JP2024519596A - 核酸ハイブリダイゼーションのためのエンハンサーオリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、核酸ハイブリダイゼーションのための改善された方法および組成物を含み、改善はエンハンサーオリゴヌクレオチドの使用を含む。標的の濃縮は、プローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを使用して行われる。フォワードおよびリバースプライマー結合部位は、ユニバーサルプライマー結合部位であり得る。

Description

発明の背景
標的の濃縮（ＴＥ）技術は、ヒト疾患研究および臨床応用を含むゲノム研究において広く利用されている。これらの技術は、全ゲノム配列決定などの全ゲノム解析と比較して、集中的で費用対効果の高い解決策を提供する。ゲノム中の目的の領域のみに解析を集中することによって、疾患または表現型関連の遺伝子バリアントおよび他の関連するゲノムの特徴を同定することができ、ならびにそのような特徴に対して費用対効果の高い臨床診断アッセイを設計することができる。
最初に、標的の濃縮では、ゲノム試料などの高複雑性な試料中の目的の領域を捕捉するために、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プローブおよびプローブプールを利用した。最近では、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プローブがＴＥワークフローにおいて普及している。ｄｓＤＮＡプローブは、標的領域のプラス（＋）およびマイナス（－）鎖の両方を捕捉する能力が好ましく、それによってＤＮＡ鎖の捕捉バイアスを最小限に抑えることによってデータ品質を改善する。残念なことに、これらのプローブの二本鎖の性質は、自己アニーリング、交差アニーリングおよび他のアーチファクトを引き起こし、アッセイ性能の低下および最終的にはアッセイ感度の喪失をもたらす。
費用対効果の高いゲノム解析を臨床に持ち込む際の標的濃縮の重要性を考慮すると、標的の濃縮アッセイにおけるプローブの性能を改善する必要がある。
一実施形態では、本発明は、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む、核酸ハイブリダイゼーションのための組成物である。いくつかの実施形態では、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下で、複数の核酸標的に特異的にハイブリダイズすることができる複数のプローブオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。いくつかの実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは二本鎖である。いくつかの実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの実施形態では、すべてのプローブオリゴヌクレオチドは、同じ第１のプライマー結合領域および同じ第２のプライマー結合領域を有する。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの混合物を含む。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域の各鎖にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの混合物を含む。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、それぞれが第１のプライマー結合領域または第２のプライマー結合領域のワトソン鎖またはクリック鎖の一方にハイブリダイズすることができる４のオリゴヌクレオチドの混合物を含む。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、４つのグループにグループ分けされる４を超えるオリゴヌクレオチドの混合物を含み、オリゴヌクレオチドの各グループは、第１のプライマー結合領域または第２のプライマー結合領域のワトソン鎖またはクリック鎖の一方にハイブリダイズすることができる。
一実施形態では、本発明は、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む、核酸標的の濃縮のための組成物である。いくつかの実施形態では、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸との混合物中に存在する複数の核酸標的に特異的にハイブリダイズすることができる複数のプローブオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、標的核酸と非標的核酸との混合物をさらに含む。いくつかの実施形態では、
一実施形態では、本発明は、標的核酸を濃縮する方法であり、方法は、標的核酸と非標的核酸との混合物を、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む組成物と接触させることと、ハイブリダイゼーション条件下で混合物をインキュベートすることと、プローブが結合した標的核酸を未結合核酸から分離することと、を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸、非標的核酸、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチド、および１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドの各々は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、方法は、ハイブリダイゼーションの前に、核酸の変性をもたらす条件下で混合物をインキュベートすることをさらに含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸と非標的核酸との混合物は、生物のゲノムＤＮＡを構成する。いくつかの実施形態では、標的核酸と非標的核酸との混合物は、生物のゲノムＤＮＡから形成されたライブラリを構成する。いくつかの実施形態では、ライブラリは、生物から単離された核酸を含み、各核酸は、少なくとも１つのアダプター核酸、例えば２つのアダプター核酸にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、アダプター核酸は、核酸バーコードおよびユニバーサルプライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、プローブオリゴヌクレオチドに存在する捕捉部分を介してハイブリダイズした核酸を捕捉することによって、混合物から任意の一本鎖核酸を除去することをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、標的核酸と非標的核酸との混合物を、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む組成物と接触させることと、ハイブリダイゼーション条件下で混合物をインキュベートすることと、プローブと標的核酸との間に形成されたハイブリッドを捕捉して濃縮された核酸を得ることと、濃縮された核酸を配列決定することと、を含む、核酸を配列決定する方法である。いくつかの実施形態では、標的核酸、非標的核酸、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチド、および１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドの各々は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション前に変性が必要である。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、濃縮された核酸のユニバーサルプライマー結合部位に結合するユニバーサルプライマーを用いて、濃縮された核酸を増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法によって形成される核酸の濃縮ライブラリである。
一実施形態では、本発明は、標的核酸および非標的核酸を含む複数の核酸と、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む、反応混合物である。いくつかの実施形態では、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸との混合物中に存在する複数の核酸標的に特異的にハイブリダイズすることができる複数のプローブオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸および非標的核酸を含む複数の核酸は、生物のゲノムＤＮＡから形成されたライブラリを構成し、ライブラリは、生物から単離された核酸を含み、各核酸は少なくとも１つのアダプター核酸にコンジュゲートされている。
一実施形態では、本発明は、患者の疾患または症状を評価する方法であり、方法は、患者から核酸含有試料を準備することと、本明細書に記載の方法によって試料中の標的核酸を濃縮することと、濃縮された標的核酸において、疾患または症状のバイオマーカーであることが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することによって、患者の疾患または症状を検出することと、を含む。
一実施形態では、本発明は、患者の疾患または症状の処置を選択する方法であり、方法は、疾患または症状を有する患者から核酸含有試料を準備することと、本明細書に記載の方法によって試料中の標的核酸を濃縮することと、濃縮された標的核酸において、疾患または症状のバイオマーカーであることが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することと、濃縮された核酸で検出された変異に対して適切な処置を選択することと、を含む。
一実施形態では、本発明は、患者のがん性腫瘍の存在を診断またはスクリーニングする方法であり、方法は、患者から核酸含有試料を準備することと、本明細書に記載の方法によって試料中の標的核酸を濃縮することと、濃縮された核酸において、がん性腫瘍の存在を示すことが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することによって、患者のがん性腫瘍の存在を検出することと、を含む。
一実施形態では、本発明は、腫瘍の変異状態に基づいて患者のがん性腫瘍を標的とする処置を選択する方法であり、方法は、患者から核酸含有試料を準備することと、本明細書に記載の方法によって試料中の標的核酸を濃縮することと、濃縮された核酸において、がん性腫瘍で変異していることが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することと、見つかった変異状態を標的とする処置を選択することと、を含む。
