RU2815686C1 - Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках - Google Patents
Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815686C1 RU2815686C1 RU2023122864A RU2023122864A RU2815686C1 RU 2815686 C1 RU2815686 C1 RU 2815686C1 RU 2023122864 A RU2023122864 A RU 2023122864A RU 2023122864 A RU2023122864 A RU 2023122864A RU 2815686 C1 RU2815686 C1 RU 2815686C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fluorescence intensity
- hyaluronic acid
- dna
- breaks
- fluorescein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 title abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 27
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 229920002749 Bacterial cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 239000005016 bacterial cellulose Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 231100001074 DNA strand break Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 108010025899 gelatin film Proteins 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012897 dilution medium Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 241000032681 Gluconacetobacter Species 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках. Осуществляют разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином. Полученные результаты сравнивают с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%. Сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля. При интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля выявляют, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными. Способ обеспечивает повышение эффективности обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов за счёт их фиксации на поверхности бактериальной целлюлозы через сродство гиалуроновой кислоты к рецепторам мужских половых клеток. 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины для выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) половых клеток мужчин и может быть использовано для обнаружения сперматозоидов, имеющих повреждения в ДНК, у мужчин, перенесших Covid-19.
Мужское бесплодие – это глобальная проблема человечества. Перспективным решением данной проблемы в урологии является исследование жизнеспособности мужских половых клеток и выявление фрагментации геномной ДНК за счёт меченных олигонуклеотидов.
На мировом рынке представлено много различных тестов и методик для определения разрывов в ДНК сперматозоидов.
На мировом рынке представлено много различных тестов и методик для определения разрывов в ДНК сперматозоидов.
Известен TUNEL-тест, сущность которого заключается в том, что при добавлении специального реактива находятся сперматозоиды с поврежденной ДНК и окрашиваются. Отличительной чертой позднего апоптоза является обширная фрагментация геномной ДНК, которая создает множество двунитевых разрывов ДНК (DSBs) с доступной 3'-гидроксил (3'-OH) группой. TUNEL анализ идентифицирует апоптозные клетки с помощью терминальной деоксинуклеотидил трансфераза (TdT)-опосредованного добавления меченых (X) деоксиуридин трифосфат нуклеотидов (X-dUTP) к 3’-OH концу разрыва ДНК цепи, что затем визуализируется способом, соответствующим внедренной метке, таким образом служа показателем процентного соотношения апоптозных клеток в анализируемой клеточной популяции. Чувствительность анализа зависит от эффективности внедрения модицицированных dUTP, что определяется размером прикрепленной метки (Kyrylkova, K. Detection of apoptosis by TUNEL assay / K. Kyrylkova, S. Kyryachenko. – Текст : электронный // Methods Mol Biol : электронный журнал. – URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22566045/. – Дата публикации: 2012).
Недостатками TUNEL-теста являются дороговизна данного метода оценки фрагментации ДНК, а также не достаточно стандартизированные пороговые значения. Также данный метод Tunel Assay является неспецифичным, так как используется для оценки других повреждений в организме.
Известен другой тест, который также представлен на рынке – HALOSPERM тест (Halotech, Испания). Он основан на обнаружении разрывов ДНК по дисперсии хроматина вокруг ядра клетки после гидролиза. Сперматозоиды обрабатывают раствором кислоты, затем после инкубации клетки прокрашивают и просматривают в световом микроскопе. Сперматозоиды, которые содержат целую ДНК, образуют ореол дисперсии («halo-эффект»). Сперматозоиды с фрагментированной ДНК образуют минимальный ореол или не образуют его вообще. Метод прост в использовании (Феськов, А.М. Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин с повышенным содержанием незрелых спермиев в эякуляте / А.М. Феськов. – Текст : электронный // Мир медицины и биологии : электронный журнал. – URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=17947630. Дата публикации: 2012).
