JP7413283B2 - 変異を導入するための方法 - Google Patents
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Description
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、および
b.低バイアスDNAポリメラーゼを使用して少なくとも1つの標的核酸分子を増幅すること
を含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法が提供される。
a.少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる低確率変異の平均数を決定すること、および
b.少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる低確率変異の平均数より多い低確率差により各サンプルタグがサンプルタグ群の実質的に全てのサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
を含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法における使用に適したサンプルタグ群を設計するための方法が提供される。
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、および
b.DNAポリメラーゼを使用して少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することにより、この少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入して変異した少なくとも1つの標的核酸分子を用意すること、
ここでステップb.は不均一濃度のdNTPを使用して実行するものとする、
を含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法が提供される。
a.標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、
b.標的核酸分子の3’末端に第1アダプターを導入し、かつ標的核酸分子の5’末端に第2アダプターを導入すること、および
c.第1アダプターの一部に相補的であるプライマーを使用して標的核酸分子を増幅すること、
ここで該第1アダプターと該第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、
を含む、1 kbp長より大きい標的核酸分子を選択的に増幅するための方法が提供される。
他に定義する場合を除き、本明細書中で使用する技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の熟練者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
ある態様では、本発明は、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法における、低バイアスDNAポリメラーゼの使用を提供する。
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、および
b.低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅すること
を含んでいてもよい。
少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法は、少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意するステップを含んでいてもよい。
本発明の方法は、低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することを含んでいてもよい。
i) 該少なくとも1つの標的核酸分子に相補的である少なくとも1つの核酸分子を提供するために、該少なくとも1つの標的核酸分子を複製するラウンド、および
ii) 該少なくとも1つの標的核酸分子の複製物を提供するために、該少なくとも1つの標的核酸分子を複製するラウンド
を含む。
a)融解、
b)アニーリング、
c)伸長(extension)、および
d)延長(elongation)
を必要とするプロセスである。
本発明の方法は、低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップを含んでいてもよい。
低変異バイアスを呈する低バイアスDNAポリメラーゼは、アデニンおよびチミン、アデニンおよびグアニン、アデニンおよびシトシン、チミンおよびグアニン、チミンおよびシトシン、またはグアニンおよびシトシンを同様の割合で変異させることができるDNAポリメラーゼである。ある実施形態では、低バイアスDNAポリメラーゼはアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンを同様の割合で変異させることができる。
低バイアスDNAポリメラーゼが1ラウンドの複製当たりに該少なくとも1つの標的核酸分子中のヌクレオチドのある一定の割合を変異させうるかどうかは、一定数の複製ラウンドの間、低バイアスDNAポリメラーゼの存在下で既知配列の核酸分子を増幅することにより判定できる。得られた増幅核酸分子を次に配列決定し、1ラウンドの複製当たりに変異したヌクレオチドの割合を算出することができる。例えば、既知配列の核酸分子は、低バイアスDNAポリメラーゼの存在下で10ラウンドのPCRを利用して増幅することができる。得られた核酸分子は次に配列決定することができる。得られた核酸分子が元の既知配列中の対応ヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを10%含む場合、その際使用者は、低バイアスDNAポリメラーゼが1ラウンドの複製当たりに平均して該少なくとも1つの標的核酸分子中のヌクレオチドの1%を変異させることができると理解するであろう。同様に、低バイアスDNAポリメラーゼが所与の方法で該少なくとも1つの標的核酸分子中のヌクレオチドのある一定の割合を変異させるかどうかを調べるために、使用者は、既知配列の核酸分子に対して該方法を実施することができるであろうし、また該方法が終了し次第、変異したヌクレオチドの割合を決定するために配列決定法を利用することができるだろう。
低バイアスDNAポリメラーゼはヌクレオチドを他のヌクレオチドと直接置き換えられない場合がある(少なくとも高頻度ではない)が、該低バイアスDNAポリメラーゼはそれでもヌクレオチド類似体を使用すれば核酸分子を変異させうる場合がある。低バイアスDNAポリメラーゼは、ヌクレオチドを他の天然ヌクレオチド(すなわちシトシン、グアニン、アデニンもしくはチミン)またはヌクレオチド類似体と置き換えることができる場合がある。
低バイアスDNAポリメラーゼは低鋳型増幅バイアスを有していてもよい。低バイアスDNAポリメラーゼは、該低バイアスDNAポリメラーゼが異なる標的核酸分子を1サイクル当たり同様の成功度合で増幅できるならば、低鋳型増幅バイアスを有する。高バイアスDNAポリメラーゼでは、高G:C含量であるかまたは二次構造の程度が大きい鋳型核酸分子を増幅するのに苦労する場合がある。ある実施形態では、本発明の低バイアスDNAポリメラーゼは、25 000未満、10 000未満、1~15 000、または1~10 000のヌクレオチド長である鋳型核酸分子に対して低鋳型増幅バイアスを有する。
ある実施形態では、低バイアスDNAポリメラーゼは、配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号7を含むポリペプチドの断片または変異体である。配列番号2、4、6および7のポリペプチドはサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼである。配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号7のポリメラーゼは高い忠実度を示す低バイアスDNAポリメラーゼであり、またそれらはdPTPなどのヌクレオチド類似体を組み込むことにより標的核酸分子を変異させることができる。配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号7のポリメラーゼは、それらが低変異バイアスおよび低鋳型増幅バイアスを有しているため、特に有利である。それらはまた高度にプロセッシブであって、かつ校正ドメインを含む高忠実度ポリメラーゼであり、このことは、ヌクレオチド類似体の非存在下で、それらが変異標的核酸分子を迅速かつ正確に増幅できることを意味している。
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
の少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも750個の連続したアミノ酸の断片を含んでいてもよい。
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
の少なくとも700個の連続したアミノ酸の断片を含む。
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
を含んでいてもよい。
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
を含む。
前記方法は、標的核酸分子にバーコードを導入することをさらに含んでいてもよい。本発明の目的上、バーコードは縮重した、またはランダムに生成されたヌクレオチド配列である。「バーコード」という用語は、「固有の分子識別子」(UMI)または「固有の分子タグ」(UMT)という用語と同義である。前記方法は、標的核酸分子に1、2またはそれ以上のバーコードを導入することを含んでいてもよい。好適な実施形態では、前記方法は標的核酸分子に様々なバーコードを導入することを含み、その結果、該バーコードが導入された後は、元の標的核酸分子の大部分が他の元の標的核酸分子と比較して固有のバーコードを含む。