一実施形態では、本発明は、腫瘍の成長または縮小をモニタリングする方法であり、方法は、患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を定期的にサンプリングすることと、本明細書に記載の方法によってｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、がん性腫瘍で変異していることが公知の標的配列中の１つまたはそれを超える変異を含む変異したｃｆＤＮＡの量の変化を検出することと、を含み、このような変異したｃｆＤＮＡのレベルの増加は腫瘍の成長を示す一方、このような変異したｃｆＤＮＡのレベルの減少は腫瘍の縮小を示す。
一実施形態では、本発明は、患者のがんの処置の有効性をモニタリングする方法であり、方法は、患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を定期的にサンプリングすることと、本明細書に記載の方法によってｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、がん性腫瘍で変異していることが公知の標的配列中の１つまたはそれを超える変異を含むｃｆＤＮＡの量の変化を検出することと、を含み、このような変異ｃｆＤＮＡのレベルの増加は腫瘍の成長および処置の無効性を示す一方、このような変異ｃｆＤＮＡのレベルの減少は腫瘍の縮小および処置の有効性を示し、このような変異ｃｆＤＮＡの安定したレベルは安定した疾患および処置の有効性を示す。
一実施形態では、本発明は、がん患者の微小残存病変（ＭＲＤ）の診断方法であって、方法は、患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を得ることと、本明細書に記載の方法によってｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、濃縮されたｃｆＤＮＡにおいて、がん性腫瘍で変異していることが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を検出することと、を含み、変異したｃｆＤＮＡの存在は、患者のＭＲＤの存在を示す。
一実施形態では、本発明は、核酸の改善されたハイブリダイゼーションのためのキットであり、これは、１またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチド、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドは二本鎖であり、キットは、４つのプライマー結合領域にハイブリダイズすることができる４のエンハンサーオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸の精製および分離のための試薬、核酸のライブラリを形成するための試薬、核酸を増幅するための試薬、および核酸を配列決定するための試薬のうちの１つまたは複数を含む。
一実施形態では、本発明は、標的核酸を濃縮する方法であり、方法は、標的核酸と非標的核酸との混合物を、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含み、第１のプライマー結合領域が、固体支持体に付着した捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、プローブオリゴヌクレオチドと、第２のプライマー結合領域にハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む組成物と接触させることと、ハイブリダイゼーション条件下で混合物をインキュベートすることと、混合物を、捕捉オリゴヌクレオチドからの第１のプライマー結合領域の解離に適した条件下で、第１のプライマー結合領域にハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと接触させることによって、プローブが結合した標的核酸を未結合核酸から分離することと、を含む。
エンハンサーオリゴヌクレオチドの設計および操作を示す図である。 エンハンサーオリゴヌクレオチドの設計および操作を示す図である。 エンハンサーオリゴヌクレオチドの設計および操作を示す図である。
エンハンサーオリゴヌクレオチドの存在下でハイブリダイゼーションによって濃縮された核酸に対して行った配列決定の結果を示す。 エンハンサーオリゴヌクレオチドの存在下でハイブリダイゼーションによって濃縮された核酸に対して行った配列決定の結果を示す。
発明の詳細な説明
定義
以下の定義は、本開示の理解を助ける。このセクションで具体的に定義されていないすべての技術用語は、通常および通例の意味を有する。
「プローブ」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドを含む核酸（一本鎖または二本鎖のいずれか）を指す。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には天然に存在する核酸よりも短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドおよび核酸という用語は、互換的に使用され得る。別段の記載がない限り、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。
「エンハンサーオリゴヌクレオチド」という用語は、ハイブリダイゼーションプローブの性能を改善する、ハイブリダイゼーションプローブに存在するある特定のエレメントにハイブリダイズする特異的特性を有する、本明細書に記載および特許請求されるオリゴヌクレオチドの種類を指す。
「ブロッカーオリゴヌクレオチド」という用語は、例えば配列決定のために調製された核酸ライブラリを含むハイブリダイゼーション反応に添加されるオリゴヌクレオチドを指す。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、すべてのライブラリ分子に存在するある特定のエレメントにハイブリダイズし、それをブロックする特異的特性を有する。いくつかの市販のブロッカーオリゴヌクレオチドは、「ユニバーサルエンハンサーオリゴヌクレオチド」という名称で販売されている。疑義を回避するため、本明細書で定義される「エンハンサーオリゴヌクレオチド」という用語は、「ユニバーサルエンハンサーオリゴヌクレオチド」とは異なる。「ユニバーサルエンハンサーオリゴヌクレオチド」という用語は、本開示では使用されない。
「プライマー結合領域」という用語は、増幅プライマーが鎖合成を開始するために結合する、核酸内の配列であるプライマー結合部位を含む。本開示の文脈では、「プライマー結合領域」という用語は、プライマー結合部位の逆相補体をさらに含む。例えば、プライマーを用いた増幅から生じる二本鎖核酸は、４つのプライマー結合領域を含み、２つの鎖の各々の２つの末端の各々に１つの領域を含み、２つのプライマー結合領域はプライマー結合部位であり、他の２つのプライマー結合領域はプライマー結合部位の逆相補体である。
標的の濃縮（ＴＥ）技術は、ライフサイエンスおよびヒト疾患研究および臨床応用の一部として、ゲノム研究において広く利用されている。標的の濃縮は、疾患および表現型関連遺伝子バリアントおよびゲノム領域の同定において、全ゲノム配列決定と比較して、集中的で費用対効果の高い解決策を提供する。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）プローブは、濃縮対象の標的領域のプラス（＋）およびマイナス（－）鎖の両方を捕捉するそれらの能力のために、近年ＴＥワークフローにおいて一般的な種類のプローブになっている。ｄｓＤＮＡプローブは、ＤＮＡ鎖の捕捉バイアスを最小限に抑えることによってデータ品質を改善する。生産コストを制御するために、主要なｄｓＤＮＡプローブプロバイダは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によって、これらのプローブを大量に製造する。ＰＣＲを可能にするために、生産される各ｄｓＤＮＡプローブの末端にプライマー結合部位（ＰＢＳ）を含めなければならない。ＰＢＳは、通常、プローブのロットまたはプールの一部として、製造業者によって合成されたすべてのプローブにおいて同一である。製造コストを削減しながらでの、これらプライマー結合部位の生産は、プローブ性能を損なうアーチファクトの形成をもたらす。性能の低下は、プローブ分子のプラス（＋）鎖およびマイナス（－）鎖がこれらの相補的ＰＢＳを介してコンカテネートする（図１Ａ、左上）、または自己アニールもしくは交差アニールする（図１Ａ、左下）傾向に起因する。これらのアーチファクトは、ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼし、したがって、最適以下での標的の濃縮および下流での分析、例えば核酸配列決定の質の低下をもたらす。
ハイブリダイゼーションブロッカーは、当技術分野で公知である。しかしながら、ハイブリダイゼーションブロッカーオリゴヌクレオチドは、従来、核酸のライブラリにおいてアダプター配列をブロックするために使用される（ＵＳ２０２００１０２６１１を参照）。標的の濃縮ハイブリダイゼーションの間、そのようなブロッカーオリゴヌクレオチドはライブラリ分子に結合し、ハイブリダイゼーションプローブには結合しない。既存のブロッカーオリゴヌクレオチドは、ライブラリ分子のアダプター－アダプターハイブリダイゼーションを妨げ、ハイブリダイゼーションプローブに関連する問題またはアーチファクトのいずれにも対処しない。例えば、ハイブリダイゼーションプローブのコンカテネーション、交差アニーリングまたは自己アニーリングの問題は、既存のブロッカーによっては対処されない。
本開示は、ハイブリダイゼーションプローブ、例えば標的の濃縮ハイブリダイゼーションプローブに関連する問題に対する解決策を提供する。本発明は、捕捉効率および標的の濃縮性能を改善するプローブエンハンサーオリゴヌクレオチド（ｄＰＥＯ）を含む。エンハンサーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブのプール間で共有される共通の配列に結合するように設計される。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡプローブに存在するプライマー結合部位に結合するように設計される。ＰＣＲは、ハイブリダイゼーションプローブの製造において一般的に用いられる。そのような場合、各プローブは、フォワードおよびリバースのユニバーサルプライマー結合部位を含む。本発明のエンハンサーオリゴヌクレオチドは、これらのユニバーサル部位に結合し、かつハイブリダイゼーション混合物中のプローブ間の望ましくない相互作用を防止するように設計される。結果として、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、プローブのコンカテネーションを最小限に抑え（図１Ｂ左上に示す）、再アニーリングまたは交差アニーリングした二本鎖プローブの広がりを抑え（図１Ｂ、左下）、したがってハイブリダイゼーション反応における有効なプローブ分子の数を増加させる。異なる用量のエンハンサーオリゴヌクレオチドを用いて生成された配列決定データの総括である、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、エンハンサーオリゴヌクレオチドの使用は、用量依存的に、捕捉の均一性を改善し（図２Ａ）、リード重複レベルを低下させる（図２Ｂ）。
