JPWO2019162657A5

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Publication number: JPWO2019162657A5
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Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2039-02-19

Description

先のステップで得た長いDNA断片を、反応物をPCR増幅用に3つのプールに分けたことを除き、標準的なタグメンテーション反応(例えばNextera XTまたはNextera Flex)に供した。これにより、元の鋳型の各末端に由来する断片(サンプルのバーコードを含む)、ならびに前記の長い鋳型由来の、両末端で新たにタグメント化された内部断片の選択的増幅が可能となる。これにより、Illumina装置(例えばMiSeqまたはHiSeq)での配列決定用の3つのプールが効果的に創出される。

Claims

以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、および
b.低鋳型増幅バイアスを有する、低バイアス高忠実度DNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅することを含み、
該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップが、ヌクレオチド類似体の存在下で実行され、かつ、該少なくとも1つの標的DNA分子の増幅を少なくとも２ラウンド含み、
第１ラウンドの増幅において該DNAポリメラーゼがヌクレオチドの代わりに該ヌクレオチド類似体を組込み、かつ、第２ラウンドの増幅において該ヌクレオチド類似体が天然ヌクレオチドと対を形成して相補鎖に置換変位を導入する、
少なくとも1つの標的DNA分子に置換変異を導入する方法。
少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法における、低鋳型増幅バイアスを有する、低バイアス高忠実度DNAポリメラーゼの使用であって、
前記の少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法が、以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、および
b.該DNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅することを含み、
該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップが、ヌクレオチド類似体の存在下で実行され、かつ、該少なくとも1つの標的DNA分子の増幅を少なくとも２ラウンド含み、
第１ラウンドの増幅において該DNAポリメラーゼがヌクレオチドの代わりに該ヌクレオチド類似体を組込み、かつ、第２ラウンドの増幅において該ヌクレオチド類似体が天然ヌクレオチドと対を形成して相補鎖に置換変位を導入する、
前記使用。
前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5、0.6～1.4：0.6～1.4：0.6～1.4：0.6～1.4、0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3、0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2、または約1：1：1：1の率比で変異させる、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドを、それぞれ0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3の率比で変異させる、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子中のヌクレオチドの1％～15％、2％～10％、または約8％を変異させる、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、1ラウンドの複製当たりに、該少なくとも1つの標的DNA分子中のヌクレオチドの0％～3％、または0％～2％を変異させる、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、該少なくとも1つの標的DNA分子にヌクレオチド類似体を組み込む、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して該少なくとも1つの標的DNA分子中のアデニン、チミン、グアニン、および／またはシトシンを変異させる、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、グアニン、シトシン、アデニン、および／またはチミンをヌクレオチド類似体と置き換える、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して、グアニンまたはアデニンヌクレオチドを、それぞれ0.5～1.5：0.5～1.5、0.6～1.4：0.6～1.4、0.7～1.3：0.7～1.3、0.8～1.2：0.8～1.2、または約1：1の率比で導入する、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、ヌクレオチド類似体を使用して、グアニンまたはアデニンヌクレオチドを、それぞれ0.7～1.3：0.7～1.3の率比で導入する、請求項１又は２に記載の方法または使用。
該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップにより該ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的DNA分子が提供される、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項７に記載の方法または使用。
前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項８に記載の方法または使用。
前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項９に記載の方法または使用。
前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項１０に記載の方法または使用。
前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項１１に記載の方法または使用。
前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項１２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を導入する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を、それぞれ0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5、0.6～1.4：0.6～1.4：0.6～1.4：0.6～1.4、0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3、0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2、または約1：1：1：1の率比で導入する、請求項１９に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、グアニンからアデニンへの置換変異、シトシンからチミンへの置換変異、アデニンからグアニンへの置換変異、およびチミンからシトシンへの置換変異を、それぞれ0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3：0.7～1.3の率比で導入する、請求項１９に記載の方法または使用。
