CN111748611B - Pcr引物及其在dna片段连接中的应用 - Google Patents

Pcr引物及其在dna片段连接中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111748611B
CN111748611B CN201910243111.8A CN201910243111A CN111748611B CN 111748611 B CN111748611 B CN 111748611B CN 201910243111 A CN201910243111 A CN 201910243111A CN 111748611 B CN111748611 B CN 111748611B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
sequence segment
sequencing
pcr
pcr primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910243111.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111748611A (zh
Inventor
陈智超
唐冲
阮凤英
郭梅
石卓兴
杨林峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Technology Solutions Co Ltd
Original Assignee
BGI Technology Solutions Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Technology Solutions Co Ltd filed Critical BGI Technology Solutions Co Ltd
Priority to CN201910243111.8A priority Critical patent/CN111748611B/zh
Publication of CN111748611A publication Critical patent/CN111748611A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111748611B publication Critical patent/CN111748611B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了一种PCR引物及其在DNA片段连接中的应用。所述PCR引物包含回文序列段和任意PCR引物序列段，所述回文序列段的3’端与所述任意PCR引物序列段的5’端相连，所述回文序列段的3’端的核苷酸为U，所述任意PCR引物序列段与预扩增DNA模板的3’端互补配对。根据本发明实施例的引物可用于测序文库的构建，在构建过程中，利用根据本发明实施例的引物作为基于DNA的PCR扩增引物，所获得的扩增产物DNA双链的两端具有回文序列结构，且回文序列结构的3’端具有核苷酸U，为后续不同扩增产物双链DNA的相互连接奠定了基础。

Description

PCR引物及其在DNA片段连接中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及PCR引物及其在DNA片段连接中的应用，更具体地，本发明涉及PCR引物、PCR扩增方法、构建测序文库的方法以及全长转录组的测序方法。
背景技术
基因组和转录组测序是生命科学领域的基础性工作。由于绝大部分非模式生物缺乏基因组数据，全长转录组测序就变得尤为重要，全长转录本可以大大促进这些物种的基因功能、基因表达调控和进化关系等多方面的基础与应用研究。当前，绝大多数的转录组数据都是基于第二代高通量测序技术获得的。然而，第二代测序技术测序序列短，短序列拼接无法提供大量的长转录本并且丢失了可变剪接等重要信息，因而转录组的从头测序开始采用PacBio第三代测序技术。在2013年PacBio RS II推出时，其通亮较低，测序成本一直让科研人员望而止步。到2015年10月，PacBio推出Sequel平台，大幅提升了全长转录组的测序通量，在通量上是PacBio RSⅡ的5-10倍。鉴于三代测序技术在科研甚至临床领域的发展潜力，很多公司相继引入Sequel平台，提供Pacbio三代测序的全长转录组测序服务。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
通常转录本的平均长度低于2k，常规建库所得到的转录组文库平均长度也同样低于2k，而Pacbio测序平台的酶读长可达到20k以上，即转录组文库平均的测序轮数达到10轮以上。根据统计，测序轮数达到3轮，测序的QV值即可达到0.9，已足够对转录组进行准确的分析。所以多出来的7轮测序可认为是数据冗余，即现有的全长转录组建库方式无法充分利用Pacbio平台酶读长的优势。而近期Pacbio公司推出了试剂和芯片的升级，升级后的酶读长可达到80k以上，若仍用现有的建库方法，转录组测序将产生更大的数据冗余。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种PCR引物。根据本发明的实施例，所述PCR引物包含回文序列段和任意PCR引物序列段，所述回文序列段的3’端与所述任意PCR引物序列段的5’端相连，所述回文序列段的3’端的核苷酸为U，所述任意PCR引物序列段与预扩增DNA模板的3’端互补配对。根据本发明实施例的引物可用于测序文库的构建，在构建过程中，利用根据本发明实施例的引物作为基于DNA的PCR扩增引物，所获得的扩增产物DNA双链的两端具有回文序列结构，且回文序列结构的3’端具有核苷酸U，为后续不同扩增产物双链DNA的相互连接奠定了基础。