本発明の様々な態様を以下でさらに詳細に説明する。
本発明は、試料からの核酸を操作する方法を含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象または患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、生検によって、対象または患者に由来する固形組織または固形腫瘍の断片を含み得る。試料はまた、核酸を含み得る体液（例えば、尿、痰、血清、血液もしくは血液分画、すなわち、血漿、リンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、または糞便試料）を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する血漿試料または尿試料である。他の実施形態では、試料は、培養された試料、例えば、核酸が単離され得る細胞および流体を含む組織培養物である。いくつかの実施形態では、試料中の目的の核酸は、ウイルス、細菌、原虫または真菌などの感染性病原体に由来する。
本発明は、試料から単離または抽出された、単離された核酸を操作することを含む。核酸抽出の方法は、当技術分野で周知である。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、１９８９年、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。生物学的試料から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出するための様々なキット（例えば、ＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．））、ならびにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌ．）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）；Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）；およびＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌ．）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌ．）からの他の同様の製品などが市販されている。
いくつかの実施形態では、例えば公開ＷＯ２０１９０９２２６９およびＷＯ２０２００７４７４２に記載されているように、核酸は抽出され、サイズによって分離され、任意に、エピタコフォレーシスによって濃縮される。
標的の濃縮は、試料または反応混合物中の、１もしくは複数の標的核酸を捕捉するか、または１つもしくは複数の標的核酸を任意の非標的核酸から分離する方法である。いくつかの実施形態では、標的の濃縮は、試料または反応混合物中に存在する任意の非標的核酸の濃度に対して、１つまたはそれを超える標的核酸の濃度を増加させる方法である。
標的核酸は、試料中に存在し得る目的の核酸である。各標的は、その核酸配列によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、遺伝子または遺伝子断片（エクソンおよびイントロンを含む）である。いくつかの実施形態では、標的は、融合事象に関与する遺伝子、遺伝子断片または遺伝子間領域、例えば、融合のブレイクポイントが位置する領域である。いくつかの実施形態では、標的はＲＮＡで存在し、遺伝子転写物またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、バイオマーカー、すなわち、一塩基変異（ＳＮＶ）、コピー数変異（ＣＮＶ）または遺伝子融合などのバリアントが疾患または症状に関連する遺伝子を含む。例えば、標的核酸は、２０１５年９月１０日に出願された米国特許出願第１４／７７４，５１８号に記載されている疾患関連マーカーのパネルから選択され得る。そのようなパネルは、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ分析キット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．）として入手可能である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、表１または表２に列挙された遺伝子のうちの１つまたは複数である。
Figure 2024519596000001
Figure 2024519596000002
いくつかの実施形態では、標的核酸は、臨床的に関連する遺伝子融合に関与する１またはそれを超える遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、腫瘍において融合を受けることが公知の１またはそれを超える遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、以下の遺伝子に関連する１つまたはそれを超える融合部位である：ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＮＴＲＫ１、ＡＬＫ、ＰＰＡＲＧ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＡＸＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＢ、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＰＯＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＦＧＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＡＭＬ２、ＭＡＳＴ１、ＭＡＳＴ２、ＭＳＭＢ、ＭＵＳＫ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＵＭＢＬ、ＮＵＴ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＫＮ１、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＬＡ、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＳＹＫ、ＴＥＲＴ、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＨＡＤＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＳＬＰ、ＴＹ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＢＦＢ、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＩＣ、ＣＲＦＬ２、ＤＵＳＰ２２、ＥＰＣ１、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＧＬＩ１、ＧＬＩＳ２、ＨＭＧＡ２、ＪＡＺＦ１、ＫＭＴ２Ａ、ＭＡＬＴ１、ＭＥＡＦ６、ＭＥＣＯＭ、ＭＫＬ１、ＭＫＬ２、ＭＴＢ、ＮＣＯＡ２、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＬＡＧ１、ＲＢＭ１５、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ６、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＦＧ、ＴＹＫ２、ＵＳＰ６、ＹＷＨＡＥ、ＡＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＲＢ８４、ＦＬＴ３、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ４、ＭＹＢＬ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ４、ＮＵＴＭ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ５１Ｂ、およびＲＢ１。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡメチル化などのエピジェネティック改変に関与する１つまたはそれを超える遺伝子またはゲノム領域である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムの維持またはミスマッチの修復に関与する１つまたはそれを超える遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示すマイクロサテライト遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、変異したときにマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の表現型を付与することが公知のミスマッチ修復に関与する１つまたはそれを超える遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、例えば逆転写を介した、ＲＮＡに由来するｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞ＤＮＡを含むＤＮＡ、または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）および無細胞胎児ＤＮＡを含む無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。標的核酸は、短いまたは長い形態で存在し得る。いくつかの実施形態では、より長い標的核酸は、以下に記載されるように、酵素的または物理的処理によって断片化される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、例えば、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、天然に断片化されたＤＮＡか、または化学的に保存されたもしくは古い試料に見られるものなどの化学的に分解されたＤＮＡである。
