CN109136371B

CN109136371B - 一种放疗疗效和毒性反应相关基因组合、检测探针库以及检测试剂盒

Info

Publication number: CN109136371B
Application number: CN201810824734.XA
Authority: CN
Inventors: 袁双虎; 于金明; 邵阳; 汪笑男; 吴雪; 逄娇慧
Original assignee: 南京世和基因生物技术有限公司
Current assignee: Nanjing Shihe gene Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2019-11-01
Anticipated expiration: 2038-07-25
Also published as: CN109136371A

Abstract

本发明提供一种预测放疗疗效和毒性反应的基因组合、检测探针库以及检测试剂盒，所述预测放疗疗效和毒性反应基因组合中包含了与放疗敏感性、抗拒性、组织损伤毒性反应相关的106个基因，可以能够直接对放疗疗效和毒性反应进行预先评估；同时使用的检测探针库和试剂盒能够有效地利用高通量测序方法对这些基因进行高通量测序，以获得基因信息。

Description

一种放疗疗效和毒性反应相关基因组合、检测探针库以及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及一种放疗疗效和毒性反应相关基因组合、检测探针库以及检测试剂盒。该发明提供了涉及106个与放疗疗效和毒性反应相关的基因，可以应用于对病人放疗疗效和毒性反应的预测和评估，同时也提供了用于检测这个放疗疗效和毒性反应相关基因panel的探针库，对DNA样本库可进一步结合下一代测序技术（NGS），精准地判断病人的这些放疗相关基因上的突变情况，并为放疗过程的诊断、预后、及临床治疗方案的设计提供指导及理论基础。

背景技术

目前绝大部分实体瘤的治疗都是局部治疗联合全身治疗。肿瘤放射治疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法，其主要优点是杀灭肿瘤而无需致残或导致身体外观的改变。放疗是利用放射线如放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类x射线治疗机或加速器产生的x射线、电子线、质子束及其它粒子束等来治疗恶性肿瘤。放射线是有一束粒子或者携带能量的波。它可以直接破坏DNA，也可以在细胞内产生带电基团（如自由基等），从而间接破坏DNA。DNA控制着细胞的生长和分化，辐射损伤了癌细胞的DNA，当受损DNA无法修复时，癌细胞便停止分裂或死亡。当受损的癌细胞死亡后，它们会被身体的自然过程分解和消除。70%左右的恶性肿瘤患者在疾病发展的不同阶段需要接受放疗，放射治疗已成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一。

基于循证医学的各类指南为肿瘤的放疗提供了依据。然而，循证模式以统计学数据为基础，针对的是整个患者群体，这就导致了相同分期的不同患者在接受相同的放射治疗后，其肿瘤控制和正常组织损伤差异显著，说明以群体化的信息指导患者个体的治疗是有缺陷的，不适合存在个体差异的患者。因此，基于患者个体的临床、病理和分子基因水平参数做到 “量体裁衣式”的个体化放疗才是提高疗效的有效途径。个体化放疗指在循证医学的综合治疗模式下，以患者个体生物学特性为指导，在患者个体肿瘤解剖靶区的基础上，考虑患者个体肿瘤内部代谢、乏氧、增殖、凋亡、基因变异及不同亚靶区放射敏感性等生物学特性，给予不同生物学特性的靶区或亚靶区不同剂量、分割模式的放射治疗。

研究表明，肿瘤患者体内诸多基因变异与放疗敏感性、抗拒性、以及放疗引起的并发症存在着显著相关性，提示我们需要关注患者个体在治疗过程中基因变异情况，及时调整治疗方案，提高放疗疗效，降低并发症风险。然而，目前尚无针对这些临床放疗问题设计的多基因检测试剂盒。

大量研究发现，放疗敏感性可能与DNA损伤修复途径相关基因有关，放疗引起的DNA损伤可以通过多种DNA修复途径来弥补，DNA修复基因失活可能增加细胞对放化疗的敏感性；同时发现放疗抗拒的分子机制可能与细胞凋亡等信号通路的相关基因有关；另外，PI3K-AKT通路、MAPK-ERK通路等激活也可能影响放疗的敏感性。从DNA层面到RNA层面，筛选出 106个可能与放疗疗效和毒性反应相关的基因。这些基因的多态性和基因变异可以科学地预测放疗的疗效和放疗引起组织损伤，提高治疗的针对性，为临床放疗提供指导。基于个体化生物学特征制定放疗策略和技术方案，避免无效治疗、治疗不足或治疗过度，早期发现并干预一些潜在毒性反应，有望实现恶性肿瘤患者放疗受益最大化。

现有的主流基因突变检测方法主要集中于以下3个技术：

1）PCR突变检测

基于PCR片段扩增和凝胶电泳分离的方法，从而分辨出野生型和突变性的差异。其缺点包括：其为单碱基突变类型检测，不能对mRNA进行定量，不能检测基因颠换；敏感性低；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化；无法进行高通量检测。

2）Q-PCR（定量PCR）检测

基于荧光和PCR片段扩增来对模板mRNA多少来进行定量。其缺点包括：不能检测单碱基类型突变；不能检测基因颠换；只能检测已知突变；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化。

3）基因芯片技术

用高精度技术将DNA片段打印在芯片上，然后通过DNA杂交结合特性来确定突变性质。其缺点包括：不能检测基因颠换；只能检测已知突变；成本高，通量较小；准确率低，通常需要重复2次以上才能确定结果。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了涉及106个与放疗敏感性、抗拒性及组织损伤毒性反应相关的基因，可以应用于对病人放疗疗效和毒性反应的预测和评估，同时也提供了用于检测这个放疗疗效和毒性反应相关基因panel的探针库，对DNA样本库可进一步结合下一代测序技术（NGS），精准地判断病人的这些放疗疗效和毒性反应相关基因上的突变情况，并为放疗过程的诊断、预后、及临床治疗方案的设计提供指导及理论基础。

本发明的第一个方面：

一种预测放疗疗效和毒性反应的基因组合，能够预测放疗敏感性、抗拒性以及损伤毒性反应，包括如下基因： ABL1、AKT1、AKT2、APEX1、AR、ATM、ATR、BAD、BAX、BCL2、BCL2L1、BCL2L11、BCL3、BRCA1、BRCA2、CBLB、CUL3、CXCL8、CYLD、CYP2D6、EGFR、ERBB2、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、FANCD2、FANCF、FOXO3、GNAS、HDAC1、HMOX1、HSPB1、IGF1R、IL13、IL1A、IRF1、ITGB6、JUN、KEAP1、KRAS、LIG3、LIG4、LIN28B、MALT1、MAPK1、MAPK3、MCL1、MEN1、MIF、MLH1、MMP1、MRE11、MSH2、MSH6、MTHFR、MTOR、MTRR、MUC5B、NBN、NEIL1、NFE2L2、NFKB1、NFKBIA、NOS2、NOS3、NTHL1、PAK2、PARP1、PARP2、PDK1、PIK3CA、PMAIP1、PMS2、PNKP、PRKCB、PRKDC、PTEN、RAD50、RAD51、RAD51C、RAD54L、RAD9A、RCC1、RELA、SERPINE1、STAT1、SUMO1、TBK1、TFG、TGFB1、TNFAIP3、TNFRSF19、TNFRSF1B、TP53、TP53、TSC1、TSC2、UNG、VEGFA、XRCC1、XRCC2、XRCC3、XRCC4、XRCC5。