Недостатком данного способа является относительно низкая чувствительность и специфичность по сравнению с другими методами исследования фрагментации ДНК.
Известен способ оценки качества эякулята по содержанию сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, заключающийся в том, что на преаналитическом этапе проводят фиксацию сперматозоидов на предметных стеклах и детектируют в них гидроксиметилированную ДНК с помощью иммунофлуоресценции, затем оценивают при микроскопическом анализе флуоресценцию в не менее чем 5000 индивидуальных сперматозоидов, при этом нормой считают долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, не превышающую 0,5% от общего числа проанализированных сперматозоидов (RU 2673472, МПК G01N 33/53, опубл. 27.11.2018).
Недостатками заявленного способа являются сложность подготовки к исследованию, так как на рынке не представлено готового набора для проведения анализа, а также подсчёт клеток осуществляется лаборантом, где не исключается человеческая ошибка, что ведет к недостоверности данных.
Наиболее близким по сущности к предлагаемому решению является способ оценки генетической полноценности сперматозоидов , включающий использование пробы эякулята in vitro в среде для разбавления, в пробы эякулята in vitro в среде для разбавления добавляют гиалуроновую кислоту, меченную флуоресцеином, в концентрации 0,5-1,0 ммоль с последующей инкубацией при 37°С в течение 5-10 мин и регистрацией интенсивности флуоресценции с максимумом 495 нм, при интенсивности флуоресценции пробы выше 50-60 а.u. сперматозоиды считают зрелыми, генетически полноценными, при интенсивности флуоресценции пробы ниже 30-35 а.u. сперматозоиды считают генетически неполноценными (RU 2679312, МПК G01N 33/52, опубл. 07.02.2019). Данный способ является прототипом тест-системы.
Недостатками данного способа являются малая специфичность и эффективность, так как молекулы гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, находятся в растворе, что не позволяет зафиксировать клетки.
Таким образом, представленные способы оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах малоэффективны, обладают малой чувствительностью и специфичностью, а также некоторые являются недостоверными.
Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечении доступности используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.
Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках включает разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции регистрируется с максимумом излучения 512 нм, полученные результаты сравниваются с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином. Интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%. Сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля. При интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.
Предложенный способ обеспечивает эффективное обнаружение поврежденных сперматозоидов с фрагментированной геномной ДНК за счёт фиксации данных клеток на поверхность бактериальной целлюлозы через сродство гиалуроной кислоты к рецепторам мужских половых клеток. Это улучшает и облегчает проведение дальнейшего анализа. В данном случает используется биоразлагаемая, прочная и с высокой частотой – бактериальная целлюлоза. Одним из главных плюсов также является то, что ее можно «сшить» с любыми молекулами.
В данном способе бактериальная целлюлоза с иммобизизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой используется в качестве контроля для измерения интенсивности флуоресценции, а результаты исследования выражаются в процентах относительно контроля.
Способ осуществляется следующим образом. Для получения бактериальной целлюлозы используют штамм бактерии рода Gluconacetobacter. Культивирование и получение гель-пленки проводят известным способом в среде Шрама Хетрикс.
Бактериальную целлюлозу очищают от избытка клеток, промывая 4-5 раз 1Н NaOH с выдержкой 30 мин при 80°С и проводят нейтрализацию избытка щелочи промыванием дистиллированной водой до рН 7. Затем очищенную бактериальную целлюлозу размером 2×4 см, весом 8 мг и толщиной 20 мкм высушивают при комнатной температуре и проводят сшивание флуоресцеин гиалуроновой кислоты с бактерицидной целлюлозой.
