CN105524981B - 目标基因的捕获试剂盒及捕获方法 - Google Patents

目标基因的捕获试剂盒及捕获方法 Download PDF

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CN105524981B CN201410508624.4A CN201410508624A CN105524981B CN 105524981 B CN105524981 B CN 105524981B CN 201410508624 A CN201410508624 A CN 201410508624A CN 105524981 B CN105524981 B CN 105524981B
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Abstract

本发明属于生物技术领域,公开了一种目标基因的捕获探针、包括目标基因的捕获探针的捕获试剂盒及捕获目标基因的方法。本发明所述目标基因的捕获探针为生物素标记的63个目标基因的特异性探针组,其与全基因组DNA杂交,运用链霉亲和素包被的磁珠,可将与探针结合的DNA片段捕捉下来,在进行二代高通量测序前实现对特定目标基因组区域的富集。本发明所述目标基因的捕获探针覆盖率广,测序深度深,极大的提高了基因组中目标区域的研究效率,显著降低了测序成本。本发明所述目标基因捕获试剂盒组成简单,适用范围广,而且成本低,适用于广大的实验室和科研工作。

Description

目标基因的捕获试剂盒及捕获方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种目标基因的捕获探针、包括目标基因的捕获探针的捕获试剂盒及捕获目标基因的方法。
背景技术
快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说,基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息,进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性,因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。
测序技术最早可以追溯到20世纪50年代,早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导,即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法,标志着第一代测序技术的诞生。此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术,包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。相比传统的Sanger测序法,新一代测序技术的推出及普及,使得基因测序的通量和质量大幅提高,而测序成本逐步降低。目前Roche,Illumina等公司推出的小型实验台测序仪价格非常低廉,感兴趣的客户群也非常之多。
目前临床癌症的早期诊断和个性化指导用药需要对病人进行相关基因的测序。然而Roche,Illumina等公司推出的配套测序平台使用的试剂盒仅仅适用于全基因组或者全外显子的测序,而全基组测序或全外显子的测序对于大样本量的研究仍然费用太高,不适合癌症的早期诊断和个性化指导用药。因此要想真正能够把二代测序技术推向临床,能够满足医生的需求,就需要设计针对特定疾病的靶向基因的测序试剂盒。
目前Illumina公司和Life technologies公司都提供靶向基因的捕获试剂盒,然而上述公司的试剂盒产品针对的靶向基因的数目不全,并非全区域覆盖。如Illumina公司的TruSeq Amplicon-Cancer Panel,共检测48个基因,而Life technologies公司的AmpliSeq Cancer Hotspot Panel,共检测50个基因中的热点位点而非全部区域。而且以上商业试剂盒虽然均能达到90%以上的覆盖率,但是仍然有10%区域的缺失,并且每个区域的覆盖深度不同,无法进行定量的分析。
发明内容
有鉴于此,本发明的一个目的是提供一种目标基因的捕获探针,为生物素标记的目标基因的特异性探针组,所述目标基因包括如下63个基因:
ABCC1 ABL ALK APC ATM BRAF BRCA1 BRCA2
BRIP1 CDH1 CDKN2A CHEK2 CKIT CSF1R CTNNB1 CYP19A1
EGFR EPCAM ERBB2 ERBB4 ERCC1 EZH2 FBXW7 FGFR1
FGFR2 FGFR3 FLT3 GNA11 GNAQ GNAS GSTM1 HRAS
HGF JAK2 JAK3 KDR KIT KRAS MDR1 MEK1
MET MLH1 MRP2 MSH2 MSH6 NCF4 NQO1 NRAS
PDGFRA PMS1 PMS2 PTCH PTEN RB1 RET RRM1
SLIT1 SMAD4 SMO top2A TP53 VEGFR3 VHL
在一些实施方案中,所述特异性探针组包括至少一条针对每个目标基因的特异性探针序列。
在另一些实施方案中,所述特异性探针组包括两条以上的针对每个目标基因的特异性探针序列。