本发明的第二个方面：

一种检测权利要求1所述的基因组合的方法，所述方法包括以下步骤：

1）获得受试者的DNA样本库；

2）获得所述的检测上述预测放疗疗效和毒性反应基因组合的探针库；

3）使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；和

4）分离步骤3）的杂交产物，然后释放经杂交富集的上述预测放疗疗效和毒性反应基因组合DNA片段。

在一个实施方式中，所述步骤1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1）包括：1-1）提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者1-2）提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA。

在一个实施方式中，所述DNA片段的长度为150～600bp。

在一个实施方式中，还包括检测任意一个所述的基因的拷贝数变异的步骤。

在一个实施方式中，所述的步骤包括：

S1，从待测基因中选出至少两个待检测区域，将所述的基因组合中的其它基因的全部或部分区域作为其它区域，将所述的待检测区域与其它区域组成panel，并对待测样本和正常样本采用所述的panel进行NGS测序；

S2，根据步骤S1的结果，计算出每份正常样本和待测样本上的待检测基因的拷贝数；

S3，将正常样本中待检测基因的拷贝数进行T分布拟合，将分布曲线的平均值作为该待检测基因的平均拷贝数基线；

S4，将待测样本中所述的待检测基因的拷贝数与平均拷贝数基线进行比较，判定是否存在拷贝数变异；

其中，待测样本和正常样本的待检测基因的拷贝数是指每个待检测区域的拷贝数的平均值；

待检测区域的拷贝数的计算方法是：根据样本与对照样本的NGS测序结果，比对至参考基因组序列，获得唯一比对至所述的检测区域的读段（reads），并计算出每个样本中每个检测区域上的测序深度；对同一份样本中的每个检测区域的测序深度进行T分布拟合，将分布曲线的平均值作为该样本上的平均测序深度；根据平均测序深度计算出每份样本上的待检测区域的拷贝数。

在一个实施方式中，panel中检测区域的数量为3～50000个。

在一个实施方式中，拷贝数的计算是公式是：拷贝数=（样本的待检测区域的测序深度/样本的平均测序深度）/（对照样本的待检测区域的测序深度/对照样本的平均测序深度）×倍体数（Ploidy）。

在一个实施方式中，每个待检测区域的拷贝数的平均值是指算术平均值。

本发明的第五个方面：

本发明提供了检测上述的预测放疗疗效和毒性反应的基因组合的试剂盒。

有益效果

该发明提供了涉及106个与放疗疗效和毒性反应相关的基因，可以应用于对病人放疗疗效和毒性反应的预测和评估，同时也提供了用于检测这个放疗疗效和毒性反应相关基因panel的探针库，对DNA样本库可进一步结合下一代测序技术（NGS），精准地判断病人的这些放疗相关基因上的突变情况，并为放疗过程的诊断、预后、及临床治疗方案的设计提供指导及理论基础。

附图说明

图1为本发明技术方案的示例性工艺流程图，其中富集得到目标基因群，并用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测。

图2为本发明的探针设计策略的示意图。

图3为本发明的探针覆盖范围示意图。

图4是上机测序结果示意图。图5是KEAP1基因拷贝数检测结果对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本文中所使用的术语“DNA”为脱氧核糖核酸（英文：Deoxyribo nucleicacid，缩写为DNA）是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运行，其碱基排列顺序构成了遗传信息，所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。

在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa（Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq-4000、Hiseq X ten等）、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。高通量测序技术，例如Miseq测序技术具有以下优势：（1）高灵敏度：高通量测序，例如Miseq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据，高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到含量更低的突变，同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。（2）高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签序列，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。

本发明中的“突变”、“核酸变异”、“基因变异”可通用，本发明中的“SNP”(SNV)、“拷贝数变异”（CNV）、“插入缺失”(indel)和“结构变异”(SV)同通常定义，但本发明中对各种变异的大小不作特别限定，这样这几种变异之间有的有交叉，比如当插入/缺失的为大片段甚至整条染色体时，也属于发生拷贝数变异(CNV)或是染色体非整倍性，也属于SV。这些类型变异的大小交叉并不妨碍本领域人员通过上述描述执行实现本发明的方法和/或装置并且达到所描述的结果。

本发明提供了一种与放疗疗效和毒性反应相关的基因组合，本组合中包含了以下这些基因：

另外，本发明还提供了用于富集放疗疗效和毒性反应相关基因组合DNA片段的方法。具体而言，本发明的方法包括：从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA，经处理或合成cDNA，从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库；此外，针对要富集的放疗疗效和毒性反应相关的基因外显子片段，设计与该放疗疗效和毒性反应相关的基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；然后，将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交，从而从DNA样本库中富集得到放疗疗效和毒性反应相关的基因片段。根据本发明的具体实施方式，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化，然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物，再从磁珠上释放出富集的放疗疗效和毒性反应相关的基因片段。经适应性处理，可以采用下一代测序基因对放疗疗效和毒性反应相关的基因片段进行基因结构突变的检测，以确认放疗疗效和毒性反应相关的基因的各类突变。

下面以富集得到的放疗疗效和毒性反应相关的基因片段用于基于下一代测序技术的基因突变检测为例，示例性地说明本发明。

一、准备mRNA/DNA样本库

1. 准备基因组DNA样本（采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”）

1.1 DNA提取

DNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。

分别使用Nanodrop和Qubit定量测定DNA质量和浓度，记录A260/A280比值，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。血液或肿瘤组织来源的DNA样本，50ng以上为合格（Qubit定量），ctDNA样本，10ng以上为合格（Qubit定量）。

1.2 DNA片段化

将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书，将DNA片段化，片段长度为150～200碱基。

DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

1.3 DNA样本库质量检测

用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。

2. 准备cDNA样本（采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库）

2.1 mRNA提取

mRNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。

使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。

2.2 mRNA片段化

采用NEBNext RNA Fragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。

mRNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

2.3 用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。

cDNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

3. cDNA/DNA末端修补

将DNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行，其中，所述Klenow片段具有5’-3’’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对经过末端修复的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。

利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。

cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

4. 在cDNA/DNA样本3'末端加上碱基A

在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例，可以利用Klenow(3’-5’exo-)，即具有3’-5’外切酶活性的Klenow，在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A。由此，能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3’末端。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。