a.標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、
b.標的核酸分子の3’末端に第1アダプターを、かつ標的核酸分子の5’末端に第2アダプターを導入すること、および
c.第1アダプターの一部に相補的であるプライマーを使用して標的核酸分子を増幅すること、
ここで第1アダプターと第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、
を含む、1 kbp長より大きい核酸分子を選択的に増幅するための方法を提供する。
(a) 該少なくとも1つの標的核酸分子または複数の標的核酸分子の3’末端に第1プライマー結合部位を含む第1アダプターを導入し、かつ該少なくとも1つの標的核酸分子または複数の標的核酸分子の5’末端に該第1プライマー結合部位に相補的である部分を含む第2アダプターを導入すること、ここで該第1アダプターと該第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、
(b)第1プライマー結合部位に相補的でありかつ第2プライマー結合部位を含む第1セットのプライマーを使用し、状況に応じて低バイアスDNAポリメラーゼを使用して、標的核酸分子を増幅すること、および
(c)第2プライマー結合部位に相補的である第2セットのプライマーを使用し、状況に応じて低バイアスDNAポリメラーゼを使用して、標的核酸分子を増幅すること
を含んでいてもよい。
本発明の一態様は、本発明の変異を導入するための方法を含む、少なくとも1つの標的核酸分子の配列を決定するための方法に関する。
a.本発明の少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
b.少なくとも1つの変異した標的核酸分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、および
c.変異した配列リードを使用して、少なくとも1つの標的核酸分子の少なくとも一部に対して配列を組み立てるステップ
を含んでもよい。
a.本発明の少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
b.該少なくとも1つの変異した標的核酸分子を断片化および/または増幅することにより、少なくとも1つの断片化および/または増幅された変異標的核酸分子を用意するステップ、
c. 該少なくとも1つの断片化および/または増幅された変異標的核酸分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、ならびに
d.変異した配列リードを使用して、該少なくとも1つの標的核酸分子の少なくとも一部に対して配列を組み立てるステップ
を含んでいてもよい。
本発明の変異を導入するための方法は、タンパク質を操作するための方法の一環として有用でありうる。例えば、タンパク質操作は、タンパク質の活性を増大もしくは低下させる変異、またはその構造を変更する変異を探索することを伴う場合がある。タンパク質操作の一環として、使用者は、タンパク質をランダムに変異させて、該変異が該タンパク質の活性または構造にどのように影響を与えるかを調べることを望む場合がある。本発明の方法は、非常にランダムな突然変異誘発をもたらし、またそのために、タンパク質を操作するための方法の一環として有利に使用できる方法である。
a.本発明の変異を導入するための方法を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
b. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子をベクターに挿入するステップ、および
c. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
を含んでいてもよい。
a.本発明の変異を導入するための方法を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
b.ヌクレオチド類似体の存在下で低バイアスDNAポリメラーゼを使用して少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することにより、ヌクレオチド類似体を含む標的核酸分子を用意するステップ、
c.ヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む標的核酸分子を増幅することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
d. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子をベクターに挿入するステップ、および
e. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
を含んでいてもよい。
ある態様では、本発明は、以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる低確率変異の平均数を決定すること、および
b.少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる低確率変異の平均数より多い低確率変異差により各サンプルタグがサンプルタグ群の実質的に全てのサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
を含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法における使用に適したサンプルタグ群を設計するための方法をさらに提供する。
a.(i)少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる高確率変異の平均数を決定すること、および
(ii)少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる高確率変異の平均数より多い高確率変異差により各サンプルタグがサンプルタグ群の実質的に全てのサンプルタグと異なっている該群について配列を決定すること
をさらに含んでいてもよい。
低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸を増幅するステップは、不均一濃度のdNTPを使用して実行してもよい。
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、および
b.DNAポリメラーゼを用いて該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することにより、該少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入して、変異した少なくとも1つの標的核酸分子を用意すること、
ここでステップb.は不均一濃度のdNTPを使用して実行するものとする、
を含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法が提供される。
(i)ヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するさらなるステップを含み、かつこのヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行するか、または
(ii)変異した少なくとも1つの標的核酸分子を用意し、かつ、この変異した少なくとも1つの標的核酸分子を低バイアスDNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを含み、かつ、この変異した少なくとも1つの標的核酸分子を低バイアスDNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行する。
DNA分子を断片化して適当なサイズ(例えば10 kb)とし、さらにタグメンテーションを利用して規定配列プライミング部位(アダプター)を各末端に結合した。
突然変異誘発を、広範な種々のDNAポリメラーゼを用いて実施した(表4)。大腸菌株MG1655から得たゲノムDNAを、実施例1の方法にて記載した通りにタグメント化して長い断片を作製し、ビーズ精製した。この後、0.5 mM dPTP存在下での6サイクルの「突然変異誘発PCR」、SPRIselectビーズ精製、およびdPTP非存在下での追加の14~16サイクルの「回復PCR」を行った。結果として生じた長い変異鋳型を次に標準的なタグメンテーション反応(実施例1を参照されたい)に供し、さらに「内部」断片を増幅してMiSeq装置で配列決定した。
本発明者らは、単一セットの反応条件下でサーモコッカス属古細菌のポリメラーゼ(Primestar GXL;Takara)を使用して、種々のレベルのG+C含量(33~66%)を示す広範なゲノムDNAサンプルに対してdPTP突然変異誘発を実施した。突然変異誘発および配列決定は、10サイクルの「回復PCR」を実施したことを除き、実施例3の方法にて記載した通りに実施した。予想通り、変異率はG+C含量の多様性にもかかわらずサンプル間でほぼ同様であった(変異率の中央値7~8%)(図2)。
鋳型増幅バイアスを、2つのポリメラーゼ、すなわちIlluminaシーケンシングプロトコルで慣用される校正ポリメラーゼであるKapa HiFi、および長い断片を増幅するその能力で知られるKODファミリーのポリメラーゼであるPrimeStar GXLについて測定した。最初の実験では、Kapa HiFiを使用することにより、約2kbpの大きさを有する限られた数の大腸菌ゲノムDNA鋳型を増幅した。これらの増幅断片の末端を次に配列決定した。同様の実験を、大腸菌から得た約7~10kbpの断片に対して、PrimeStar GXLを用いて行った。各末端配列リードの位置は、大腸菌参照ゲノムにマッピングすることにより決定した。隣接する断片末端間の距離を測定した。これらの距離を、一様分布からランダムに抽出した一連の距離と比較した。該比較はノンパラメトリックコルモゴロフ・スミルノフ検定のDを介して実行した。2つのサンプルが同じ分布に由来する場合、Dの値はゼロに近付く。低バイアスPrimeStarポリメラーゼに関しては、本発明者らは、50,000の断片末端について50,000のゲノム位置の均一なランダムサンプルと比較して測定した際に、D=0.07を観察した。Kapa HiFiポリメラーゼに関しては、本発明者らは50,000の断片末端についてD=0.14を観察した。
