcag cgtctggcgg tgccaagcct cacaccaccc ccacccacag atccactgtg 60
cgacagctcg gtgatcgcag ccgctgtcct cttctccttc atcgtctcgg tgctgctgcc 120
gagcccacga gac 133
<210> 40
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcgtcggcag cgttggctac caccacctgc catgctctgc ccccagctgc tctactctgt 60
ggcaatgagg gagtgaggga ggtgagggct ggtggctgct gccatgccct acctgccaca 120
gggccgagcc cacgagac 138
<210> 41
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tcgtcggcag cgtgccatgc tctgccccca gctgctctac tctgtggcat gagggaggtg 60
agggaggtgg gggctggtgg ctgctgccat gccctacctg ccacagggat cctggccttt 120
cccccgagcc cacgagac 138
<210> 42
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcgtcggcag cgtgtctgca ttaccagctt tatttctcca ttcgcaaagg taaaaaaaaa 60
aaaaggcact acacacgatt cccacacaca gtgcaagtgc tctccaactg ctagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 43
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tcgtcggcag cgtgatgcca gagccggaga tgcccgggct ggagatgcct gggctggaga 60
tgcccggcct ggagatgccc ggcctggagg tgtaccagct ggagatgcct gggcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 44
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tcgtcggcag cgtaaccccc acaggagcca cagcccccct tggagccccc acaggagcca 60
cagctggtgc aggaacaggc tggcacccag gagcacacgg gcttgcagca gcagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 45
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tcgtcggcag cgtaggctgt ggctctggct gtgggggctg tggctccggc tgtggaggct 60
gtggctccgg ctgtgggggc tgtggctccg gctgtgcggg ctgtggggga tgtggctccg 120
gctgctccga gcccacgaga c 141
<210> 46
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tcgtcggcag cgttgccaag catcacacct gccaagcatc acacctgcca agcatcacac 60
ctgcgatgcc tgcacgagct gggtgcggtc cgcgcagctg cagtaagggg gcgaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 47
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tcgtcggcag cgtgcccaag tctcacccag cctgggctgg acaaagaggc agctgtagca 60
gtggagtctg ctgtacagca ggaagtggcc tcccctgggg aggatgcagc agaaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 48
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tcgtcggcag cgttggggct ctcacagaac tcagaggtac agagagttct ctttgtggtc 60
ttttatgtgg tcacggtttg tggcaacatg ctcattgtgg tcactatcac ctccccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 49
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcgtcggcag cgtagggaca agacgggacc gccggagccc ccggactcct ttggatgggc 60
ctggcgctgg cgctggcgct ggcgctggct ctgtctgact ctcgggttct ctggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 50
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tcgtcggcag cgtagtgcca gaagcctcgc agcctagctg ccattgagga ggctgcccta 60
ctgcatgccc tactgcgctc accactgttt agcattctca atgggctcca cctgcacaac 120
ctccgaccga gcccacgaga c 141
<210> 51
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tcgtcggcag cgtcaccctc aacccaccag aaccatgggc tgctgtggct gctctggagg 60
ctgttggctc cggctgtggg ggctgggctc cggctgtggg ggctgcggct ctggctgtgg 120
gggatgtggc tctagccgag cccacgagac 150
<210> 52
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tcgtcggcag cgtatccacc ctcaatctac cagaatcatg ggctgctgtg gctgctccgg 60
aggcctgtgg ctccggctgt gggggtgtgg ctccggctgt gggggttgtg gctccggctg 120
tgggggctgt ggctcccgag cccacgagac 150
<210> 53
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tcgtcggcag cgtttgctgc tgctgctgct gttgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 60
gctgttgctg ctgttgctgt tgggtgtagt gtaggagaga aggcttgttc tgggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 54
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tcgtcggcag cgtacggggg caagggcagg gactggggct ggggctgggg cagggccatg 60
ccacgtacag ccgccagctg ctgctccagc tcgcgcacca ccagccgcag gtagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 55
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tcgtcggcag cgtggggcaa ccgcagaatc caggagctgg aagagccact gggactcatt 60
catttcattc atcattcata caacatgtat ttatccagtg cctactctgg accagtcact 120
gtccgagccc acgagac 137
<210> 56
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tcgtcggcag cgtagtctca ggaggaggag aggaaaacgg gcgaggagga aggggaggag 60
gaggagaaag aggaggaggg gaaggaggac aaaaagattg tcatggaaga aactgaggaa 120
aaggctggac cgagcccacg agac 144
<210> 57
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tcgtcggcag cgtgctggtg ggcatgggag tgggaggcgg ggcggctgct gctgccccca 60
ccccgccgct gctcgccgct gctgccgctg ctctgctctg tacctggtga cagtcagtgg 120
catccgagcc cacgagac 138
<210> 58
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tcgtcggcag cgttgggagt gggaggcggg gcggctgctg ctgcccccac ccccgccgct 60
gctggccgct gctccgctgc tctgctctgt acctggtgac agtcagtggc atcagcaggg 120
ggaccgagcc cacgagac 138
<210> 59
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tcgtcggcag cgtttctttg aatttatcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct 60
cctctccatc tgccacttct tcttcccatt cctccacctt accacgctta tcagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 60
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tcgtcggcag cgtgcgtgcc tggtgggcgt gtctggtggg tgtgtctggt gggccagcct 60
ggtgggtgtg cctggtgggc gtgtctggtg ggtgtgctag gtgggcgtgc ctggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 61
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tcgtcggcag cgtttctttt ttaacaggtg atcatttcaa accaagcatc agcaacaatt 60
aaaatagttt aataatggac caacatcaac atttgaataa aacagcagag tcagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 62
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tcgtcggcag cgtccataaa ggaccagggt tgcgactgga ccatatccac ttaccataaa 60
ggacagggtt gcgaacacca ggaagcgcca gcatgttgcc gatggagtag accactgcct 120