根据本发明的实施例，上述引物还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述回文序列段的长度不受特别限制，只要能够满足后续不同扩增产物双链DNA相互之间的粘性末端连接即可。根据本发明的具体实施例，所述回文序列段的长度为2bp，4bp，6bp，8bp，10bp或12bp。
根据本发明的实施例，所述回文序列段具有SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列。
ACTAGU(SEQ ID NO:1)。
ACTCAUGAGU(SEQ ID NO:2)。
发明人发现，具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的回文序列段具有两个U，在用USER酶切时，会切两次，从而使得酶切过程中的两次解链同时进行，在形成粘性末端短序列时更容易解链，酶切过程进行更加顺利。
根据本发明的实施例，所述任意PCR引物序列段的长度为15～35bp，优选地，所述随机序列段的长度为25bp。根据本发明实施例的随机序列段的长度采用了常规引物设计所需要的长度，所述引物的常规序列段的长度在上述范围内，可实现对目的基因片段的特异性结合和有效扩增。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种PCR扩增方法。根据本发明的实施例，将预扩增DNA模板在PCR引物、PCR酶的作用下进行扩增，所述PCR引物如前面所限定的。利用根据本发明实施例的扩增方法所获得的DNA双链两端具有回文序列结构，且回文序列结构的3’端具有核苷酸U，该回文序列结构可在内切酶的作用下，在核苷酸U的3’侧进行切割，产生粘性末端，为后续扩增产物之间的两两连接奠定了基础。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述预扩增DNA模板是cDNA。根据本发明实施例的PCR扩增方法可用于转录本文库的构建。
根据本年发明的实施例，所述cDNA是通过如下方式获得的：(1)将3’端带有polyA尾巴的RNA在polyT引物和MMLV RT反转录酶存在的条件下进行反转录，当反转录进行至RNA的5’端时，在MMLV RT反转录酶的末端转移酶活性的条件下，在反转录产物cDNA单链的3’端加上数个C；(2)将3’端具有数个G的模板转换引物与步骤(1)所获得的反转录产物cDNA单链通过CG碱基互补配对结合，在MMLV RT反转录酶存在的条件下，以所述反转录产物cDNA单链为模板，进行所述模板转换引物的延伸，以便获得反转录产物cDNA双链。根据本发明实施例的上述获得cDNA的方式，利用模板转换原理构建出了双端为互补序列的转录本cDNA，即双端不存在单链区的转录本cDNA，为后续以该转录本cDNA为模板，以前面所述的PCR引物为引物扩增cDNA奠定了基础，也为后续扩增产物的双端酶切后产生一致的回文序列粘性末端奠定了基础。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用前面所述的方法扩增DNA模板；(2)利用USER酶对步骤(1)所获得的扩增产物进行消化处理，以便产生粘性末端；(3)将步骤(2)所获得的消化产物进行连接处理；(4)将步骤(3)所获得的连接处理产物进行加接头处理，以便获得测序文库。根据本发明实施例的建库方法所获得的测序文库，平均长度得到有效延长，所获得的测序文库可充分利用Pacbio平台酶读长的优势，减少测序冗余数据，得到更多的转录本数据，提高测序数据的有效利用率。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，连接处理后，进一步包括对连接处理产物进行末端修复和3’端加A处理，将5’末端带有游离T的接头与3’端加A处理后的末端修复产物进行T-A连接，以便获得测序文库。发明人发现，采用T-A连接，可有效避免接头的自连现象，提高连接处理产物与接头的有效连接率。
根据本发明的实施例，所述接头为发卡结构。
根据本发明的具体实施例，所述5’末端带有游离T的接头具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
CTGCTCGTCAATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATTGACGAGCAGT(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的实施例，步骤(1)之后，步骤(2)之前，进一步包括将所述扩增产物进行第一纯化处理。进而进一步提高USER酶消化效率。
根据本发明的实施例，步骤(3)之后，步骤(4)之前，进一步包括将所述连接处理产物进行第二纯化处理。进而进一步提高接头的连接效率。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种全长转录组的测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述的方法构建测序文库；以及利用Pacbio测序平台对所述测序文库进行测序，以便获得所述全长转录组的序列信息。根据本发明实施例的全长转录组的测序方法可充分利用Pacbio平台酶读长的优势，减少测序冗余数据，得到更多的转录本数据，提高测序数据的有效利用率。
附图说明
图1是根据本发明实施例的反转录流程示意图；
图2是根据本发明实施例的PCR扩增以及获得测序文库的方法流程示意图；以及
图3是根据本发明实施例的PB dT adaptor(多一个dTTP的接头)示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明针对现有的全长转录组建库方式无法充分利用Pacbio平台酶读长优势的问题，设计了全长转录组首尾相连建库的方案，将转录组的PCR产物通过粘性末端进行首尾相连，从而增加文库的平均长度，这样在测序后可得到更多的转录本数据。
