CN112159853A

CN112159853A - 一种基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法

Info

Publication number: CN112159853A
Application number: CN202010913804.6A
Authority: CN
Inventors: 韩鹤友; 舒明波; 王文乾; 王文静
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2021-01-01

Abstract

本发明公开了一种基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法，涉及细菌检测领域，该方法包括：选择待检测靶标并将其与DNA walker探针作用，绘制标准曲线，DNA walker探针包括纳米颗粒，纳米颗粒上修饰有特异性酶链DNAzyme和若干带有FAM荧光基团的底物链，待检测靶标与特异性酶链DNAzyme作用，特异性酶链DNAzyme能够切割底物链上的FAM荧光基团，体系产生荧光；从待测样品中提取总DNA，并进行aPCR扩增，将扩增产物和DNA walker探针混合反应0.5～2h后；将检测结果与标准曲线进行比对。本发明在高通量检测中的成本较低，并且涉及到信号的二次转换，因此准确度较高。

Description

一种基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法

技术领域

本发明涉及细菌检测领域，具体涉及一种基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法。

背景技术

黄龙病(HLB)是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起，该细菌会侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物，而柑橘是我国种植规模较大的水果之一，在农业经济中占有重要的地位，柑橘一旦感染黄龙病，不仅会影响果实产量和质量，严重时甚至会造成柑橘植株大面积死亡，进而造成柑橘产量和品质的下降，损失巨大，是制约柑橘产业发展和农民增收的重要因素。

由于黄龙病的传染性较强，果园中一旦出现柑橘感染时，要及时将被感染的植株连根挖除，因此，及时准确的发现病株能够有效减少生产损失。

生物的检测最终是遗传物质的检测(主要是DNA，少数是RNA 和蛋白质)，目前对黄龙菌DNA的检测主要是PCR类(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术和环介导等温扩增技术(LAMP 技术)。

PCR类技术包括常规PCR、实时定量PCR和巢式PCR，但是，由于PCR类技术的本质是“长度识别”，且具有假阳性风险，检测结果的可靠性较低；同时，在使用PCR进行检测时，为了提高结果的可靠性，通常要结合Sanger测序(第一代测序技术，核酸检测的“金标准”)来进行“序列识别”，这种模式虽然准确性较高，但是应用于大量样品的高通量检测，将会带来昂贵的检测费用(一个Sanger测序反应一般20到40元，1000个反应是2万～4万)。另外，环介导等温扩增技术涉及4条引物，主要解决了巢式PCR的变温问题和检测时长问题，但是其假阳性较高，且仍然没有解决上述“序列识别” 问题。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于 aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，检测准确度较高且成本较低。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法，包括以下步骤：选择待检测靶标并将其与DNA walker探针作用，绘制标准曲线，所有黄龙菌中均存在所述待检测靶标，所述DNA walker探针包括纳米颗粒，所述纳米颗粒上修饰有特异性酶链DNAzyme和若干带有FAM荧光基团的底物链，所述特异性酶链DNAzyme被封闭链所封闭，所述待检测靶标与特异性酶链DNAzyme作用，使封闭链脱落，所述特异性酶链DNAzyme能够切割底物链上的FAM荧光基团，体系产生荧光，且荧光强度与待检测靶标所对应的aPCR模板浓度的对数呈线性关系；

从待测样品中提取总DNA并进行aPCR扩增，将扩增产物和 DNA walker探针混合反应0.5～2h后；将检测结果与标准曲线进行比对，判断是否符合标准曲线，若是，则表明待测样品中含有黄龙菌。

进一步的，所述纳米颗粒为金纳米颗粒，银纳米颗粒或者量子点。

进一步的，所述纳米颗粒为金纳米颗粒，所述金纳米颗粒的粒径为10～20nm。

进一步的，所述待检测靶标为单链DNA，且所述待检测靶标含有核心检测靶标T0，所述核心检测靶标T0的核苷酸序列为： ATGAGCCTGCGTTGGATTAGCT。

进一步的，所述封闭链的核苷酸序列为： AAGAGAAGCTAATCCAACGCAGGCTCAT；

所述特异性酶链DNAzyme的核苷酸序列为： TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTT GGATTAGCTTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT；所述底物链的核苷酸序列为：TTTTTTTTTTTTTTCACTAT/rA/GGAAGAGAT。