tcttgcttgg accaagcccc gagcccacga gac 153
<210> 63
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tcgtcggcag cgtgcctcca ccaaagccgc ctccaccgaa accaccacca ctgaagccgc 60
tgcccctcca aagccgctgc cgacctccaa agctgctgcc gcctccaaaa ccacctcctc 120
tgccaccaaa tcccgagccc acgagac 147
<210> 64
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tcgtcggcag cgtagccgcc tccaccgaaa ccaccaccac tgaagccgct gccacctcca 60
aagcgctgcc gcctccaaag cctgctgccg cctccaaaac cacctcctct gccaccaaat 120
ccaccagcgg cgccgagccc acgagac 147
<210> 65
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tcgtcggcag cgtgccatgg ccgccgccgc cacctccaga gccatagctg ccacctccgg 60
agccatagct gccacggccg ccgccgccgc cacctccaga accatagcta ccacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 66
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tcgtcggcag cgtcagagca ccctgcccaa agctgaggct ccccgagagc cggagcgggg 60
aggggggggg ggggggcccc gccaagtcag cattccagcc ggtgattgca atggacaccg 120
aactgctccg agcccacgag ac 142
<210> 67
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
tcgtcggcag cgttcaccat caccaccagc aacagcaaca gcagcagcag cagcagcagc 60
agcatcacgg aaactctggg ccccctcctc ctggagcatt tccccaccca ctggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 68
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tcgtcggcag cgttcaccac cagcaacagc aacagcagca gcagcagcag cagcagcagc 60
agcatcacgg aaactctggg ccccctcctc ctggagcatt tccccaccca ctggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 69
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
tcgtcggcag cgtcattctt accaaactct aaattttctc ttggaaactc ccatttgaga 60
tcattattca tattctctga aatcaattca tattctctga aatcaacgta gaagtactca 120
ttatctgagg agccgccgag cccacgagac 150
<210> 70
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tcgtcggcag cgttcttacc aaactctaaa ttttctcttg gaaactccca tttgagatca 60
tatttcatat tctctgaaat caacgtagca tattctctga aatcaacgta gaagtactca 120
ttatctgagg agccggtccc gagcccacga gac 153
<210> 71
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tcgtcggcag cgttctcttt tttggacatg tgtctctcca ctgccacaac acccaagatg 60
atcacaagac catctctgtg tggggctgcg tgacccagat gttcttcatg cactccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 72
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tcgtcggcag cgtcacctgc acgtcccgga tcacgacgct ctgagcccgg gccacgcagg 60
ggcttctgag cccgggccac gcaggggcct gagcccgggc cacgcagggg ccctgagcca 120
aaagaggggg agaatgagcc gagcccacga gac 153
<210> 73
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tcgtcggcag cgtgaactgg tggctggcct ttcacatgga tgtgaactct gtcctgatag 60
gtccgctgct gctgctgctg ctgctccctg ctgctgctgc tgctgctgct gttgctgctt 120
ttgctgctgt ctgaaccgag cccacgagac 150
<210> 74
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tcgtcggcag cgtactggtg gctggccttt cacatggatg tgaactctgt cctgataggt 60
cccctgctgc tgctgctgct gctgctgctg cctgctgctg ctgctgctgc tgctgttgct 120
gcttttgctg ctgtctgaaa cccgagccca cgagac 156
<210> 75
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
tcgtcggcag cgtatgtgaa ctctgtcctg ataggtcccc ctgctgctgc tgctgctgct 60
gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gttgctgctt ttgctgctgt ctgaaacatt 120
caaaagtgaa gtatatttaa accgagccca cgagac 156
<210> 76
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tcgtcggcag cgttcccttc tgagcccacg caccgaccca gctcctcttc cctgcagttg 60
tggccatggc ggctgtgccc atggtgctca gtgccatggg cttcactgcg gcgggaatcg 120
cctccgagcc cacgagac 138
<210> 77
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tcgtcggcag cgtcagcgca taagtctcct gaatgagggg caaaaggaga ggcttcggga 60
gcaggaggag aggcttcagc agctggccga gccacagaac agcttcaagg agctccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 78
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tcgtcggcag cgtccccgca gaggcgcaga cgcaggcgga ggggcagggg caagggcagg 60
ggcaagggca ggggcaagga caggggcaag gacaggggca agggcagggg cgcaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 79
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tcgtcggcag cgtccccgca gaggcgcaga cgcaggcgga ggggcagggg caagggcagg 60
ggcaaggaca ggggcaagga caggggcaag ggcaggggcg caggccgggc ctggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 80
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tcgtcggcag cgtctccaac cccaccgata tctacccctc caagtggatt gcccggctcc 60
gccagcgggt agggaatatg gggctccctc agcggggtgt gctggctgcc caagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 81
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tcgtcggcag cgttaatctc aagacacctt ccgagcgtca gctcactccc cttccaccct 60
cagcagatga taatatcaag acacctgccg agcgtctgcg ggggccgctt ccacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 82
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tcgtcggcag cgtgcagcag cagcaacagc agcagccgca gcagcagcag ccacagcagc 60
agccgcagca gcagcagcca cagcagcagc cacaggcctt gcctcggtat cctcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 83
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tcgtcggcag cgttcccaag aggaaactgc ctcttccagc ctccccaggg aaaaaaaaaa 60
aaaaataaat aaaaggcaaa cctcctttcc caatgtggct gaatgtgtct ttgcaagaca 120
ctcaccgagc ccacgagac 139
<210> 84
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tcgtcggcag cgtgctacgg ggcagcttac ggggcaggct atggggcagc ctacggggca 60
ggctgcgggg cagcctacgg ggcaggctac ggggcaggcc cttgcactgc acatcgcacg 120
ttgagccaca gactcagacc gagcccacga gac 153
<210> 85
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
tcgtcggcag cgtgaggcgg ctgcgtcccc gctccggcga gcgggagctc ctgctggtgg 60
gacgggtacg ggggtggggg ccgtacgggg gtgggggcca gtacgggggt gggggaacac 120
tacaagggtg ggccgagccc acgagac 147