反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。

cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

5. 在cDNA/DNA两端加上接头

cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

如使用mRNA→cDNA，进行6和7；

如果是用基因组DNA，直接跳到8。

6. 分离出合适长度的cDNA片段

使用电泳凝胶，对照DNA梯度标准，在凝胶上剪切出150－250碱基cDNA片段。

将含有cDNA样本库的凝胶样本过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

7. cDNA片段样本库质量检测

使用生物分析仪，进行cDNA定性定量分析，并确认分离出的cDNA片断长度峰值合理。

PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次（cDNA样本库）或者4－6次（DNA样本库）。最后在72℃延伸5分钟。

PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

8. 扩增DNA模板

在本发明的一个实施例中，样本为含微量游离DNA片段的血浆样本，包含极其微量的目标游离DNA片段，第一扩增使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求

聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行。

PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

9. 扩增后cDNA/DNA样本库质量检测

使用生物分析仪，进行cDNA/DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。

对于得到的cDNA/DNA样本库，如果cDNA小于30纳克/微升，DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥（低于45℃），再用无核酸酶水溶解至所需浓度。

针对本发明提供的放疗疗效和毒性反应相关基因组合准备DNA探针库。

在用于对基因组合中任意一个或几个或者全部的基因进行检测时，可以根据参考基因组中的序列设计相应的探针，设计方法可以参考现有技术或相关产品的说明书进行，可以设计出相应的检测试剂和试剂盒，试剂中可以根据位点的序列设计出相应的探针或引物，也可以在试剂盒中增加其它的对照基因及相应的检测试剂。

二、DNA捕获探针杂交

1. 将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交

将cDNA/DNA样本库与杂交缓冲液混合，反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。

然后将该混合物与探针库混合，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。

三、得到经杂交富集的放疗疗效和毒性反应相关基因组合片段

1. 准备链霉亲和素（Streptavidin-Coated）磁珠

使用Dynabeads链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀，每个样本需要50微升磁珠。

磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液，在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。

2. 分离杂交产物

混合1中的杂交反应混合物与2中的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。

然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液，在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。

以上步骤重复三次。

3. cDNA/DNA富集样本释放

将磁珠与50微升洗脱缓冲液混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的基因片段cDNA/DNA样本库。

将样本库过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

五、PCR扩增与纯化

因杂交捕获会损耗一定量的核酸，第二扩增能使捕获下的目标片段获得再次扩增以满足上机测序和质控检测的要求。本发明的这一文库构建方法特别适用于总游离核酸不低于10ng或者常规组织基因组DNA不低于1μg的样本的测序文库构建。

将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。

PCR扩增产物过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

六、采用下一代测序技术检测放疗疗效和毒性反应相关基因的突变

使用下一代商业化的测序仪器进行测序，如Roche 454、Illumina Hiseq等。测序结果用已有的测序软件分析包进行分析。

示例性地，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统，PE-90bp其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。

经过QC筛选后，对测序结果使用了Bowtie对所得片段进行序列映射，利用Bioconductor软件，成功映射片段进行突变分析。

在上述的基因检测的基础上，本发明进一步提出了对上述的基因组合中任意一个基因拷贝数检测的方法。这种检测方法是基于读深方法进行判定各个检测区域的拷贝数变异，进行检测的过程中，各个检测的区域共同构成panel进行高通量测序，这些区域可以是某一个基因中的一个或几个外显子。检测的原理为：如果染色体某一区域发生了拷贝数变异，则高通量测序时该区域的序列片段分布将发生变化，即，拷贝数缺失-序列密度将变小，拷贝数扩增-序列密度将变大。本发明提供的检测方法仅仅是用于通过测序结果判定是否存在着拷贝数变异现象，并非是用于非治疗或诊断目的。在实际检测过程中，为了发挥高通量测序的通量大、效率高的优点，通常是将上述的基因组合中的许多个基因片段、区域共同组成检测panel，同时对这些区域进行检测，在一些通常的panel中，检测区域的数量可以是几十个，也可以是几百、上千个。有可能有一次检测的过程中，较为关心的只是这个panel中的一部分基因或位点，这部分也就是属于待检测的基因或位点区域。本发明中所述的“待检测区域”是指某一个需要进行拷贝数变异检测的基因中的一个子区域，这个子区域可以是指这个基因中的某一个外显子区域。本发明中所述的“其它区域”是指与待检测区域一起加入至panel的那些区域，这些区域可能是在其它的条件下较为重要、需要检测，也可以是在本次检测中的后续步骤中再进行拷贝数变异的检测，“其它区域”的加入是为了提高高通量测序的效率而进行加入。这些其它的区域的来源，可以是本发明提供的基因组合中其它的一个或几个基因的外显子区域。根据上述的定义，本发明说明书中当提及“每个检测区域”、“panel中的检测区域”时，是指“待检测区域”和“其它区域”，因为这两个区域都属于在一次高通量测序中都进行检测的区域，并且“其它区域”中的测序深度等数据也是要应用于检测的计算过程。本发明中“待测样本”是指需要进行检测，并判定该样本上的一个或者多个基因区域是否存在有拷贝数变异。“正常样本”是指用于计算判定基线的样本，这些样本可以是选择具有一定数量的正常人的血液样本进行统计分析（可以采用几百例正常人样本，可以根据实际情况使样本数量具有统计意义）。在计算拷贝数时，还需要使用“对照样本（control）”，以对待测样本/正常样本的测序深度进行对比，并计算拷贝数，这里的“对照样本”可以是使用与待测样本配对的样本，当待测样本存在着自己的对照时，可以直接将其作为对照样本，如果没有对照样本时，可以采用标准品细胞DNA样本作为对照，例如当待测样本为人类来源时，可使用健康北京人B淋巴细胞DNA样本NA18535等。

本发明中，所述的拷贝数变异的检测方法是用于非治疗与诊断目的。

如本文所用的，术语“比对”是指将读数或标签与参考序列进行比较并且由此确定该参考序列是否含有该读数序列的过程。如果该参考序列含有该读数，则可以将该读数映射至参考序列，或者在某些实施方案中，映射至参考序列中的某个特定位置。在有些情况下，比对简单地告知读数是或不是特定参考序列的成员(即，该读数是存在还是不存在于参考序列中)。举例来说，将读数与人类染色体13的参考序列进行比对，将告知该读数是否存在于针对染色体13的参考序列中。提供这种信息的工具可以被判定集合成员身份测试器。在有些情况下，比对另外指示参考序列中读数或标签可以映射至其中的位置。举例来说，如果参考序列是全人类基因组序列，那么比对可以指示读数存在于染色体13上，并且可以进一步指示读数是在染色体13的具体股和/或位点上。术语“参考基因组”或“参考序列”是指任何生物体或病毒的任何具体的已知基因组序列(无论是部分的或完整的)，它可以用于对来自受试者的识别的序列进行参比。例如，用于人类受试者以及许多其他生物体的参考基因组可见于美国国家生物技术信息中心（ncbi.nlm.nih.gov），对于人的样品来说，参照序列可以是人基因组hg18或hg19的序列。目前hg19的相关数据库相对较多且hg19测出来的碱基量比hg18要多，即样品比对率会相对较高，所以优先选择hg19。