进一步的，所述待检测靶标包括T1、T2、T3、T4、T5；

所述T1的序列为：

ATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCC TACCA；

所述T2的序列为：

GGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAAA GATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTG GTAGGGTAAGAGCCTACCA；

所述T3的序列为：

TGGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAA AGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTT GGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTG AGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAG；

所述T4的序列为：

AGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTA GTTGGTAGGGTAAGAGC；

所述T5的序列为：

ATACGCCCTATTGGGGGAAAGATTTTATTGGAGAGAGATGA GCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAG GCTACGA。

进一步的，所述待检测靶标为T2。

进一步的，所述aPCR扩增中，正/反引物比例为100:1，退火温度为56℃。

进一步的，所述DNA walker的制备方法包括以下步骤：

将0.92μL浓度为100mM的酶链溶液、2.76μL浓度为100μM 的封闭链溶液、0.9μL的浓度为100mM的PBS混合均匀，加热至 90℃后保温5min，将溶液冷却至室温后，加入1.2μL在醋酸盐缓冲液中活化、浓度为10mM的TCEP溶液，混合均匀后得到溶液A；

将9.2μL浓度为100μM的底物链溶液和1.2μL浓度为100 mM的TCEP溶液混合均匀，得到溶液B，将溶液A、溶液B置于室温下孵育1h后混合均匀并缓慢添加到200μL浓度为4.6nM的金纳米颗粒预冷溶液中，得到混合液；

将混合液放入温度为4℃的条件下冷藏16h后离心纯化得到 DNA walker。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明中基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法，选用黄龙菌特征基因16SrDNA通过aPCR扩增出的单链DNA片段作为待检测靶标，当特异性酶链DNAzyme与待检测靶标作用时，封闭链脱落，被封闭链所封闭的特异性酶链DNAzyme恢复活性。

本发明选用带有黄龙菌16SrDNA序列最保守的片段的序列作为检测靶标，所以黄龙菌中均含有该检测靶标，将待检测靶标进行aPCR 扩增快速得到大量待检测靶标，操作较简单，成本较低，aPCR扩增相当于对待检测靶标进行扩增放大。

同时，使用RNA切割型DNAzyme与纳米颗粒结合形成DNA walker来进行二次信号转换：使用纳米颗粒作为载体，将一段特异性酶链DNAzyme和若干带有FAM荧光基团的底物链修饰在纳米颗粒上，形成DNA walker，带有FAM荧光基团的底物链修饰在纳米颗粒上时，FAM荧光基团由于靠近纳米颗粒时会发生荧光共振能量转移 (FRET)，从而使得FAM荧光基团的荧光猝灭。

向DNA walker中加入由aPCR扩增出的待检测靶标之后，待检测靶标与封闭链发生竞争反应导致封闭链脱落，特异性酶链 DNAzyme被激活并将带有FAM荧光基团的底物链切断，FAM荧光基团游离到远离纳米颗粒之处，荧光获得恢复，在待检测靶标的浓度不相同的情况下，荧光强度不相同，且呈良好的线性关系，因此，可以通过检测反应体系中的荧光强度确定黄龙病病菌的存在并对其进行定量，以判断病情的严重程度。

由于特异性酶链DNAzyme与待检测靶标之间为特异性作用，因此，不会出现假阳性的情况，准确度较高，同时，制备DNA walker 和进行aPCR扩增的成本均较低，能够有效降低检测成本。