<210> 86
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tcgtcggcag cgtgctgcag gtcccactag ttgagaagct aggaaatccg cagaagctgg 60
tctgcagcag ctggtctcag cagcagcttg gctggcagca gctggtctca cagcagcttg 120
gctggcagcc cgagcccacg agac 144
<210> 87
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
tcgtcggcag cgtaagcccc agtgctgcca gtctgtgtgc tgccagccca cctgctgccg 60
cccctgctgc tgcctgcgtc cagtctgtgg ccgagtctcc tgccacacca cttgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 88
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
tcgtcggcag cgtctggggc agcagcaggt ggtcctgcag caggtggtcc tgcagcaggt 60
ggtcggcagc agctggggct ggcagcagca ggggcggcag cagctggatt cacagcaata 120
ggggcggcac cgagcccacg agac 144
<210> 89
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tcgtcggcag cgtagcaggt ggtcctgcag caggtggtcc tgcagcaggt ggtctggcag 60
cagctgggga ggcagcagca ggggcggcag cagctggatt cacagcaata ggggcggcag 120
cagctggagc cgagcccacg agac 144
<210> 90
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tcgtcggcag cgtagcaggt ggtcctgcag caggtggtct ggcagcagca ggggcggcag 60
cagcaggggc ggcagcagct ggagatgcag cagctagggt ggcagcaggt gggcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 91
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tcgtcggcag cgtaaggcct gcagcaactg gaaatgcagc agctggggcg gcagcaggtg 60
gtccgcagca ggtggtcagt gcagcagctg ggtttgcagc agctggagat acagcaggaa 120
ggcctgcagc cgagcccacg agac 144
<210> 92
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tcgtcggcag cgtcagcaac tggaaatgca gcagctgggg cggcagcagg tggtcctgca 60
gcaggtggtc aggcagcagc tgggtttgca gcagctggag atacagcagg aaggcctgca 120
gcaactggac cgagcccacg agac 144
<210> 93
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
tcgtcggcag cgtaggaaca cctcttgcca gcccacctgc tgtgggtcca gctgctgcca 60
gcctagctgt gggtccagct gctgccagcc ttgctgccac ccaacatgct gtcaaaccat 120
ttgtagatcc acctgctgcc accgagccca cgagac 156
<210> 94
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
tcgtcggcag cgtgctgtca accgcctgag ccgagcttgg gggaaaggag gttggggcgc 60
tgtggggcgc tgtggcgctg taggcgctgg gtccccggtt acagagtggg tactctaaga 120
aggccgagcc cacgagac 138
<210> 95
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
tcgtcggcag cgtcagtagc tgcaccctgc cccccagtga caccagctcc tccagcccct 60
ccaggcccct ccacccctcc accttcacct ccccctccac ctgctgtgca acacacaggc 120
cttccgagcc cacgagac 138
<210> 96
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tcgtcggcag cgtccgcccg gtgcactgtg gacgatgagt cagggttagg ggcgccagga 60
cgtggggcgt gcaggacgcg gcgtgcagga cgccagagct gggtcagagc tcgagccagc 120
ggcgcccggc cgagcccacg agac 144
<210> 97
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
tcgtcggcag cgtagggcct cccgccgggc cagctgctcc ggaccgagca gcggcaggtc 60
ctccgctccg gggagctccg ggaagagcgg gaggaagggg cggccggatc ggtcggctcg 120
aggccgagcc cacgagac 138
<210> 98
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
tcgtcggcag cgtcacctcc agctcccgca gcagcgcctc gcccccacgg tgcgcgctcc 60
gcgcggttcc atgggctccg tacggttcca tgggctccgt aggttccatg ggctccgtgg 120
gttccatgga ctccgagccc acgagac 147
<210> 99
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tcgtcggcag cgtccccacg gtgcgcgctc cgcgccggtt ccatgggctc cgtaggttcc 60
atggctccgt aggttccatc gggctccgtg ggttccatgg actctgtggg ctcgggcccg 120
acgcgcacgg agccgagccc acgagac 147
<210> 100
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
tcgtcggcag cgtggcgtcc gtagccaccg cccccgtacc tgcggggtgg cggtccccgg 60
cggccgtagc gcgccatttg cacccgcagc tcgcggccgt ccagcacggc cccgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 101
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tcgtcggcag cgtacctcgc ttagtgctcc ctgggggcag ctcgtggtga ggctcccctt 60
tcttcctctg tgcgccggtc tctcccagga caggcacaaa cacgcacctc aaagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 102
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tcgtcggcag cgtgtgcagg gtggcaagtg gctcctgacc tggagtcttc cagtgtgatg 60
atgggcctcc ggttcatgcc gcccatgcag gaactgttac acatgtagtt gtagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 103
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
tcgtcggcag cgtccctgtc gtctctccag ccccagctgc tcaccatcgc tatctgagca 60
gcgcctcaca acctccgtca tgtgctgtga ctgcttgtag atggccatgg cgcgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 104
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tcgtcggcag cgttccgtca tgtgctgtga ctgcttgtag atggccatgg cgcggacgcg 60
ggtgtggaat caacccacag ctgcacaggg caggtcttgg ccagttggca aaacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 105
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
tcgtcggcag cgttgacaca gcaaggtatt tggctgggtg gacttcggtg gcaatggtaa 60
cagtctccct ggtcgcttga aagcactcat tattagcagt taatgttgtt ggctccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 106
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
tcgtcggcag cgttcctctt ttcctaattg aatacccttt atttccttct cctgcctgat 60
tgcagatgac atgattgttt atctagaaaa ccccatcgtc tcagcccaaa atctccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 107
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tcgtcggcag cgttgcaggc agcagagaaa caaatgaagg acaaacagga cgaggagcag 60
aggcagagga caaggaggat gatgaggaca aagatgagga tgaggaggat gaggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 108
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
tcgtcggcag cgtaggcagc agagaaacaa atgaaggaca aacaggacga ggagcagagg 60
cttaggagga ggcagaggac aaggaggatg atgaggacaa agatgaggat gaggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 109
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