Для этого 5 мг флуоресцеин гиалуроновой кислотой растворяют в 10 мл 1%-ного раствора NaOH. Разведенный раствор флуоресцеин гиалуроновой кислоты поместить в емкость с бактериальной целлюлозой, так чтобы раствор покрывал пленку. Раствор оставляют на 60 мин, переодически перемешивая по 5 мин. Сшивание производят с помощью сшивающего агента 20%-ным 1,4-бутандиол-диглицидиловым эфиром; для этого 3 мл раствора разводят в 1%-ном растворе NaOH в соотношении 1:5, добавляют к бактериальной целлюлозе. Раствор перемешать стерильной лопаточкой в течение 10 мин. Гель-пленку поместить на водяную баню на 3 часа при 52°С для лучшего протекания реакции сшивки. Об эффективности сшивки судят по интенсивности поглощения на FTIR-ИК спектрах в диапазоне 1075-1000 см-1, свидетельствующей об образовании эфирных связей между компонентами композиции.
После иммобилизации гель-пленку переместить в лабораторную посуду для in vitro исследований (чашка Петри культуральная, 60 мм с центральным отверстием), на поверхность которой наносится препарат спермы (в 1 – биологическая жидкость здоровых мужчин-доноров; во 2 – биологическая жидкость, полученная от мужчин, переболевших Covid-19) – 300-400 мкл. Полученные пробы оставить на 10-15 мин при 37°С для инкубации, после чего регистрируют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения с максимумом при 494 нм и максимумом излучения при 512 нм.
Контрольным образцом является бактериальная целлюлоза с иммобилизованными остатками флуоресцеин гиалуроновой кислоты, интенсивность флуоресценции которой принимается как 100%. Снижение интенсивности флуоресценции при добавлении сперматозоидов до 40% относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными; при интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля считается, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.
Было показано, что у мужчин, переболевших Covid-19, процент связавшихся клеток с флуоресцеин гиалуроновой кислотой ниже за счёт снижения интенсивности флуоресценции, что свидетельствует о том, что после перенесенной болезни половые клетки утрачивают рецептор к гиалуроновой кислоте и являются генетически неполноценными.
Исследование проводилось на сперматозоидах, полученных от мужчин-доноров. У каждого мужчины уточнялись следующие данные: переболел ли Covid-19, период болезни и степень тяжести. С полученным эякулятом проводились исследования на полноценность генетической информации (Пример 1, 2).
Пример 1.
В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента А, который официально не болел Covid-19. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента А. составила 19,33%, означающая, что сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными.
Пример 2.
В соответствии с заявленным способом была взята проба эякулята у пациента Б, который официально переболел Covid-19 в конце 2021 года. Далее семенную жидкость в количестве 300-400 мкл нанесли на поверхность бактериальной целлюлозы с иммобилизованной на ней гиалуроновой кислотой, меченной флуоресцеином в чашку Петри. Данный образец оставили на 10-15 мин для инкубации при температуре 37°С. После инкубации проводили измерение интенсивности флуоресценции при длине волны 512 нм против контроля, в качестве которого использовалась бактериальная целлюлоза с иммобилизованной флуоресцеин гиалуроновой кислотой без эякулята. Интенсивность флуоресценции пробы пациента Б. составила 50,7%, означающая, что сперматозоиды имеют большое количество разрывов ДНК и являются генетически неполноценными.
По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность обнаружения разрывов в геномной ДНК сперматозоидов и обеспечить доступность используемых компонентов за счёт природного механизма, основанного на взаимодействии специфических рецепторов с гиалуроновой кислотой, находящейся на поверхностной мембране яйцеклетки и изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеина, ковалентно связанного с гиалуроновой кислотой.
Изобретение создано за счет средств Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (соглашение № 17051ГУ/2021 от 28.10.2021).
