CN110079602A - 甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针及制备方法 - Google Patents
甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针及制备方法，本发明使用微流体芯片合成涵盖甲状腺癌相关11个基因的151个外显子(Exon)，73个热点(Hotspot)基因和61种融合基因的基因组合(Panel)的高质量超长探针，基于液相杂交法对目标区域基因组进行特异性、高灵敏捕获，建库过程简单快速，构建的文库适配Illumina二代测序平台，具有高通量、高特异性、适用范围广、捕获效率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针及制备方法。
背景技术
甲状腺结节是最为常见的内分泌“疾病”，随着高分辨超声和CT、MRI等检查的广泛应用，临床意外发现众多的结节、微小结节，这已成为当前甲状腺诊治领域备受关注的棘手问题。甲状腺癌主要包括乳头状癌(PTC)、滤泡型癌(FTC)、髓样癌和未分化癌，其中乳头状癌和滤泡型癌称为分化性甲状腺癌，占所有甲状腺癌的90％。据2015中国癌症统计数据报告：女性甲状腺癌年龄标准化发病率显著上升，女性30岁以前被诊断出的最普遍的癌症是甲状腺癌。由于我国医疗技术发展的不均衡以及穿刺细胞诊断的客观局限性，甲状腺结节治疗不足和治疗过度在临床实践中时有发生，对患者的生活质量和躯体功能等造成了不可逆的损伤，也导致了有限医疗资源的巨大浪费。因此，对临床中发现的日益增多的甲状腺结节，进行良恶性精确鉴别既具有现实的患者需求，也具有重要的临床决策价值。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针。
本发明的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。
本发明的发明思路为：本发明设计了涵盖甲状腺癌相关11个基因的151个外显子(Exon)，73个热点(Hotspot)基因和61种融合基因的基因组合(Panel)，采用微流体芯片大规模并行合成制备了甲状腺结节良恶性鉴别相关基因的捕获测序探针引物库，将探针引物库PCR后进行T7体外标记转录、纯化得到甲状腺结节良恶性鉴别相关基因的捕获测序探针。利用VariantBaitsTM Target Enrichment System将本发明所述探针与目标基因组文库进行杂交捕获，通过链霉亲和磁珠结合抓取目的片段DNA，得到的捕获文库在Illumina二代测序平台完成测序，进行甲状腺结节良恶性鉴别。
本发明的技术方案为：
本发明提供了一种甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针，所述探针的基因组合涵盖甲状腺癌相关11个基因的151个外显子、73个热点基因和61种融合基因。
所述甲状腺癌相关11个基因的151个外显子信息如下表所示：
所述73个热点基因的信息如下表所示：
所述61种融合基因的信息如下表所示：
本发明还公开了一种检测甲状腺结节恶性风险的试剂盒，所述试剂盒包含上述的探针。
本发明还公开了上述探针的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备探针，所述探针的基因组合涵盖甲状腺癌相关11个基因的151个外显子(Exon)，73个热点(Hotspot)基因和61种融合基因，所述探针的引物库采用微流体芯片进行大规模并行合成；
S2:提取基因组DNA、片段化后纯化；
S3:构建基因组文库；
S4:探针与基因组文库杂交，将S1制得的探针和S3构建的基因组文库进行杂交；
S5:通过链霉亲和素磁珠捕获杂交产物；
S6:捕获产物PCR并纯化；
S7：捕获文库质控；
S8:捕获文库测序，利用Illumina二代测序平台进行高通量测序。
优选地，所述S1包括如下步骤：
S11：合成探针引物库，所述探针引物库采用微流体芯片进行大规模并行合成，所述探针引物库的全部引物序列的5’末端和3’末端分别加上了如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的序列；
S12:对S11合成的探针引物库进行PCR，所述PCR包括两轮PCR，第一轮PCR的引物为如SEQ ID No.ID 3所示的PCR引物A和如SEQ ID No.ID 4所示的PCR引物B，第二轮PCR的引物为如SEQ ID No.ID5所示的PCR T7引物A和如SEQ ID No.ID 4所示的PC引物B。