术语“读数(read)”是指来自核酸样品的一部分的序列读数。典型地，虽然并不一定是，读数代表样品中的相邻碱基对的短序列。读数可以通过样品部分的碱基对序列(以ATCG表示)以符号代表。它可以存储在存储设备中，且酌情处理，以确定它是否与参考序列匹配或者满足其它标准。读数可以直接地从测序装置中或者间接地从涉及样品的存储的序列信息中获得。在有些情况下，读数是足够长度(例如，至少约30bp)的DNA序列，其可以用于识别更大的序列或区域，例如，其可以与染色体或基因组区域或基因进行比对并且具体地分配给染色体或基因组区域或基因。

每个目标区域上的序列信息是比对结果中包含该位点的测序片段，位点的测序深度信息是比对结果中包含该位点的测序片段数目。所检测的区域可以使任何感兴趣的区域，不局限于外显子与基因，长度大小也都没有限制。上面的检测区域数量，可以是3～50000个。例如：如果检测若干个感兴趣的基因时，可以将它们与本发明中的基因组合中的其它的一个或几个或者其它全部基因共同构成panel同时进行NGS测序，测序过程中这些感兴趣的区域都通过其参考基因序列设计探针进行捕获并检测；如果是采用了较大的基因进行检测时，也可以只检测这个基因中的若干个子区域（例如是外显子区域），将这些子区域与其它基因的子区域（也可以是外显子）的区域共同构成panel同时时行NGS测序，测序过程中根据这些子区域的参考序列设计探针对子区域进行捕获和检测，并将待测基因的子区域的拷贝数的平均值作为该基因的拷贝数（这里的平均值可以是指算术平均值、正态分布平均值、卡方分布平均值、F分布平均值或者T分布平均值）。

第1步，在检测过程中，首先通过上述的方法对样本DNA提取、片断化、捕获并上机测序，在获得了相应的测序信息后，可以采用常规方法做数据进行预处理，这里的处理主要是对测序所得的每个样本序列分别进行过滤，以去除掉不合格的序列和接头序列，其中，样本包括目标样本(即，变异组织)和对照样本(即，正常组织)；具体地，对高通量测序后的样本序列进行过滤，去除不合格的序列及接头序列，其中，不合格序列可以为下列情况中的至少一种：测序质量低于某一阈值的碱基个数超过整条序列碱基个数的一定比例(例如，50%)和序列中测序结果不确定的碱基(例如，IlluminaGA测序结果中的N)个数超过整条序列碱基个数的一定比例(例如，10%)。其中，高通量测序技术可以为IlluminaGA或者HiSeq测序技术，也可以为现有的其他高通量测序技术，低质量阈值可以由具体测序技术和测序环境确定。在对读段进行了预处理之后，将过滤后的每个样本序列分别比对到参考基因组序列，对比对后的每个样本序列分别进行筛选以得到唯一比对的样本序列，确定每个唯一比对的样本序列相对于参考基因组序列的位置信息，并对位置信息进行排序；具体地：(1)首先可以通过任何一种短序列映射程序(例如，短寡核苷酸分析包(Short Oligo nucleotideAnalysis Package ,SOAP))将过滤得到的每个样本序列(即，由多个测序片段数据构成的序列)分别比对到参考基因组序列(例如，人类基因组参考序列)得到每个样本序列在参考基因组上的位置情况；(2)然后，对比对结果进行一系列的筛选，例如，去除比对到多个位置的序列(因为这个序列已无法准确唯一的提供比对位置信息)、去除重复出现的序列(因为这些序列可能是由于前期实验引入的误差，如由测序错误引起，为使检测结果更加精准，故去除)，以得到唯一比对的序列结果。

第2步，需要根据以上获得的唯一比对的序列统计出在各个样本各个目标区域上的测序深度，也就是统计在各个目标区域上的读数。由于本发明中是对多个目标区域构成的panel进行整体检测，在一些位置上的拷贝数变异会导致该样本的总体平均测序深度发生变化，因此计算panel上各个区域的平均测序深度时就会出现会随着选取的目标区域的不同而发生计算值不一致的情况，也就导致了拷贝数计算结果的不稳定性，并且随着目标区域的数量的减少，影响程度呈增大趋势。或者随着拷贝数变异程度增大，影响程度也会增大。对于由若干个待检测区域和其它一些区域共同构成的panel来说，这里是要计算出分别在这些待测区域和其它区域上的测序深度；而对于包含一个基因中的多个子区域的panel来说，这里也是同样地获得这些子区域以及其它一些区域的测序深度。

需要对同一份样本上的全部的检测区域的测序深度进行统计，目标是为了获得该样本上的平均测序深度，本发明中意外地发现针对第2步中所描述的问题，采用t分布拟合计算平均值的方法可以非常有效地解决计算结果稳定性问题。对于包含一个基因中的多个子区域的panel来说，也是要将这些全部的子区域和其它的区域的测序深度进行T分布统计，并拟合计算出分布平均值，就该值作为这份样本的平均测序深度；在该步骤中，可以针对每个正常样本、待测样本和对照样本分别统计出它们的平均测序深度。

第4步，通过比值比（odds ratio, OR）的方法计算出每个样本上的每个待测区域的拷贝数。

对于包含一个基因中的多个子区域的panel来说，该计算方法是是类似地通过以下公式得到的：

对于待测样本，拷贝数=（待测样本的待测子区域的测序深度/待测样本的平均测序深度）/（对照样本的待测子区域的测序深度/对照样本的平均测序深度）×倍体数（Ploidy）。

对于正常人群样本，拷贝数=（正常样本的待测子区域的测序深度/正常样本的平均测序深度）/（对照样本的待测子区域的测序深度/对照样本的平均测序深度）×倍体数（Ploidy）。

使用比值比进行计算可以达到以下几个目的，首先可以降低区域的GC含量对其测序深度的影响，这种影响会在计算待测样本和对照样本在同一区域的比值比时，这种影响在除法中抵消了，其次，消除了该区域自身由于自身特性比如不容易捕获而导致的测序深度较其他区域低的影响，通常会可能会被认为是发生了拷贝数降低，但通过比值比的计算后只关注待测样本相对于对照样本的比值比的变化而不是实际的值，因此依然可以准确得到拷贝数变异区域。最后，如果采用对照样本时，可以对不同的对照样本实现比较，因为它们都是相对于同一个标准做的比较。其中，对包含多个子区域的基因的拷贝数进行检测时，对该基因上的子区域进行检测，然后根据每个子区域的拷贝数做平均值作为该基因上的拷贝数。

第5步，获得用于判定目标区域是否存在拷贝数变异的基线，所使用的方法是将全部的正常样本上的待测个区域（或者是包含子区域的基因）的拷贝数进行T分布拟合，求出平均值，作为拷贝数基线，这里的基线数值可以是采用平均值（mean）±标准偏差（sd）所构成。