进一步的,所述的捕获探针中,所述特异性探针序列由通用接头A、目标基因特异性序列和通用接头B组成,其中通用接头A的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示,通用接头B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一个优选实施方案中,所述特异性探针组包括如SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.1253示核苷酸序列。
本发明的一个目的是提供一种目标基因的捕获方法,为构建样本基因组DNA文库,与上述目标基因的捕获探针杂交,亲和素包被的磁珠捕捉与目标基因的捕获探针结合的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供一种目标基因的捕获试剂盒,包括上述目标基因的捕获探针。
在一些实施方案中,本发明所述目标基因的捕获试剂盒,还包括杂交混合液、杂交缓冲液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液中的至少一种。
在一个优选实施方案中,所述目标基因的捕获试剂盒中,所述杂交混合液含有浓度为500ng/μL人Cot-1 DNA和浓度为500ng/μL鲑鱼精子DNA,所述杂交缓冲液含有10×SSPE缓冲液、10×邓哈特溶液(Denhardt’s Solution)、10mM EDTA和0.1%SDS,所述洗涤液A含有1×SSC和0.1%SDS,所述洗涤液B含有0.1×SSC和0.1%SDS,所述洗脱液含有0.1M NaOH。
本发明提供了一种目标基因的捕获探针、包括目标基因的捕获探针的捕获试剂盒及捕获目标基因的方法。本发明所述目标基因的捕获探针为生物素标记的63个目标基因的特异性探针组,其与全基因组DNA杂交,运用链霉亲和素包被的磁珠,可将与探针结合的DNA片段捕捉下来,在进行二代高通量测序前实现对特定目标基因组区域的富集。本发明所述目标基因的捕获探针覆盖率广,测序深度深,极大的提高了基因组中目标区域的研究效率,显著降低了测序成本。本发明所述目标基因捕获试剂盒组成简单,适用范围广,而且成本低,适用于广大的实验室和科研工作。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种目标基因的捕获探针,为生物素标记的目标基因的特异性探针组。
其中按照本领域技术人员的理解,本发明所述目标基因为特定疾病的靶向基因。目前已公开报道的特定疾病的靶向基因有很多种,如肺癌的易感基因ABCC1,与遗传性乳腺癌有关的基因BRCA1和BRCA2。
在一些实施方案中,所述目标基因包括如下63个基因:
ABCC1 ABL ALK APC ATM BRAF BRCA1 BRCA2
BRIP1 CDH1 CDKN2A CHEK2 CKIT CSF1R CTNNB1 CYP19A1
EGFR EPCAM ERBB2 ERBB4 ERCC1 EZH2 FBXW7 FGFR1
FGFR2 FGFR3 FLT3 GNA11 GNAQ GNAS GSTM1 HRAS
HGF JAK2 JAK3 KDR KIT KRAS MDR1 MEK1
MET MLH1 MRP2 MSH2 MSH6 NCF4 NQO1 NRAS
PDGFRA PMS1 PMS2 PTCH PTEN RB1 RET RRM1
SLIT1 SMAD4 SMO top2A TP53 VEGFR3 VHL
本发明中上述目标基因的序列都可通过GenBank基因序列号从GenBank数据库获得。GenBank数据库是1982年由美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立并维护的综合性序列数据库。如下表1为本发明中所涉及的目标基因对应的GenBank基因序列号。
本发明所使用的术语“探针”就是一段与目标基因互补的特异核苷酸序列,它可以包括整个基因,也可以仅仅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之转录而来的RNA。
表1目标基因的Genebank序列号
在一些实施方案中,本发明所述的捕获探针中,所述特异性探针组由针对目标基因的特异性探针序列组成,所述特异性探针序列由通用接头A、目标基因特异性序列和通用接头B组成。
在一些优选实施方案中,所述通用接头A长度为15nt,其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示;所述通用接头B的核苷酸序列长度为15nt,其核苷酸如SEQ ID NO.2所示。
本领域技术人员可以根据NCBI数据库中公开的目标基因的参考序列,设计与目标基因的外显子互补的目标基因特异性序列,然后与通用接头A和通用接头B组成特异性探针序列。
在一些实施方案中,所述目标基因特异性序列长度为120nt。与通用接头A和通用接头B组合后,特异性探针序列长度为150nt。
本发明中上述所有的63个目标基因中,每个基因都有多个外显子区域,每个外显子区域都至少有一条探针,在一些实施例中,每个区域都至少有二条探针;在一些实施例中,每个区域都至少有三条探针;在一些实施例中,每个区域都至少有五条探针;在一些实施例中,每个区域都至少有十条探针;在一些实施例中,每个区域都至少有二十条探针。
在一些实施方案中,所述特异性探针组包括至少一条针对每个目标基因的特异性探针序列。即所述特异性探针组针对每个目标基因至少包括一条特异性探针序列。
在另一些实施方案中,所述特异性探针组包括两条以上的针对每个目标基因的特异性探针序列。