tcgtcggcag cgtagaaggg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtgtgtaggg agcacccagg cagatctccc ccaggctgag agagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 110
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
tcgtcggcag cgtagaaggg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt gtagggagca cccaggcaga tctcccccag gctgagagag gactccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 111
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tcgtcggcag cgtagaaggg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 60
gtgtgtgtgt agggagcacc caggcagatc tcccccaggc tgagagagga ctttccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 112
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tcgtcggcag cgtcgggcaa ggccaagaag cccaaagtga agaagaagga gaagggcaag 60
aagggagaag ggcaagaaga gaagggcaag aagaaggagg ctccccactg aagggccctg 120
gacagggctc cgagcccacg agac 144
<210> 113
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
tcgtcggcag cgttctcatc tactgggcag cggtgaggac agtcctgtcc aacagggagg 60
gaggtcaggg gagaaggcaa gatgctagcc agatcactga ggccagaaag gggtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 114
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
tcgtcggcag cgtaaggaga aggccgagga gaagctggcc ggggaggagc tggccgggga 60
ggaggccccc caggagaagg cggaggacaa gcccagcacc ggtgaggggc gggtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 115
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
tcgtcggcag cgtgggcctg ggtttgggcc tgagattggg cctgagattg ggcctgggat 60
cgggactgag attgggcctg ggatcgggcc tgagattggg cctgggatcg ggccccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 116
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
tcgtcggcag cgtagccttg gaggttgcgt gggggccggg aattgcccga gcccccagcc 60
gagggccgcc gccagccgcc gccgccgccc cctgaagagc aaccctggga ggccgggggc 120
agcccgagcc cacgagac 138
<210> 117
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tcgtcggcag cgtaggttgc gtgggggccg ggaattgccc gagcccccag ccgaggagcc 60
gccggccgcc gccccgccgc cccctgaaga gcaaccctgg gaggccgggg gcagcgccag 120
gggccgagcc cacgagac 138
<210> 118
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
tcgtcggcag cgtttgggtg gccccttggg gtcccagggt ggctccttca tctcgcccca 60
tggccgcttg ccctccttca cccaggtgtg cgactctggc tgctctctga ccacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 119
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
tcgtcggcag cgtgtaccgg aactccgtgg tggggttgtt gaaggtgagc ttctcgcagc 60
gcagggtggt tcagtggttc acgggcgggt tgccttccag gttcaggaac aggtcgtagg 120
tgaccgagcc cacgagac 138
<210> 120
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
tcgtcggcag cgtcggagcc cgaggagcta cccgggggct cggcgccacc gttctcgctg 60
tcgctggcgt cctcgctgga ggagctctcg tacctggggg cagggtggga ggtgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 121
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
tcgtcggcag cgttaatctc tttcctcagt gtacaaaaga tgaaattcaa atttatcagt 60
caaagttagt tcttagtgat catatggtca gctaatatta gttcttagtg atcaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 122
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
tcgtcggcag cgtacggaga gatcggacac ggtgtcctca ctgccatcct cgctgtcgct 60
gctgctctct ctgtcctgca ggaacttctt cccgggacgc cgcctgcagt ctgtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 123
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
tcgtcggcag cgttgaggcc ggagacactg gcactgcctg gggttcacac tcttcctcct 60
cctctcctcc tctctcctcc tcttcagctt catcctctgg agatgcccca caaacaccct 120
cctccgagcc cacgagac 138
<210> 124
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
tcgtcggcag cgtattaaag cccgtgctct gcaggtccga ggggcgagag gtcaccactg 60
ccatcggagg ggggggtggc ccgggtggag gtggcggcgg ggccaccgat gaggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 125
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
tcgtcggcag cgtgggacct gctcggagga atggcgccgc cgggtgagga gttgcgcgtg 60
gcttacagac agggccccgc ggccggcact ctttggggag agggctgtcg cccgcgggag 120
gttactagtc gccgctcgag agcccgagcc cacgagac 158
<210> 126
<211> 158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tcgtcggcag cgtgggacct gctcggagga atggcgccgc cgggtgagga gttgcgcgtg 60
gcttatagac agggccccgc ggccggcact ctttggggag agggctgtcg cccgcgggag 120
gttactagtc gccgctcgag agcccgagcc cacgagac 158
<210> 127
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
tcgtcggcag cgtaagtcat cacttccgac aacagagggt ggctatgatg atgcagcagc 60
agcaacagca gcagcagcag cagcagcagc agcaacagca acagcaacag caacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 128
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
tcgtcggcag cgtaactttt ttttttttaa tgaaaattta aagagacaga aaaaagagaa 60
aacagtgaga gtctaatcca gctgcctgga cgcctttagc tatattctag tactactaca 120
actccaagtg caggccaggg ccgagcccac gagac 155
<210> 129
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
tcgtcggcag cgtggaatac catgtgcaac ttgggggagt accgtgcaca gcttggggga 60
gtaccgtgtg cagtttggag gagtacggtg tgcagtttgc aggagtaccg tgtgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 130
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
tcgtcggcag cgttgaatgc tggcctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 60
ctcttgtgtg tgtgctgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtga gatagagaga 120
gagaccgagc ccacgagac 139
<210> 131
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
tcgtcggcag cgtttttaaa cattttagta ctgttcatat agatttcacc tcacacccca 60
ccctgcccca gccaataaat ccatatacac agacccactc aaactctcac ctgcagattc 120
tcagagccga gcccacgaga c 141
<210> 132
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
tcgtcggcag cgtgcaggtg gacgactgcc cagagagctg ctgcgagccc ccctgctgcg 60
