CN101597646A - 一种鼻咽癌相关基因ebna1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒，包括鼻咽癌相关基因EBNA1扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液。本发明还提供了鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测方法及其应用。本发明的检测试剂盒和检测方法操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性和敏感性均较高，PCR检测可以批量进行，对于大规模的鼻咽癌筛查是一种有价值的指标，具有广阔的市场前景，在鼻咽癌高危人群的筛查以及鼻咽癌的早期发现和早期诊断中具有重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及鼻咽癌早期检测试剂盒和检测方法，特别是一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中国南方和东南亚地区的常见恶性肿瘤，其发病率在15～50/10万人口。鼻咽癌的发生有多种遗传和环境因素的参与，其中Epstein-Barr病毒(EB病毒)作为一种特殊的环境致病因子，与鼻咽癌高度相关：鼻咽癌患者血清中EB病毒特异性抗体水平显著升高；EB病毒的感染发生于鼻咽癌细胞单克隆增殖之前；EB病毒DNA及其表达产物在鼻咽癌病灶中的广泛检出等，均提示EB病毒在鼻咽癌的发生发展中起着重要作用。但是EB病毒的感染在大多数人群中并不引起疾病。因此，在鼻咽癌细胞中可能存在具有转化能力的致癌性EB病毒亚株。
EBNA1(Epstein-Barr nuclear antigen 1，EBNA1)是唯一在EB病毒相关肿瘤细胞中均有表达的蛋白，在病毒的潜伏性感染中有重要的功能。EBNA1可以激活EB病毒的DNA复制，在宿主细胞的分裂过程中，EBNA1蛋白可与细胞分裂中期染色体相结合，介导EB病毒游离体在子代细胞的平均分配。作为转录激活子，EBNA1可以促进其他EBNA蛋白，以及LMP1蛋白的表达。EBNA1可以分为P-ala，P-thr，V-val，V-leu和V-pro五种亚型。在广东地区患者的鼻咽癌组织中，全部为单一的V-val突变型，提示这种突变型与鼻咽癌有密切的相关性。目前还没有一种将EBNA1基因的检测用于诊断鼻咽癌中。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒。
本发明的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒，包括鼻咽癌相关基因EBNA1扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液。
优选的，所述EBNA1扩增用基因特异性引物如下：
5′-cgggagcgatagagcagggc-3′，
5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′。
优选的，本发明的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为B95-8细胞DNA。
优选的，本发明的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒还包括阴性对
照，所述阴性对照为BJAB细胞DNA。
本发明的第二个目的是提供鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测方法。将待检模板DNA通过EBNA1扩增用基因特异性引物进行PCR扩增。所述EBNA1扩增用基因特异性引物如下：
5′-cgggagcgatagagcagggc-3′，
5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′。
本发明的第三个目的是提供了鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒
在早期诊断鼻咽癌中的应用。
同现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开了一种鼻咽癌诊断试剂盒及其检测方法与应用，该试剂盒可以快速、准确地进行外周血EB病毒EBNA1亚型的检测，从而可以对鼻咽癌做出快速的辅助诊断，具有重要的临床应用价值。作为一种无创伤性而快速的检查方法，在鼻咽癌高危人群的筛查以及鼻咽癌的早期发现和早期诊断中具有重要的临床价值。本发明的检测试剂盒和检测方法操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性和敏感性均较高，PCR检测可以批量进行，对于大规模的鼻咽癌筛查是一种有价值的指标，具有广阔的市场前景。通过检测鼻咽癌患者和EB病毒携带者外周血中EBNA1的亚型，进行统计学分析，根据EBNA1亚型与鼻咽癌的相关性，可为鼻咽癌的临床早期诊断找到新的生物标记物。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
病例选择及试验方法：
我们的随机外周血样品包括144份携带有EB病毒的健康成人外周血样品和36例鼻咽癌患者外周血标本。所有病例和对照个体均为广东地区居民操白话方言者。144例健康人中男性79例，女性65例，平均年龄为41.62岁(年龄范围20～82岁)。36例鼻咽癌患者均经CT和病理确诊，其中男性26例，女性10例，平均年龄为48.4岁(年龄范围29～74岁)。其中临床分期为I期者1例，II期6例，III期12例，IV期17例。病理诊断为未分化型非角化鳞状细胞癌者32例，分化型非角化鳞状细胞癌者4例。