(2)本发明中基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法，选用长度为104bp，带有最保守的片段的单链T2作为待检测靶标，本身具有较高的荧光强度，T2与DNA walker探针作用后，其浓度与荧光强度呈较好的线性关系，对T2的荧光曲线进行线性拟合，线性方程为y＝6.09x+23.92，R²＝0.9923，得到T2所对应aPCR模板质粒的检测限LOD为0.045pg/μL，灵敏度较高。

(3)本发明中基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法，从待测样品中提取总DNA并进行aPCR扩增，将扩增产物和DNA walker探针加入反应溶液中反应0.5～2h后，将检测结果与标准曲线进行比对，判断是否符合标准曲线，若是，则表明待测样品中含有黄龙菌并计算出相应的质粒浓度，检测方法较简单，操作难度较低，成本较低。

附图说明

图1为本发明实施例中用于检测黄龙菌的探针的检测流程图；

图2为本发明实施例中制备待检测DNA片段的流程图；

图3为本发明实施例中aPCR扩增靶标T1～T5的示意图；

图4为本发明实施例中不同退火温度相对应的电泳图；

图5为本发明实施例中不同浓度的T1～T5经过aPCR扩增后的电泳图；

图6为本发明实施例中DNA walker探针的表针图；

图7为本发明实施例中PAGE法和荧光法验证保守序列竞争封闭链的验证结果图；

图8为本发明实施例中T1～T5在不同引物比例下扩增产物的电泳图；

图9为本发明实施例中DNA walker探针分别与T1～T5在不同的正/反引物比例下扩增产物作用后的荧光图谱；

图10为本发明实施例中不同浓度T2扩增产物的荧光图谱；

图11为本发明实施例中不同浓度的T2进行扩增后与DNA walker探针作用的荧光图及该图的拟合曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作进一步详细说明。

参见图1所示，本发明实施例提供一种基于aPCR和DNA walker 的黄龙菌检测方法，本发明选用黄龙菌相关基因通过aPCR (asymmetric PCR，不对称扩增)扩增出的单链DNA片段作为待检测靶标，耦合DNA Walker检测系统，可以在短时间内对大量样品进行检测，高通量检测的成本较低，检测周期较短(Sanger测序时间一般8h，包括样品处理，双脱氧扩增，上机检测等，而本技术在3小时以内就可以完成，将时间缩短了63％)；同时，使用DNAzyme (Deoxyribozyme，脱氧核酶，以下称为特异性酶链DNAzyme或酶链)进行配合，特异性酶链DNAzyme的活性区域被封闭链所封闭，当特异性酶链DNAzyme与待检测单链作用时，封闭链脱落，特异性酶链DNAzyme恢复活性。

本发明选用带有黄龙菌16S rDNA序列最保守的片段的单链作为待检测靶标，所以黄龙菌中均含有该待检测靶标，将待检测靶标进行 aPCR扩增快速得到大量待检测靶标，操作较简单，成本较低(相当于对待检测靶标进行扩增放大)。

同时，使用RNA切割型DNAzyme与纳米颗粒结合形成DNA walker来进行二次信号放大：使用纳米颗粒作为载体，将一段特异性酶链DNAzyme和若干带有FAM荧光基团的底物链修饰在纳米颗粒上，形成DNA walker，带有FAM荧光基团的底物链修饰在纳米颗粒上时，FAM荧光基团由于靠近纳米颗粒时会发生荧光共振能量转移 (FRET)，从而使得FAM荧光基团的荧光猝灭。

向DNA walker中加入由aPCR扩增出的待检测靶标之后，待检测靶标与封闭链发生竞争反应导致封闭链脱落，特异性酶链 DNAzyme被激活并将带有FAM荧光基团的底物链切断，FAM荧光基团游离到远离纳米颗粒之处，荧光获得恢复，在待检测靶标的浓度不相同的情况下，荧光强度不相同，且与待测靶标所对应的aPCR模板浓度的对数呈良好的线性关系，因此，可以通过检测反应体系中的荧光强度确定黄龙病病菌的存在并对其进行定量，以判断病情的严重程度。