根据本发明实施例的反转录步骤与常规建库一致，采用模版转换原理构建出双端带有互补序列的转录本cDNA，本发明在随后的PCR环节中，在PCR primer上引入包含一个U碱基的一段回文序列，使得cDNA的PCR产物5’端产生这段回文序列，经过USER酶中的Uracil-DNA Glycosylase(UDG)和Endonuclease VIII可将U碱基消化去除，从而产生一段回文黏性末端，将带有回文黏性末端的产物用DNA连接酶进行连接。由于回文序列的存在，不同产物之间会进行连接，再通过末端修复及加A和加加头的环节，可得到标准的哑铃状文库。根据本发明实施例，将转录本的PCR产物进行上述连接后，可得到较长的文库，使用连接后的文库进行上机测序，可以在保证数据质量的同时，大幅提高数据利用率。
为了便于理解，申请人将根据本发明实施例的转录组文库的构建流程表示于图1和图2中，其中，图1是反转录流程示意图，图2是PCR扩增以及获得测序文库的方法流程示意图。
下面将进一步详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例使用首尾连接建库技术和常规全长转录组建库方法分别对UHRR标准品(Universal Human Reference RNA)进行建库测序。
常规全长转录组建库流程参见https://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-Iso-Seq TM-Template-Preparation-for-Sequel-Systems.pdf对应的文件名为“Procedure&Checklist-Iso-SeqTM Template Preparation for
Figure BDA0002010280990000041
Systems”。使用的试剂盒及试剂主要包括SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech,634925)、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Clontech,R050A)、
Figure BDA0002010280990000042
dsDNA BR AssayKit or HS Assay Kit(Invitrogen)、DNA 12000Kit(Agilent)、SMRTbell Template PrepKit(Pacific Biosciences)、
Figure BDA0002010280990000043
PB Beads(Pacific Biosciences)。
本发明的首尾连接法建库中，反转录步骤使用与常规全长转录组建库流程中一样的反转录试剂盒SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech,634925)。另外，还使用到
Figure BDA0002010280990000052
dsDNA BR Assay Kit or HS Assay Kit(Invitrogen)、DNA 12000Kit(Agilent)、
Figure BDA0002010280990000053
PB Beads(Pacific Biosciences)等试剂。
下面详细描述本发明实施例的首尾连接法建库方法。
1、RNA样本RT-PCR
1.1cDNA合成(反转录RT)
1)根据浓度，取1μg UHRR标准品至一个标记好的0.2mL PCR管里，补NF水至体积3.5μL。
2)加入1μL 3’UMI CDS Primer(12μM)，体系共4.5μL，手弹混匀，短暂离心。
3)将这个0.2mL PCR管置于PCR仪上，72℃反应3min，然后以0.1℃/S的速度缓慢降至42℃，反应2min。反应体系及反应条件见表1。
表1：
试剂名称 单管用量(μL)
UHRR(1μg/μl) 1
3’UMI CDS Primer(12μM) 1
无核酸酶水(NF water) 2.5
总体积 4.5
其中：3’UMI CDS Primer的序列为5’–AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CNNNNNNNN TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTVN-3’
其中：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC为PCR引物结合序列；
NNNNNNNN为随机碱基，作用有两个方面：1、给转录本加上独立分子标签，可辅助基因和转录本定量；2、由于下一步反转录产生的cDNA两端的引物结合序列为互补序列，PCR产物两端序列一致，这8个随机碱基可帮助区分测序结果是5’端还是3’端；
4)按表2所示配制MIX，手弹混匀，短暂离心。
表2：
Figure BDA0002010280990000051
Figure BDA0002010280990000061
5)将MIX管置于PCR仪上，与上一步反应产物一起反应42℃1min，使两管液体温度都达到42℃。
6)将两管混合，共10μL，混匀并短暂离心，置于PCR仪上反应。反应条件见表3。
表3：
反应条件 反应时间
42℃ 90min
70℃ 10min
4℃ hold
1.2二链合成
1)在上一步的产物(10μL)中加入40μL EB洗脱缓冲液，配制PCR体系，与产物混合，手弹混匀，短暂离心。
2)将表4所示体系分为5管，每管50μL，置于PCR仪上反应。反应体系及反应条件见表4和表5。
表4：
试剂名称 用量(μL)
稀释后的cDNA 20
Tail-head PCR primer(12μM) 6.4
无核酸酶水(NF water) 23.6
KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2×) 50
总体积 100
表5：
Figure BDA0002010280990000062