上記の通り、タグメンテーションを利用することにより、DNA分子を断片化すると同時にその断片の末端にプライマー結合部位(アダプター)を導入することができる。Nexteraタグメンテーション系(Illumina)は、2つの固有アダプター(本明細書中ではXおよびYと称する)のうちの1つを持つトランスポザーゼ酵素を利用する。これにより、一部は同一の末端配列(X-X、Y-Y)を有し、また一部は固有末端(X-Y)を有する、増幅産物のランダムな混合物が生成する。標準的なNexteraプロトコルでは、2つの別個のプライマー配列を利用することにより、各末端に異なるアダプターを含有する「X-Y」生成物を選択的に増幅する(Illumina技術によるシーケンシングに必要な場合)。しかし、単一プライマー配列を使用することにより同一末端アダプターを有する「X-X」または「Y-Y」断片を増幅することも可能である。
サーモコッカス属古細菌のポリメラーゼは他のDNAポリメラーゼと比較するとはるかにバランスのとれた変異プロファイルを生成するが、それらはGおよびC部位における変異に対してわずかなバイアスを呈する(表4を参照されたい)。この残留バイアスを排除するため、本発明者らは、種々のヌクレオチドの相対的組み込み率に影響を与えるために突然変異誘発および回復PCRステップの最中に天然のdNTPの濃度を変更することの効果を検証した。
[1] 以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、およびb.低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することを含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法。
[2] 少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法における、低バイアスDNAポリメラーゼの使用。
[3] 前記の少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法が、以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、およびb.低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することを含む、実施形態2記載の使用。
[4] 前記変異が置換変異である、実施形態1~3のいずれかに記載の方法または使用。
[5] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的核酸分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5、0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4、0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3、0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2、または約1:1:1:1の率比で変異させる、実施形態1~4のいずれかに記載の方法または使用。
[6] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的核酸分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3の率比で変異させる、実施形態1~5のいずれかに記載の方法または使用。
[7] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的核酸分子中のヌクレオチドの1%~15%、2%~10%、または約8%を変異させる、実施形態1~6のいずれかに記載の方法または使用。
[8] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、1ラウンドの複製当たりに、該少なくとも1つの標的核酸分子中のヌクレオチドの0%~3%、または0%~2%を変異させる、実施形態1~7のいずれかに記載の方法または使用。
[9] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的核酸分子にヌクレオチド類似体を組み込む、実施形態1~8のいずれかに記載の方法または使用。
[10] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して該少なくとも1つの標的核酸分子中のアデニン、チミン、グアニン、および/またはシトシンを変異させる、実施形態1~9のいずれかに記載の方法または使用。
[11] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、グアニン、シトシン、アデニン、および/またはチミンをヌクレオチド類似体と置き換える、実施形態1~10のいずれかに記載の方法または使用。
[12] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して、グアニンまたはアデニンヌクレオチドを、それぞれ0.5~1.5:0.5~1.5、0.6~1.4:0.6~1.4、0.7~1.3:0.7~1.3、0.8~1.2:0.8~1.2、または約1:1の率比で導入する、実施形態1~11のいずれかに記載の方法または使用。
[13] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して、グアニンまたはアデニンヌクレオチドを、それぞれ0.7~1.3:0.7~1.3の率比で導入する、実施形態1~12のいずれかに記載の方法または使用。
[14] 前記方法が低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップを含み、この低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップがヌクレオチド類似体の存在下で実行され、かつこの少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップにより該ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的核酸分子が提供される、実施形態9~13のいずれかに記載の方法または使用。
[15] 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、実施形態9~14のいずれかに記載の方法または使用。
[16] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を導入する、実施形態15記載の方法または使用。
[17] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を、それぞれ0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5、0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4、0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3、0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2、または約1:1:1:1の率比で導入する、実施形態16記載の方法または使用。
[18] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を、それぞれ0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3の率比で導入する、実施形態16または17記載の方法または使用。
[19] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが高忠実度DNAポリメラーゼである、実施形態1~18のいずれかに記載の方法または使用。
[20] ヌクレオチド類似体の非存在下で、前記高忠実度DNAポリメラーゼが、1ラウンドの複製当たり0.01%未満、0.0015%未満、0.001%未満、0%~0.0015%、または0%~0.001%の変異を導入する、実施形態19記載の方法または使用。
[21] 前記方法が、ヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するさらなるステップを含む、実施形態14または15記載の方法または使用。
[22] 前記のヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップを、低バイアスDNAポリメラーゼを使用して実行する、実施形態21記載の方法または使用。
[23] 前記方法が変異した少なくとも1つの標的核酸分子を提供し、かつ前記方法が、この変異した少なくとも1つの標的核酸分子を低バイアスDNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップをさらに含む、実施形態1~22のいずれかに記載の方法または使用。
[24] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが低鋳型増幅バイアスを有する、実施形態1~23のいずれかに記載の方法または使用。
[25] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、校正ドメインおよび/またはプロセッシビティ増強ドメインを含む、実施形態1~24のいずれかに記載の方法または使用。
[26] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、以下a.~h.、すなわち