ccccggcccc ctgcctgagc ctggtctgca ccccagtgag ccgtgtgtcc agccccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 133
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
tcgtcggcag cgtttgctgc acctcctccc cctgccagca ggcctgctgt gtgcctgtct 60
gctgcgtgcc cgtctgtaac aagcctgtgt gcttcgtgcc tacctgctcc gagtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 134
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
tcgtcggcag cgtcggcggt ttcttcggct ccagcctgcc cggccccccc ggccccccag 60
gcccacgtgg ctaccctggg attccagtaa gtcccagcct gtgcaggcag agccccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 135
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
tcgtcggcag cgtcttgaca ttggggcctt aagcatctcc tgggcatgat aaagtttttt 60
ttttttgttt ttttttttga gatggagtct tgtaatctcc tctttctggg ctcaagcgat 120
tctcctgccc gagcccacga gac 143
<210> 136
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
tcgtcggcag cgtacaattg gcctccagga ccgagagctc acctgctggg aggaggtgag 60
gggcacgggg agccagggcg caggtggagg aggtgagggg catggggaga caggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 137
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
tcgtcggcag cgtaagtccc cggaaaaggc caagtctcca acgaaggagg aagcaaagtc 60
cccttgagaa ggccaagtcc ccgagaaggc caagtcccca gagaaggaag aggccaagtc 120
ccctgagaag gcccgagccc acgagac 147
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<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
tcgtcggcag cgtcaagtct ccaacgaagg aggaagcaaa gtcccctgag aaggccaagt 60
cccctgagaa ggccaagtcc ccagtgaagg cagaagcaaa gtcccctgag aaggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 139
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
tcgtcggcag cgtgtcccca gcagctgccc ggctcctggt cctagagagc ctcgactcca 60
cctcagatct ggccagcacc tccccgtgag cgctcctcac cttgccggca tagtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 140
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
tcgtcggcag cgtccccacg ggtcctgctg caaacccccc agccactact gcaaaccccc 60
cagcacctgc cgcaaccccc acgggtcctg ctgcaaatcc cccagcccct gccgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 141
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
tcgtcggcag cgtaagggtg gaggtgcagg gctgggggca cggcttggca cccggcttgg 60
ggtggagttg cccggccggt ccaggaggtc atcgaggctg tggctgcccc ggagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 142
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
tcgtcggcag cgtccctgat gactcaggta cctggaaggc agctcgttcc cggggttcat 60
gggttgtcat ggggtcatgg gggacatgga ggtcatggag gtcatggggg tcacgggggt 120
catccgagcc cacgagac 138
<210> 143
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
tcgtcggcag cgtgcagcaa cagggagcag ggccaggaat aggccctgga atggccaacc 60
ataaacccca aggagttggc tacccaccac agcagcagca gcggatgcag catcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 144
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tcgtcggcag cgtcccctga ccactcctgt cctgggggcc cgtgtcctcc ctgccccccg 60
cccccccggc cactggatga ctctggagca ggtcccaggc acgttctcat tctgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 145
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
tcgtcggcag cgttgttatg ggtcagcctc tccgggatgg tggccgccaa cactcgggcc 60
cccgcaggac ccaagcccag ctcctgcgag tgggctgtgt gctgggcacc tgccccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 146
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
tcgtcggcag cgtggagtct aaggaacact gagtactccc cgggttgatc agctggagaa 60
ggggattagg gggattagga tgagaaggag gcaagaggac ggccccatcc tgtacagagt 120
caccgagccc acgagac 137
<210> 147
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
tcgtcggcag cgtggagtct aaggaacact gagtactccc cgggttgatc agctggagaa 60
ggggggatta gggattagga tgagaaggag gcaagaggac ggccccatcc tgtacagagt 120
caccgagccc acgagac 137
<210> 148
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
tcgtcggcag cgtgccctgc ttgttgttgt tgctgttgct gctgctgctg ctgctgctgc 60
tgctttatgt agagatggtt actatgaagg tgagatacac cttgagctgg aacaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 149
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
tcgtcggcag cgttcctcaa cgtcctcata gtcattctca ggctcgggct caggctcggg 60
ctcaaggctc aggctcggct caggctctgc ttcgtacact ggctcttcct ccacctggag 120
gccttcccga gcccacgaga c 141
<210> 150
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
tcgtcggcag cgtcagcagc cccagccccc gtagcagcag ccccagcagc agcagctcca 60
gcacccagca gtcccagcac agcagtccca gcagcagcag tcccagcagc agcagcccca 120
gcagcagctc cgagcccacg agac 144
<210> 151
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
tcgtcggcag cgtaacagct taaagacagt gtcccaggag aaaagagcat ccagagaggt 60
taggcacaca gatgaaatta tatgggatca aacctggaag aagaaaagga caaaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 152
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tcgtcggcag cgttgtgttg gtgacactgg agggaaatga tgtggtcatt tcatctggag 60
gagcgtctcc tgcgtaacat gtctccatca cattgtgtac acttggggaa gaaaaaagag 120
ttgatgtcac cgagcccacg agac 144
<210> 153
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
tcgtcggcag cgtcttctcc caaaaaagca cctggtacta agggtactgc tgctgctgct 60
gctggctgct gctgctgctc tgctgctgct gctaaagttc cagcaaaaaa gatcaccgcc 120
gcgagtaaac cgagcccacg agac 144
<210> 154
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
tcgtcggcag cgtgagcgtt ctgtggagag agtgcgaggt caggccatga acttggggta 60
agcaaggggt aagcggggta agctggggta agctggggta agcaaggtgg tcgtcagcgg 120
agagccgagc ccacgagac 139
<210> 155
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
tcgtcggcag cgtgttgccc aggctggagc acggggtttc accatgttag ccaggatgtt 60
ttgttttgtt ttgttttgtt ttgttttgtt ttgttttttc tttttttttt ttttgagatg 120