第6步，将计算得到的待测样本上的某一个区域（或者是包含子区域的基因）的拷贝数值与该区域的基线值进行比较，大于或小于某一个数值时，则判定存在拷贝数增加/缺失。例如，可以判定当拷贝数 <= 0.65或>= 1.6时，存在着缺失/增加，这里的mean±sd可以是Mean±2SD、Mean±2.5SD或Mean±3SD等，采取的平均值加减sd的标准使判定结果具有统计学意义，例如mean±2sd包含了96%的样本，3sd包含99%样本。如果超过这个范围，可以再通过假设检验计算p值，考察其显著性。

实施例1 富集并检测放疗疗效和毒性反应相关基因

一、构建样本库

1.DNA的提取和纯化

采用商品化的试剂盒对于待测样本、正常样本进行血液DNA提取，同时对照样本的DNA进行提取，并进行质量检测。

2. DNA片段化

按照DNA破碎仪使用说明书，将DNA样本片段化，使片段长度为150-200碱基。

使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒将DNA过柱纯化。

3. DNA样本库质量检测

4. DNA末端修补

使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒将cDNA/DNA过柱纯化。

5. 在DNA样本3'末端加上碱基A

反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。

使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒将cDNA/DNA过柱纯化。

6. 在DNA两端加上接头

使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒将cDNA/DNA过柱纯化。

7. 扩增5获得的DNA片段样本库

聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行。

PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环15次（cDNA样本库）或者4～6次（DNA样本库）。最后在72℃延伸5分钟。

使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒（货号：A63880）将PCR扩增产物过柱纯化。

8. 扩增后DNA样本库的质量检测

使用生物分析仪，进行DNA定性定量分析，并确认纯化后片段长度峰值合理，约200bp。

对于得到的DNA样本库，如果DNA浓度小于150纳克/微升，须将样品经过真空浓缩机低温干燥（低于45℃），再用无核酸酶水溶解至所需浓度。

二、针对以上的放疗疗效和毒性反应相关基因准备DNA探针库

根据上述的探针设计方法和思路，设计并合成探针进行试验，在5’端有生物素（Biotin），探针覆盖率2X，长度为120nt。以KEAP1基因为例，其探针序列如SEQ ID NO.1～60所示，探针设计方法如图3所示。

三、将DNA样本库与生物素化的DNA探针库杂交

将DNA样本库与杂交缓冲液（10mM Tris-HCl, 2%牛血清白蛋白, pH8.0）混合（混合后，DNA样本库浓度至多不超过50ng/ul），反应条件为95℃ 5分钟，之后保持在65℃。反应在PCR扩增仪中进行。

然后以DNA样本库：探针库为1:100的摩尔比，将探针库加入上述混合物，反应条件为65℃ 5分钟。将杂交反应置于PCR扩增仪中，65℃孵育24小时。

四、得到经杂交富集的放疗疗效和毒性反应相关基因片段

1. 准备链霉亲和素磁珠

使用Dynabeads（Life technologies, 货号：11206D）链霉亲和素磁珠或者其它商业化公司链霉亲和素磁珠。将磁珠置于混匀仪上混匀。

磁珠洗涤：混合50微升磁珠和200微升结合缓冲液（10mM Tris-HCl, 2%牛血清白蛋白, pH8.0），在混匀仪上混匀，使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠与缓冲液分离纯化，缓冲液弃掉不用。重复三次，每次加入200微升结合缓冲液。

2. 分离杂交产物

混合步骤三中得到的杂交反应混合物与步骤四的1中得到的链霉亲和素磁珠，反复颠倒试管5次。在室温下振摇30分钟。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。

然后向磁珠中加入500微升洗涤缓冲液（磷酸缓冲液，0.1% Tween-20, 0.1% SDS,pH7.4），在65℃孵育10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离纯化。以上步骤重复三次。

3. DNA富集样本释放

将磁珠与50微升洗脱缓冲液（10mM氢氧化钠溶液）混合，室温孵化10分钟，每隔5分钟混匀一次。使用Dynal磁选机或者其它商业化公司磁选机，将磁珠分离弃掉。此时上清液中即含有富集过的放疗疗效和毒性反应相关基因片段DNA样本库。

使用Beckman Coulter Ampure Beads试剂盒将样本库过柱纯化。

五、PCR扩增与纯化

将富集cDNA/DNA样本库进一步扩增，为测序仪器上样做准备。

六、采用下一代测序技术检测放疗疗效和毒性反应相关基因组合的结构突变

使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS，使用桥式PCR对DNA样本库模板进行扩增：每个DNA样本片段将会在芯片上形成克隆簇，每条泳道上产生数百万这样的克隆簇。使用Illumina HiSeq2000下一代测序系统，其原理是边合成边测序。和传统Sanger方法相比，利用“可逆性末端终结反应”技术，四种dNTP碱基末端被保护基团封闭，并分别以不同颜色荧光标记。检测结果如图4所示。

对10例患者样本和5例阴性样本进行DNA提取，并通过本发明优选的探针和方法进行测序，结果中显示，阳性样本和阴性样本的测序结果与qPCR测序法所得结果相同，证明了本方法的可靠性。

实施例2、对基因组合中KEAP1基因拷贝数的检测

本实施例中检测的目标区域是含有5个编码氨基酸的外显子区域的KEAP1基因的拷贝数进行检测，目标区域的主要信息如下表所示：

这里的正常人群共214位，他们的KEAP1基因OR值组成的z分布的曲线平均值为1.14，sd为0.072，这里的病人样本用的是https://www.horizondiscovery.com 公司提供的HD786标准品，它包含KEAP1扩增，官方未提供其拷贝数OR值，我们利用NGS的方法以及以上描述的算法得到的该基因的拷贝数OR为0.76左右。这里采用的对照样本为NA18535标准品细胞。

进行检测的panel中还包括了其它的一些敏感基因的外显子区域，分别取不同数量的区域与KEAP1基因5个外显子共同构成panel，共选择了4766个其它备选区域，例如其中100个其它备选区域的信息如下：

在进行计算时，将KEAP1基因的5个外显子分别和10个、50个、100个、300个、400个、……4000个、4766个其它的热点基因的外显子区域共同构成panel同时进行NGS测序，具体的panel中的区域数量如表上所示，其中采用10个、50个、100个其它区域时，是采用的表中序号为1～10、1～50、1～100的外显子区域，其它的区域在此不一一描述。

采用的检测步骤如下：

1、采用Illumina高通量测序技术对待测序列进行测序，接收测序序列后，对测序序列进行过滤，去除不合格的序列，将样本接头序列从序列片段中去除，其中，不合格序列包括：测序质量值低于5的碱基个数超过整条序列碱基个数的50%或序列中测序结果中N的个数超过整条序列碱基个数的10%；

2、采用短寡核苷酸分析包(SOAP)映射程序将高通量测序技术得到的癌症样本和癌旁样本测序片段比对到人类参考基因组序列上，筛选掉比对结果中多重比对的序列、去除重复出现的测序序列、一端测序数据中碱基序列一样的序列(仅保留一份)，以降低结果中的假阳性，最后，根据需求提取比对结果中所需要处理的染色体编号及位置信息，染色体位置。