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
の少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも750個の連続したアミノ酸の断片を含む、実施形態1~25のいずれかに記載の方法または使用。
[27] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、以下a.~h.、すなわち
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
を含む、実施形態26記載の方法または使用。
[28] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、配列番号2と少なくとも98%同一である配列を含む、実施形態27記載の方法または使用。
[29] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、配列番号4と少なくとも98%同一である配列を含む、実施形態27記載の方法または使用。
[30] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、配列番号6と少なくとも98%同一である配列を含む、実施形態27記載の方法または使用。
[31] 前記低バイアスDNAポリメラーゼが、配列番号7と少なくとも98%同一である配列を含む、実施形態27記載の方法または使用。
[32] 前記低バイアスDNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)、またはその誘導体である、実施形態1~31のいずれかに記載の方法または使用。
[33] 前記低バイアスDNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼである、実施形態32記載の方法または使用。
[34] 前記のサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼが、T.コダカレンシス(T.kodakarensis)、T.シクリ(T.siculi)、T.セレル(T.celer)およびT.エスピー(T.sp)KS-1からなる群より選択されるサーモコッカス目古細菌の菌株に由来するものである、実施形態32または33記載の方法または使用。
[35] 前記の少なくとも1つの標的核酸分子にバーコードを導入することをさらに含む、実施形態1~34のいずれかに記載の方法または使用。
[36] 前記の少なくとも1つの標的核酸分子にサンプルタグを導入することをさらに含む、実施形態1~35のいずれかに記載の方法または使用。
[37] サンプルタグ群を使用し、かつ異なるサンプルからの標的核酸分子を該群からの異なるサンプルタグで標識する、実施形態36記載の方法または使用。
[38] 各サンプルタグが、少なくとも1の低確率変異差または少なくとも3の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態37記載の方法または使用。
[39] 各サンプルタグが、少なくとも3の低確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態38記載の方法または使用。
[40] 各サンプルタグが、3~25、または3~10の低確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態38または39記載の方法または使用。
[41] 前記低確率変異がトランスバージョン変異またはインデル変異である、実施形態38~40のいずれかに記載の方法または使用。
[42] 各サンプルタグが、少なくとも5の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態37~41のいずれかに記載の方法または使用。
[43] 各サンプルタグが、5~25、または5~10の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態42記載の方法または使用。
[44] 前記高確率変異がトランジション変異である、実施形態38~43のいずれかに記載の方法または使用。
[45] 前記サンプルタグ群が、実施形態71~75のいずれかに記載の方法で取得可能である、実施形態37~44のいずれかに記載の方法または使用。
[46] 前記の少なくとも1つの標的核酸分子の各々にアダプターを導入することをさらに含む、実施形態1~45のいずれかに記載の方法または使用。
[47] 前記の少なくとも1つの標的核酸分子の3’末端に第1アダプターを導入し、かつ前記の少なくとも1つの標的核酸分子の5’末端に第2アダプターを導入することを含み、該第1アダプターと該第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、実施形態46記載の方法または使用。
[48] 前記の少なくとも1つの標的核酸分子を、互いに同一でありかつ前記第1アダプターの一部に相補的であるプライマーを使用して増幅する、実施形態47記載の方法または使用。
[49] 前記第1アダプターが、前記第2アダプターと少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一である核酸分子に相補的である、実施形態47または48記載の方法または使用。
[50] 前記プライマーが第2プライマー結合部位を含み、かつ前記方法が前記プライマーを使用して前記の少なくとも1つの標的核酸分子を増幅すること、前記プライマーを除去すること、および該第2プライマー結合部位とアニーリングする第2セットのプライマーを使用して前記の少なくとも1つの標的核酸分子をさらに増幅することを含む、実施形態48または49記載の方法または使用。
[51] 前記方法が、前記標的核酸分子の各々にバーコード、サンプルタグおよびアダプターを導入することをさらに含む、実施形態1~50のいずれかに記載の方法または使用。
[52] 前記のバーコード、サンプルタグおよび/またはアダプターを、タグメンテーションにより、または剪断およびライゲーションにより導入する、実施形態1~51のいずれかに記載の方法または使用。
[53] 前記の少なくとも1つの標的核酸分子が、1 kbp超、1.5 kbp超、2 kbp超、4 kbp超、5 kbp超、7 kbp超、または8 kbp超である、実施形態1~52のいずれかに記載の方法または使用。
[54] 実施形態1または3~53のいずれかに記載の変異を導入するための方法を含む、少なくとも1つの標的核酸分子の配列を決定するための方法。
[55] 以下a.~c.のステップ、すなわち、
a.実施形態1または3~53のいずれかに記載の方法を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
b.少なくとも1つの変異した標的核酸分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、および
c.変異した配列リードを使用して、少なくとも1つの標的核酸分子の少なくとも一部に対して配列を組み立てるステップ
を含む、実施形態54記載の方法。
[56] 以下a.~d.のステップ、すなわち
a.実施形態1または3~53のいずれかに記載の方法を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
b.該少なくとも1つの変異した標的核酸分子を断片化および/または増幅することにより、少なくとも1つの断片化および/または増幅された変異標的核酸分子を用意するステップ、
c. 該少なくとも1つの断片化および/または増幅された変異標的核酸分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、ならびに
d.変異した配列リードを使用して、該少なくとも1つの標的核酸分子の少なくとも一部に対して配列を組み立てるステップ
を含む、実施形態54記載の方法。
[57] 実施形態1または3~53のいずれかに記載の変異を導入するための方法を含む、タンパク質を操作するための方法。
[58] 以下a.~c.のステップ、すなわち
a.実施形態1または3~53のいずれかに記載の方法を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
b. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子をベクターに挿入するステップ、および
c. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
を含む、実施形態57記載の方法。
[59] 以下a.~e.のステップ、すなわち
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意するステップ、および
b.ヌクレオチド類似体の存在下で低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することにより、該ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的核酸分子を用意するステップ、
c.ヌクレオチド類似体の非存在下で該ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することにより、少なくとも1つの変異した標的核酸分子を用意するステップ、
d. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子をベクターに挿入するステップ、および
e. 該少なくとも1つの変異した標的核酸分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
を含む、実施形態58記載の方法。
[60] 前記方法が、前記の少なくとも1つの変異した標的核酸分子によりコードされるタンパク質の活性を試験するかまたは該タンパク質の構造を評価するステップをさらに含む、実施形態58または59記載の方法。
[61] 前記ベクターがプラスミド、ウイルス、コスミド、または人工染色体である、実施形態58~60のいずれかに記載の方法。