用2ml EDTA采血管进行采血，通过淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞。采用QIAamp DNA mini blood kit(购自德国QIAGEN公司)抽提外周血细胞DNA，操作方法按试剂盒说明书进行。为鉴定EBNA1基因的亚型，在其C末端第487位氨基酸两端设计一对引物，正义引物为5′-cgggagcgatagagcagggc-3′(109，241-109，260nt)，反义引物为5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′(109，549-109，569nt)。PCR产物长329bp，在ABI PRISM 377DNA测序仪上进行测序。
EBNA1检测试剂盒组成：
1、PCR试剂：包括PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，均购自大连宝生物工程有限公司。
EBNA 1引物：5′-cgggagcgatagagcagggc-3′，
5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′。
2、阳性对照为B95-8细胞DNA(含有原型EBNA1基因)，阴性对照为BJAB细胞DNA(不含EB病毒基因组)。
检测方法：
1、全血的分离：从患者体内抽取EDTA抗凝血2ml，用淋巴细胞分离液进行分离，在水平离心机离心3000rpm，30分钟，4℃，吸取单个核细胞层，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗一次，再加入200μl PBS，混匀，获得外周血单个核细胞悬浮液，使用前可置于-20℃保存。
2、抽提DNA：细胞悬液解冻后，用QIAamp DNA mini blood kit抽提DNA，操作方法按试剂盒说明书进行：先加入1/10体积的蛋白酶K溶液，充分混匀后再加入等体积的消化缓冲液，在56℃恒温水浴箱中孵育2小时；95℃，15分钟，灭活蛋白酶K；加入等体积的无水乙醇，把混合溶液加入QIAamp DNA分离柱中，室温下离心14000rpm，1分钟；换新的离心管，加入AW1溶液500ul，室温下离心8000rpm，1分钟；换新的离心管，加入AW2溶液500ul，室温下离心14000rpm，3分钟；换新的离心管，室温下离心14000rpm，1分钟；换新的离心管，加入灭菌纯水50ul，室温下放置10分钟；室温下离心8000rpm，1分钟，得到DNA溶液；在紫外分光光度计上测光密度。抽提好的DNA使用前可置于-20℃保存。
3、PCR反应：在PCR管中加入PCR buffer(10×)2.5μl，dNTP(2.5mM)2ul，EBNA1引物(50μM)各0.5μl，Taq polymerase(5U/μl)0.3μl，模板DNA0.5μg，加灭菌纯水使总反应体积达25μl，置于PCR自动反应仪(PE9700)中。反应循环参数设置：94℃，1分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，30秒；循环30次；72℃，10分钟。
4、对照：每批PCR反应用0.2ng B95-8细胞作阳性对照，用0.2ng BJAB细胞作阴性对照。
5、电泳：使用Bio-Rad水平电泳仪。配制1％的琼脂糖凝胶(含EB)，电泳槽加入约400ml的电泳缓冲液(1×TAE)，恰好没过胶面约1mm。取10ul的DNA样品和2ul的6×上样缓冲液混匀后，加入加样孔底部。电泳结束后，取出凝胶，用紫外成像仪观察泳带。
6、测序：取5ul PCR产物在PE377测序仪上进行单向测序，检测EBNA1基因第487位密码子的突变情况。
7、数据统计：检验两样本率之间的差异使用卡方检验。P＜0.05被认为具有统计学意义。
本发明的优选实施例的实验结果显示，从所有健康人外周血和鼻咽癌患者外周血标本中均可检测到EBNA1基因。表1为广东地区健康成人和鼻咽癌患者外周血细胞及鼻咽癌组织中EBNA1亚型的检测情况。从健康人外周血细胞中可以检测到V-val、V-thr和P-ala三种亚型。V-val是健康人外周血中最常见的亚型，在几乎所有个体中均可检出，但大部分同时伴有其它亚型的混合感染。健康人中EBNA1亚型的分布与年龄和性别没有明显关系。在健康人外周血中最常见的感染形式是V-val和V-thr亚型的双重感染(占60.42％)，其次是单一的V-val亚型感染(占21.53％)。这与其它地区的健康人感染情况不同，有报道在来自非洲和欧美的健康人外周血中只检测到P-thr、P-ala、V-leu和V-pro亚型，未检测到V-val亚型。提示EBNA1基因变异的分布存在地理和种族差异，而V-val亚型的流行可能与广东地区鼻咽癌的高发有一定联系。
表1
在36例鼻咽癌患者外周血中，可以检测到V-val、V-thr和P-ala三种亚型。单一的V-val亚型最常见，占69.44％(25/36)。单一的V-val亚型的检出率在鼻咽癌患者和健康携带者之间有显著性差异(x2＝28.66，P＜0.05)。36例鼻咽癌患者中，只有1例是V-val和P-ala亚型的混合感染，其余35例均为单一亚型的感染。
与健康人相比，鼻咽癌患者外周血细胞中单一亚型的感染率明显较高(97.22％vs 22.92％，x2＝64.52，P＜0.05)。提示外周血中单一亚型的EBNA1基因的检出对鼻咽癌的诊断有一定的临床意义。这可能是由于在鼻咽癌患者发病前期，由于体内原来处于潜伏状态的EB病毒被激活，而激活的EB病毒可能诱导宿主外周血中携带单一EBV亚株的B淋巴细胞单克隆增生，导致发病前多种亚型的混合感染变为单一亚型的感染。
我们以前的研究发现，V-val亚型的EBNA1基因与P-ala原型EBNA1相比，克隆形成能力增强，说明V-val EBNA1有助于细胞的存活和生长。V-val EBNA1与原型相比，转录激活的能力也增强，可能会上调一些肿瘤相关基因的表达，从而起到促进肿瘤发生的作用。因此，V-val EBNA1可能是具有较强致癌能力的EBV亚型。以外周血中的V-val型EBNA1基因作为指标来筛查鼻咽癌发病的高危人群，并定期对这些高危人群进行检测，达到对鼻咽癌的早发现、早诊断和早治疗，最终达到提高疗效和改善预后的目的。