本発明は、試料中の目的の核酸（標的核酸）を標的とするハイブリダイゼーションプローブの使用を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、一本鎖または二本鎖核酸のいずれかである。いくつかの実施形態では、プローブは、１つを超える、例えば、最大１０，または１０～１００プローブ、または１００～５００プローブ、または５００～１，０００プローブ、または１，０００～１０，０００プローブのプールである。いくつかの実施形態では、各標的遺伝子座、すなわち目的の遺伝子または領域に対して１つのプローブが存在する。他の実施形態では、目的の同じ遺伝子または領域をカバーする複数のプローブ、例えば２～１０プローブ、または１０～１００プローブ、または１００～５００プローブが存在する。特注のプローブおよびプローブプールを含む、多くの生物特異的ハイブリダイゼーションプローブおよびプローブプールが利用可能である。一般に、ハイブリダイゼーションプローブは、例えばＰＣＲまたは非指数関数的増幅法による増幅を含むワークフローによって製造される。このため、プローブは、例えばユニバーサルプライマー結合部位などの増幅プライマー結合部位を含む。
本発明は、プローブの増幅プライマー結合部位、例えばユニバーサルプライマー結合部位に特異的なエンハンサーオリゴヌクレオチドの使用を含む。これらのエンハンサーオリゴヌクレオチドは、現在入手可能な（例えば、ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＣａｐワークフローの一部としての）「ユニバーサルエンハンサーオリゴヌクレオチド」とは異なる。既存のユニバーサルエンハンサーオリゴヌクレオチドは、ライブラリ分子のアダプター配列に結合する。対照的に、本発明のエンハンサーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブのプライマー結合部位に結合するように設計されている。（図１Ｂ）いくつかの実施形態では、図１Ｂに示すように、それぞれが二本鎖プローブオリゴヌクレオチドのフォワードおよびリバースプライマー結合部位に相補的であり、フォワードおよびリバースプライマー結合部位に逆相補的である４のエンハンサーオリゴヌクレオチドが添加される。他の実施形態では、例えば、プローブが一本鎖である場合、上記の４より少ないエンハンサーオリゴヌクレオチドが添加される。
いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、プライマー結合部位と同じ長さを有する。他の実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、プライマー結合部位より短いかまたは長い。当業者は、所与のハイブリダイゼーション条件（例えば、標的の濃縮に使用される条件）で、エンハンサーオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブのプライマー結合部位と安定なハイブリッドを形成し、そうして、本明細書に記載の所望のハイブリダイゼーションの増強を達成するように、エンハンサーオリゴヌクレオチドの最適な長さを決定することができる。
当業者はさらに、使用されるエンハンサーオリゴヌクレオチドの数に応じて、各二本鎖ハイブリダイゼーションプローブに結合するために１～４つの間のエンハンサーオリゴヌクレオチドが必要であるという事実を考慮して、エンハンサーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションプローブの間で所望の比を計算することができる。いくつかの実施形態では、プローブとエンハンサーオリゴヌクレオチドとのモル比は、１：４である。他の実施形態では、モル過剰のエンハンサーオリゴヌクレオチドが、プローブとエンハンサーオリゴヌクレオチドとのモル比が１：６、１：８、１：１０またはそれを超えるように添加される。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドの最終濃度は、約０．２ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．００２ｍＭ、または０．０００２ｍＭである。原則として、プローブに対してモル過剰のエンハンサーオリゴヌクレオチドを有することが有益であり得る。
標的の濃縮プロセスで用いられるハイブリダイゼーション条件下で、温度（Ｔｍ）によって所望の融解を有するようにエンハンサーオリゴヌクレオチドの設計を最適化することが有益であり得る。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドの予測Ｔｍは、実験的に、または手動計算またはこの目的のために利用可能なインシリコツールのいずれかを用いて求められる。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドの所望のＴｍは、標的の濃縮で用いられるハイブリダイゼーション条件において使用されるインキュベーション温度よりも高い。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドの所望のＴｍは、仮想的なプローブ－プローブハイブリッドのＴｍよりも高いか、または二本鎖プローブのＴｍよりも高い。そのような高いＴｍを達成するために、いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、例えば、５－メチルシトシン、２，６－ジアミノプリン、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、リボヌクレオチド、２’Ｏ－メチルリボヌクレオチドまたはロックド核酸から選択される、１つまたはそれを超える改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド改変物を含む。
エンハンサーオリゴヌクレオチドの長さも融解温度に影響する。プライマー結合部位は、より多くの場合には約１０～２０ヌクレオチド長であるが、約１０および約４０ヌクレオチド長の間であってもよい。エンハンサーオリゴヌクレオチドの長さは、ブロックされるプライマー結合部位の長さと正確に一致する必要はない。例えば、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、エンハンサーオリゴヌクレオチドの片側または両側で、ブロックされるプライマー結合部位よりも１つまたはそれを超えるヌクレオチド短いものであり得る。
また、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、ブロックされるプライマー結合部位に完全に相補的である必要はない。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、ブロックされるプライマー結合部位に対して１００％未満の相補性、例えば９０％超、８０～９０％、または７０～８０％の相補性である。
いくつかの実施形態では、試料中の核酸はライブラリの形態で存在する。いくつかの実施形態では、ライブラリは、生物のゲノムＤＮＡから形成される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、ゲノムライブラリである。ライブラリは、配列決定、増幅または別の種類の検出方法などの下流での用途を可能にするように改変された複数の核酸からなる。ライブラリは、例えば、試料中の複数の核酸に１つまたはそれを超える共通エレメントを付加することによって、試料中の複数の核酸から形成される。
いくつかの実施形態では、ライブラリは、共通のアダプター分子を、試料中の核酸の一方または両方の末端に付加することによって形成される。様々な形状および機能のアダプターが当技術分野で公知である（例えば、２０１９年２月２８日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５１５、ＵＳ８８２２１５０およびＵＳ８４５５１９３を参照）。いくつかの実施形態では、アダプターは、核酸バーコード、プライマー結合部位およびライゲーション可能部位などのある特定のエレメントを含む。アダプターは、バーコード、プライマー結合部位、およびライゲーション可能部位から選択される少なくとも１つのエレメントを含む。アダプターは、二本鎖、部分的に一本鎖、または一本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、Ｙ字形、ヘアピンアダプターまたはステムループアダプターが使用され、アダプターの二本鎖部分は、本明細書に記載されているように、形成された二本鎖核酸にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、アダプターは、インビトロで合成された人工配列である。他の実施形態では、アダプターは、インビトロで合成された天然に存在する配列である。さらに他の実施形態では、アダプターは、単離された天然に存在する分子または単離された非天然分子である。
いくつかの実施形態では、アダプターは、試料中で複数の核酸にアニーリングしたアダプター配列含有プライマーを伸長することによって付加される。このようなプライマーは、「テイルドプライマー」と称される。テイルドプライマーは、標的にハイブリダイズする３’部分、およびアダプター配列を含む非ハイブリダイズ５’テイルを含む。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイズ配列は、ライブラリ中の１の核酸に特異的、例えば遺伝子特異的である。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイズ配列は、１種類の核酸、例えばポリＴ配列に特異的である。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイズ配列は、ランダム、例えばランダムヘキサマーのヌクレオチド配列である。試料中の核酸にハイブリダイズしたテイルドプライマーの伸長時に、核酸は適合された核酸のライブラリを形成する。
いくつかの実施形態では、アダプターは、試料中の複数の核酸の各々の末端にライゲーションによって付加される。いくつかの実施形態では、アダプターは、オーバーハングまたは平滑末端を有する、二本鎖であるかまたは部分的に二本鎖化されたアダプターオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ライゲーションを適用して平滑末端化アダプターをライゲーションされ得る、平滑末端を含み得る。他の実施形態では、平滑末端化されたＤＮＡは、単一のＡヌクレオチドが平滑末端の３’末端に付加されるＡテイリングを受ける。対応するアダプターは、ＤＮＡおよびアダプターの間のライゲーションを容易にするために、平滑末端の３’末端から伸長する単一のＴヌクレオチドを有するように設計される。アダプターライゲーションを行うための商業的に入手可能なキットとしては、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ＫｉｔまたはＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐおよびＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アダプターがライゲートした（適合した）ライブラリ核酸は、試料中の過剰なアダプターおよびライゲートされていない核酸から分離され得る。