gaccgagccc acgagac 137
<210> 156
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
tcgtcggcag cgtgtgctgt tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 60
gctgtgttgc tgtctgctgc tgctgctgtt gctgttgctg tttctgctgc atgagtttgg 120
cccccgagcc cacgagac 138
<210> 157
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
tcgtcggcag cgtctgttgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct 60
gctgttgctg ttgctgtttc tgctgcatga gtttggccct ttgttgctgc tgtgccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 158
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
tcgtcggcag cgtgcttggc caacagtggg caggggtcca acagcctgac ccgccatccc 60
tgcccctgct ggttggggtg gaattgcaga gagctgccgg cccctggcct gtcaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 159
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
tcgtcggcag cgtaggcgga agaggcggcg gtgcgcggag ctgcggccca cgtaccacag 60
catctgcagc agcatgagcg ccgtcaggaa gcacagcagg tcgctcttgc tcacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 160
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
tcgtcggcag cgttttatag aaaccgaggt atgaaattcg ctggagggtc attgaatcaa 60
tcagatatat ttatgtggac ccgatgcagc tgccttatga ctcaagatgg gagtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 161
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
tcgtcggcag cgtcctggca caaggaaaaa ttgtgaagat ctgtgacttt ggcctggcca 60
gagattcgaa ctatgtgtcg aaaggcagtg tacgtcctca cttccctcac tggtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 162
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
tcgtcggcag cgtgcagcgg agcctggaag cgccaggttg ggaggacgcg gagcggaggg 60
agcggaggga gcggagggag cgtgaggagc gcgagcgcct ggaggcggag gaggagcgaa 120
ggcgtctgca ggccgagccc acgagac 147
<210> 163
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
tcgtcggcag cgtaagctag caagcaagca agcaaacaaa caatattctt ccctccctga 60
gcgcgcacac acacacacac acacacacac acacacacat agacttagta aattatttta 120
gcccgagccc acgagac 137
<210> 164
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
tcgtcggcag cgttgacagc agcgatagca gtgacagcag caacagcagt gacagcagtg 60
atagtagtga cagcagtgac agcaacgaaa gcagcaatag cagtgacagc agtgatagca 120
gcaccgagcc cacgagac 138
<210> 165
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
tcgtcggcag cgtcagcagt gacagcagcg acagcagtga tagcagtgaa agcagtgata 60
gcagcgatag cagtgacagc agcaatagca gtgacagcag cgatagcagc gacagcagcg 120
acaccgagcc cacgagac 138
<210> 166
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
tcgtcggcag cgtcagcagt gacagcagcg acagcagtga tagcagtgaa agcagtgata 60
gcagcaatag cagtgacagc agcgatagca gcgacagcag cgacagcagc gataccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 167
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
tcgtcggcag cgttagcagt gacagcagtg acagcagcga cagcagtgat agcagtgaca 60
gcagtgatag cagcgatagc agtgacagca gcaacagcag tgacagcagt gacagcagtg 120
aaagcagcga cagcagtgac accgagccca cgagac 156
<210> 168
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
tcgtcggcag cgtcagcagc aacagcagtg acagcagtga cagcagtgaa agcagcgaca 60
gcagcgatag cagcgacagc agtgacagca gcgacagcag tgacagcagc gatagcagcg 120
acagcagcga caccgagccc acgagac 147
<210> 169
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
tcgtcggcag cgtctgcagt aaatgctgca gttcagaggg tccaggttct tccagatgct 60
gatattttgc cacggaaagt actccagatg gattttcttg ttcatccagc ctgaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 170
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
tcgtcggcag cgtcaggccc ctggttcttg gatccagagg cgtctgaggt atgttcacag 60
gcactgctgc tgcctgctgc tgctgctgct gcctctgctc ttgccctcag tccccgtctt 120
tccccgagcc cacgagac 138
<210> 171
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
tcgtcggcag cgtgttcttg gatccagagg cgtctgaggt atgttcacag gcacctgctg 60
ctgcgctgct gctgctgctg cctgctgctg cctctgctct tgccctcagt ccccgtcttt 120
ccacctgggt ccccgagccc acgagac 147
<210> 172
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
tcgtcggcag cgtgattaac caactttttt atagacttca gcagaagtac agcctactta 60
ggtgttgttg ttgttgttgt tgttgttgtt ttgtttgaga tggagtcttg ctgtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 173
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
tcgtcggcag cgttgtcgtt ggaatgctca ttgttgttgg aacagttgtc gttggaacag 60
tcgttgtcgt tggaacagtg gtgctcgttc gaacagtcgt gacggttgga acagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 174
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
tcgtcggcag cgtgcaggcg ctcgcgggcc gagcccctta gcagccggcg ccggcgtcgg 60
cggcggcggc ggcggcggcc atggcctcct gcgtttgctc ctcccgcccc cggcgctctg 120
cggcggccgc cgagcccacg agac 144
<210> 175
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
tcgtcggcag cgtccttccc aagggcattc tctgcttcta cccagacttc aatgttgaca 60
aaatcaacag tgcatgaggt gggggtgtca cgttttgctt tgcaatcagc aaacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 176
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
tcgtcggcag cgtcttccca agggcattct ctgcttctac ccagacttca atgttgacaa 60
aataatcaac agtgcatgag gtgggggtgt cacgttttgc tttgcaatca gcaaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 177
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
tcgtcggcag cgtccactac aaccccgagg cccaccactg ccaccacccg ccgcacgacc 60
accaggcgtc caacaaccac agtccgaacc actacgcgga caaccaccac caccccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 178
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
tcgtcggcag cgtttggcgg gggcagcctg cctcgtcatg atttttatct cacctggtaa 60
gttgtctgct ttcatcattt cccaggcaat cgaagtgtgg ggaaagtgtt gtgaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 179