3、根据待测样本、正常样本与对照样本的各个检测区域的读段（reads）计算出各个区域上的测序深度；对于每一个单独的样本，将样本上各个检测区域的测序深度进行T分布拟合（例如，当需要检测100个区域时，将某一份样本上这100个区域的测序深度进行T分布统计），并计算出T分布曲线的平均值，将这个平均值作为该单独样本的平均测序深度；按照上述的方法，再对其它的样本进行平均测序深度的计算，此时，就获得了待测样本集、正常样本集与对照样本集中的每一个样本的平均测序深度。

4、通过比值比的方法计算出每一个样本上的每一个检测区域的拷贝数，计算方法是：

对于待测样本，某一个特定检测区域的拷贝数=（待测样本上检测区域上的测序深度/待测样本上的平均测序深度）/（对照样本上某区域上的测序深度/对照样本上的平均测序深度）×倍体数（Ploidy）。

对于正常人群样本，拷贝数=（正常样本上检测区域上的测序深度/正常样本上的平均测序深度）/（对照样本上某区域上的测序深度/对照样本上的平均测序深度）×倍体数（Ploidy）。

可以获得了每个待测样本和正常样本上的各个区域上的拷贝数。

本实施例中，KEAP1基因具有5个外显子，对这5个外显子区域计算出拷贝数之后，将两者的算术平均值作为基因的拷贝数。

5、把正常样本集中每个样本上的KEAP1基因的拷贝数进行T分布统计，并计算出分布曲线上的平均值，作为KEAP1基因的拷贝数基线值，并以mean±3sd数值范围作为判定区间；

6、将待测样本的KEAP1基因的拷贝数与步骤5得到的KEAP1基因拷贝数基线进行比较，判定是否出现拷贝数异常。

作为对照，步骤3中计算每个样本的平均测序深度中，采用的是将一个样本中的全部检测区域的测序深度作算术平均值，作为该样本的平均测序深度。

计算结果如下表所示，区域数量与拷贝数值之间进行作图后如图5所示。

本实施例中，KEAP1基因有5个编码氨基酸的外显子，对这5个外显子区域计算出拷贝数之后，将两者的算术平均值作为基因的拷贝数。采用本发明的方法可以避免在panel中的其它检测区域的数量的影响，使每次检测结果的数值与对标准品的实际值一致。

还采用了KEAP1外显子分别与10个不同的其它区域构成panel来进行拷贝数的检测，分别采用上述的100个其它备选区域的信息中序号为1～10、21～30、41～50、61～70、81～90号的外显子区域与KEAP1组成panel（分为称为1～5组），依照同样的方法对KEAP1拷贝数进行检测，结果如表下所示：

MET基因拷贝数

从表中可以看出，当在KEAP1基因与其它10个检测区域构成panel进行检测时，在panel中的其它区域的不同，会对采用平均值方法检测得到的结果产生明显不同，因此，这种方法的检测结果的可信度较低；而采用T分布拟合方法计算得到的结果与panel中其它的区域并没有明显的关联，得到的检测结果始终保持稳定，可信度高。

序列表

<110> 南京世和基因生物技术有限公司

<120> 一种放疗疗效和毒性反应相关基因组合、检测探针库以及检测试剂盒

<130> 无

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgacatcg ggccggagtg gggtgggcgt ggctgtcacc atggagccct gccggaagca 60

gattgaccag cagaactgta cctgttgagg cacttttgtt tcttgggcaa aaatacagtc 120

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgttacgac ccagatacag acacctggag cgaggtgacc cgaatgacat cgggccggag 60

tggggtgggc gtggctgtca ccatggagcc ctgccggaag cagattgacc agcagaactg 120

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccgcagga ggctatgatg gtcacacgtt cctggacagt gtggagtgtt acgacccaga 60

tacagacacc tggagcgagg tgacccgaat gacatcgggc cggagtgggg tgggcgtggc 120

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgtgacag gtggtgacca tcccttctgt tcttcccgca ggaggctatg atggtcacac 60

gttcctggac agtgtggagt gttacgaccc agatacagac acctggagcg aggtgacccg 120

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctctctctt tctgtcccct gctcttggat gtggtgtgac aggtggtgac catcccttct 60

gttcttcccg caggaggcta tgatggtcac acgttcctgg acagtgtgga gtgttacgac 120

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tataggcgtg agccaccacg cccggcctgc ttttgcatct cacagctgca tctctctctt 60

tctgtcccct gctcttggat gtggtgtgac aggtggtgac catcccttct gttcttcccg 120

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacagagac gtggactttc gtagccccca tgaagcaccg gcgaagtgcc ctggggatca 60

ctgtccacca ggggagaatc tacgtccttg gtgaggccct gggggcgggg aagagtcctg 120

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtcaggacc agctgaacag cgtggagcgc tacgatgtgg aaacagagac gtggactttc 60

gtagccccca tgaagcaccg gcgaagtgcc ctggggatca ctgtccacca ggggagaatc 120

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgtcctgcac aactgtatct atgctgctgg gggctatgat ggtcaggacc agctgaacag 60

cgtggagcgc tacgatgtgg aaacagagac gtggactttc gtagccccca tgaagcaccg 120

<210> 10

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccagagtcac cttctctgca tggtgccctt taggcgtctg cgtcctgcac aactgtatct 60

atgctgctgg gggctatgat ggtcaggacc agctgaacag cgtggagcgc tacgatgtgg 120

<210> 11

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaggtctcc ctcaaggagg tgatggctgg ggttcccaaa gccagacccc cagagtcacc 60

ttctctgcat ggtgcccttt aggcgtctgc gtcctgcaca actgtatcta tgctgctggg 120

<210> 12

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttctgagggt gagaagggag aggagagagg aaaggtctcc ctcaaggagg tgatggctgg 60

ggttcccaaa gccagacccc cagagtcacc ttctctgcat ggtgcccttt aggcgtctgc 120

<210> 13

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaacgagtgg cgaatgatca cagcaatgaa caccatccga agcggggcag gtgggtgggg 60

acggtaggga ggggagcacc caggaacacc ccctaccatc ctggggtgaa actgagccag 120

<210> 14

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggacaaaccg ccttaattca gctgagtgtt actacccaga gaggaacgag tggcgaatga 60

tcacagcaat gaacaccatc cgaagcgggg caggtgggtg gggacggtag ggaggggagc 120

<210> 15

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggctgtcctc aatcgtctcc tttatgccgt ggggggcttt gacgggacaa accgccttaa 60

ttcagctgag tgttactacc cagagaggaa cgagtggcga atgatcacag caatgaacac 120

<210> 16

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccaatgctg acacgaagga tcggggtggg cgtggctgtc ctcaatcgtc tcctttatgc 60

cgtggggggc tttgacggga caaaccgcct taattcagct gagtgttact acccagagag 120

<210> 17

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agccagagcg ggatgagtgg cacttggtgg ccccaatgct gacacgaagg atcggggtgg 60