いくつかの実施形態では、ライブラリ核酸に存在するアダプターは、核酸の配列決定で使用される。大規模並列配列決定によって個々の分子を分析することは、典型的には、試料の同定およびエラー補正のために、異なるレベルのバーコード化を必要とする。米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号、および同第８，７２２，３６８号に記載されているような分子バーコードの使用。ユニークな分子バーコードを、配列決定される各分子に付加して、分子およびその子孫（例えば、元の分子およびＰＣＲによって生成されたそのアンプリコン）をマークする。ユニークな分子識別子バーコード（ＵＩＤ）（ユニークな分子識別子（ＵＭＩ）としても公知）は、試料中の元の標的分子の数の計数およびエラー補正を含む複数の用途を有する（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．ら、（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９）。
いくつかの実施形態では、ユニークな分子バーコード（ＵＩＤ）は、配列決定のエラー補正のために使用される。単一の標的分子の子孫全体が同じバーコードでマークされ、バーコード化されたファミリーを形成する。バーコード化されたファミリーのすべてのメンバーによって共有されていない配列内の変動は、アーチファクトして破棄される。ファミリー全体が、元の試料中の単一分子を表すので、バーコードはまた、位置重複排除（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｄｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）および標的の定量に使用され得る（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．ら、（２０１６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：５４７）。
本発明のいくつかの実施形態では、バーコード化された標的核酸の一方または両方の末端にライゲーションされたアダプターは、配列決定で使用される１つまたはそれを超えるバーコードを含む。バーコードは、試料が混合（多重化）される場合、試料の供給源を識別するために使用されるＵＩＤまたは多重試料ＩＤ（ＭＩＤまたはＳＩＤ）であり得る。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードは、ＵＩＤおよびＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、予め定義された配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、バーコードは、約４～２０塩基長の間であり、その結果、９６～３８４個の異なるアダプター（各々が、同一バーコードの異なるペアを有する）が、ヒトゲノム試料に付加される。いくつかの実施形態では、反応におけるＵＩＤの数は、標識される分子の数を超え得る。当業者は、バーコードの数が試料の複雑さ（すなわち、ユニークな標的分子の予想される数）に依存し、各実験に対して適した数のバーコードを作製することができ得ることを認識するだろう。
いくつかの実施形態では、本発明は、非標的核酸も含む試料または反応混合物中に存在する、１またはそれを超える標的核酸を濃縮する改善された方法である。本発明は、試料または反応混合物を、標的核酸に特異的にハイブリダイズする１またはそれを超えるプローブと接触させることを含む。より具体的には、本発明は、改善されたプローブ混合物の使用を含む。改善されたプローブ混合物は、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチド、例えば複数のプローブオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、複数のプローブは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０未満または１０～１００プローブ、または１００～５００プローブ、または５００～１，０００プローブ、または１，０００～１０，０００プローブを含む。プローブ混合物中の１またはそれを超えるプローブは、増幅プライマー結合領域を含む。改善されたプローブ混合物は、プローブのプライマー結合領域にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションエンハンサーオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物。いくつかの実施形態では、プローブ混合物は、プローブの第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域にハイブリダイズすることができるエンハンサーオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブ混合物中のプローブとエンハンサーオリゴヌクレオチドとのモル比は、追加のハイブリダイゼーション部位、例えば部分的に相補的な部位などとのプローブの交差反応なしにブロッキングを達成するように最適化される。いくつかの実施形態では、プローブオリゴヌクレオチドとエンハンサーオリゴヌクレオチドとのモル比は、１：２、１：４、１：８またはそれを超える。
方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸、非標的核酸、プローブおよびエンハンサーオリゴヌクレオチドを含む反応混合物をインキュベートし、プローブにハイブリダイズした標的核酸をハイブリダイズしていない核酸から分離することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸、非標的核酸、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチド、および１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドを含む混合物中の核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、標的核酸、非標的核酸、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチド、および１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドを含む混合物中の核酸のうちの少なくとも１つは二本鎖であり、方法は、核酸の変性をもたらす条件下で、試料または反応混合物をインキュベートする予備ステップを含む。核酸の変性は、高温、アルカリまたはそれらの組み合わせによって行われ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の標的の濃縮手順は、生物のゲノムＤＮＡに対して行われる。いくつかの実施形態では、生物のゲノムＤＮＡは、本明細書に記載の標的の濃縮手順の前に、ゲノムライブラリへと変換される。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリは、本明細書に記載の標的の濃縮手順の前に、反復配列が除かれる。
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリからの反復配列の除外は、本明細書に記載の標的の濃縮方法によって行われる、すなわち、本明細書に記載の改善されたプローブ混合物を利用するハイブリダイゼーション手順が、生物のゲノムの繰返し配列にハイブリダイズすることができるプローブに適用される。
いくつかの実施形態では、方法は、ハイブリダイゼーション後に、任意のハイブリダイズしていない核酸または任意の一本鎖核酸を反応混合物から除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズしていないまたは一本鎖核酸は、捕捉によって除去される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、プローブにハイブリダイズした試料核酸の捕捉を可能にする捕捉部分（例えば、ビオチン）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸と非標的核酸との混合物を、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む組成物に接触させることと、ハイブリダイゼーション条件下で混合物をインキュベートすることと、ハイブリダイズした標的核酸を捕捉し、捕捉された核酸のみを配列決定することと、を含む、核酸を配列決定する経済的な方法である。いくつかの実施形態では、経済的な配列決定方法は、生物のゲノムＤＮＡに適用される。いくつかの実施形態では、生物のゲノムＤＮＡは、配列決定手順の前に、ゲノムライブラリに変換される。
いくつかの実施形態では、方法は、配列決定の前に、濃縮された核酸を増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅は、配列決定の前に、ライブラリ核酸のアダプターに存在するユニバーサルプライマー結合部位を利用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を増幅するステップを含む。いくつかの実施形態では、増幅は、配列決定ステップの前に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、標的の濃縮ステップの前に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、標的の濃縮ステップの後であるが配列決定ステップの前に行われる。増幅は、上流プライマーおよび下流プライマーを利用する。いくつかの実施形態では、両方のプライマーは、標的特異的プライマー、すなわち、メチル化バイオマーカーの標的配列に相補的な配列を含むプライマーである。他の実施形態では、一方または両方のプライマーはユニバーサルプライマーである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、本明細書に記載されているように、配列決定される標的にライゲーションされたアダプターに存在する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、標的特異的プライマーの５’領域（テイル）に存在する。したがって、テイルド標的特異的プライマーを用いた１回または複数回のプライマー伸長の後、ユニバーサルプライマーを後続の回の増幅のために使用することができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、（同じまたは異なる配列の）別のユニバーサルプライマーとペアである。他の実施形態では、ユニバーサルプライマーは、標的特異的プライマーとペアである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって濃縮された核酸が配列決定される。いくつかの配列決定技術または配列決定アッセイのいずれかを利用できる。本明細書で使用される「次世代配列決定（ＮＧＳ）」という用語は、クローン的に増幅された分子および単一の核酸分子の超並列配列決定を可能にする配列決定方法を指す。
