CN113278616B - 可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme及试剂盒 - Google Patents

可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，其序列如SEQ ID No：1所示，以及利用该DNAzyme构建的荧光分子探针体系和试剂盒。本发明通过使用特异性识别刚地弓形虫分泌蛋白ROP的具有RNA酶功能的DNAzyme作为荧光分子探针，可在几分钟之内快速检测出刚地弓形虫。在反应过程中，通过荧光分光光度计的不同荧光通道检测并区分出不同的荧光信号，从而鉴定出不同的病原体。

Description

可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme及试 剂盒
技术领域
本发明属于大分子检测技术领域，更具体的涉及一种可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，及其制成的试剂盒和胶体金试纸。
背景技术
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生，机会致病原虫，引起人和动物共患的弓形虫病(toxoplasmosis)。弓形虫可侵犯人体任何器官，其好发部位为脑、眼、淋巴结、心、肺、肝和肌肉，可引起各种疾病，尤其在宿主免疫功能低下时，可致严重后果。WHO数据显示弓形虫的感染呈世界性分布，全球成人感染率从10％到90％不等。弓形虫感染通常是无症状的，据估计，全世界30％的人口遭受刚地弓形虫慢性感染。尽管大多数人在感染后没有表现出明显的症状，但是对那些免疫系统受到抑制的人们(如接受癌症治疗的病人，或者HIV感染者)而言，这种感染可以是威胁生命的。孕妇也能够将感染传播给未出生的孩子，从而让这些婴儿处于患有严重神经疾病的风险之中。除了可导致免疫功能低下的人患上危及生命的疾病之外，它也可导致免疫功能正常的人出现复发性眼部病变。
弓形虫可以引起人和各种动物的传染，传播途径分为先天性和获得性。先天性感染指孕妇通过胎盘传播使胎儿感染。获得性感染传播途径以饮食(生或未熟的肉、乳、蛋等)、水源污染和密切接触动物(猫、猪、犬、兔等)为主。输血或器官移植并发弓形虫病也有报告，经损伤的皮肤黏膜或唾液飞沫传播也有报道。
弓形虫在我国传播广泛，我国阳性感染率为5～20％，部分地区高达30％以上，农村高于城市，成人高于儿童。因此，我国医院已在开展对孕妇普遍进行弓形虫抗体检查。孕期体检中有一项TORCH检查，TORCH中字母T就代表弓形虫。但检查的质量不高，试剂质量和筛检方法有待标准化，许多临床医生对血清学检查结果的意义和正确判断也不熟悉。检验质量不高造成的假阳性结果和医生解释错误，不仅浪费病家钱财，而且引起病人和家属无谓的焦虑不安，带来很大精神负担，甚至做了不该做的人工流产，造成难以弥补的损失。
弓形虫不仅宿主很多，而且人和人之间也可以互相传染，大多数人都是弓形虫带虫者，形成带虫免疫。患弓形虫病人的尿液，唾液、眼泪、鼻涕、带有弓形虫包囊。急性发作的病人的喷嚏，可以成为飞沫传染源。人吃感染动物的肉，是传染的主要原因。弓形虫可以污染草原、牧场、土壤、水，在外界环境的生存时间可以很长，在潮湿土壤里可活数月乃至数年。随着社会的发展，养宠物的人越来越多，人和动物的关系越来越密切，弓形虫也成为最重要的人畜共患病原体之一，威胁着人类的健康。面对严重威胁人类安全与发展的人畜共患病，相对于个人的自我防护，更为重要的是对各种人畜共患病进行控制，做到早发现、早报告、早处理，严格防止某些疾病的暴发和传播。及时的检测就尤为重要。
目前，弓形虫病的实验室诊断包括病原学检查、免疫学诊断和分子生物学检测。病原学检查主要包括组织学诊断、动物接种分离法和细胞培养法。常用的血清学诊断方法有染料试验、间接血凝试验、间接免疫荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验。分子诊断包括PCR技术及核酸杂交技术等。但这些方法基本局限在实验室检测层面。
因此，开发一种弓形虫的快速、准确的检测方法对弓形虫的筛查和现场检测具有巨大的社会意义，可以实现随时随地的检测，对弓形虫的防治意义重大。
近年来，基于核酸适配体的检测技术发展迅速。作为通过SELEX体外筛选技术人工筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类只有几十个核苷酸长的单链核酸分子(一般20～100nt)，核酸适配体不但和抗体一样能与靶标分子特异性结合，而且还有许多抗体无法比拟的优点，比如可任意人工合成、成本低、稳定性强、易修饰等。
DNAzyme则是一类具有催化作用的单链核酸分子(催化性DNA)。目前尚无天然形成的催化性DNA，也需经体外筛选(IVS)这一过程从随机序列DNA库中分离出。最早发现的DNAzyme是由Breaker和Joyce通过利用金属离子设计的一种体外筛选技术得到，该DNAzyme在铅离子存在下催化酯交换反应，表明单链DNA确实可以具有类似核酶和蛋白质酶的功能。通过一些IVS研究已经得到许多具有RNA剪切功能的催化性DNA(RNase DNAzymes),可以催化RNA底物中磷酸二酯连接的转酯反应，导致RNA底物的剪切。它是将单个RNA嵌入到DNA的序列当中形成，这类DNAzyme通常由底物链和酶链组成，底物链修饰有单个RNA(rA)的连接点并且作为切割位点，酶链则是包含催化核心部分及两臂。在含有催化反应的辅因子时，酶链催化切割底物链，使其断裂为两部分。由于DNAzyme对底物链表现出很高的特异性、高敏感性和高选择性识别，其已应用于金属离子检测、生物传感、医药研究及纳米材料研究等领域。具有RNA酶功能的催化性DNA及其底物可被一对荧光供体和受体基团(或荧光基团及淬灭剂)修饰以形成一个荧光信号系统(一个信号催化性DNA)，从而可以通过荧光信号的生成来判断催化性DNA对RNA剪切的活性。具有信号功能的催化性DNA可以进一步与核酸适配体偶联(可与目标分子结合的核酸序列)，得到荧光催化性核酸适配体酶，通过适配体与靶点的相互作用可以对RNA剪切和催化性DNA酶活性的荧光信号进行别构调节。荧光探针核酸适配体酶可被开发作为生物传感应用中的有用的工具。除荧光信号外，DNAzyme也能与卟啉类等结合具有过氧化物酶活性使信号底物产生颜色等多种信号而被用作核酸检测技术的信号报告分子。当DNAzyme作为探针时，与互补基因进行配对，在外切酶活性的作用下从而释放出DNAzyme探针信号序列，通过该序列发挥其活性产生多种可读的检测信号，从而报告检测结果。
发明内容
1、发明目的。
本发明提出了一种用于特异性识别刚地弓形虫的RNA切割DNAzyme，以及利用该DNAzyme构建一个荧光分子探针体系。
2、本发明所采用的技术方案。