S13:对S12获得的PCR产物进行T7体外逆转录；
S14:对S13获得的T7体外逆转录产物进行纯化获得RNA探针，所述纯化使用ZymoResearch的RNA Clean&ConcentratorTM-5纯化试剂盒进行纯化；
S15:对RNA探针进行质控、贮藏，所述质控方法为，使用Nanodrop检测纯化后RNA探针的浓度，使用Agilent BioAnalyzer 2100Expert进行探针峰型质检；所述贮藏温度为-80℃。
优选地，S11中探针引物库的合成拷贝数的优化方法为：计算全部探针引物的GC含量，统计不同GC含量区段的探针的数目，将GC含量为40％-60％的探针引物合成拷贝数定为基准数，GC含量为30％-40％和60％-70％的探针引物合成拷贝数为基准数的2-3倍，GC含量为20％-30％和70-80％的探针引物合成拷贝数为基准数的3-4倍，GC含量为10％-20％和80-90％的探针引物合成拷贝数为基准数的4-5倍，GC含量小于10％和大于90％的探针引物合成拷贝数为基准数的5倍以上。
优选地，S2中提取基因组合DNA的质量要求为DNA总量200ng-1μg，浓度不低于10ng/μL，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.5，电泳主带完整，无明显降解；片段化的平均片段大小为150-200bp。
优选地，S3中构建基因组文库的方法为，使用VariantBaitsTM Target EnrichmentLibrary PrepKit的所有组分将S2获得的纯化DNA片段构建成Illumina基因组文库。
优选地，S4中探针与基因组文库杂交使用的试剂盒包括：VariantBaitsTM TargetEnrichmentHyb&Amp Kit、VariantBaitsTM Target Enrichment Adapter&Block Oligo、VariantBaitsTM TargetEnrichment Probe，杂交反应条件为PCR仪恒温65℃孵育16-24小时。
优选地，S7中捕获文库的质控方法为Qubit荧光定量仪定量检测文库浓度，Agilent 2100Bioanalyzer质检文库峰型，荧光定量PCR定量检测文库摩尔浓度。
优选地，S7中捕获文库的质控标准为：文库Qubit定量浓度不低于1ng/μL；文库片段大小在200-500bp之间；荧光定量PCR定量浓度不低于5nM，熔解曲线峰型单一，无Dimer污染。
本发明的有益效果为：本发明所述探针具有高通量、高特异性、适用范围广、捕获效率高等优点，对4对已知信息样本进行检测，阳性结果检出符合率为100％。本发明采用VariantBaitsTM Target Enrichment System进行探针制备，具有操作简单、生产成本低的优点。
附图说明
图1基因组文库的质检谱图；
图2捕获基因组文库的质检谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
一种甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，包括如下步骤：
S1:制备探针
S11:合成探针引物库
将全部探针引物使用微流体30K芯片进行大规模并行合成寡核苷酸，侧翼序列的全部探针引物的反向互补序列另外使用微流体30K芯片进行大规模并行合成寡核苷酸，将所有30K芯片上的全部寡核苷酸一同转入一个离心管作为OligoMix。
其中，所述探针引物的基因组合(panel)涵盖甲状腺癌相关11个基因的151个外显子(Exon)，73个热点(Hotspot)基因和61种融合基因。
其中，所述探针引物库的全部引物序列的5’末端和3’末端分别加上了序列5’-ATCGCACCAGCGTGT-3’(SEQ ID No.1)和序列3’-CACTGCGGCTCCTCA-5’(SEQ ID No.2)。
其中，探针引物库的合成拷贝数的优化方法为：计算全部探针引物的GC含量，统计不同GC含量区段的探针的数目，将GC含量为40％-60％的探针引物合成拷贝数定为基准数，GC含量为30％-40％和60％-70％的探针引物合成拷贝数为基准数的2-3倍，GC含量为20％-30％和70-80％的探针引物合成拷贝数为基准数的3-4倍，GC含量为10％-20％和80-90％的探针引物合成拷贝数为基准数的4-5倍，GC含量小于10％和大于90％的探针引物合成拷贝数为基准数的5倍以上，其中，探针不同GC含量的数量及对应的增加拷贝数后的数量如下表所示：