本明細書に開示されている方法を用いた使用に適した配列決定アッセイの非限定的な例としては、ナノポアシーケンシング（米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、同第２０１３／０２６４２０７号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１５／０１１９２５９号および同第２０１５／０３３７３６６号）、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、熱サイクルシーケンシング（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３：６２６～６３３（１９９２））、固相シーケンシング（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３：３９～４２（１９９２））、質量分析を用いたシーケンシング、例えばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６：３８１～３８４（１９９８））、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６：５４～５８（１９９８）、および以下を含むがそれらに限定されない、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａから入手可能）、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＮＧＳ法が挙げられる。
市販の配列決定技術としては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）のシーケンシング・バイ・ハイブリダイゼーション・プラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）のシーケンシング・バイ・シンセシス・プラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）のシーケンシング・バイ・ライゲーション・プラットフォームが挙げられる。他の配列決定技術としては、以下に限定されないが、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびナノポアシーケンシング（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＧｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌ．）、およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、配列決定ステップは、配列アラインメントを含む。いくつかの実施形態では、アラインメントを使用して、複数の配列、例えば、同じユニークな分子ＩＤ（ＵＩＤ）を有する複数からコンセンサス配列を求める。分子ＩＤは、配列決定の前に、または増幅ステップが含まれる場合には増幅ステップの前に、各分子に付加され得るバーコードである。いくつかの実施形態では、ＵＩＤは、ＲＴプライマーの５’部分に存在する。同様に、ＵＩＤは、化合物バーコードに付加される最後のバーコードサブユニットの５’末端に存在し得る。他の実施形態では、ＵＩＤは、アダプターに存在し、ライゲーションによって標的核酸の一方または両方の末端に付加される。
いくつかの実施形態では、コンセンサス配列は、すべて同一のＵＩＤを有する複数の配列から求められる。同一のＵＩＤを有する配列は、増幅を介して同じ元の分子に由来すると推定される。他の実施形態では、ＵＩＤを使用して、アーチファクト、すなわち、（特定のＵＩＤによって特徴付けられる）単一分子の子孫に存在するバリエーションを排除する。ＰＣＲエラーまたは配列決定エラーから生じるこのようなアーチファクトは、ＵＩＤを使用して排除され得る。
いくつかの実施形態では、試料中の各配列の数は、同じ多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）を有する集団中で、各ＵＩＤを有する配列の相対数を定量化することによって定量され得る。各ＵＩＤは、元の試料での単一分子を表すので、各配列バリアントに関連した異なるＵＩＤを計数することによって、すべての分子が同じＭＩＤを共有する、元の試料中の各配列バリアントの分率を求めることができる。当業者は、コンセンサス配列を求めるために必要な配列リードの数を求めることができる。いくつかの実施形態では、妥当な数は、正確な定量結果のために必要なＵＩＤ１つ当たりのリード数（「配列深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｐｔｈ）」）である。いくつかの実施形態では、所望の深度はＵＩＤ当たり５～５０リードである。
いくつかの実施形態では、本発明は、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む、核酸ハイブリダイゼーションのための組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、複数の核酸標的に特異的にハイブリダイズすることができる複数のプローブオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物と接触させることによって得られる。プローブ混合物は、第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの混合物を含むエンハンサーオリゴヌクレオチドをさらに含む。エンハンサーオリゴヌクレオチドの様々な混合物が、本発明の範囲において想定される。例えば、第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域の各鎖にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。エンハンサーオリゴヌクレオチドは、それぞれが第１のプライマー結合領域または第２のプライマー結合領域のワトソン鎖またはクリック鎖の一方にハイブリダイズすることができる、４のオリゴヌクレオチドの混合物であり得る。エンハンサーオリゴヌクレオチドはまた、４つのグループにグループ化され得る４を超えるオリゴヌクレオチドの混合物であり得、オリゴヌクレオチドの各グループは、第１のプライマー結合領域または第２のプライマー結合領域のワトソン鎖またはクリック鎖の一方にハイブリダイズすることができる。
いくつかの実施形態では、組成物中の少なくともいくつかの核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、標的核酸および非標的核酸、プローブおよびエンハンサーオリゴヌクレオチドを含む、組成物中のすべての核酸は一本鎖である。
いくつかの実施形態では、本発明は、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、濃縮対象の核酸にハイブリダイズすることができる標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む、核酸標的の濃縮のための組成物である。組成物中のプローブオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸との混合物中に存在する、濃縮対象の複数の核酸標的に特異的にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、組成物は、標的核酸と非標的核酸との混合物をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物中に存在する標的核酸と非標的核酸との混合物は、生物のゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、組成物中に存在する標的核酸と非標的核酸との混合物は、生物のゲノムに由来するゲノムＤＮＡライブラリである。
いくつかの実施形態では、試料核酸および捕捉プローブの間のハイブリダイゼーションは溶液中で起こる。他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、固体支持体、例えば表面またはスライドまたはビーズなどの粒子上で起こる。この実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、固体支持体に共有結合的または非共有結合的につながれている。いくつかの実施形態では、プローブは、プローブに存在する捕捉部分（例えば、ビオチン）を介して固体支持体に付着される。いくつかの実施形態では、プローブは、固体支持体に共有結合的または非共有結合的に付着した捕捉オリゴヌクレオチドへのプローブ中の配列のハイブリダイゼーションを介して、固体支持体に付着される。試料核酸は、固体支持体と接触している溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、プローブは、プライマー結合部位を介して固体支持体に付着される。そのような場合、本発明のエンハンサーオリゴヌクレオチドを使用して、固体支持体からプローブまたはプローブ標的複合体を溶出することができる。