Claims (1)
- Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках, включающий разбавление пробы эякулята мужчин in vitro в среде из гиалуроновой кислоты, меченной флуоресцеином, отличающийся тем, что интенсивность флуоресценции регистрируется с максимумом излучения 512 нм, полученные результаты сравниваются с биосовместимым материалом, состоящим из бактериальной целлюлозы, к которой присоединена гиалуроновая кислота, меченная флуоресцеином, интенсивность флуоресценции биосовместимого материала принимается как 100%, сперматозоиды имеют минимальное число разрывов ДНК и являются генетически полноценными при снижении интенсивности флуоресценции пробы эякулята в среде до 40% относительно контроля, при интенсивности флуоресценции 40% и выше относительно контроля выявляют, что сперматозоиды имеют высокий уровень разрывов цепей ДНК и являются генетически неполноценными.
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815686C1 true RU2815686C1 (ru) | 2024-03-20 |
| RU2815686C9 RU2815686C9 (ru) | 2024-04-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2679312C1 (ru) * | 2017-09-12 | 2019-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" | Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов |
| RU2730947C1 (ru) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2679312C1 (ru) * | 2017-09-12 | 2019-02-07 | Общество с ограниченной ответственностью "Генетико-селекционный исследовательский центр "Генология-МГУ" | Способ оценки генетической полноценности сперматозоидов |
| RU2730947C1 (ru) * | 2020-01-17 | 2020-08-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ХалоРУС" | Способ для определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROMAN MONTANANA C. Assessment of DNA structure and integrity in the human spermatozoon. Tesis doctoral. Birmingham, 2019, 252 p.. GONZALEZ-MARIN C. et al. Types, Causes, Detection and Repair of DNA Fragmentation in Animal and Human Sperm Cells. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 14026-14052. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9428810B2 (en) | Detection of a target in a preservative solution | |
| US8026065B2 (en) | Assessment of oocyte competence | |
| JP7306723B2 (ja) | 遺伝子のｃｐｇメチル化変化を用いた肝癌の予後または危険度を評価する方法 | |
| JP6998658B2 (ja) | アミノ酸代謝異常の検出のためのデバイス、及びデバイスを使用する方法 | |
| CN110198711A (zh) | 癌症检测方法 | |
| DK2269065T3 (en) | METHODS AND REAGENTS TO INCREASE THE SENSITIVITY OF ENZYM METALLOGRAPHIC DETECTION | |
| KR20060069862A (ko) | 자동화된 세포학적 시료 분류 | |
| CN105525029A (zh) | 反映男性精子活力的精浆piRNA标志物或其组合及应用 | |
| JP2009543089A (ja) | 細胞状態に関連したグリコシル化パターン検出の方法と試験（分析） | |
| CN110108889B (zh) | 一种用于诊断IgA肾病的试剂盒及其应用 | |
| US20200166528A1 (en) | Methods for Improving Assays of Biological Samples | |
| RU2815686C1 (ru) | Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках | |
| RU2815686C9 (ru) | Способ выявления одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК в мужских половых клетках | |
| CN115948544B (zh) | Cited4和/或metrn在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用 | |
| Ansah et al. | Ultrasensitive electrochemical genosensors for species-specific diagnosis of malaria | |
| WO2019113827A1 (en) | Sandwich and species-specific nucleic acid aptamers against plasmodium lactate dehydrogenase for malaria diagnosis | |
| KR20180081445A (ko) | 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법 | |
| CN107779503A (zh) | 阿尔茨海默相关的差异表达基因及其应用 | |
| Guo et al. | Identification and validation of metabolism-related genes signature and immune infiltration landscape of rheumatoid arthritis based on machine learning | |
| CN113278616B (zh) | 可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme及试剂盒 | |
| WO2009096429A1 (ja) | ヌクレオチドの抽出方法 | |
| WO2017029450A1 (fr) | Méthode individuelle prédictive des effets génotoxiques d'agents chimiques ou biochimiques, cassant l'adn | |
| CN115287336A (zh) | 一种检测人淋巴细胞eb病毒感染和免疫检查点表达水平的方法 | |
| CN101586165A (zh) | 检测OTOF基因2975-2978delAG突变的试剂盒 | |
| EP3882361A1 (en) | Lateral flow assay for detecting the presence of coronavirus in a biological sample |