S12:对S11合成的探针引物库进行PCR
(1)第一轮PCR
将S11所得的OligoMix使用25uL的10mM Tris-HCl溶解重悬，使用微型离心机离心后进行第一轮PCR扩增，PCR反应体系如下：
| Reagent | 体积 |
| 2×PCR酶混合液 | 12.5微升 |
| 10uM PCR引物A | 1.5微升 |
| 10uM PCR引物B | 1.5微升 |
| 二甲亚砜 | 0.75微升 |
| OligoMix模板 | 1微升 |
| 无核酸酶水 | 7.75微升 |
| 总体积 | 25微升 |
其中，PCR引物序列和浓度如下：
| 引物 | 浓度 | 序列(5’-3’) |
| PCR引物A | 10uM | CTGGGAATCGCACCAGCGTGT(SEQ ID No.3) |
| PCR引物B | 10uM | CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG(SEQ ID No.4) |
PCR反应条件如下：
第一轮PCR反应结束后，PCR产物使用3倍体积的LC纯化磁珠按照常规纯化方法进行纯化。
(2)第二轮PCR
将第一轮PCR产物进行第二轮PCR，第二轮PCR反应体系如下：
| Reagent | 体积 |
| 2×PCR酶混合液 | 12.5微升 |
| 10uM PCR T7引物A | 1.5微升 |
| 10uM PCR引物B | 1.5微升 |
| 二甲亚砜 | 0.75微升 |
| 第一轮PCR纯化产物 | 8.75微升 |
| 总体积 | 25微升 |
其中，PCR引物序列和浓度如下：
| 引物 | 浓度 | 序列(5’-3’) |
| PCR引物B | 10uM | CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG(SEQ ID No.4) |
| PCR T7引物A | 10uM | GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGATCGCACCAGCGTGT(SEQ ID No.5) |
第二轮PCR反应程序如下：
第二轮PCR反应结束后，PCR产物使用3倍体积的LC纯化磁珠按照常规纯化程序进行纯化。
(3)：PCR产物质控
第二轮PCR产物使用Qubit测定浓度，使用Agilent BioAnalyzer 2100Expert进行产物峰型质检。
S13:对S12获得的PCR产物进行T7体外逆转录
配制如下变性试剂；
| 试剂 | 体积 |
| 5×第一链合成缓冲液 | 2微升 |
| 0.1M二硫苏糖醇 | 1微升 |
向变性试剂中加入50ng质控合格的第二轮PCR产物，充分混匀，于PCR仪中70℃孵育15min，孵育结束后将反应管立即置于冰上，静置2min，加入下表体外转录试剂：
| 试剂 | 体积 |
| 无核酸酶水 | 0.5微升 |
| 5×转录缓冲液 | 3.2微升 |
| 100mM腺苷三磷酸 | 0.25微升 |
| 100mM胞苷三磷酸 | 0.25微升 |
| 100mM鸟苷三磷酸 | 0.25微升 |
| 100mM尿苷三磷酸 | 0.2微升 |
| 10mM生物素标记的尿苷三磷酸 | 0.5微升 |
| 0.1M二硫苏糖醇 | 0.6微升 |
| T7RNA聚合酶 | 0.25微升 |
| 总体积 | 6微升 |
充分混匀，40℃孵育4h，体外转录总体积为16微升。
S14:对S13获得的T7体外逆转录产物进行纯化获得RNA探针
使用Zymo Research的RNA Clean&ConcentratorTM-5纯化试剂盒纯化T7体外转录产物，具体纯化方法如下：
(a)加入无核酸酶水将转录产物体积补至100uL；
(b)加入200uL RNA Binding Buffer，充分混匀；
(c)加入300uL无水乙醇，充分混匀；
(d)将上述溶液转移至纯化柱(Zymo-SpinTM IC Column)，10000g，30s高速离心，弃去下层废液；
(e)向纯化柱中加入400uL RNA Prep Buffer，10000g，30s高速离心，弃去下层废液；
(f)向纯化柱中加入700uL RNA Wash Buffer，10000g，30s高速离心，弃去下层废液；
(g)向纯化柱中加入400uL RNA Wash Buffer，10000g，2min高速离心，弃去下层废液；
(h)将纯化柱转移至新的无核酸酶1.5mL离心管中，加入20uL无核酸酶水，10000g，2min高速离心；