其中，纳米颗粒根据实验需求进行选择，可以为金纳米颗粒，银纳米颗粒或者量子点，本实施例中以粒径为13nm的金纳米颗粒为例进行说明，在实际使用中，纳米颗粒的种类和粒径均可以改变，如金纳米颗粒的粒径可以为10～20nm。

待检测靶标包括黄龙菌16SrDNA序列最保守的片段中的长度为 22bp的核心检测靶标(T0)，核心检测靶标、待检测靶标在所有黄龙菌中均存在。

本发明实施例选取带有T0序列的五条待检测DNA片段T1-T5 并对其进行aPCR扩增(T1至T5由于序列和长度都不尽相同，所以会形成不同的二级结构，不同的二级结构也会影响最终的荧光检测效果)，之后分别对其扩增的产物进行荧光检测，实验结果发现T2具有良好的荧光检测性能，本发明实施例最终选取T2作为检测黄龙病菌的检测靶标。

核心检测靶标T0的序列为：ATGAGCCTGCGTTGGATTAGCT。

T1的序列为：

ATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCC TACCA。

T2的序列为：

GGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAAA GATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTG GTAGGGTAAGAGCCTACCA。

T3的序列为：

TGGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAA AGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTT GGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTG AGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAG。

T4的序列为：

AGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTA GTTGGTAGGGTAAGAGC。

T5的序列为：

本发明中用于检测黄龙菌探针的制备方法包括以下步骤：

待检测靶标的选择及扩增：

S1、黄龙菌16SrDNA的扩增及质粒选择

对已报道的黄龙菌16S rDNA的目的基因进行不对称扩增 (aPCR)，扩增反应体系(50μL)包括：目标DNA 4μL，dNTP 1 μL(deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)，Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(超保真DNA聚合酶)1μL，正、反向扩增引物各2μL(具体扩增时先加入正扩增引物，待其延伸完毕后再加入反扩增引物)，ddH₂O15μL，Buffer(缓冲液)25μL。

aPCR扩增程序为：在95℃的条件下预热3min，在95℃的条件下保持30s进行变性，在56℃的条件下保持30s进行退火，在72℃ 的条件下保持1min使引物在模板上延伸，加入单引物后在72℃的条件下保持5min使单引物在模板上延伸，在16℃的条件下保持退火5min；重复变性至退火的步骤循环34次。

采用胶回收试剂盒对扩增产物回收纯化后，与pEASY Blunt vector进行连接(产物3μL，载体1μL，在25℃的条件下连接20min)，随后利用大肠杆菌感受态Trans T 1进行热激反应，在温度为37℃的条件下8小时倒置培养后，挑取单克隆扩繁后利用通用引物M13正反向引物进行PCR检测，选取片段与16S rDNA大小一致的送武汉擎科生物科技有限公司进行测序，经过与参考基因组比对后，确定黄龙菌16S rDNA的序列，及核心检测靶标在广州源的患病材料中的保守性，选取其中一个克隆继续扩繁，提取质粒，作为后续实验的标样。

S2、选择检测靶标

根据NCBI数据库(National Center for Biotechnology Information, 美国国家生物技术信息中心)中黄龙菌亚洲种的基因组信息，查询其 16SrDNA序列，分析已经提交到NCBI数据库中所有黄龙菌16S rDNA的变异类型(SNP)，确定所有提交的16S rDNA序列最保守的片段，根据DNAzyme的设计原则，选择最保守的片段中一段长度为 22bp的序列作为核心检测靶标(Target)T0，即目的基因，该目的基因在所有黄龙菌16S rDNA的变异类型中均存在，但是，目的基因本身在黄龙菌中没有单独存在，且由于其长度过小，检测时灵敏度较低，不适合作为待检测靶标。