其中，Tail-head PCR primer序列为5’-ACTAGU AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’。
其中：ACTAGU为回文序列；
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC为与cDNA 3’端互补的序列。
1.3样品纯化
1)取1倍体积(100μl)的AMPure PB磁珠加入到装有到PCR产物的1.5mL离心管中，混匀并瞬离。
2)将离心管放于ThemoMixer上，20℃，2000rpm，10min。
3)10min后取出，短离2s。
4)离心管转移放置于磁力架上，静止至澄清。
5)吸取上清液。加入300μL 75％乙醇，弃上清。
6)重复上一步骤一次，将去上清后的离心管短离2s，放于磁力架上静止至澄清，去掉残留的乙醇。
7)开盖晾干1min后，用21μL洗脱缓冲液回溶，放于ThemoMixer上，20℃，2000rpm，10min。
8)10min结束后，取出离心管，短离2s，放置于磁力架上，静止至澄清，吸取上清液，回收于另一个标记好的1.5mL离心管中。
9)取1μL纯化好的样品稀释5倍，取1μL稀释液进行Qubit检测，并将剩余的稀释样品进行2100质检。
2首尾相连：
2.1制造回文粘性末端
取2ug纯化后的PCR产物，配置体系如表6所示。
表6：
试剂 体积/μl
纯化后的PCR产物 2μg所对应体积
10×T4 DNA ligase buffer 2
USER Enzyme(1unit) 1
无核酸酶水(NF water) 补足19ul
混匀后，37℃反应20min。
2.2进行首尾连接
加入1μl T4 DNA连接酶，混匀后16℃反应1h。
2.3磁珠纯化
1)加入80μl无核酸酶水到连接产物中，转移至1.5mL离心管中，加入0.5倍体积(50μl)的AMPure PB磁珠，混匀并瞬离。
2)将离心管放于ThemoMixer上，20℃，2000rpm，10min。
3)10min后取出，短离2s。
4)离心管转移放置于磁力架上，静止至澄清。
5)吸取上清液。加入200μL 75％乙醇，弃上清。
6)重复上一步骤一次，将去上清后的离心管短离2s，放于磁力架上静止至澄清，去掉残留的乙醇。
7)开盖晾干1min后，用27μL洗脱缓冲液回溶，放于ThemoMixer上，20℃，2000rpm，10min。
8)10min结束后，取出离心管，短离2s，放置于磁力架上，静止至澄清，吸取上清液，回收于另一个标记好的1.5mL离心管中。
9)取1μL纯化好的样品稀释5倍，取1μL稀释液进行Qubit检测，并将剩余的稀释样品进行2100质检。
3末端修复及加接头(使用
Figure BDA0002010280990000081
UltraTM II DNA Library Prep Kit forIllumina试剂盒进行)
表7：末端修复体系
试剂 体积/μL
纯化后的连接产物 25
NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer 3.5
NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix 1.5
混匀后20℃反应30min，65℃反应30min，4℃保持。
表8：加接头体系
试剂 体积/μL
NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 15
NEBNext Ligation Enhancer 0.5
接头(PB dT adaptor) 2
混匀后20℃反应30min
其中PB dT adaptor序列为：
5’-CTG CTC GTC AAT CTC TCT CTT TTC CTC CTC CTC CGT TGT TGT TGT TGAGAG AGA TTG ACG AGC AG T-3’
其中下划线的CTGCTCGTCAATCTCTCTC与GAGAGAGATTGACGAGCAG为反向互补序列，可形成发卡结构，如图3所示。
其中CCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTT为测序引物结合区。
其中3’端的T可进行T/A连接。
PB dT adaptor的结构如图3所示。
4酶消化反应及磁珠纯化
1)向上步产物中加入表9所示混合液。
表9：
Figure BDA0002010280990000091
混匀后，37℃反应30min。
2)反应完成后，取新的1.5mL离心管，做好标记，将反应后体系全部转移到新的对应的离心管中。
3)取0.5倍体积(50μL)的AMPure PB磁珠加入到装有到酶消化反应产物的1.5mL离心管中，进行纯化，最终回溶于50μL洗脱缓冲液中。
4)取1μL纯化好的样品稀释5倍，取1μL稀释的样品进行Qubit检测，并将剩余的稀释样品进行2100质检。
5上机测序
常规法与首尾连接法在建库后均采用Pacbio公司提供的Magbeads loading方案，按Pacific Biosciences Procedure&Checklist-Preparing MagBeads for Sequencing说明书要求进行制备上机并测序。
测试结果
表10：Pacbio Sequel下机数据概况
Figure BDA0002010280990000092
其中，CCS数量表示环形一致性序列，一个CCS由一个测序孔测出。
其中，酶读长表示所有测序孔中测序酶的平均读长。
其中，subreads长度表示测序结果插入片段的平均长度。
表11：数据分析结果统计
Figure BDA0002010280990000101
其中，Reads数表示CCS经过数据分析得到的有效转录本的数量。
其中，FL数(Full length)表示全长转录本数量，NFL数(Not full length)表示非全长转录本数量。
其中，FL占比表示FL数占CCS数的比例，NFL占比表示NFL数占CCS数的比例。