(i)加入0.5uL RNA酶抑制剂(40U/uL)，充分混匀，置于冰上待用。
S15:对RNA探针进行质控、贮藏
使用Nanodrop检测纯化后探针的浓度，使用Agilent BioAnalyzer 2100Expert进行探针峰型质检。将质检合格的探针置于-80℃贮藏。
S2:提取基因组DNA、片段化后纯化
(1)样品准备
样本要求：
A.样品类型：血液、组织、细胞、唾液等。
B.DNA类型：基因组DNA。
C.DNA浓度测定：使用Qubit荧光定量仪测定DNA浓度。
D.DNA质量要求：DNA总量200ng-1μg，浓度不低于10ng/μL，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.5，电泳主带完整，无明显降解。
(2)基因组DNA片段化
使用超声波物理打断的方法进行DNA片段化，具体操作步骤如下：
A.DNA打断仪器运行前须提前预冷至4℃。
B.通常情况下进行片段化的样品总体积为100μL，取500ng质量合格的基因组DNA，加入10mM Tris-HCl(pH8.0-8.5)将总体积补足为100μL。
C.待片段化的样品经漩涡振荡充分混匀，离心将液体保留在离心管底部。样品须经4℃充分预冷(可置于冰上10-15min)，然后对称放入片段化仪器样品孔中，空置孔位放入配平管。确保样品管内液体完全浸没于仪器水槽内的蒸馏水中。
D.设置运行参数，On：30”，OFF：30”，Cycles：10，运行。
E.将样品从仪器中取出，使用漩涡振荡器轻轻混匀样品，用微型离心机离心将液体保留在离心管底部，重新放入片段化仪器中。
F.重复步骤D-E 2次，即共运行3次打断程序，共运行30个Cycles。
G.完成打断后DNA的平均片段大小为150-200bp。
(3)片段化产物纯化
A.准备LC Beads，室温静置平衡30min，磁珠使用前应充分混匀，注意避免产生大量气泡。
B.取100μL片段化产物至1.5mL离心管中，加入200μL混合均匀的LC beads，用移液枪轻轻吹打混匀，室温静置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min，直至溶液澄清，小心吸取并弃除上清。
D.保持上述1.5mL离心管固定在磁力架上，向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温放置30s，小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
E.重复步骤D一次。
F.保持1.5mL离心管固定在磁力架上，室温干燥2～5min。
G.将1.5mL离心管从磁力架上取下，加入51μL Nuclease-free water，用移液枪轻轻吹打混匀，室温静置5min。
H.将1.5mL离心管置于磁力架上，室温放置5min至溶液澄清，小心吸取51μL上清液转移到新的PCR管中，即得纯化的片段化DNA。
I.取1μL纯化产物使用Qubit荧光定量仪测定浓度，计算DNA总量(ng)，取用200ng纯化的片段化DNA进入下游建库。
S3:构建基因组文库
1.实验试剂
(1)VariantBaitsTM Target Enrichment Library Prep Kit(96反应)
使用注意事项：注意避免试剂的反复冻融，建议首次使用后将剩余试剂分装保存。
(2)VariantBaitsTM Target Enrichment Hyb&Amp Kit(96反应)
使用注意事项：2×Hyb Buffer使用前置于室温下解冻，2×Hyb Buffer在室温下通常会出现沉淀，使用前可放入37℃水浴锅中孵育5-10min，直至沉淀完全溶解。注意避免试剂的反复冻融，建议首次使用后将剩余试剂分装保存。
(3)VariantBaitsTM Target Enrichment Adapter&Block Oligo(96反应)
(4)VariantBaitsTM Target Enrichment Wash Kit(96反应)
使用注意事项：建议保藏温度保持在20-25℃
(5)VariantBaitsTM Target Enrichment Purification Beads(96反应)
使用注意事项：LC Beads注意避免-20℃低温冷冻，建议首次使用后将剩余试剂分装保存。
(6)自备试剂
2.仪器设备及耗材
(1)仪器：真空旋转蒸发仪、涡旋振荡器、微型离心机、PCR仪、恒温金属振荡仪、恒温水浴锅、1.5mL磁力架、Qubit荧光定量仪、Agilent 2100Bioanalyzer。