待检测靶标的选择

参见图3所示，实际检测黄龙菌16S rDNA时，扩增出若干种含有核心检测靶标的DNA单链，从中选择一个或多个作为待检测单链 (待检测靶标)，由于不同长度的DNA单链会影响DNAzyme的检测效果，因此，本实施例为降低成本并提高准确度，最终选择了五种长度不同的DNA单链作为待检测靶标：T1、T2、T3、T4、T5，这五种DNA单链在所有黄龙菌中均存在。

参见图3所示，核心检测靶标T0的长度为22bp，T1的长度为 46bp，T2的长度为104bp，T3的长度为245bp，T4的长度为58bp， T5的长度为93bp。(对黄龙菌进行aPCR扩增能够得到T1～T5的 DNA单链)

以T1～T5作为模板质粒进行aPCR得到大量DNA单链：

不对称PCR扩增反应体系(40μL)包括：模板质粒4μL，dNTP0.8 μL(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)，Taq DNA Polymerase1μL(热稳定DNA聚合酶)，正/反向扩增引物各0.8 μL(具体扩增时先加入正扩增引物，待其延伸完毕后再加入反扩增引物，正/反向扩增引物(简称正/反引物)的浓度比根据需要设置，通常为50：1～100：1)，ddH₂O 31.2μL，Buffer 4μL。

aPCR扩增程序为：在94℃的条件下预热3min，在94℃的条件下保持30s进行变性，在52～62℃的条件下保持30s进行退火，在 72℃的条件下保持30s min使正扩增引物在模板上延伸，加入反扩增引物后在72℃的条件下保持10min使该扩增引物在模板上延伸，在16℃的条件下保持退火5min；重复变性至退火的步骤循环2～34次。

由于退火温度、正/反向扩增引物比例，模板质粒的浓度对aPCR 扩增结果影响较大，为了得到品质较高的DNA单链，本实施例对 aPCR条件进行以下优化：

a、优化退火温度：在其他条件不变的情况下，设置以下8个退火温度不同的平行试验：退火温度分别为：52℃、52.7℃、53.9℃、 55.8℃、58.1℃、60℃、61.2℃、62℃。

将反应所得产物纯化后置于4％琼脂糖凝胶中进行电泳表征(产物电泳对应图4中泳道1至8)，参见图8A至8E所示，为不同退火温度对扩增T1～T5的影响，由图可知，当温度低于53.9℃时，出现了非特异性扩增的假阳性现象，而温度大于等于58.1℃时，没有条带，出现了假阴性的现象，因此，选取中间反应温度为56℃作为最佳反应温度。

同时，从图中可以看出，T2的电泳荧光强度较高，信号较强。

b、优化模板质粒浓度

对aPCR反应体系中模板质粒的浓度进行梯度设置，以确定检测体系的线性范围：在其他条件不变的情况下，aPCR反应中模板的浓度依次是0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20ng/μL，将反应所得产物置于4％琼脂糖凝胶中进行电泳表征，参见图5所示，T2作为模板质粒所对应的产物亮度逐步变亮，即T2的浓度与亮度之间具有较好的线性关系，浓度越大，亮度越高；并且从图9的荧光图谱中也可以看出T2所对应aPCR模板浓度的对数与荧光强度具有较好的线性关系，且其灵敏度较高，能够获得较准确的检测结果，因此，选用 T2作为最终的待检测DNA片段进行aPCR扩增。

c、DNA walker探针的构建：

将0.92μL浓度为100mM的酶链溶液、2.76μL浓度为100μM 的封闭链溶液、0.9μL的浓度为5mm的PBS(100mM NaH₂PO₄、 100mM Na₂HPO₄和500mM NaCl，pH＝7.4)加入PCR管并混合均匀，加热至90℃后保温5min，将溶液冷却至室温后，加入1.2μL在醋酸盐缓冲液(50mM，pH 5.2)中活化、浓度为10mM的TCEP(Tris (2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羧乙基)膦)溶液，混合均匀后得到溶液A以供进一步使用。