其中,申请人根据NCBI数据库中公开的目标基因的参考序列,设计表2所示的与所述63个目标基因的外显子互补的特异性探针序列。
表263个目标基因的特异性探针序列
基因名称 特异性探针序列 基因名称 特异性探针序列 基因名称 特异性探针序列
ABCC1 SEQ ID NO.3~33 EZH2 SEQ ID NO.474~496 MRP2 SEQ ID NO.861~892
ABL SEQ ID NO.34~45 FBXW7 SEQ ID NO.497~510 MSH2 SEQ ID NO.893~910
ALK SEQ ID NO.46~74 FGFR1 SEQ ID NO.511~533 MSH6 SEQ ID NO.911~923
APC SEQ ID NO.75~92 FGFR2 SEQ ID NO.534~557 NCF4 SEQ ID NO.924~934
ATM SEQ ID NO.92~155 FGFR3 SEQ ID NO.558~576 NQO1 SEQ ID NO.935~941
BRAF SEQ ID NO.156~173 FLT3 SEQ ID NO.577~600 NRAS SEQ ID NO.942~948
BRCA1 SEQ ID NO.174~203 GNA11 SEQ ID NO.601~607 PDGFRA SEQ ID NO.949~971
BRCA2 SEQ ID NO.204~230 GNAQ SEQ ID NO.608~614 PMS1 SEQ ID NO.972~987
BRIP1 SEQ ID NO.231~250 GNAS SEQ ID NO.615~632 PMS2 SEQ ID NO.988~1003
CDH1 SEQ ID NO.251~266 GSTM1 SEQ ID NO.633~640 PTCH SEQ ID NO.1004~1033
CDKN2A SEQ ID NO.267~272 HRAS SEQ ID NO.641~661 PTEN SEQ ID NO.1034~1042
CHEK2 SEQ ID NO.273~289 HGF SEQ ID NO.662~669 RB1 SEQ ID NO.1043~1069
CKIT SEQ ID NO.290~311 JAK2 SEQ ID NO.670~694 RET SEQ ID NO.1070~1090
CSF1R SEQ ID NO.312~334 JAK3 SEQ ID NO.695~717 RRM1 SEQ ID NO.1091~1109
CTNNB1 SEQ ID NO.335~352 KDR SEQ ID NO.718~747 SLIT1 SEQ ID NO.1110~1146
CYP19A1 SEQ ID NO.353~363 KIT SEQ ID NO.748~769 SMAD4 SEQ ID NO.1147~1158
EGFR SEQ ID NO.364~394 KRAS SEQ ID NO.770~775 SMO SEQ ID NO.1159~1170
EPCAM SEQ ID NO.395~403 MDR1 SEQ ID NO.776~804 top2A SEQ ID NO.1171~1204
ERBB2 SEQ ID NO.404~434 MEK1 SEQ ID NO.805~815 TP53 SEQ ID NO.1205~1220
ERBB4 SEQ ID NO.435~461 MET SEQ ID NO.816~837 VEGFR3 SEQ ID NO.1221~1250
ERCC1 SEQ ID NO.462~473 MLH1 SEQ ID NO.838~860 VHL SEQ ID NO.1251~1253
本领域技术人员可以理解本发明所述与所述63个目标基因的外显子互补的特异性探针序列包括但不限于表2所示序列。
在一个优选实施方案中,所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的特异性探针序列中的至少一条。如包括针对ABCC1基因的特异性探针序列SEQ ID NO.3、针对ABL基因的特异性探针序列SEQ ID NO.34、……、针对VHL基因的特异性探针序列SEQ IDNO.1251。即所述特异性探针组包括63条特异性探针序列,每个特异性探针序列特异性识别上述63个目标基因中的一个。
在一些实施例中,所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的特异性探针序列中的至少二条;所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的特异性探针序列中的至少三条;所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的特异性探针序列中的至少五条。
在另一个优选实施方案中,所述特异性探针组包括如SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.1253所示核苷酸序列。即所述特异性探针组包括上述表2所示的与所述63个目标基因的外显子互补的所有特异性探针序列。
本发明所述生物素标记的目标基因的特异性探针组中生物素标记可采用PCR或缺口平移法来完成。优选的,采用缺口平移法。
所述缺口平移法包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用起点,即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入,从而复制出带有生物素标记的探针。