一种可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，其特征在于其序列如SEQ ID No：1所示，具体为：TG1:5-GCAGTACGTAAGATATCGCTGGAAGTATGCGTTGTAGCTTAGTTCTTAACCGGATGCGCATTGTAGGCTCATTAAAGTTACGAGCTAGACGGCCGCATGGTTAGCTACACAGGTATAGARGGTTCGATCAAGA-3’，其中R为一个任意的核糖核苷酸。
优选的，所述序列具有荧光基团修饰，其序列为：TG1-RFD:5-GCAGTACGTAAGATATCGCTGGAAGTATGCGTTGTAGCTTAGTTCTTAACCGGATGCGCATTGTAGGCTCATTAAAGTTACGAGCTAGACGGCCGCATGGTTAGCTACACAGGTATAGAFRQGGTTCGATCAAGA-3’，其中F是荧光基团标记的dT，Q是DABCYL标记的dT。
优选的，所述荧光基团从FITC、VIC、NED、ROX、texas Red或FAM中选择。
本发明还公开了一种可特异性识别刚地弓形虫的试剂盒，其特征在于含有上述的可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme。
3、本发明所产生的技术效果。
DNAzyme和核酸适配体一样，不但具有抗体的和靶分子特异性结合，而且由于其是核酸分子，和抗体相比更有优势，比如靶分子广泛、稳定性强、易于人工合成、可进行各种修饰和标记、体外筛选不依赖于细胞、容易分离纯化鉴定等。本发明通过使用特异性识别刚地弓形虫分泌蛋白ROP的具有RNA酶功能的DNAzyme作为荧光分子探针，可在几分钟之内快速检测出刚地弓形虫。在反应过程中，通过荧光分光光度计的不同荧光通道检测并区分出不同的荧光信号，从而鉴定出不同的病原体。本发明检测分析的整个过程均在单管的条件下进行，实验的整个过程只需在加入样品时打开反应管一次，可防止外界污染。在每个反应中，可实现反应的实时动态检测和结果的自动分析。采用胶体金试纸条技术，通过观察条带显色情况，可实现快速检测和定性分析；结合胶体金试纸条阅读仪，可进行半定量分析和数据上传云平台。
附图说明
图1为实施例1中DNAzyme荧光分子探针(RFD)原理图。
图2为实施例1中DNAzyme荧光分子探针特异性检测图。
图3为实施例1中DNAzyme的特异性RNA切割活性图。
图4为实施例1中DNAzyme的检测灵敏度分析示意图。
图5为实施例3中DNAzyme胶体金试纸检测图。
具体实施方式
实施例1
合成TG1-RFD:5-GCAGTACGTAAGATATCGCTGGAAGTATGCGTTGTAGCTTAGTTCTTAACCGGATGCGCATTGTAGGCTCATTAAAGTTACGAGCTAGACGGCCGCATGGTTAGCTACACAGGTATAGAFRQGGTTCGATCAAGA-3’序列，其中F是荧光基团FAM标记的dT，R是腺嘌呤核糖核苷酸，Q是DABCYL标记的dT。当体系中存在靶分子时，FFD与靶分子结合激活RNA酶切功能，从而释放出猝灭基团，让荧光基团荧光信号恢复。
在含有100nM DNAzyme的反应液(筛选缓冲液：100mM HEPES pH 7.5,400mM NaCl,10mM MgCl2,0.02％Tween 20)中加入弓形虫分泌蛋白ROP，以未加入弓形虫分泌蛋白ROP的含有DNAzyme的同浓度筛选缓冲液为对照，混合室温孵育5分钟左右；
如图2所示，在含有DNAzyme的反应液中加入弓形虫分泌蛋白ROP时，5分钟之内荧光信号开始大幅增强，随着孵育时间的推移，荧光信号迅速达到最强。而在其他不含弓形虫分泌蛋白ROP的情况下，则荧光信号几乎没有变化。
将DNAzyme酶切反应物通过电泳分析，结果如图3所示。随着反应时间的延长，DNAzyme序列被不断切割直至几乎完全切割。
图4设计了一种确定DNAzyme切割效果的示意图。当切割反应完成后，被切割下来的部分序列通过RCA(滚环扩增)，可以定量分析该段核酸序列的量，从而反映DNAzyme的切割效果。尤其是发生痕量RNA切割的时候，通过RCA反应，可实现高灵敏度检测。
实施例2
合成TG1-RFD:5-GCAGTACGTAAGATATCGCTGGAAGTATGCGTTGTAGCTTAGTTCTTAACCGGATGCGCATTGTAGGCTCATTAAAGTTACGAGCTAGACGGCCGCATGGTTAGCTACACAGGTATAGAFRQGGTTCGATCAAGA-3’序列，其中F是荧光基团FITC标记的dT，R是脲嘧啶核糖核苷酸，Q是DABCYL标记的dT。当体系中存在靶分子时，FFD与靶分子结合激活RNA酶切功能，从而释放出猝灭基团，让荧光基团荧光信号恢复。
采用该荧光探针检测刚地弓形虫的方法，其步骤包括：
(1)将弓形虫感染的白血病粒细胞THP-1和正常未感染的THP-1细胞，分别与含有100nM DNAzyme的反应液(筛选缓冲液：100mM HEPES pH 7.5,400mM NaCl,10mM MgCl2,0.02％Tween 20)混合室温孵育5分钟左右；
(2)用荧光分光光度计分析上述反应液或者手持式紫外分析仪对上述反应液进行照射，观察荧光信号，与阴性对照进行比较，如有明显荧光增强，则表示对应的病原体呈阳性。荧光信号的强度可进行定量分析。
实施例3
(1)合成SEQ ID No：1所示的序列，将弓形虫感染的白血病粒细胞THP-1和正常未感染的THP-1细胞，分别与含有100nM DNAzyme的反应液(筛选缓冲液：100mM HEPES pH7.5,400mM NaCl,10mM MgCl2,0.02％Tween 20)混合室温孵育5分钟左右；
(2)将上述反应液滴加到含有刚地弓形虫识别的DNAzyme的胶体金试纸条(TG101，温州优智医疗科技有限公司)上，观察显色条带，如果在T带出现显色，则表示对应检测结果为阳性，如图5所示。结合胶体金试纸条阅读仪，可进行半定量分析和数据上传。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 温州医科大学
浙江原创医疗科技有限公司
<120> 可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme及试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 134
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagtacgta agatatcgct ggaagtatgc gttgtagctt agttcttaac cggatgcgca 60
ttgtaggctc attaaagtta cgagctagac ggccgcatgg ttagctacac aggtatagar 120
rggttcgatc aaga 134