同时，将9.2μL浓度为100μM的底物链溶液和1.2μL浓度为 100mM的TCEP溶液加入另一PCR管中混合均匀，得到溶液B。将溶液A、溶液B置于室温下孵育1h后混合均匀并缓慢添加到200μL 浓度为4.6nM的金纳米颗粒预冷溶液中，得到混合液。

将混合液放入温度为4℃的条件下冷藏16h后，冷藏过程中采用盐老化法提高DNA链的负载效率，即：每隔8h分4次向混合液中添加0.5μL浓度为5M的NaCl，冷藏完成后，以12000r/min的转速高速离心30分钟并重复4次，以除去多余的DNA链，得到DNA walker探针。

DNA walker所用DNA序列，其中碱基组成(由5’-3’)：

核心检测靶标序列：ATGAGCCTGCGTTGGATTAGCT。

封闭链：AAGAGAAGCTAATCCAACGCAGGCTCAT；酶链： TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTT GGATTAGCTTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT(使用5’SH C6)作为修饰基团。

底物链：TTTTTTTTTTTTTTCACTAT/rA/GGAAGAGAT(使用5’ SHC6，RNA，3’6-FAM作为修饰基团)。

参见图6所示，其中，图6A为金纳米颗粒的透射电子显微镜表征图，由图中可知合成了分散性较高且粒径为13nm的金纳米颗粒；图6B为DNA walker探针的透射电子显微镜表征图，由图中可知本实施例中合成了分散性较好，水合粒径为18nm左右的DNA walker探针；图6C为金纳米颗粒和DNA walker探针的Zeta电势表征图，由图可知金纳米颗粒的Zeta电势为-9，DNA walker探针的Zeta电势为-20，金纳米颗粒由于表面带有柠檬酸根离子所以表面带负电，而 DNA walker探针中的DNA也带有负点，因此其负电势更高；图6D 为金纳米颗粒和DNA walker探针的水合粒径表征，DNA walker探针的水合粒径大于金纳米颗粒的水合粒径4nm，表明DNA成功修饰在了金纳米颗粒表面；图6E为金纳米颗粒和DNAwalker探针的紫外表征图，DNA walker探针相对于金纳米颗粒发生了2nm的红移，证明DNA成功地修饰在了金纳米颗粒表面。

PAGE法(凝胶电泳法)验证保守序列(T0)竞争封闭链的可行性：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对设计的DNA序列进行了验证和表征，每个样品10微升装在12％，1mm的聚丙烯酰胺凝胶上，在1×TBE 缓冲液中120V电泳100min，分离后染色，荧光凝胶成像系统成像。

荧光法验证DNA walker探针对保守序列(T0)的可行性：

信号组：向PCR管中分别加入10μL浓度为5mM的Mn²⁺、5 μL浓度为1μM的T0和0.5μLDNA walker探针，使用浓度为25 mM的Tris-HCl溶液(25mM，with 100mM NaCl，pH＝7.4)稀释至 100μL，放置于室温下反应1h，检测荧光，激发光波长为495nm，收集范围为510nm～600nm，狭缝长度和宽度均为5nm。

空白组：向PCR管中分别加入10μL浓度为5mM的Mn²⁺和0.5 μL DNA walker探针，使用浓度为25mM的Tris-HCl溶液(25mM， with 100mM NaCl，pH＝7.4)稀释至100μL，放置于室温下反应1h，检测荧光，激发光波长为495nm，收集范围为510nm～600nm，狭缝长度和宽度均为5nm。

图7为保守序列(T0)竞争封闭链的可行性图，图中7A中，泳道1为DNA标尺，泳道2为酶链，泳道3为封闭链，泳道4为底物链，泳道5为保守序列(T0)，泳道6为酶链+封闭链，泳道7为酶链+封闭链+保守序列(T0)，泳道8为酶链+封闭链+底物链，所有泳道中DNA链的浓度均为200nM。