[62] 前記の少なくとも1つの変異した標的核酸分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップが、前記ベクターを用いて細菌細胞を形質転換すること、真核細胞をトランスフェクトすること、または真核細胞に形質導入することにより達成される、実施形態58~61のいずれかに記載の方法。
[63] サンプルタグ群であって、各サンプルタグが、少なくとも1の低確率変異差または少なくとも3の高確率変異差により該群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、該サンプルタグ群。
[64] 各サンプルタグが、少なくとも3の低確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態63記載のサンプルタグ群。
[65] 各サンプルタグが、3~25、または3~10の低確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態63または64記載のサンプルタグ群。
[66] 前記低確率変異がトランスバージョン変異またはインデル変異である、実施形態63~65のいずれかに記載のサンプルタグ群。
[67] 各サンプルタグが、少なくとも5の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態63~66のいずれかに記載のサンプルタグ群。
[68] 各サンプルタグが、5~25、または5~10の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、実施形態63~67のいずれかに記載のサンプルタグ群。
[69] 前記高確率変異がトランジション変異である、実施形態63~68のいずれかに記載のサンプルタグ群。
[70] 各サンプルタグが、少なくとも8ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも12ヌクレオチド長、8~50ヌクレオチド長、10~50ヌクレオチド長、または10~50ヌクレオチド長である、実施形態63~69のいずれかに記載のサンプルタグ群。
[71] 以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる低確率変異の平均数を決定すること、および
b.少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる低確率変異の平均数より多い低確率差により各サンプルタグがサンプルタグ群の実質的に全てのサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
を含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法における使用に適したサンプルタグ群を設計するための方法。
[72] 以下a.(i)および(ii)、すなわち
a.(i)前記の少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる高確率変異の平均数を決定すること、および
(ii)前記の少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法の最中に生じる高確率変異の平均数より多い高確率差により、各サンプルタグがサンプルタグ群の実質的に全てのサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
をさらに含む、実施形態71記載の方法。
[73] 前記低確率変異がトランスバージョン変異またはインデル変異である、実施形態71または72記載の方法。
[74] 前記高確率変異がトランジション変異である、実施形態72~73のいずれかに記載の方法。
[75] コンピュータにより実装される方法である、実施形態71~74のいずれかに記載の方法。
[76] 前記の低バイアスDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップを、不均一濃度のdNTPを使用して実行する、実施形態1~75のいずれかに記載の方法または使用。
[77] 以下(i)または(ii)である、すなわち
(i)前記方法がヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するさらなるステップを含み、かつこのヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行するか、または
(ii)前記方法が変異した少なくとも1つの標的核酸分子を提供し、前記方法がこの変異した少なくとも1つの標的核酸分子を前記低バイアスDNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを含み、かつこの変異した少なくとも1つの標的核酸分子を前記低バイアスDNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行する、
実施形態1~76のいずれかに記載の方法。
[78] 以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、およびb.DNAポリメラーゼを使用して少なくとも1つの標的核酸分子を増幅することにより、この少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入して変異した少なくとも1つの標的核酸分子を用意すること、
ここでステップb.は不均一濃度のdNTPを使用して実行するものとする、
を含む、少なくとも1つの標的核酸分子に変異を導入するための方法。
[79] ステップb.をヌクレオチド類似体の存在下で実行する、実施形態78記載の方法。
[80] 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、実施形態79記載の方法。
[81] 前記方法が、ヌクレオチド類似体の非存在下で、前記の変異した少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するさらなるステップc.を含む、実施形態79または80記載の方法。
[82] ステップc.を不均一濃度のdNTPを使用して実行する、実施形態81記載の方法。
[83] 不均一濃度のdNTPを使用することにより、導入する変異のプロファイルを変更する、実施形態76~82のいずれかに記載の方法。
[84] 不均一濃度のdNTPを使用することにより、導入する変異のプロファイルにおけるバイアスを低減する、実施形態83記載の方法。
[85] 前記方法が、低バイアス変異プロファイルで変異を導入するための方法である、実施形態1~84のいずれかに記載の方法。
[86] 前記の不均一濃度のdNTPがdATP、dCTP、dTTPおよびdGTPを含み、かつdATP、dCTP、dTTPまたはdGTPのうちの1つまたは2つが他のdNTPと比較してより低い濃度である、実施形態76~85のいずれかに記載の方法。
[87] 不均一濃度のdNTPの使用が、導入する変異のプロファイルにおけるバイアスを低減するためにそのレベルを増大または減少させるべきdNTPを同定するステップを含む、実施形態76~86のいずれかに記載の方法。
[88] 前記の不均一濃度のdNTPが、他のdNTPより低い濃度のdTTPを含む、実施形態76~87のいずれかに記載の方法。
[89] 前記の不均一濃度のdNTPが、dATP、dCTPまたはdGTPの濃度の75%未満、70%未満、60%未満、55%未満、25%~75%、25%~70%、25%~60%、または約50%の濃度のdTTPを含む、実施形態88記載の方法。
[90] 前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の75%未満、70%未満、60%未満、55%未満、25%~75%、25%~70%、25%~60%、または約50%の濃度のdTTPを含む、実施形態89記載の方法。
[91] 前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の60%未満の濃度のdTTPを含む、実施形態90記載の方法。
[92] 前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の25%~60%の濃度のdTTPを含む、実施形態87記載の方法。
[93] 前記のヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップ、またはヌクレオチド類似体の非存在下で、変異した少なくとも1つの標的核酸分子を増幅するステップを、不均一濃度のdNTPを使用して実行する、実施形態77、または81~92のいずれかに記載の方法。
[94] 前記の不均一濃度のdNTPが、他のdNTPと比較してより低い濃度のdATPを含む、実施形態93記載の方法。
[95] 前記の不均一濃度のdNTPが、dTTP、dCTPまたはdGTPの濃度の75%未満、70%未満、60%未満、55%未満、25%~75%、25%~70%、25%~60%、または約50%の濃度のdATPを含む、実施形態94記載の方法。
[96] 前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の75%未満、70%未満、60%未満、55%未満、25%~75%、25%~70%、25%~60%、または約50%の濃度のdATPを含む、実施形態95記載の方法。
[97] 前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の60%未満の濃度のdATPを含む、実施形態96記載の方法。
[98] 前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の25%~60%の濃度のdATPを含む、実施形態96または97記載の方法。
[99] 実施形態71~74のいずれかに記載の方法により取得可能なサンプルタグ群。
[100] 実施形態71~74のいずれかに記載の方法を実施するために構成されたコンピュータ可読媒体。