(2)耗材：建议使用低吸附无核酸酶0.2mL PCR管、0.6mL离心管、1.5mL离心管，高质量无核酸酶带滤芯吸头。
3.构建基因组文库
(1)End Repair and A-tailing
A.按照下表配制End Repair and A-tailing体系：
B.使用移液器将上述溶液轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心后将所有组分收集到管底。
C.将反应管置于PCR仪中，按如下参数进行反应。
B.充分混匀Ligation反应Mix，直接加入上一步End Repair and A-tailing反应管中。
C.使用移液器将上述溶液轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心,将所有组分收集到管底，此时反应体系总体积为110μL。
D.将反应管置于PCR仪中(不要开启热盖)，进行下述反应：
(3)Post-Ligation Cleanup
A.准备LC Beads，室温静置平衡30min，磁珠使用前应充分混匀，注意避免产生大量气泡。
B.将接头连接反应产物全部转移至1.5mL离心管中，加入154μL混合均匀的LCbeads，用移液枪轻轻吹打混匀，室温放置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min，直至溶液澄清，小心吸取并弃除上清。
D.保持上述1.5mL离心管固定在磁力架上，向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温放置30s，小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
E.重复步骤D一次。
F.保持1.5mL离心管固定在磁力架上，室温干燥2～5min。
G.将1.5mL离心管从磁力架上取下，加入20μL Nuclease-free water，用移液枪轻轻吹打混匀，室温放置5min。
H.将1.5mL离心管置于磁力架上，室温放置5min至溶液澄清，小心吸取20μL上清液转移到新的PCR管中，即得纯化的连接产物。
4.扩增基因组文库
(1)Library Amplification
A.在PCR管中加入以下试剂并混匀：
B.使用移液器将上述溶液轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心,将所有组分收集到管底。
C.将反应管置于PCR仪中，按下述参数进行反应。
(2)Post-amplification Size Selection
A.准备LC Beads，室温静置平衡30min，磁珠使用前应充分混匀，注意避免产生大量气泡。
B.将PCR产物全部转移至1.5mL离心管中，加入50μL Nuclease-free water将总体积补至100μL，加入80μL混合均匀的LC beads，用移液枪轻轻吹打混匀，室温放置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min，直至溶液澄清，小心吸取并将全部上清转移至另一新的1.5mL离心管中。
注意：吸取上清时注意避免吸到磁珠，切勿弃除上清！
D.向上述新的1.5mL离心管中加入40μL混合均匀的LC beads，用移液枪轻轻吹打混匀，室温放置5min。
E.将离心管置于磁力架上5min，直至溶液澄清，小心吸取并弃除上清。
F.保持上述离心管固定在磁力架上，向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温放置30s，小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
G.重复步骤F一次。
H.保持离心管固定在磁力架上，室温干燥2～5min。
I.将离心管从磁力架上取下，加入20μL Nuclease-free water，用移液枪轻轻吹打混匀，室温放置5min。
J.将离心管置于磁力架上，室温放置5min至溶液澄清，小心吸取20μL上清液转移到新的PCR管中，即得纯化的基因组文库。
K.1μL基因组文库使用Qubit测定浓度，计算其总量(ng)，使用Agilent2100Bioanalyzer对基因组文库峰型进行质检，检验结果如图1所示，质检标准如下：
(a)文库总质量大于1μg，质量浓度一般大于35ng/μL；
(b)文库片段大小为200-500bp，150bp以下无尖锐峰污染(引物二聚体)，无大片段污染。