ヌクレオチド類似体の非存在下で、前記DNAポリメラーゼが、1ラウンドの複製当たり0.01％未満、0.0015％未満、0.001％未満、0％～0.0015％、または0％～0.001％の変異を導入する、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記方法が、ヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するさらなるステップを含む、請求項１２に記載の方法または使用。
前記のヌクレオチド類似体の非存在下でヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップを、該DNAポリメラーゼを使用して実行する、請求項２３に記載の方法または使用。
前記方法が変異した少なくとも1つの標的DNA分子を提供し、かつ前記方法が、この変異した少なくとも1つの標的DNA分子を該DNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、校正ドメインおよび／またはプロセッシビティ増強ドメインを含む、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、以下a.～h.、すなわち
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列
の少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、または少なくとも750個の連続したアミノ酸の断片を含む、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、以下a.～h.、すなわち
a.配列番号2の配列、
b.配列番号2と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列、
c.配列番号4の配列、
d.配列番号4と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列、
e.配列番号6の配列、
f.配列番号6と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列、
g.配列番号7の配列、または
h.配列番号7と少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％同一である配列
を含む、請求項２７に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、配列番号2と少なくとも98％同一である配列を含む、請求項２８に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、配列番号4と少なくとも98％同一である配列を含む、請求項２８に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、配列番号6と少なくとも98％同一である配列を含む、請求項２８に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼが、配列番号7と少なくとも98％同一である配列を含む、請求項２８に記載の方法または使用。
前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)、またはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼ(thermococcal polymerase)、またはその誘導体である、請求項２に記載の使用。
前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼである、請求項３３に記載の方法。
前記DNAポリメラーゼがサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼである、請求項３４に記載の使用。
前記のサーモコッカス目古細菌のポリメラーゼが、T.コダカレンシス(T.kodakarensis)、T.シクリ(T.siculi)、T.セレル(T.celer)およびT.エスピー(T.sp)KS-1からなる群より選択されるサーモコッカス目古細菌の菌株に由来するものである、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法または使用。
前記の少なくとも1つの標的DNA分子にバーコードを導入することをさらに含む、請求項1又は２に記載の方法または使用。
前記の少なくとも1つの標的DNA分子にサンプルタグを導入することをさらに含む、請求項1又は２に記載の方法または使用。
サンプルタグ群を使用し、かつ異なるサンプルからの標的DNA分子を該群からの異なるサンプルタグで標識する、請求項３９に記載の方法または使用。
各サンプルタグが、少なくとも1の低確率変異差または少なくとも3の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、請求項４０に記載の方法または使用。
各サンプルタグが、少なくとも3の低確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、請求項４１に記載の方法または使用。
各サンプルタグが、3～25、または3～10の低確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、請求項４１に記載の方法または使用。
前記低確率変異がトランスバージョン変異またはインデル変異である、請求項４１～４３のいずれか1項に記載の方法または使用。
各サンプルタグが、少なくとも5の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、請求項４１に記載の方法または使用。
各サンプルタグが、5～25、または5～10の高確率変異差により前記サンプルタグ群の実質的に全ての他のサンプルタグと異なっている、請求項４５に記載の方法または使用。
前記高確率変異がトランジション変異である、請求項４４に記載の方法または使用。
前記高確率変異がトランジション変異である、請求項４１～４３、４５及び４６のいずれか一項に記載の方法または使用。
各サンプルタグが、少なくとも8ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも12ヌクレオチド長、8～50ヌクレオチド長、10～50ヌクレオチド長、または10～50ヌクレオチド長である、請求項４１～４３、４５及び４６のいずれか1項に記載の方法又は使用。
前記サンプルタグ群が、請求項６９～７３のいずれか1項に記載の方法で取得可能である、請求項４０～４９のいずれか1項に記載の方法または使用。
前記の少なくとも1つの標的DNA分子の各々にアダプターを導入することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記の少なくとも1つの標的DNA分子の3’末端に第1アダプターを導入し、かつ前記の少なくとも1つの標的DNA分子の5’末端に第2アダプターを導入することを含み、該第1アダプターと該第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、請求項５１に記載の方法または使用。
前記の少なくとも1つの標的DNA分子を、互いに同一でありかつ前記第1アダプターの一部に相補的であるプライマーを使用して増幅する、請求項５２に記載の方法または使用。