由于常规建库得到的数据中，每个CCS都只包含一个转录本信息，所以经数据过滤后转录本Reads数低于CCS数；而本发明的连接法建库得到的数据中，每个CCS可能包含多个转录本信息，所以得到的转录本Reads比CCS数多(表10)。同样的，连接法的全长转录本和非全长转录本的比例均比常规法高。本发明可大幅提升检测到的转录本数量，提高测序数据的有效利用率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因科技服务有限公司
<120> PCR引物及其在DNA片段连接中的应用
<130> PIDC3190744
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 回文序列段的核苷酸序列
<400> 1
actagu 6
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 回文序列段的核苷酸序列
<400> 2
actcaugagu 10
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 5'末端带有游离T的接头的核苷酸序列
<400> 3
ctgctcgtca atctctctct tttcctcctc ctccgttgtt gttgttgaga gagattgacg 60
agcagt 66

Claims (13)

1.一种PCR引物，其特征在于，所述PCR引物包含回文序列段和任意PCR引物序列段，所述回文序列段的3’端与所述任意PCR引物序列段的5’端相连，所述回文序列段的3’端的核苷酸为U，所述任意PCR引物序列段与预扩增DNA模板的3’端互补配对。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述回文序列段的长度为2bp，4bp，6bp，8bp，10bp或12bp。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述回文序列段具有SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述任意PCR引物序列段的长度为15～35bp。
5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于，所述任意PCR引物序列段的长度为25bp。
6.一种PCR扩增方法，其特征在于，将预扩增DNA模板在PCR引物、PCR酶的作用下进行扩增，所述PCR引物如权利要求1～5任一项所限定的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预扩增DNA模板是cDNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述cDNA是通过如下方式获得的：
(1)将3’端带有polyA尾巴的RNA在polyT引物和MMLV RT反转录酶存在的条件下进行反转录，当反转录进行至RNA的5’端时，在MMLVRT反转录酶的末端转移酶活性的条件下，在反转录产物cDNA单链的3’端加上数个C；
(2)将3’端具有数个G的模板转换引物与步骤(1)所获得的反转录产物cDNA单链通过CG碱基互补配对结合，在MMLV RT反转录酶存在的条件下，以所述反转录产物cDNA单链为模板，进行所述模板转换引物的延伸，以便获得反转录产物cDNA双链。
9.一种构建测序文库的方法，其特征在于，包括：
(1)利用权利要求6～8任一项所述的方法扩增DNA模板；
(2)利用USER酶对步骤(1)所获得的扩增产物进行消化处理，以便产生粘性末端；
(3)将步骤(2)所获得的消化产物进行连接处理；
(4)将步骤(3)所获得的连接处理产物进行加接头处理，以便获得测序文库。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，连接处理后，进一步包括对连接处理产物进行末端修复和3’端加A处理，将5’末端带有游离T的接头与3’端加A处理后的末端修复产物进行T-A连接，以便获得测序文库。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)之后，步骤(2)之前，进一步包括将所述扩增产物进行第一纯化处理。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)之后，步骤(4)之前，进一步包括将所述连接处理产物进行第二纯化处理。
13.一种全长转录组的测序方法，其特征在于，包括：
利用权利要求9～12任一项所述的方法构建测序文库；以及
利用Pacbio测序平台对所述测序文库进行测序，以便获得所述全长转录组的序列信息。
CN201910243111.8A 2019-03-28 2019-03-28 Pcr引物及其在dna片段连接中的应用 Active CN111748611B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910243111.8A CN111748611B (zh) 2019-03-28 2019-03-28 Pcr引物及其在dna片段连接中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910243111.8A CN111748611B (zh) 2019-03-28 2019-03-28 Pcr引物及其在dna片段连接中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111748611A CN111748611A (zh) 2020-10-09
CN111748611B true CN111748611B (zh) 2021-02-19

Family