说明：基因组文库的保存介质建议为Nuclease-free Water，请勿使用TE Buffer或Tris-HCl等，因该类Buffer中的盐分可能影响杂交步骤中的蒸干浓缩。
S4:探针与基因组文库杂交
(1)准备基因组文库及封闭试剂
VariantBaitsTM Target Enrichment System支持单个基因组文库进行杂交，同时支持最多8个基因组文库混合杂交，混库杂交时应避免选择Index序列相同的文库进行混合，同时需要考虑混合基因组文库Index序列的碱基复杂度和平衡性，以使各文库在测序时获得比较一致的测序质量。
A.将S1构建的基因组文库置于冰上融化，取用前漩涡振荡充分混匀，短暂离心后将所有溶液收集到管底，使用低吸附无核酸酶0.6mL离心管，按下表取用1μg基因组文库及相应的封闭试剂：
B.漩涡振荡充分混匀上述封闭反应混合，短暂离心后将所有组分收集到管底。将0.6mL离心管置于真空旋转蒸发仪中，40℃真空旋转将反应液蒸干。
(2)杂交反应
A.向完成蒸干的0.6mL离心管中加入以下杂交反应液，漩涡振荡充分混匀，短暂离心后将所有组分收集到管底，室温下静置10min。
B.准备无核酸酶0.2mL PCR管，将上述杂交反应液全部转移至新的0.2mL PCR管中，将PCR管置于PCR仪中，运行以下程序。
(3)探针准备
将杂交探针从-80℃中取出，置于冰上融化，漩涡混匀后将探针溶液离心至管底，置于冰上待用。
(4)每个杂交反应取用4.5μL的探针，置于无核酸酶0.2mL PCR管中，待步骤(2)中PCR反应的Step2开始后，将装有杂交探针的0.2mL PCR管放入PCR仪中，预热5min。
(5)待Step2结束后，将杂交探针全部转移至杂交反应管中，用移液器迅速吹打混匀，盖紧管盖，65℃孵育杂交16-24h。
S5:通过链霉亲和素磁珠捕获杂交产物；
(1)链霉亲和素磁珠的平衡
A.准备Dynabeads MyOne Streptavidin T1Magnetic Beads，室温静置平衡30min，磁珠使用前应充分混匀，注意避免产生大量气泡。
B.每个反应取25μL于无核酸酶1.5mL离心管中。
C.向离心管中加入200μL Beads Wash Buffer，用移液枪轻轻吹打混匀。
D.将离心管置于磁力架上，静置1-5min至溶液澄清，小心移除上清。
E.重复步骤C-D两次，即总共需要清洗三次。
(2)杂交产物与链霉亲和素磁珠结合
A.向上述离心管中加入70μL Beads Wash Buffer，用移液枪轻轻吹打混匀重悬Beads，置于65℃恒温水浴锅中预热至少2min。
B.将完成杂交的产物全部转移至步骤A的离心管中，用移液枪轻轻吹打混匀，置于65℃恒温水浴锅中孵育30min。
C.每隔10min使用漩涡振荡器轻轻混匀样品，保持样品管内溶液均匀，避免磁珠沉降到管底。
(3)清洗捕获磁珠
A.将LS Buffer，HS Buffer置于65℃恒温水浴锅中预热。
B.将离心管置于磁力架上，室温静置1-5min，直至溶液澄清。
C.小心移除上清，加入200μL 65℃预热的LS Buffer，轻轻吹打重悬Beads，于65℃恒温水浴锅中孵育15min。
D.将离心管取出置于磁力架上，室温静置1-5min，直至溶液澄清。
E.小心移除上清，加入200μL 65℃预热的HS Buffer，轻轻吹打重悬Beads，快速放入65℃水浴锅中孵育10min。
F.将离心管从水浴锅中取出，快速置于磁力架上至溶液澄清。
G.重复步骤E-F 2次，即总共需要清洗三次。
H.小心移除上清，加入200μL RS Buffer，轻轻吹打重悬Beads，将离心管置于恒温金属振荡仪中室温1400-1800rpm振荡孵育1min。
I.将离心管取出置于磁力架上，室温静置1-5min，直至溶液澄清。
J.小心移除上清，加入40μL Nuclease-free water，轻轻吹打混匀，即得捕获后产物，将离心管置于冰上待用。
S6:捕获产物PCR并纯化
(1)PCR扩增
A.使用低吸附无核酸酶0.2mL PCR管按下表配制PCR反应液，用移液器轻轻吹打充分混匀：
B.将上述PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
(2)清洗
A.准备LC Beads，室温静置平衡30min，磁珠使用前应充分混匀，注意避免产生大量气泡。
B.将Post-Capture PCR反应产物全部转移至1.5mL离心管中，加入50μL混合均匀的LCbeads，用移液枪轻轻吹打混匀，室温放置5min。