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
tcgtcggcag cgttgagact ccatcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaggaaag 60
aaaggaaaga aaaaagaaaa gctgtaagtc ctcacttcaa gtcattgtaa ggttttggaa 120
acccgagccc acgagac 137
<210> 180
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
tcgtcggcag cgtacagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 60
agcaacaggc agtggcagct gcagccgttc agcagtcaac gtcccagcag gcaaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 181
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
tcgtcggcag cgtccccaca gaacatcttc cagcagctac agacctggct caagctggca 60
aagggtgaag tctgaatctc ataccctttc cactccctgc atggtcacct cagtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 182
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
tcgtcggcag cgtattggtt tgaccaggca tgtcattcac atagccaccc acataataaa 60
tgcaatgaga aagtagattt gttgggggag taaattgaca aatcagaaga ttttccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 183
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
tcgtcggcag cgtttcctgt ttttaagatt ttgcctttgt tgttgaaaaa gtgttgcact 60
ctgtcaccaa ggctgtgtaa ttgtgacaca attacagctg attgcagcct caaccttccc 120
agcccgagcc cacgagac 138
<210> 184
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
tcgtcggcag cgtgccaccg ccgaagtcgc cgccgccgaa gtcgccgccg ccgaagtcgc 60
cgcctagggg gatgtagggg ctgcaggcca gctcgtcctc agacatggcg aagtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 185
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
tcgtcggcag cgtgtctgaa caatgctcag tctatggcga cccccgttac ctcacatttg 60
acggttctga tcaagactgt ggacgtactg cctgaggggg tggagcccct cctcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 186
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
tcgtcggcag cgttactcaa agaggatgtc aagtggccgc ccactctgca gccgcccact 60
ctgcagccgc ccgtggtgct gggtccccct gctccagacc ccagccccct ggctccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 187
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
tcgtcggcag cgtcagttta aaaacacttt ctgttctcat tatcaagata gtttaggctt 60
agttgttgtt tgtttttttt tttttttttt tttttttttt ttgagacaca gtcttactct 120
tgccgagccc acgagac 137
<210> 188
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
tcgtcggcag cgtcggacag agcgcaagtc ccacggaggg cgagccctga gccggacaga 60
gcgcgagtca cacggagggt gagcaccacg cgtgactcca acacacccac ctgtccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 189
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
tcgtcggcag cgtacagaca tgaccatggt catgacatgg gtcatgtcag gcacagacat 60
gacccagcaa gccaggccag caccacgcat agcaatggcc tcctcccctt tggcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 190
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
tcgtcggcag cgtagtgagc agtgaaaacc gaagcggcag aaggcagtgg cagcaggcag 60
tggcccaggc agaaatagct cccgcgcgat tcactggagc cttccccggg ccctccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 191
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
tcgtcggcag cgtcacacac cacacataca cgcaccacac atacacacac gtagacacac 60
cacagaaaca cacattaaca caccacatac acatatgtat gtgcatatac acacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 192
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
tcgtcggcag cgtgctaccc ttgcacttct ccttgcagcc cctgcagccc ctgcagcccc 60
tgcagcccat atgatccttg caacccgtgt tatccctgtg gaagccgatt ttccccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 193
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
tcgtcggcag cgtttctcct tgcagcccct gcagcccctg cagcccctgc aacccctgca 60
gcccatatga tccttgcaac ccgtgttatc cctgtggaag ccgattttcc tgtaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 194
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
tcgtcggcag cgtcgacgcc gccatgaggg cgcacgcagc cgcactgggg gtgcaaggtg 60
agggcgtgcg gggatggctg gggcaccaca gaagggagtc gggcggcgcg gaacccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 195
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
tcgtcggcag cgttcatcta tgtaaagaat tggaaaaagt agatctccct tcatgcgtgt 60
gcgcacatgc gtgcacgcgc gcacacacac acacacacac acacgcacac caatttgttt 120
aaccgagccc acgagac 137
<210> 196
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
tcgtcggcag cgtagagcac acggcagatc tgatggggct gtcaattgca gctctagagc 60
acacagcaga tctgatgggg ctgtcaattg cagctctaga gcacatcgca gaaaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 197
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
tcgtcggcag cgtgactagg ggactggcgg agggtgcacg ctgatggatt tactcaccgg 60
gtgccttgga gctccagcag ctgttggagc tccagcagct ggctggagcc cgcgatgacg 120
tcacggactc gggccgagcc cacgagac 148
<210> 198
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
tcgtcggcag cgtaaaaaaa cagacaatga aaacccaaat ataagtgagc attagctgaa 60
ttagtgtgtc ccctcttttg catttagatc aactgtgggc attatgtatt ctgcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 199
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
tcgtcggcag cgtgcctgcc tgggtgacag agcaagacac tgttgaaaga aagaaaagaa 60
aagggaaaga aaagaaaaga aagaaaagaa aagaaggaga gagagaaaga aaggaaggaa 120
ggaaggaagc cgagcccacg agac 144
<210> 200
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
tcgtcggcag cgtgggaaag ggacagggac ccctgcgggg ggagcggtgg tggtggcggc 60
ggcgggcggc ggcgcggcgg ctgcagtagc agcagcagct actgcagctt ccctccctcc 120
ttgccgagcc cacgagac 138
<210> 201
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
tcgtcggcag cgtcaccggg cccggcacaa ggcgcagcct gctcacgagg ctgtggagaa 60
ggaggccacg gagaaggagg ctgagatagt ggaagccgac aaggaaaagg agctccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 202
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