ID=72671259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910243111.8A Active CN111748611B (zh) 2019-03-28 2019-03-28 Pcr引物及其在dna片段连接中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111748611B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363612A (zh) * 2021-01-29 2024-01-09 深圳华大基因科技服务有限公司 一种dna分子的扩增引物设计和连接方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732629B (zh) * 2012-08-01 2015-05-13 复旦大学 利用高通量测序同时测定基因表达量和多聚腺苷酸加尾的方法
CN104480534B (zh) * 2014-12-29 2017-02-22 深圳华因康基因科技有限公司 一种建库方法
CN104531874B (zh) * 2014-12-29 2017-09-05 深圳华因康基因科技有限公司 Egfr基因突变检测方法及试剂盒
CN105986015B (zh) * 2015-02-05 2020-10-23 大连晶泰生物技术有限公司 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒
JP2018530536A (ja) * 2015-09-11 2018-10-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ヌクレアーゼＤＳＢの完全照合およびシーケンシング（ＦＩＮＤ−ｓｅｑ）
CN107641838A (zh) * 2016-07-22 2018-01-30 深圳华大基因股份有限公司 用于第三代单分子测序的pcr产物测序文库构建方法
CN108624666B (zh) * 2017-03-16 2021-12-24 深圳华大基因股份有限公司 用于构建测序文库的接头核酸分子

Also Published As

Publication number Publication date
CN111748611A (zh) 2020-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8986958B2 (en) Methods for generating target specific probes for solution based capture
JP6995751B2 (ja) ガイド核酸を作製および使用するための方法および組成物
AU2015364286B2 (en) Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using CRISPR/Cas system proteins
ES2900102T3 (es) Composiciones para la secuenciación de ácidos nucleicos en mezclas
US9255291B2 (en) Oligonucleotide ligation methods for improving data quality and throughput using massively parallel sequencing
CN107922967A (zh) 用于下一代基因组步移的方法以及相关的组合物和试剂盒
CN111094565B (zh) 指导核酸的产生和用途
EP3555305B1 (en) Method for increasing throughput of single molecule sequencing by concatenating short dna fragments
EP2334802A1 (en) Methods of generating gene specific libraries
CN108715902A (zh) 梅花垂枝性状snp分子标记及其应用
CN109593757B (zh) 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法
CN112105744A (zh) 方法
US20210198660A1 (en) Compositions and methods for making guide nucleic acids
CN115003867A (zh) 一种待测样本rna的测序文库的构建方法
CN102839168A (zh) 核酸探针及其制备方法和应用
CN111748611B (zh) Pcr引物及其在dna片段连接中的应用
JP7206424B2 (ja) ｍＲＮＡを増幅する方法及び完全長ｍＲＮＡライブラリを調製する方法
CN107287296B (zh) 凡纳滨对虾功能基因est-ssr标记及其特异性引物和检测方法
CN113462748A (zh) Dna测序文库的制备方法及试剂盒
US20180100180A1 (en) Methods of single dna/rna molecule counting
WO2018081666A1 (en) Methods of single dna/rna molecule counting
CN110468179B (zh) 选择性扩增核酸序列的方法
CN112063690A (zh) 单分子探针多重靶向捕获文库的构建方法及应用
WO2018126584A1 (zh) 一种环状转座子复合物及其应用
CN114250279B (zh) 一种单倍型的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40030578

Country of ref document: HK