前記第1アダプターが、前記第2アダプターと少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一であるDNA分子に相補的である、請求項５２に記載の方法または使用。
前記プライマーが第2プライマー結合部位を含み、かつ前記方法が前記プライマーを使用して前記の少なくとも1つの標的DNA分子を増幅すること、前記プライマーを除去すること、および該第2プライマー結合部位とアニーリングする第2セットのプライマーを使用して前記の少なくとも1つの標的DNA分子をさらに増幅することを含む、請求項５３または５４に記載の方法または使用。
前記方法が、前記標的DNA分子の各々にバーコード、サンプルタグおよびアダプターを導入することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法または使用。
前記のバーコード、サンプルタグおよび／またはアダプターを、タグメンテーションにより、または剪断およびライゲーションにより導入する、請求項５６に記載の方法または使用。
前記の少なくとも1つの標的DNA分子が、1 kbp超、1.5 kbp超、2 kbp超、4 kbp超、5 kbp超、7 kbp超、または8 kbp超である、請求項１又は２に記載の方法または使用。
少なくとも1つの標的DNA分子の配列を決定する方法であって、
以下a.～c.のステップ、すなわち、
a.請求項１又は２に記載の方法又は使用を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
b.少なくとも1つの変異した標的DNA分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、および
c.変異した配列リードを使用して、少なくとも1つの標的DNA分子の少なくとも一部について配列を組み立てるステップ
を含む、前記方法。
少なくとも1つの標的DNA分子の配列を決定する方法であって、
以下a.～d.のステップ、すなわち
a.請求項１又は２に記載の方法又は使用を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
b.該少なくとも1つの変異した標的DNA分子を断片化および／または増幅することにより、少なくとも1つの断片化および／または増幅された変異標的DNA分子を用意するステップ、
c. 該少なくとも1つの断片化および／または増幅された変異標的DNA分子の領域を配列決定することにより、変異した配列リードを用意するステップ、ならびに
d.変異した配列リードを使用して、該少なくとも1つの標的DNA分子の少なくとも一部について配列を組み立てるステップ
を含む、前記方法。
タンパク質を操作する方法であって、
以下a.～c.のステップ、すなわち
a.請求項１又は２に記載の方法又は使用を実施することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
b. 該少なくとも1つの変異した標的DNA分子をベクターに挿入するステップ、および
c. 該少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
を含む、前記方法。
以下a.～e.のステップ、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意するステップ、および
b.ヌクレオチド類似体の存在下でDNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅することにより、該ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的DNA分子を用意するステップ、
c.ヌクレオチド類似体の非存在下で該ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅することにより、少なくとも1つの変異した標的DNA分子を用意するステップ、
d. 該少なくとも1つの変異した標的DNA分子をベクターに挿入するステップ、および
e. 該少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップ
をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
前記方法が、前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質の活性を試験するかまたは該タンパク質の構造を評価するステップをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
前記方法が、前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質の活性を試験するかまたは該タンパク質の構造を評価するステップをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
前記ベクターがプラスミド、ウイルス、コスミド、または人工染色体である、請求項６１に記載の方法。
前記ベクターがプラスミド、ウイルス、コスミド、または人工染色体である、請求項６２～６４のいずれか1項に記載の方法。
前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップが、前記ベクターを用いて細菌細胞を形質転換すること、真核細胞をトランスフェクトすること、または真核細胞に形質導入することにより達成される、請求項６１に記載の方法。
前記の少なくとも1つの変異した標的DNA分子によりコードされるタンパク質を発現させるステップが、前記ベクターを用いて細菌細胞を形質転換すること、真核細胞をトランスフェクトすること、または真核細胞に形質導入することにより達成される、請求項６２に記載の方法。
以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる低確率変異の平均数を決定すること、および
b.少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる低確率変異の平均数より多い低確率差により各サンプルタグがサンプルタグ群の実質的に全てのサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
を含む、少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法における使用に適したサンプルタグ群を設計する方法。
以下a.(i)および(ii)、すなわち
a.(i)前記の少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法を解析し、かつこの少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる高確率変異の平均数を決定すること、および
(ii)前記の少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法の最中に生じる高確率変異の平均数より多い高確率差により、各サンプルタグがサンプルタグ群の実質的に全てのサンプルタグと異なっている該群について、配列を決定すること
をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
前記低確率変異がトランスバージョン変異またはインデル変異である、請求項６９に記載の方法。
前記高確率変異がトランジション変異である、請求項７０に記載の方法。
コンピュータにより実装される方法である、請求項６９に記載の方法。
コンピュータにより実装される方法である、請求項７０～７２のいずれか1項に記載の方法。
サンプルタグ群が、請求項６９～７３のいずれか一項に記載の方法により取得可能である、請求項４０～４３、４５及び４６のいずれか１項に記載の方法又は使用。