Claims (4)

1.一种可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，其特征在于其序列如下所示：
TG1:5-GCAGTACGTAAGATATCGCTGGAAGTATGCGTTGTAGCTTAGTTCTTAACCGGATGCGCATTGTAGGCTCATTAAAGTTACGAGCTAGACGGCCGCATGGTTAGCTACACAGGTATAGARGGTTCGATCAAGA-3’，其中R为一个任意核糖核苷酸。
2.根据权利要求1所述的可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，其特征在于：所述序列具有荧光基团修饰，具体为：
TG1-RFD:5-GCAGTACGTAAGATATCGCTGGAAGTATGCGTTGTAGCTTAGTTCTTAACCGGATGCGCATTGTAGGCTCATTAAAGTTACGAGCTAGACGGCCGCATGGTTAGCTACACAGGTATAGAFRQGGTTCGATCAAGA-3’，其中F是荧光基团标记的dT，Q是DABCYL标记的dT。
3.根据权利要求2所述的可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme，其特征在于：所述荧光基团从FITC、VIC、NED、ROX、texas Red或FAM中选择。
4.一种可特异性识别刚地弓形虫的试剂盒，其特征在于含有权利要求1-3中任一项所述的可特异性识别刚地弓形虫具有RNA切割功能的DNAzyme。
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Inventor after: Wu Shiyi

Inventor after: Ye Sheng

Inventor after: Zhou Fangyan

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Inventor after: Huang Weijie

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