gcgtggctgt cctcaatcgt ctcctttatg ccgtgggggg ctttgacggg acaaaccgcc 120

<210> 18

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccccattttt cttacgccct tgcaggtatg agccagagcg ggatgagtgg cacttggtgg 60

ccccaatgct gacacgaagg atcggggtgg gcgtggctgt cctcaatcgt ctcctttatg 120

<210> 19

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aaaaaaaaga gtatctggcc cttaagtatt ccacgaaggt cagctataat ggccattgtc 60

cccatttttc ttacgccctt gcaggtatga gccagagcgg gatgagtggc acttggtggc 120

<210> 20

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttaaggggga aaaaaaaaag gaaaaaaaag agtatctggc ccttaagtat tccacgaagg 60

tcagctataa tggccattgt ccccattttt cttacgccct tgcaggtatg agccagagcg 120

<210> 21

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagtgctggg attacaggca tgagccatcg cgccggatga acctgtctct ttaaggggga 60

aaaaaaaaag gaaaaaaaag agtatctggc ccttaagtat tccacgaagg tcagctataa 120

<210> 22

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggggtcatcg atggccacat ctatgccgtc ggcggctccc acggctgcat ccaccacaac 60

agtgtggaga ggtgagtggc agggcctggg ggtgggctcg gagggtcctg ctcctggcaa 120

<210> 23

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgagcgtgc cccgtaaccg catcggggtg ggggtcatcg atggccacat ctatgccgtc 60

ggcggctccc acggctgcat ccaccacaac agtgtggaga ggtgagtggc agggcctggg 120

<210> 24

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagtggtcgc cctgcgcccc catgagcgtg ccccgtaacc gcatcggggt gggggtcatc 60

gatggccaca tctatgccgt cggcggctcc cacggctgca tccaccacaa cagtgtggag 120

<210> 25

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggcaggaaca actcgcccga cggcaacacc gactccagcg ccctggactg ttacaacccc 60

atgaccaatc agtggtcgcc ctgcgccccc atgagcgtgc cccgtaaccg catcggggtg 120

<210> 26

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gggcgggctg ttgtacgccg tgggcggcag gaacaactcg cccgacggca acaccgactc 60

cagcgccctg gactgttaca accccatgac caatcagtgg tcgccctgcg cccccatgag 120

<210> 27

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggccggctgc gtggtgggcg ggctgttgta cgccgtgggc ggcaggaaca actcgcccga 60

cggcaacacc gactccagcg ccctggactg ttacaacccc atgaccaatc agtggtcgcc 120

<210> 28

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ctcagctacc tggaggctta caaccccagt gacggcacct ggctccggtt ggcggacctg 60

caggtgccgc ggagcggcct ggccggctgc gtggtgggcg ggctgttgta cgccgtgggc 120

<210> 29

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gtgggccgcc tgatctacac cgcgggcggc tacttccgac agtcgctcag ctacctggag 60

gcttacaacc ccagtgacgg cacctggctc cggttggcgg acctgcaggt gccgcggagc 120

<210> 30

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gggcgcccaa ggtgggccgc ctgatctaca ccgcgggcgg ctacttccga cagtcgctca 60

gctacctgga ggcttacaac cccagtgacg gcacctggct ccggttggcg gacctgcagg 120

<210> 31

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gactacctgg tcaagatctt cgaggagctc accctgcaca agcccacgca ggtgatgccc 60

tgccgggcgc ccaaggtggg ccgcctgatc tacaccgcgg gcggctactt ccgacagtcg 120

<210> 32

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctgcagtccg actcccgctg caaggactac ctggtcaaga tcttcgagga gctcaccctg 60

cacaagccca cgcaggtgat gccctgccgg gcgcccaagg tgggccgcct gatctacacc 120

<210> 33

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcagatgcag ctgcagaagt gcgagatcct gcagtccgac tcccgctgca aggactacct 60

ggtcaagatc ttcgaggagc tcaccctgca caagcccacg caggtgatgc cctgccgggc 120

<210> 34

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cagcgacggt tctacgtcca ggcgctgctg cgggccgtgc gctgccactc gttgacgccg 60

aacttcctgc agatgcagct gcagaagtgc gagatcctgc agtccgactc ccgctgcaag 120

<210> 35

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

catcaactgg gtcaagtacg actgcgaaca gcgacggttc tacgtccagg cgctgctgcg 60

ggccgtgcgc tgccactcgt tgacgccgaa cttcctgcag atgcagctgc agaagtgcga 120

<210> 36

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

acctgaacgt gcgctgcgag tccgaggtct tccacgcctg catcaactgg gtcaagtacg 60

actgcgaaca gcgacggttc tacgtccagg cgctgctgcg ggccgtgcgc tgccactcgt 120

<210> 37

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gagttcttca acctgtccca ctgccaactg gtgaccctca tcagccggga cgacctgaac 60

gtgcgctgcg agtccgaggt cttccacgcc tgcatcaact gggtcaagta cgactgcgaa 120

<210> 38

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gccctctgca ggtggccaag caagaggagt tcttcaacct gtcccactgc caactggtga 60

ccctcatcag ccgggacgac ctgaacgtgc gctgcgagtc cgaggtcttc cacgcctgca 120

<210> 39

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gggtgactgg agagtcagcc cgtcccactg tcgccctctg caggtggcca agcaagagga 60

gttcttcaac ctgtcccact gccaactggt gaccctcatc agccgggacg acctgaacgt 120

<210> 40

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

aagctgagac tgtcagcggc agtgataagt tacttgtccc ggtcctgctt ggtgaggtgt 60

gggggtgact ggagagtcag cccgtcccac tgtcgccctc tgcaggtggc caagcaagag 120

<210> 41

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cctattattt gaatccccat ttagcagata aggaagctga gactgtcagc ggcagtgata 60

agttacttgt cccggtcctg cttggtgagg tgtgggggtg actggagagt cagcccgtcc 120

<210> 42

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ttagtcatca caatgtacgc ggttcctatt atttgaatcc ccatttagca gataaggaag 60

ctgagactgt cagcggcagt gataagttac ttgtcccggt cctgcttggt gaggtgtggg 120

<210> 43

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

cgctgagcag attggctgtg tggagttgca ccagcgtgcc cgggagtaca tctacatgca 60

ttttggggag gtgagcgggg aagtggggct gggggcagtg tcaggagaag gaccagggat 120

<210> 44

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

catcgccaac ttcgctgagc agattggctg tgtggagttg caccagcgtg cccgggagta 60

catctacatg cattttgggg aggtgagcgg ggaagtgggg ctgggggcag tgtcaggaga 120

<210> 45

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cctggtgcag cagctggacc ccagcaatgc catcggcatc gccaacttcg ctgagcagat 60

tggctgtgtg gagttgcacc agcgtgcccg ggagtacatc tacatgcatt ttggggaggt 120

<210> 46

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gtgtgtcctc cacgtcatga acggtgctgt catgtaccag atcgacagcg ttgtccgtgc 60