在本发明中，如果把外周血细胞中单一的EB病毒EBNA1亚型的PCR检出率作为鼻咽癌的诊断指标，其敏感性(97.22％，35/36)和特异性(77.08％，111/144)均较高，对于鼻咽癌的诊断具有一定的临床意义。与传统的血清学指标IgA/VCA(敏感度和特异度分别为80.30％和89.66％)相比，特异度有所不足，但敏感性有所提高。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
<120>一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<222>(1)...(20)
<400>1
cgggagcgat agagcagggc 20
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<222>(1)...(21)
<400>1
ggggagacga ctcaatggtg t 21
Claims (7)
1、一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒，其特征在于，包括鼻咽癌相关基因EBNA1扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液。
2、根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述EBNA1扩增用基因特异性引物如下：
5′-cgggagcgatagagcagggc-3′，
5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′。
3、根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照为B95-8细胞DNA。
4、根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照，所述阴性对照为BJAB细胞DNA。
5、一种鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测方法，其特征在于，将待检模板DNA通过EBNA1扩增用基因特异性引物进行PCR扩增。
6、根据权利要求5所述的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测方法，其特征在于，所述EBNA1扩增用基因特异性引物如下：
5′-cgggagcgatagagcagggc-3′，
5′-ggggagacgactcaatggtgt-3′。
7、权利要求1所述的鼻咽癌相关基因EBNA1的早期检测试剂盒在早期诊断鼻咽癌中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100407962A CN101597646A (zh) | 2009-07-03 | 2009-07-03 | 一种鼻咽癌相关基因ebna1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100407962A CN101597646A (zh) | 2009-07-03 | 2009-07-03 | 一种鼻咽癌相关基因ebna1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Publications (1)
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| CN101597646A true CN101597646A (zh) | 2009-12-09 |
Family
ID=41419241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2009100407962A Pending CN101597646A (zh) | 2009-07-03 | 2009-07-03 | 一种鼻咽癌相关基因ebna1的早期检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101597646A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543396A (zh) * | 2016-02-24 | 2016-05-04 | 胡斌 | 鼻咽癌游离ebv-dna荧光pcr检测试剂盒及其使用方法 |
| CN110819714A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-02-21 | 南方医科大学深圳医院 | 一种抑癌基因及其应用 |
| WO2024022466A1 (en) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Function-enhanced engineered ebna1 for protein expression in mammalian cells |
-
2009
- 2009-07-03 CN CNA2009100407962A patent/CN101597646A/zh active Pending
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
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| WO2024022466A1 (en) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Function-enhanced engineered ebna1 for protein expression in mammalian cells |
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20091209 |