[101] 以下a.~c.、すなわち
a.標的核酸分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、
b.標的核酸分子の3’末端に第1アダプターを導入し、かつ標的核酸分子の5’末端に第2アダプターを導入すること、および
c.第1アダプターの一部に相補的であるプライマーを使用して標的核酸分子を増幅すること、
ここで第1アダプターと第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、
を含む、1 kbp長より大きい標的核酸分子を選択的に増幅するための方法。
[102] 前記プライマーが互いに同一である、実施形態101記載の方法。
[103] 前記第1アダプターが、前記第2アダプターと少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一である核酸分子に相補的である、実施形態101または102記載の方法。
[104] 前記方法が、1.5 kbp長より大きい標的核酸分子を選択的に増幅するための方法である、実施形態101~103のいずれかに記載の方法。
[105] 前記標的核酸分子を配列決定するステップをさらに含む、実施形態101~104のいずれかに記載の方法。
Claims (87)
- 以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、およびb.低バイアス高忠実度DNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅すること、ここで該DNAポリメラーゼは該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5の率比で変異させ、かつ、ヌクレオチド類似体の非存在下で、該DNAポリメラーゼは、1ラウンドの複製当たり0.01%未満の変異しか導入しない、
を含み、
該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップが、該ヌクレオチド類似体の存在下で実行され、かつ、該少なくとも1つの標的DNA分子の増幅を少なくとも2ラウンド含み、 第1ラウンドの増幅において該DNAポリメラーゼがヌクレオチドの代わりに該ヌクレオチド類似体を組込み、かつ、第2ラウンドの増幅において該ヌクレオチド類似体が天然ヌクレオチドと対を形成して相補鎖に置換変異を導入する、
少なくとも1つの標的DNA分子に置換変異を導入する方法。 - 少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法における、低バイアス高忠実度DNAポリメラーゼの使用であって、
前記の少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法が、以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、およびb.該DNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅すること、ここで該DNAポリメラーゼは該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5の率比で変異させ、かつ、ヌクレオチド類似体の非存在下で、該DNAポリメラーゼは、1ラウンドの複製当たり0.01%未満の変異しか導入しない、
を含み、
該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップが、該ヌクレオチド類似体の存在下で実行され、かつ、該少なくとも1つの標的DNA分子の増幅を少なくとも2ラウンド含み、 第1ラウンドの増幅において該DNAポリメラーゼがヌクレオチドの代わりに該ヌクレオチド類似体を組込み、かつ、第2ラウンドの増幅において該ヌクレオチド類似体が天然ヌクレオチドと対を形成して相補鎖に置換変異を導入する、
前記使用。 - 前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4、0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3、0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2、または1:1:1:1の率比で変異させる、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3の率比で変異させる、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子中のヌクレオチドの1%~15%、2%~10%、または8%を変異させる、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、1ラウンドの複製当たりに、該少なくとも1つの標的DNA分子中のヌクレオチドの0%~3%、または0%~2%を変異させる、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子にヌクレオチド類似体を組み込む、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、および/またはシトシンを変異させる、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、グアニン、シトシン、アデニン、および/またはチミンをヌクレオチド類似体と置き換える、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して、グアニンまたはアデニンヌクレオチドを、それぞれ0.5~1.5:0.5~1.5、0.6~1.4:0.6~1.4、0.7~1.3:0.7~1.3、0.8~1.2:0.8~1.2、または1:1の率比で導入する、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して、グアニンまたはアデニンヌクレオチドを、それぞれ0.7~1.3:0.7~1.3の率比で導入する、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップにより該ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的DNA分子が提供される、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項7に記載の方法または使用。
- 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項8に記載の方法または使用。
- 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項9に記載の方法または使用。
- 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項10に記載の方法または使用。
- 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項11に記載の方法または使用。
- 前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項12に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を導入する、請求項13~18のいずれか一項に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を、それぞれ0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5、0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4:0.6~1.4、0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3、0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2:0.8~1.2、または1:1:1:1の率比で導入する、請求項19に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を、それぞれ0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3:0.7~1.3の率比で導入する、請求項19に記載の方法または使用。
- ヌクレオチド類似体の非存在下で、前記DNAポリメラーゼが、1ラウンドの複製当たり0.0015%未満、0.001%未満、0%~0.0015%、または0%~0.001%の変異を導入する、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記方法が、ヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するさらなるステップを含む、請求項12に記載の方法または使用。
- 前記のヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップを、該DNAポリメラーゼを使用して実行する、請求項23に記載の方法または使用。
- 前記方法が変異した少なくとも1つの標的DNA分子を提供し、かつ前記方法が、この変異した少なくとも1つの標的DNA分子を該DNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、校正ドメインおよび/またはプロセッシビティ増強ドメインを含む、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、以下a.~h.、すなわち
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
の少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも750個の連続したアミノ酸の断片を含む、請求項1又は2に記載の方法または使用。 - 前記DNAポリメラーゼが、以下a.~h.、すなわち