ctgcagtgac ttcctggtgc agcagctgga ccccagcaat gccatcggca tcgccaactt 120

<210> 47

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tgaattcgcc tacacggcct ccatctccat gggcgagaag tgtgtcctcc acgtcatgaa 60

cggtgctgtc atgtaccaga tcgacagcgt tgtccgtgcc tgcagtgact tcctggtgca 120

<210> 48

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

agggtatcca ccccaaggtc atggagcgcc tcattgaatt cgcctacacg gcctccatct 60

ccatgggcga gaagtgtgtc ctccacgtca tgaacggtgc tgtcatgtac cagatcgaca 120

<210> 49

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gttcaccaac gggctgcggg agcagggcat ggaggtggtg tccattgagg gtatccaccc 60

caaggtcatg gagcgcctca ttgaattcgc ctacacggcc tccatctcca tgggcgagaa 120

<210> 50

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cagccctgtc ttcaaggcca tgttcaccaa cgggctgcgg gagcagggca tggaggtggt 60

gtccattgag ggtatccacc ccaaggtcat ggagcgcctc attgaattcg cctacacggc 120

<210> 51

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

atgcaccggc cgcccagttc atggcccaca aggtggtgct ggcctcatcc agccctgtct 60

tcaaggccat gttcaccaac gggctgcggg agcagggcat ggaggtggtg tccattgagg 120

<210> 52

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gcggctcagc cagcagctgt gtgacgtcac actgcaggtc aagtaccagg atgcaccggc 60

cgcccagttc atggcccaca aggtggtgct ggcctcatcc agccctgtct tcaaggccat 120

<210> 53

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

caagcaggcc tttggcatca tgaacgagct gcggctcagc cagcagctgt gtgacgtcac 60

actgcaggtc aagtaccagg atgcaccggc cgcccagttc atggcccaca aggtggtgct 120

<210> 54

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tggcaaccgc accttcagct acaccctgga ggatcatacc aagcaggcct ttggcatcat 60

gaacgagctg cggctcagcc agcagctgtg tgacgtcaca ctgcaggtca agtaccagga 120

<210> 55

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ggtgatgtac gcctccactg agtgcaaggc ggaggtgacg ccctcccagc atggcaaccg 60

caccttcagc tacaccctgg aggatcatac caagcaggcc tttggcatca tgaacgagct 120

<210> 56

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

tgagggggca ggggacgcgg tgatgtacgc ctccactgag tgcaaggcgg aggtgacgcc 60

ctcccagcat ggcaaccgca ccttcagcta caccctggag gatcatacca agcaggcctt 120

<210> 57

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tcacagtgcc ctgagggggc aggggacgcg gtgatgtacg cctccactga gtgcaaggcg 60

gaggtgacgc cctcccagca tggcaaccgc accttcagct acaccctgga ggatcatacc 120

<210> 58

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ggtggtggtg ttgcttatct tctggaaccc catgcagcca gatcccaggc ctagcggggc 60

tggggcctgc tgccgattcc tgcccctgca gtcacagtgc cctgaggggg caggggacgc 120

<210> 59

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cctgtgctct ctcccctcca ggtccctgag tgccagaggt ggtggtgttg cttatcttct 60

ggaaccccat gcagccagat cccaggccta gcggggctgg ggcctgctgc cgattcctgc 120

<210> 60

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

gcccagtccc aacccctgcc ctctgccctg tgctctctcc cctccaggtc cctgagtgcc 60

agaggtggtg gtgttgctta tcttctggaa ccccatgcag ccagatccca ggcctagcgg 120

Claims

1.一种非治疗与诊断目的的KEAP1基因的突变以及拷贝数检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，从KEAP1基因序列中选出至少两个待检测区域，将基因组合中的其它基因的全部或部分区域作为其它区域，将所述的待检测区域与其它区域组成panel，并对待测样本和正常样本采用所述的panel进行NGS测序；所述的NGS测序中还包括如下步骤：

1）获得受试者的DNA样本库；所述步骤1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1）包括：提取全基因组DNA，然后将其片段化；DNA片段的长度为150～600bp；

2）获得所述的检测KEAP1基因的DNA探针库；所述步骤2）中的DNA探针库包含核苷酸序列如SEQ ID 1～60所示的探针；

3）使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；和

4）分离步骤3）的杂交产物，然后释放经杂交富集的KEAP1基因的DNA片段；

S2，根据步骤S1的结果，计算出每份正常样本和待测样本上的KEAP1基因的拷贝数；

S3，将正常样本中KEAP1基因的拷贝数进行T分布拟合，将分布曲线的平均值作为KEAP1基因的平均拷贝数基线；

S4，将待测样本中所述的KEAP1基因的拷贝数与平均拷贝数基线进行比较，判定是否存在拷贝数变异；

其中，待测样本和正常样本的KEAP1基因的拷贝数是指每个待检测区域的拷贝数的算术平均值；

待检测区域的拷贝数的计算方法是：根据样本与对照样本的NGS测序结果，比对至参考基因组序列，获得唯一比对至所述的检测区域的读段，并计算出每个样本中每个检测区域上的测序深度；对同一份样本中的每个检测区域的测序深度进行T分布拟合，将分布曲线的平均值作为该样本上的平均测序深度；根据平均测序深度计算出每份样本上的待检测区域的拷贝数；

panel中检测区域的数量为3～50000个；

拷贝数的计算是公式是：拷贝数=（样本的待检测区域的测序深度/样本的平均测序深度）/（对照样本的待检测区域的测序深度/对照样本的平均测序深度）×倍体数；

所述的基因组合中的其它基因是指：ABL1、AKT1、AKT2、APEX1、AR、ATM、ATR、BAD、BAX、BCL2、BCL2L1、BCL2L11、BCL3、BRCA1、BRCA2、CBLB、CUL3、CXCL8、CYLD、CYP2D6、EGFR、ERBB2、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、FANCD2、FANCF、FOXO3、GNAS、HDAC1、HMOX1、HSPB1、IGF1R、IL13、IL1A、IRF1、ITGB6、JUN、KRAS、LIG3、LIG4、LIN28B、MALT1、MAPK1、MAPK3、MCL1、MEN1、MIF、MLH1、MMP1、MRE11、MSH2、MSH6、MTHFR、MTOR、MTRR、MUC5B、NBN、NEIL1、NFE2L2、NFKB1、NFKBIA、NOS2、NOS3、NTHL1、PAK2、PARP1、PARP2、PDK1、PIK3CA、PMAIP1、PMS2、PNKP、PRKCB、PRKDC、PTEN、RAD50、RAD51、RAD51C、RAD54L、RAD9A、RCC1、RELA、SERPINE1、STAT1、SUMO1、TBK1、TFG、TGFB1、TNFAIP3、TNFRSF19、TNFRSF1B、TP53、TP53、TSC1、TSC2、UNG、VEGFA、XRCC1、XRCC2、XRCC3、XRCC4和XRCC5。