C.将上述1.5mL离心管置于磁力架上5min，直至溶液澄清，小心吸取并弃除上清。
D.保持上述1.5mL离心管固定在磁力架上，向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温放置30s，小心吸取并弃除上清(注意不要扰动磁珠)。
E.重复步骤D一次。
F.保持1.5mL离心管固定在磁力架上，室温干燥2～5min。
G.将1.5mL离心管从磁力架上取下，加入20μL Elution Buffer，用移液枪轻轻吹打混匀，室温放置5min。
H.将1.5mL离心管置于磁力架上，室温放置5min至溶液澄清，小心吸取20μL上清液转移到新的PCR管中，即得最终的捕获文库。
S7：捕获文库质控
捕获文库使用Qubit荧光定量仪进行定量，记录浓度(ng/μL)，计算总量(ng)；使用Agilent2100Bioanalyzer对文库峰型进行质检，质检图谱如图2所示，通过荧光定量PCR对捕获文库进行定量，计算摩尔浓度(nM)。文库质控参考标准为：文库Qubit定量浓度不低于1ng/μL；文库片段大小在200-500bp之间；荧光定量PCR定量浓度不低于5nM，熔解曲线峰型单一，无Dimer污染。
S8:捕获文库测序
质控合格的文库使用Illumina Hiseq X10 2×150PE进行测序，将测序下机后的数据进行数据质量分析，并去除无效数据。有效数据与人类基因组(hg19)进行比对，并标记比对数据中的重复序列。在目标区域同一位置都展示相同突变类型时，认为此突变是真实的，计算该突变的频率，分析结果见下表：
实验结果显示，4对已知信息样本，阳性结果检出符合率为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆市肿瘤研究所
<120> 甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针及制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcgcaccag cgtgt 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cactgcggct cctca 15
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgggaatcg caccagcgtg t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtggatgag gagccgcagt g 21
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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Claims (10)
1.一种甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针，其特征在于，所述探针的基因组合涵盖甲状腺癌相关11个基因的151个外显子、73个热点基因和61种融合基因。
2.一种检测甲状腺结节恶性风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的探针。
3.权利要求1所述甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备探针，所述探针的基因组合涵盖甲状腺癌相关11个基因的151个外显子(Exon)，73个热点(Hotspot)基因和61种融合基因，所述探针的引物库采用微流体芯片进行大规模并行合成；
S2:提取基因组DNA、片段化后纯化；
S3:构建基因组文库；
S4:探针与基因组文库杂交，将S1制得的探针和S3构建的基因组文库进行杂交；
S5:通过链霉亲和素磁珠捕获杂交产物；
S6:捕获产物PCR并纯化；
S7：捕获文库质控；
S8:捕获文库测序，利用Illumina二代测序平台进行高通量测序。
4.如权利要求3所述的甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，所述S1包括如下步骤：
S11：合成探针引物库，所述探针引物库采用微流体芯片进行大规模并行合成，所述探针引物库的全部引物序列的5’末端和3’末端分别加上了如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的序列；