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列
を含む、請求項27に記載の方法または使用。 - 前記DNAポリメラーゼが、配列番号2と少なくとも98%同一である配列を含む、請求項28に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、配列番号4と少なくとも98%同一である配列を含む、請求項28に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、配列番号6と少なくとも98%同一である配列を含む、請求項28に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼが、配列番号7と少なくとも98%同一である配列を含む、請求項28に記載の方法または使用。
- 前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)であるか、前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)と少なくとも95%同一であるか、又は、前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)の少なくとも400の連続したアミノ酸の断片を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)であるか、前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)と少なくとも95%同一であるか、又は、前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)の少なくとも400の連続したアミノ酸の断片を含むものである、請求項2に記載の使用。
- 前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼである、請求項33に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼである、請求項34に記載の使用。
- 前記のサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼが、T.コダカレンシス(T.kodakarensis)、T.シクリ(T.siculi)、T.セレル(T.celer)およびT.エスピー(T.sp)KS-1からなる群より選択されるサーモコッカス目古細菌の菌株に由来するものである、請求項33~36のいずれか一項に記載の方法または使用。
- 前記の少なくとも1つの標的DNA分子にバーコードを導入することをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記の少なくとも1つの標的DNA分子にサンプルタグを導入することをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- サンプルタグ群を使用し、かつ異なるサンプルからの標的DNA分子を該群からの異なるサンプルタグで標識する、請求項39に記載の方法または使用。
- 各サンプルタグが、少なくとも1の低確率変異差または少なくとも3の高確率変異差により前記サンプルタグ群の少なくとも90%の他のサンプルタグと異なっている、請求項40に記載の方法または使用。
- 各サンプルタグが、少なくとも3の低確率変異差により前記サンプルタグ群の少なくとも90%の他のサンプルタグと異なっている、請求項41に記載の方法または使用。
- 各サンプルタグが、3~25、または3~10の低確率変異差により前記サンプルタグ群の少なくとも90%の他のサンプルタグと異なっている、請求項41に記載の方法または使用。
- 前記低確率変異がトランスバージョン変異またはインデル変異である、請求項41~43のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 各サンプルタグが、少なくとも5の高確率変異差により前記サンプルタグ群の少なくとも90%の他のサンプルタグと異なっている、請求項41に記載の方法または使用。
- 各サンプルタグが、5~25、または5~10の高確率変異差により前記サンプルタグ群の少なくとも90%の他のサンプルタグと異なっている、請求項45に記載の方法または使用。
- 前記高確率変異がトランジション変異である、請求項44に記載の方法または使用。
- 前記高確率変異がトランジション変異である、請求項41~43、45及び46のいずれか一項に記載の方法または使用。
- 各サンプルタグが、少なくとも8ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも12ヌクレオチド長、8~50ヌクレオチド長、10~50ヌクレオチド長、または10~50ヌクレオチド長である、請求項41~43、45及び46のいずれか1項に記載の方法又は使用。
- 前記の少なくとも1つの標的DNA分子の各々にアダプターを導入することをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記の少なくとも1つの標的DNA分子の3’末端に第1アダプターを導入し、かつ前記の少なくとも1つの標的DNA分子の5’末端に第2アダプターを導入することを含み、該第1アダプターと該第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、請求項50に記載の方法または使用。
- 前記の少なくとも1つの標的DNA分子を、互いに同一でありかつ前記第1アダプターの一部に相補的であるプライマーを使用して増幅する、請求項51に記載の方法または使用。
- 前記第1アダプターが、前記第2アダプターと少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%同一であるDNA分子に相補的である、請求項51に記載の方法または使用。
- 前記プライマーが第2プライマー結合部位を含み、かつ前記方法が前記プライマーを使用して前記の少なくとも1つの標的DNA分子を増幅すること、前記プライマーを除去すること、および該第2プライマー結合部位とアニーリングする第2セットのプライマーを使用して前記の少なくとも1つの標的DNA分子をさらに増幅することを含む、請求項52または53に記載の方法または使用。
- 前記方法が、前記標的DNA分子の各々にバーコード、サンプルタグおよびアダプターを導入することをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 前記のバーコード、サンプルタグおよび/またはアダプターを、タグメンテーションにより、または剪断およびライゲーションにより導入する、請求項55に記載の方法または使用。
- 前記の少なくとも1つの標的DNA分子が、1 kbp超、1.5 kbp超、2 kbp超、4 kbp超、5 kbp超、7 kbp超、または8 kbp超である、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 少なくとも1つの標的DNA分子の配列を決定する方法であって、
以下a.~c.のステップ、すなわち、
a.請求項1又は2に記載の方法又は使用を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
b.少なくとも1つの変異した標的DNA分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、および
c.変異した配列リードを使用して、少なくとも1つの標的DNA分子の少なくとも一部について配列を組み立てるステップ
を含む、前記方法。 - 少なくとも1つの標的DNA分子の配列を決定する方法であって、
以下a.~d.のステップ、すなわち
a.請求項1又は2に記載の方法又は使用を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
b.該少なくとも1つの変異した標的DNA分子を断片化および/または増幅することにより、少なくとも1つの断片化および/または増幅された変異標的DNA分子を用意するステップ、c. 該少なくとも1つの断片化および/または増幅された変異標的DNA分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、ならびに
d.変異した配列リードを使用して、該少なくとも1つの標的DNA分子の少なくとも一部について配列を組み立てるステップ
を含む、前記方法。 - タンパク質を操作する方法であって、
以下a.~c.のステップ、すなわち
a.請求項1又は2に記載の方法又は使用を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
b. 該少なくとも1つの変異した標的DNA分子をベクターに挿入するステップ、および
c. 該少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
を含む、前記方法。 - 以下a.~e.のステップ、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意するステップ、および
b.ヌクレオチド類似体の存在下でDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅することにより、該ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的DNA分子を用意するステップ、
c.ヌクレオチド類似体の非存在下で該ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
d.該少なくとも1つの変異した標的DNA分子をベクターに挿入するステップ、および
e.該少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
をさらに含む、請求項60に記載の方法。 - 前記方法が、前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質の活性を試験するかまたは該タンパク質の構造を評価するステップをさらに含む、請求項60に記載の方法。