他の実施形態では、試料核酸（すなわち、ライブラリ核酸）は、固体支持体に共有結合的または非共有結合的に（例えば、アダプターまたはライブラリ分子の別の部分に存在する捕捉部分を介して）つながれ、プローブは、固体支持体と接触して溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸および非標的核酸を含む複数の核酸、２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドとを含む、反応混合物である。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸との混合物中に存在する複数の核酸標的に特異的にハイブリダイズすることができる複数のプローブオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、生物のゲノムＤＮＡ、または生物由来のゲノムライブラリを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物中のすべての核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態では、反応混合物中のすべての核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、各プローブに４つのプライマー結合領域があり、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、４つすべてのプライマー結合領域に結合する。いくつかの実施形態では、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、それぞれが第１のプライマー結合領域または第２のプライマー結合領域のワトソン鎖またはクリック鎖の一方にハイブリダイズすることができる４のオリゴヌクレオチドの混合物を含むか、またはエンハンサーオリゴヌクレオチドは、それぞれが第１のプライマー結合領域または第２のプライマー結合領域のワトソン鎖またはクリック鎖の一方にハイブリダイズすることができる４つのグループにグループ化され得る４を超えるオリゴヌクレオチドの混合物を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、生物のゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、生物のゲノムＤＮＡから形成されたゲノムライブラリを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、エンハンサーオリゴヌクレオチドの存在下でのハイブリダイゼーションによって標的の捕捉を行うための、コンポーネントおよびツールを含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、１またはそれを超えるハイブリダイゼーションプローブのアリコート（それぞれ別個のバイアルまたは１つもしくは複数のプローブプールとして）および１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドのアリコート（それぞれ別個のバイアルまたは２もしくはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドの混合物として）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションおよび１回または複数回のハイブリダイゼーション後洗浄を行うための、溶液および緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸の中間精製のための試薬をさらに含み、試薬は、捕捉粒子（例えば、磁性または常磁性粒子）洗浄緩衝液および磁石を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションによる標的の捕捉の上流のステップを行うための、試薬およびツールをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、試料中の核酸からライブラリを調製するための試薬を含む。ライブラリ調製の試薬は、アダプターの試料核酸へのＡテイリングおよびライゲーションに必要な、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、アダプターおよび緩衝液のうちの１または複数を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションによる標的の捕捉の下流のステップを行うための、試薬およびツールをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、捕捉された核酸の分離、増幅および配列決定のための試薬を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、患者のゲノムの１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態に基づく、対象（例えば、患者）の疾患または症状の評価をさらに含む。
変異状態は、変異なし（野生型配列）、および少なくとも１つの一塩基変異（ＳＮＶ）、少なくとも１つのコピー数変異（ＣＮＶ）、（配列の欠失、重複または高次増幅を含む）、転座または融合を含む変異型から選択される１つまたはそれを超える変異から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法によって患者の核酸を濃縮することと、濃縮された核酸において、疾患または症状のバイオマーカーであることが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することによって、患者の疾患または症状を検出または診断することと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、方法は、患者の試料から濃縮された１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態に基づいて、処置を選択または変更することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者または対象のがん性腫瘍の存在について、診断またはスクリーニングする方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法によって患者の核酸を濃縮することと、濃縮された核酸において、がん性腫瘍の存在を示すことが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することによって、患者のがん性腫瘍の存在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の方法によって患者の試料から濃縮された１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態に基づいて、がん性腫瘍を標的とする処置を選択または変更することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍の成長または縮小をモニタリングする方法であり、方法は、患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を定期的にサンプリングすることと、ｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、標的配列中の１つまたはそれを超える変異型を含むｃｆＤＮＡの量の変化を測定することと、を含み、このような変異した無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍の成長を示す一方、このような変異した無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍の縮小を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者または対象のがんの処置の有効性をモニタリングする方法であり、方法は、患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を定期的にサンプリングすることと、ｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、標的配列中の１つまたはそれを超える変異型を含むｃｆＤＮＡの量の変化を測定することと、を含み、このような変異無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍の成長および処置の無効性を示す一方、このような変異無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍の縮小および処置の有効性を示し、このような変異無細胞ＤＮＡの安定したレベルは安定した疾患および処置の有効性を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、処置後のがん患者の微小残存病変（ＭＲＤ）の診断方法を含む。米国国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、患者が疾患の徴候または症候を有さない場合、処置中または処置後に体内に残る非常に少数のがん細胞としてＭＲＤを定義している。いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＲＤを診断する方法であり、方法は、患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を得ることと、ｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、濃縮されたｃｆＤＮＡにおいて、腫瘍に特徴的な１つまたはそれを超える変異型を検出することと、を含み、このような変異無細胞ＤＮＡの存在は患者のＭＲＤの存在を示す。
実施例
実施例１．標的の捕捉におけるエンハンサーオリゴヌクレオチド
この実験では、ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＣａｐ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ（ｖ３．０、Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌ．から入手可能）のプローブハイブリダイゼーションステップを、ハイブリダイゼーションエンハンサーオリゴヌクレオチドの存在下で行った。
ハイブリダイゼーションの準備のために、１３０μＬのＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｕｒｅ Ｂｅａｄｓを、ＤＮＡ試料ライブラリ（アダプターにライゲーションした剪断されたヒトゲノムＤＮＡから構成される）およびＣＯＴヒトＤＮＡ混合物を含有する各チューブに添加した。混合物を１０秒間ボルテックスすることによって完全に混合し、遠心分離した。混合物を室温で１０分間インキュベートして、ＤＮＡ試料ライブラリおよびＣＯＴヒトＤＮＡがビーズに結合することを確実にした。試料を磁石上に置き、液体が透明になるまでビーズを収集した。上清を除去し、廃棄した。試料を磁石上に維持し、２００μＬの新たに調製した８０％エタノールを添加し、試料を室温で３０秒以上インキュベートした。エタノールを、ビーズを乱すことなく、除去し、廃棄した。残留エタノールを室温で蒸発させた。
ハイブリダイゼーションマスターミックスを以下のように調製した：
Figure 2024519596000003