tcgtcggcag cgtaggagga tccacccgga gaggaggatc tacctggaga ggaggatcta 60
cctgaagtta agcctaaatc agaagaagag ggctccctga agttagagga tctaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 203
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
tcgtcggcag cgttttacaa ttcaagatga gatttgggtg aggacaatgc caaaccatat 60
cactggtagt tcttttactc tcccttactt gatttctttc ctggtcctat ctcaaaccct 120
tctggttttc tccgagccca cgagac 146
<210> 204
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
tcgtcggcag cgtcatcatc ccaccacatg ggagaacaga atggaatgga atggaatgaa 60
atgggaatgg aatgaatgga atgaaatgga atggaatgga atggaatgga atggaatgga 120
atcgccgagc ccacgagac 139
<210> 205
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
tcgtcggcag cgtaccacat gggagaacag aatggaatgg aatggaatga aatggaatgg 60
aatggaatgg aatggaatgg aatggaatgg aatcgaatcg aatcgaatcg aataccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 206
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
tcgtcggcag cgtgtttttc tgaacaggct gtggtgaaag catttcccat tcattgtcat 60
gggtaactgc atccgggcca gccctgcctc ggctcttact cttctgtgat tggcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 207
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
tcgtcggcag cgtgtgaagc ccacatgtct aggttcccag gacctgaact gattcgattt 60
cgagtgactg ttgcagatga ctgttgcagt gactgaggag gaatgtcagt ctcctctgcc 120
gtggagccga gcccacgaga c 141
<210> 208
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
tcgtcggcag cgtcatctct gccggcacca cctccacctc caccacgcca gcctctacca 60
cccctgcctc caccacaccg gcctccacca ccccggcctc caccagcacg gccagcagcc 120
aggcctcgcc cgagcccacg agac 144
<210> 209
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
tcgtcggcag cgtggttaca gccggagtga ccgctacgga gaagaaggct gctacgagga 60
gtacgaggcc gctcgcccaa cgcccacagc gagaggccgc tcgcccgacg cccacagcgg 120
gggccgcaac agttccagca accgagccca cgagac 156
<210> 210
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
tcgtcggcag cgtgcagcca ctccaagtct gccttcagtg ctgccaccag ccaccctaaa 60
cccatcaagc cagctaccag ccatgctgag cccaccactg ctgactatcc caagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 211
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
tcgtcggcag cgtctcttcc tcttcttctt cttcttcctc ctcctcctcc tcctcctgtt 60
gctttgctgc tgctgtctgc tgctgctgtt gctgcttctg ctgctgggct gcacgaaaga 120
gcctgtccga gcccacgaga c 141
<210> 212
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
tcgtcggcag cgtaaacaac taaacgccgc tttcctgcct caggatgaac tgacggcctt 60
gaataaccag cctgctgtct ctggggatga gcatggcagt gccaagaacg tcagccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 213
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
tcgtcggcag cgtaacaact aaacgccgct ttcctgcctc aggatgaact gacggccttg 60
aatgctgtct ctggggatga gcatggcagt gccaagaacg tcagcttcaa tcctccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 214
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
tcgtcggcag cgtacaacta aacgccgctt tcctgcctca ggatgaactg acggccttga 60
atgtctctgg ggatgagcat ggcagtgcca agaacgtcag cttcaatcct gccaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 215
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
tcgtcggcag cgtgccgctt tcctgcctca ggatgaactg acggccttga atgtaaaaca 60
aggtcctgct gtctctgggg atgagcatgg cagtgccaag aacgtcagct tcaaccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 216
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
tcgtcggcag cgtgccgctt tcctgcctca ggatgaactg acggccttga atgtaaaaca 60
aggtgtctct ggggatgagc atggcagtgc caagaacgtc agcttcaatc ctgcccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 217
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
tcgtcggcag cgtcctgcct caggatgaac tgacggcctt gaatgtaaaa caaggtttca 60
ataatgggga tgagcatggc agtgccaaga acgtcagctt caatcctgcc aaggccgagc 120
ccacgagac 129
<210> 218
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
tcgtcggcag cgtctcagga tgaactgacg gccttgaatg taaaacaagg tttcaataac 60
cagcatggca gtgccaagaa cgtcagcttc aatcctgcca aggtgagaca actcccgagc 120
ccacgagac 129
Claims (10)
1.一种检测肿瘤生物标志物的探针库，所述肿瘤生物标志物包括肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性，所述探针库包括多条捕获探针，其特征在于：包括针对人类全外显子的蛋白编码区设计的野生型探针、针对插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针、针对第一特定基因的全长序列设计的野生型探针、针对第二特定基因的突变位点设计的突变型探针以及针对微卫星不稳定性位点设计的野生型探针，所述第一特定基因包括EGFR、MET、ERBB2、BRCA1、BRCA2、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2和AR，所述插入和/或缺失突变位点包括表a所示的位点，所述第二特定基因包括如表b所示的基因，所述微卫星不稳定性位点包括NR21、NR25、NR27、BAT25和BAT26，并且在所述多条捕获探针的上游设置有第一附加序列，在所述多条捕获探针的下游设置有与所述第一附加序列不同的第二附加序列，所述第一附加序列和所述第二附加序列均具有与通用引物结合的位点。
表a
表b
2.如权利要求1所述的探针库，其特征在于：
所述第一附加序列为TCGTCGGCAGCGT，所述第二附加序列为CCGAGCCCACGAGAC。
3.如权利要求1所述的探针库，其特征在于：
在所述探针库中，针对所述插入和/或缺失突变位点设计的野生型探针的探针密度最大。
4.如权利要求1所述的探针库，其特征在于：
所述第二特定基因的突变位点包括位于蛋白编码区的第一类突变位点和位于非蛋白编码区的第二类突变位点。
5.如权利要求4所述的探针库，其特征在于：
所述第一类突变位点包括表c所示的突变位点，所述第二类突变位点包括CD74-exon7-ROS1-exon33融合、TPM3-exon7-ROS1-exon33融合、EML4-exon13-ALK-exon20融合、EML4-exon6-ALK-exon20融合、EML4-exon18-ALK-exon20融合、RANBP2-exon18-ALK-exon20融合、EML4-exon20-ALK-exon20融合、IGH-chr14-exon1-MYC-chr8-exon2融合、KIF5B-exon16-RET-exon12融合、KIF5B-exon15-RET-exon12融合。
表c
6.如权利要求1所述的探针库，其特征在于：
所述微卫星不稳定性位点包括如表d所示的位点。
表d
7.一种检测肿瘤生物标志物的方法，其特征在于：
(a)准备样本DNA并构建DNA文库；
(b)将所述DNA文库与权利要求1至6中任一项所述的探针库进行杂交以获得杂交文库；并且
(c)扩增所述杂交文库以获得捕获文库，并对所述捕获文库进行测序，以检测肿瘤生物标志物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述样本DNA提取自人源样本，并在步骤(b)中，使用人源性DNA封闭剂对人类基因组重复序列进行封闭。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中，所述样本DNA经片段化处理，接着进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行扩增获得所述DNA文库；并且
在步骤(b)中，使用接头封闭剂对所述测序接头进行封闭。
10.一种检测肿瘤生物标志物的试剂盒，其特征在于：
包括权利要求1至6中任一项所述的探针库。
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