S12:对S11合成的探针引物库进行PCR，所述PCR包括两轮PCR，第一轮PCR的引物为如SEQ ID No.ID3所示的PCR引物A和如SEQ ID No.ID4所示的PCR引物B，第二轮PCR的引物为如SEQ ID No.ID5所示的PCR T7引物A和如SEQ ID No.ID4所示的PC引物B。
S13:对S12获得的PCR产物进行T7体外逆转录；
S14:对S13获得的T7体外逆转录产物进行纯化获得RNA探针，所述纯化使用ZymoResearch的RNA Clean&ConcentratorTM-5纯化试剂盒进行纯化；
S15:对RNA探针进行质控、贮藏，所述质控方法为，使用Nanodrop检测纯化后RNA探针的浓度，使用Agilent BioAnalyzer 2100 Expert进行探针峰型质检；所述贮藏温度为-80℃。
5.权利要求4所述的甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，S11中探针引物库的合成拷贝数的优化方法为：计算全部探针引物的GC含量，统计不同GC含量区段的探针的数目，将GC含量为40％-60％的探针引物合成拷贝数定为基准数，GC含量为30％-40％和60％-70％的探针引物合成拷贝数为基准数的2-3倍，GC含量为20％-30％和70-80％的探针引物合成拷贝数为基准数的3-4倍，GC含量为10％-20％和80-90％的探针引物合成拷贝数为基准数的4-5倍，GC含量小于10％和大于90％的探针引物合成拷贝数为基准数的5倍以上。
6.如权利要求3所述的甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，S2中提取基因组合DNA的质量要求为DNA总量200ng-1μg，浓度不低于10ng/μL，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.5，电泳主带完整，无明显降解；片段化的平均片段大小为150-200bp。
7.如权利要求3所述的甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，S3中构建基因组文库的方法为，使用VariantBaitsTMTarget Enrichment LibraryPrep Kit的所有组分将S2获得的纯化DNA片段构建成Illumina基因组文库。
8.如权利要求3所述的甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，S4中探针与基因组文库杂交使用的试剂盒包括：VariantBaitsTMTargetEnrichment Hyb&Amp Kit、VariantBaitsTMTarget Enrichment Adapter&Block Oligo、VariantBaitsTMTarget Enrichment Probe，杂交反应条件为PCR仪恒温65℃孵育16-24小时。
9.如权利要求3所述的甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，S7中捕获文库的质控方法为Qubit荧光定量仪定量检测文库浓度，Agilent 2100Bioanalyzer质检文库峰型，荧光定量PCR定量检测文库摩尔浓度。
10.如权利要求9所述的甲状腺结节恶性风险评估相关基因捕获探针的制备方法，其特征在于，S7中捕获文库的质控标准为：文库Qubit定量浓度不低于1ng/μL；文库片段大小在200-500bp之间；荧光定量PCR定量浓度不低于5nM，熔解曲线峰型单一，无Dimer污染。
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|---|---|---|---|---|
| CN110878358A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-13 | 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 | 一组甲状腺癌标志物及其应用 |
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- 2019-05-29 CN CN201910460075.0A patent/CN110079602A/zh active Pending
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