次に、４３μＬのハイブリダイゼーションマスターミックスを、ライブラリ分子に付着したアダプターに結合するように設計されたブロッカーオリゴヌクレオチドを含む溶液に懸濁した、ビーズに結合したＤＮＡ混合物に添加した。反応混合物を完全に混合し、遠心分離し、室温で２分間インキュベートした。試料を磁石上に置いてビーズを収集し、液体が透明になるまでインキュベートした。次いで、５６．４μＬの溶出液（全体積）を、４μＬのＫＡＰＡ標的濃縮プローブ（ビオチン化された１２０ｎｔプローブのプール）および本発明のエンハンサーオリゴヌクレオチドを含有する新しいチューブに移した。エンハンサーオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション混合物の最終体積に対して、４つの異なる濃度（０．２３４ｍＭ、０．０２３４ｍＭ、０．００２３４ｍＭおよび０．０００２３４ｍＭ）で添加した。対照反応は、エンハンサーオリゴヌクレオチドを含まなかった。（図２Ａおよび図２Ｂ）
反応混合物を１０秒間ボルテックスすることによって完全に混合し、遠心分離した。ハイブリダイゼーションは、蓋の温度を１０５℃、９５℃で５分間、５５℃で一晩に設定したプログラムを使用して、サーモサイクラーで行った。
ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＣａｐ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｖ３．０の製造業者の推奨に従って、ハイブリダイズしたＤＮＡを洗浄し、回収し、増幅した。増幅したＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ装置で配列決定した。
配列決定の結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａ：本発明のｄｓＤＮＡプローブエンハンサーオリゴヌクレオチドは、用量依存的に捕捉の均一性を改善した。フォールド８０（ｆｏｌｄ ８０）ベースペナルティは、８０％の塩基を平均カバレッジの深度にするために必要な追加のシーケンシング倍数として定義され、したがって、フォールド８０ベースペナルティが低いほど、捕捉の均一性が良好であることを示す。図２Ｂ：ｄｓＤＮＡプローブエンハンサーオリゴを含めると、用量依存的に配列決定データの全重複率の低下をもたらした。

Claims (17)

  1. 核酸ハイブリダイゼーションのための組成物であって、
    ａ．２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、
    ｂ．前記プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと
    を含む、組成物。
  2. すべての前記プローブオリゴヌクレオチドが、同じ第１のプライマー結合領域および同じ第２のプライマー結合領域を有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記エンハンサーオリゴヌクレオチドが、前記第１のプライマー結合領域および前記第２のプライマー結合領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの混合物を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 核酸標的の濃縮のための組成物であって、
    ａ．２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、
    ｂ．前記プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと
    を含む、組成物。
  5. すべての前記プローブオリゴヌクレオチドが、同じ第１のプライマー結合領域および同じ第２のプライマー結合領域を有する、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記エンハンサーオリゴヌクレオチドが、前記第１のプライマー結合領域および前記第２のプライマー結合領域にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの混合物を含む、請求項４に記載の組成物。
  7. 標的核酸を濃縮する方法であって、
    ａ．標的核酸と非標的核酸との混合物を、
    ２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、
    前記プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと
    を含む組成物と接触させることと、
    ｂ．ハイブリダイゼーション条件下で前記混合物をインキュベートすることと、
    ｃ．プローブが結合した標的核酸を未結合核酸から分離することと
    を含む、方法。
  8. 前記標的核酸と非標的核酸との混合物が、生物のゲノムＤＮＡから形成されたライブラリを構成し、
    前記ライブラリが、前記生物から単離された核酸を含み、各核酸が少なくとも１つのアダプター核酸にコンジュゲートされている、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ライブラリ中の各核酸が、２つのアダプター核酸にコンジュゲートされている、請求項８に記載の方法。
  10. 核酸を配列決定する方法であって、
    ａ．標的核酸と非標的核酸との混合物を、
    ２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、
    前記プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと
    を含む組成物と接触させることと、
    ｂ．ハイブリダイゼーション条件下で前記混合物をインキュベートすることと、
    ｃ．前記プローブと前記標的核酸との間に形成されたハイブリッドを捕捉して、濃縮された核酸を得ることと、
    ｄ．前記濃縮された核酸を配列決定することと
    を含む、方法。
  11. 反応混合物であって、
    ａ．標的核酸および非標的核酸を含む複数の核酸と、
    ｂ．２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、
    ｃ．前記プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと
    を含み、
    すべての前記プローブオリゴヌクレオチドが、同じ第１のプライマー結合領域および同じ第２のプライマー結合領域を有する、反応混合物。
  12. 患者の疾患または症状を評価する方法であって、
    ａ．患者から核酸含有試料を準備することと、
    ｂ．請求項７に記載の方法によって前記試料中の標的核酸を濃縮することと、
    ｃ．前記濃縮された標的核酸において、前記疾患または症状のバイオマーカーであることが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することによって、前記患者の前記疾患または症状を検出することと
    を含む、方法。
  13. 患者のがん性腫瘍の存在を診断またはスクリーニングする方法であって、
    ａ．患者から核酸含有試料を準備することと、
    ｂ．請求項７に記載の方法によって前記試料中の標的核酸を濃縮することと、
    ｃ．前記濃縮された核酸において、がん性腫瘍の存在を示すことが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を決定することによって、前記患者の前記がん性腫瘍の存在を検出することと
    を含む、方法。
  14. 腫瘍の成長または縮小をモニタリングする方法であって、
    ａ．患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を定期的にサンプリングすることと、
    ｂ．請求項７に記載の方法によって前記ｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、
    ｃ．がん性腫瘍で変異していることが公知の前記標的配列中の１つまたはそれを超える変異を含む変異したｃｆＤＮＡの量の変化を検出することであって、このような変異したｃｆＤＮＡのレベルの増加が腫瘍の成長を示す一方、このような変異したｃｆＤＮＡのレベルの減少が腫瘍の縮小を示す、ｃｆＤＮＡの量の変化を検出することと
    を含む、方法。
  15. がん患者の微小残存病変（ＭＲＤ）の診断方法であって、
    ａ．患者から循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を得ることと、
    ｂ．請求項７に記載の方法によって前記ｃｆＤＮＡ中の１またはそれを超える標的配列を濃縮することと、
    ｃ．前記濃縮されたｃｆＤＮＡにおいて、がん性腫瘍で変異していることが公知の１つまたはそれを超える遺伝子座の変異状態を検出することであって、変異したｃｆＤＮＡの存在が前記患者のＭＲＤの存在を示す、遺伝子座の変異状態を検出することと
    を含む、方法。
  16. 核酸の改善されたハイブリダイゼーションのためのキットであって、
    ａ．１またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含む、プローブオリゴヌクレオチドと、
    ｂ．前記プライマー結合領域のうちの少なくとも１つにハイブリダイズすることができる１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと
    を含む、キット。
  17. 標的核酸を濃縮する方法であって、
    ａ．標的核酸と非標的核酸との混合物を、
    ｉ．２またはそれを超えるプローブオリゴヌクレオチドであって、各プローブオリゴヌクレオチドが、標的結合領域、ならびに第１のプライマー結合領域および第２のプライマー結合領域を含み、前記第１のプライマー結合領域が、固体支持体に付着した捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、プローブオリゴヌクレオチドと、
    ｉｉ．前記第２のプライマー結合領域にハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと
    を含む組成物と接触させることと、
    ｂ．ハイブリダイゼーション条件下で前記混合物をインキュベートすることと、
    ｃ．前記混合物を、前記捕捉オリゴヌクレオチドからの前記第１のプライマー結合領域の解離に適した条件下で、前記第１のプライマー結合領域にハイブリダイズする１またはそれを超えるエンハンサーオリゴヌクレオチドと接触させることによって、プローブが結合した標的核酸を未結合核酸から分離することと
    を含む、方法。
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