- 前記方法が、前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質の活性を試験するかまたは該タンパク質の構造を評価するステップをさらに含む、請求項61に記載の方法。
- 前記ベクターがプラスミド、ウイルス、コスミド、または人工染色体である、請求項60に記載の方法。
- 前記ベクターがプラスミド、ウイルス、コスミド、または人工染色体である、請求項61~63のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップが、前記ベクターを用いて細菌細胞を形質転換すること、真核細胞をトランスフェクトすること、または真核細胞に形質導入することにより達成される、請求項60に記載の方法。
- 前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップが、前記ベクターを用いて細菌細胞を形質転換すること、真核細胞をトランスフェクトすること、または真核細胞に形質導入することにより達成される、請求項61に記載の方法。
- 以下c.およびd.、すなわち
c.少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる低確率変異の平均数を決定すること、および
d.少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる低確率変異の平均数より多い低確率差により各サンプルタグがサンプルタグ群の少なくとも90%の他のサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
を含む、サンプルタグ群を設計する工程であって、少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する請求項1に記載の方法に使用するための、サンプルタグ群を設計する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法であって、
前記のさらなる工程を、請求項1に記載の方法の前に行う、請求項1に記載の方法。 - 以下a.(i)および(ii)、すなわち
a.(i)前記の少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる高確率変異の平均数を決定すること、および
(ii)前記の少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる高確率変異の平均数より多い高確率差により、各サンプルタグがサンプルタグ群の少なくとも90%の他のサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
をさらに含む、請求項68に記載の方法。 - 前記低確率変異がトランスバージョン変異またはインデル変異である、請求項68に記載の方法。
- 前記高確率変異がトランジション変異である、請求項69に記載の方法。
- 前記のさらなる工程が、コンピュータにより実装される工程である、請求項68に記載の方法。
- コンピュータにより実装される方法である、請求項69~71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップを、不均一濃度のdNTPを使用して実行する、請求項1又は2に記載の方法または使用。
- 以下(i)または(ii)である、すなわち
(i)前記方法がヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するさらなるステップを含み、かつこのヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行するか、または
(ii)前記方法が変異した少なくとも1つの標的DNA分子を提供し、前記方法がこの変異した少なくとも1つの標的DNA分子を前記DNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを含み、かつこの変異した少なくとも1つの標的DNA分子を前記DNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行する、
請求項1又は2に記載の方法又は使用。 - 不均一濃度のdNTPを使用して、導入される変異のプロファイルにおけるバイアスを低減する、請求項74に記載の方法又は使用。
- 不均一濃度のdNTPの使用が、導入する変異のプロファイルにおけるバイアスを低減するためにそのレベルを増大または減少させるべきdNTPを同定するステップを含む、請求項74に記載の方法又は使用。
- 不均一濃度のdNTPの使用が、導入する変異のプロファイルにおけるバイアスを低減するためにそのレベルを増大または減少させるべきdNTPを同定するステップを含む、請求項75に記載の方法又は使用。
- 前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の25%~60%の濃度のdTTPを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の25%~60%の濃度のdTTPを含む、請求項78に記載の方法。
- 前記のヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップ、またはヌクレオチド類似体の非存在下で、変異した少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップを、不均一濃度のdNTPを使用して実行する、請求項77~80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の不均一濃度のdNTPが、他のdNTPと比較してより低い濃度のdATPを含む、請求項81に記載の方法。
- 前記の不均一濃度のdNTPが、dTTP、dCTPまたはdGTPの濃度の75%未満、70%未満、60%未満、55%未満、25%~75%、25%~70%、25%~60%、または50%の濃度のdATPを含む、請求項82に記載の方法。
- 前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の75%未満、70%未満、60%未満、55%未満、25%~75%、25%~70%、25%~60%、または50%の濃度のdATPを含む、請求項83に記載の方法。
- 前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の60%未満の濃度のdATPを含む、請求項84に記載の方法。
- 前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の25%~60%の濃度のdATPを含む、請求項84または85に記載の方法。
- 該低バイアス高忠実度DNAポリメラーゼが低鋳型増幅バイアスを有し、該低バイアス高忠実度DNAポリメラーゼが、コルモゴロフ・スミルノフのD=0.1未満にて7~10 kbpの断片を増幅することができる、請求項1又は2に記載の方法。
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---|---|---|---|---|
US5780231A (en) * | 1995-11-17 | 1998-07-14 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA extension and analysis with rolling primers |
WO2002079502A1 (en) | 2001-03-28 | 2002-10-10 | The University Of Queensland | A method for nucleic acid sequence analysis |
EP2292767B1 (en) | 2004-06-04 | 2013-11-20 | Takara Bio, Inc. | Polypepdides having DNA polymerase activity |
US9481912B2 (en) * | 2006-09-12 | 2016-11-01 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples |
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AU2011253984A1 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-28 | Biobalance Llc | Method For Identifying E. Coli M-17 |
US9977861B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes |
HUE058149T2 (hu) * | 2014-01-31 | 2022-07-28 | Swift Biosciences Inc | Javított eljárások DNS-szubsztrátok feldolgozására |
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Frontiers in Microbiology,2014年,Vol.5,Article224 |
Methods in Molecular Biology,2002年,Vol.192,pp.167-174 |
Molecules,2010年,Vol.15,pp.8229-8240 |
Nucleic Acids Research,2016年,Vol.44,pp.1022-1035 |
Nucleic Acids Reserach,2010年,Vol.38,pp.8095-8104 |
NUCLEOSIDES & NUCLEOTIDES,1997年,Vol.16,pp.1749-1752 |
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