本发明还提供一种目标基因的捕获方法,为构建样本基因组DNA文库,与上述目标基因的捕获探针杂交,亲和素包被的磁珠捕捉与目标基因的捕获探针结合的DNA片段。
其中,所述样本基因组DNA文库的构建可以按照本领域技术人员公知的方法,利用商品化的建库试剂盒进行。
在一个实施方案中,所述样本基因组DNA文库是利用illumina标准建库试剂盒进行构建,得到250ng/μL的200bp-350bp标准文库片段。
在一个实施方案中,本发明所述目标基因的捕获方法中,所述与目标基因的捕获探针杂交具体为杂交缓冲液与标准文库片段混合,预热后在65℃与杂交缓冲液、目标基因的捕获探针、RNA酶抑制剂混合,在65℃保持16-18h。其中所述杂交混合液含有浓度为500ng/μL人Cot-1 DNA和浓度为500ng/μL鲑鱼精子DNA,所述杂交缓冲液含有10×SSPE缓冲液、10×邓哈特溶液(Denhardt’s Solution)、10mM EDTA和0.1%SDS。
在一个实施方案中,本发明所述目标基因的捕获方法中,所述亲和素包被的磁珠捕捉与目标基因的捕获探针结合的DNA片段具体为向杂交液中加入亲和素包被的磁珠,混合静置30分钟后,用磁力架吸住磁珠15min后,弃去上清液;加入洗涤液A室温混匀后,用磁力架吸住磁珠15分钟后,弃去上清液;加入洗涤液B混匀后,用磁力架吸住磁珠15分钟后,弃去上清液;加入洗脱液混匀后,用磁力架吸住磁珠15分钟后,取上清液即得。其中,所述洗涤液A含有1×SSC和0.1%SDS,所述洗涤液B含有0.1×SSC和0.1%SDS,所述洗脱液含有0.1MNaOH。
亲和素是一种糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每个分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合。亲合素主要包括卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素等。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链亲和素。在一个优选的实施方案中,所述亲和素为链亲和素。
在一些实施方案中,本发明所述目标基因的捕获方法还包括纯化的步骤。本领域技术人员可以理解所述纯化可以按照本领域技术人员公知的方法进行。
在一个实施方案中,所述纯化具体为洗脱的上清液与Tris缓冲液混合后,用QIAquick的纯化柱纯化。之后的样本按照illumina的测序前处理标准化处理后上机测序。
纯化后的样本可以利用第二代测序技术进行测序。如illumina测序技术。
本发明还提供了一种目标基因的捕获试剂盒,包括上述目标基因的捕获探针。
在一些实施方案中,本发明所述目标基因的捕获试剂盒,还包括杂交混合液、杂交缓冲液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液中的至少一种。
在一个优选实施方案中,所述目标基因的捕获试剂盒中,所述杂交混合液含有浓度为500ng/μL人Cot-1 DNA和浓度为500ng/μL鲑鱼精子DNA,所述杂交缓冲液含有10×SSPE缓冲液、10×邓哈特溶液(Denhardt’s Solution)、10mM EDTA和0.1%SDS,所述洗涤液A含有1×SSC和0.1%SDS,所述洗涤液B含有0.1×SSC和0.1%SDS,所述洗脱液含有0.1M NaOH。
本发明提供了一种目标基因的捕获探针、包括目标基因的捕获探针的捕获试剂盒及捕获目标基因的方法。本发明所述目标基因的捕获探针与全基因组DNA杂交,运用链霉亲和素包被的磁珠,将与探针结合的DNA片段捕捉下来,在进行二代高通量测序前实现对特定目标基因组区域的富集。本发明所述目标基因的捕获探针覆盖率广,测序深度深,极大的提高了基因组中目标区域的研究效率,显著降低了测序成本。本发明所述目标基因捕获试剂盒组成简单,适用范围广,而且成本低,适用于广大的实验室和科研工作。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:生物素标记的目标基因的特异性探针组
1)设计覆盖目标基因的150nt特异性探针序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.1237所示核苷酸序列,生物公司(美国CustomArray公司)合成备用。特异性探针序列为三个部分:15nt通用接头A-120nt目标基因特异性序列-15nt通用接头B,即ATCGCACCAGCGTGT-120nt-CACTGCGGCTCCTCA
2)用PCR的方法富集探针的含量,并连接上T7启动子:使用Titanium Taq PCR Kit(Clontech)
PCR体系(50μL体系)为:
其中引物C为:CTGGGAATCGCACCAGCGTGT
引物D为:CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG
反应循环时间为:94℃ 2min
19 cycles:94℃ 30s;55℃ 30s;72℃ 30s
72℃ 2min
PCR产物使用Qiagen QIAquick PCR extration Kit纯化,纯化后的产物用25μL试剂盒(Titanium Taq PCR Kit)洗脱液洗脱。
取1μL PCR纯化后产物重复PCR体系,使用引物E和引物D,50μL体系为:
其中引物E为:GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGATCGCACCAGCGTGT
反应循环时间为:94℃ 2min
14 cycles:94℃ 30s;55℃ 30s;72℃ 30s
72℃ 2min
PCR产物使用Qiagen QIAquick PCR extration Kit纯化,纯化后的产物用25μL试剂盒(Titanium Taq PCR Kit)洗脱液洗脱。
3)体外转录成生物素标记的探针混合物:使用MAXIscript T7 kit(Ambion)
100μL体系为:
37℃反应90min,使用Qiagen RNeasy minikit对产物纯化,洗脱于20μL缓冲液中,测定浓度后配制成500ng/μL溶液,即为生物素标记的目标基因的特异性探针组,保存至-70℃
实施例2:目标基因的捕获试剂盒
一种目标基因的捕获试剂盒由实施例1制得的生物素标记的目标基因的特异性探针组、杂交混合液、杂交缓冲液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液组成。
其中,所述杂交混合液:500ng/μL人Cot-1 DNA和500ng/μL鲑鱼精子DNA;
2×杂交缓冲液:10×SSPE缓冲液、10×邓哈特溶液(Denhardt’s Solution)、10mMEDTA和0.1%SDS;
洗涤液A:1×SSC/0.1%SDS;
洗涤液B:0.1×SSC/0.1%SDS;
洗脱液:0.1M NaOH。
实施例3:
利用illumina标准建库试剂盒构建人全血样品基因组DNA文库,得到250ng/μL的200bp-350bp标准文库片段。
将5μL杂交混合液与2μL标准文库片段共7μL混合液95℃预热5分钟,保持在65℃5分钟后,与预热在65℃的13μL的2倍杂交缓冲液、6μL 500ng生物素标记的目标基因的特异性探针组及20U的RNA酶抑制剂SUPERRase-IN混合,保持在65℃ 16-18h后,加入50μL链亲和素磁珠溶液(M-280 streptavidin Dynabeads,Invitrogen),混合静置30分钟后,用磁力架吸住磁珠15min后,弃去上清液,加入500μL的洗涤液A,室温混匀后,用磁力架吸住磁珠15分钟后,弃去上清液。加入65℃的500μL的洗涤液B,混匀后,用磁力架吸住磁珠15分钟后,弃去上清液。加入50μL洗脱液,混匀磁珠后,用磁力架吸住磁珠15分钟后,取上清液,与70μL的Tris缓冲液混合后,用QIAquick的纯化柱纯化,洗脱于20μL缓冲液。之后的样本按照illumina的测序前处理标准化处理后上机测序。
测序的结果通过标准流程计算机处理:(1)将Fastq格式原始数据用BWA软件和参考基因对比,确定它们在基因组上的位置;(2)使用SAMtools软件把序列按照一定顺序排列;(3)使用Picard软件将测序产生的冗余信息和噪声去掉;(4)使用GATK软件寻找与参考序列的差异;(5)使用Annovar对差异位点进行注释。利用Integrative Genomics Viewer(IGV)软件查看每个基因和每个突变位点的直观测序结果,使用BAMtools软件统计和计算,结果显示覆盖率达到99%,平均深度为487X。

Claims (5)

1.一种目标基因的捕获探针,为生物素标记的目标基因的特异性探针组,所述目标基因包括如下63个基因:
ABCC1 ABL ALK APC ATM BRAF BRCA1 BRCA2 BRIP1 CDH1 CDKN2A CHEK2 CKIT CSF1R CTNNB1 CYP19A1 EGFR EPCAM ERBB2 ERBB4 ERCC1 EZH2 FBXW7 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FLT3 GNA11 GNAQ GNAS GSTM1 HRAS HGF JAK2 JAK3 KDR KIT KRAS MDR1 MEK1 MET MLH1 MRP2 MSH2 MSH6 NCF4 NQO1 NRAS PDGFRA PMS1 PMS2 PTCH PTEN RB1 RET RRM1 SLIT1 SMAD4 SMO top2A TP53 VEGFR3 VHL
所述特异性探针组包括如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.1253示核苷酸序列。
2.一种目标基因的捕获方法,为构建样本基因组DNA文库,与权利要求1所述的目标基因的捕获探针杂交,亲和素包被的磁珠捕捉与目标基因的捕获探针结合的DNA片段。
3.一种目标基因的捕获试剂盒,包括权利要求1所述的目标基因的捕获探针。
4.根据权利要求3所述的捕获试剂盒,还包括杂交混合液、杂交缓冲液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的捕获试剂盒,其中所述杂交混合液含有浓度为500ng/μL人Cot-1DNA和浓度为500ng/μL鲑鱼精子DNA,所述杂交缓冲液含有10×SSPE缓冲液、10×邓哈特溶液(Denhardt’s Solution)、10mM EDTA和0.1%SDS,所述洗涤液A含有1×SSC和0.1%SDS,所述洗涤液B含有0.1×SSC和0.1%SDS,所述洗脱液含有0.1M NaOH。
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