前記DNAポリメラーゼを使用して該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップを、不均一濃度のdNTPを使用して実行する、請求項１又は２に記載の方法または使用。
以下(i)または(ii)である、すなわち
(i)前記方法がヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するさらなるステップを含み、かつこのヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む該少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行するか、または
(ii)前記方法が変異した少なくとも1つの標的DNA分子を提供し、前記方法がこの変異した少なくとも1つの標的DNA分子を前記DNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを含み、かつこの変異した少なくとも1つの標的DNA分子を前記DNAポリメラーゼを使用して増幅するさらなるステップを不均一濃度のdNTPを使用して実行する、
請求項１又は２に記載の方法又は使用。
以下a.およびb.、すなわち
a.少なくとも1つの標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、およびb.DNAポリメラーゼを使用して少なくとも1つの標的DNA分子を増幅することにより、この少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入して変異した少なくとも1つの標的DNA分子を用意すること、
ここでステップb.は不均一濃度のdNTPを使用して実行するものとする、
を含む、少なくとも1つの標的DNA分子に変異を導入する方法。
ステップb.をヌクレオチド類似体の存在下で実行する、請求項78に記載の方法。
前記ヌクレオチド類似体がdPTPである、請求項79に記載の方法。
前記方法が、ヌクレオチド類似体の非存在下で、前記の変異した少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するさらなるステップc.を含む、請求項79または80に記載の方法。
ステップc.を不均一濃度のdNTPを使用して実行する、請求項81に記載の方法。
不均一濃度の該dNTPを使用することにより、導入する変異のプロファイルを変更する、請求項８２に記載の方法。
不均一濃度の該dNTPを使用することにより、導入する変異のプロファイルにおけるバイアスを低減する、請求項83に記載の方法。
前記方法が、低バイアス変異プロファイルで変異を導入する方法である、請求項７６に記載の方法又は使用。
前記方法が、低バイアス変異プロファイルで変異を導入する方法である、請求項７８～８０及び８２～８４のいずれか一項に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPがdATP、dCTP、dTTPおよびdGTPを含み、かつdATP、dCTP、dTTPまたはdGTPのうちの1つまたは2つが他のdNTPと比較してより低い濃度である、請求項７８～８０及び８２～８４のいずれか1項に記載の方法。
不均一濃度のdNTPの使用が、導入する変異のプロファイルにおけるバイアスを低減するためにそのレベルを増大または減少させるべきdNTPを同定するステップを含む、請求項７６に記載の方法又は使用。
不均一濃度のdNTPの使用が、導入する変異のプロファイルにおけるバイアスを低減するためにそのレベルを増大または減少させるべきdNTPを同定するステップを含む、請求項７７に記載の方法又は使用。
前記の不均一濃度のdNTPが、他のdNTPより低い濃度のdTTPを含む、請求項７８～８０及び８２～８４のいずれか1項に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dATP、dCTPまたはdGTPの濃度の75％未満、70％未満、60％未満、55％未満、25％～75％、25％～70％、25％～60％、または約50％の濃度のdTTPを含む、請求項９０に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の75％未満、70％未満、60％未満、55％未満、25％～75％、25％～70％、25％～60％、または約50％の濃度のdTTPを含む、請求項９０に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の60％未満の濃度のdTTPを含む、請求項90に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の25％～60％の濃度のdTTPを含む、請求項８８に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dCTPの濃度の25％～60％の濃度のdTTPを含む、請求項８９に記載の方法。
前記のヌクレオチド類似体の非存在下で、ヌクレオチド類似体を含む少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップ、またはヌクレオチド類似体の非存在下で、変異した少なくとも1つの標的DNA分子を増幅するステップを、不均一濃度のdNTPを使用して実行する、請求項８２～８５、８８、８９及び９１～９５のいずれか1項に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、他のdNTPと比較してより低い濃度のdATPを含む、請求項９６に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dTTP、dCTPまたはdGTPの濃度の75％未満、70％未満、60％未満、55％未満、25％～75％、25％～70％、25％～60％、または約50％の濃度のdATPを含む、請求項９７に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の75％未満、70％未満、60％未満、55％未満、25％～75％、25％～70％、25％～60％、または約50％の濃度のdATPを含む、請求項９８に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の60％未満の濃度のdATPを含む、請求項９９に記載の方法。
前記の不均一濃度のdNTPが、dGTPの濃度の25％～60％の濃度のdATPを含む、請求項９９または１００に記載の方法。
請求項６９～７２のいずれか1項に記載の方法により取得可能なサンプルタグ群。
請求項６９～７２のいずれか1項に記載の方法を実施するために構成されたコンピュータ可読媒体。
以下a.～c.、すなわち
a. 標的DNA分子を含む少なくとも1つのサンプルを用意すること、
b. 標的DNA分子の3’末端に第1アダプターを導入し、かつ標的DNA分子の5’末端に第2アダプターを導入すること、および
c.第1アダプターの一部に相補的であるプライマーを使用して標的DNA分子を増幅すること、
ここで第1アダプターと第2アダプターは互いにアニーリングできるものとする、
を含む、1 kbp長より大きい標的DNA分子を選択的に増幅する方法。
前記プライマーが互いに同一である、請求項１０４に記載の方法。
前記第1アダプターが、前記第2アダプターと少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一であるDNA分子に相補的である、請求項１０４または１０５に記載の方法。
前記方法が、1.5 kbp長より大きい標的DNA分子を選択的に増幅する方法である、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
前記標的DNA分子を配列決定するステップをさらに含む、請求項１０４又は１０５に記載の方法。