对比图7A泳道2、3和6可知，酶链和封闭链成功地杂交在了一起；对比泳道2、3、5、6、7可知，保守序列(T0)成功地竞争下了封闭链并形成了双链释放出了酶链；通过对比泳道2～7可知，向酶链和封闭链双链体系中加入底物链均没有发生反应，由此可知，本实施例中向形成DNA walker中加入扩增产物后，扩增产物与封闭链发生竞争反应导致封闭链脱落，特异性酶链DNAzyme被激活这一路线是可行的。

图7B为信号组和荧光组的荧光图谱，a为空白组的荧光图谱，b 为荧光组的荧光图谱，由图可知，只有将保守序列片段T0加入体系之后，才能够出现一个三倍的荧光信号恢复，进一步验证了向形成 DNA walker中加入扩增产物后，扩增产物与封闭链发生竞争反应导致封闭链脱落，特异性酶链DNAzyme被激活这一路线是可行的。

对T1～T5通过6组不同正反引物比例aPCR扩增后进行荧光检测：

以T1～T5作为模板质粒进行aPCR，每种模板质粒均设计引物对比组，在其他条件保持不变的条件下进行引物对比试验，其中，正引物与反引物之比设置为：1:1、10:1、30:1、50:1、70:1、100:1，将所获得的30个扩增产物分别进行如下30个对比试验：

加入10μL 5mM的Mn²⁺、5μL扩增产物和0.5μL DNA walker 探针，使用浓度为25mM的Tris-HCl溶液(25mM，with 100mM NaCl， pH＝7.4)稀释至100μL，放置于室温下反应1h，检测荧光，激发光波长为495nm，收集范围为510nm～600nm，狭缝长度和宽度均为 5nm。

图9为不同正反引物比例aPCR扩增后荧光检测图，图中，A对应T0，B至E对应T1至T5，在检测之前T4和T5的浓度为T1、T2、 T3的10倍，每个图中，由左至右的泳道依次对应DNAwalker探针，1:1、10:1、30:1、50:1、70:1、100:1。

得出在正反引物之比为100:1的条件下进行扩增后的产物进行荧光检测时具有良好的荧光信号，且由于正反引物比例大于100:1会扩增出较多副产物(本领域在进行aPCR的共识)，因此，aPCR通常在正反引物比例为1:1到100:1之间，故本实施例采用正反引物比例为的100:1作为最优比例并用于之后的反应。

线a对应。

为进一步选择最优DNA单链，本实施例进行了以下实验：

将DNA walker探针、T1～T5在正引物与反引物比例为100:1的条件下进行aPCR扩增，测定反应产物的荧光信号，参见图9所示，不同正反引物比例aPCR扩增后荧光检测图，图中，线a对应DNA walker探针，1:1(对应线b)、10:1(对应线c)、30:1(对应线d)、 50:1(对应线e)、70:1(对应线f)、100:1(对应线g)。

图B至E对应T1至T5，在检测之前T4和T5的浓度为T1、T2、 T3的10倍，由图中可知T2所对应的荧光信号强度要强于其他片段，因此，选择T2作为最优DNA单链。

对T2靶标的线性检测：

在其他条件不变的情况下，aPCR反应中T2所对应模板的浓度依次是0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20ng/μL，将T2扩增产物纯化后进行荧光检测。

即加入10μL 5mM的Mn²⁺、5μL纯化后的T2扩增产物和0.5 μL DNA walker探针，使用浓度为25mM的Tris-HCl溶液(25mM， with 100mM NaCl，pH＝7.4)稀释至100μL，放置于室温下反应1h，检测荧光，激发光波长为495nm，收集范围为510nm～600nm，狭缝长度和宽度均为5nm(其中，T2扩增产物在反应体系中的浓度依次为0、0.25、0.5、1.25、2.5、5、25pg/μL)。

参见图10和图11所示，随着T2扩增产物的浓度增加，荧光强度逐渐增强，参见图11B所示，对T2的荧光曲线进行线性拟合，线性方程为y＝6.09x+23.92，R²＝0.9923，得到T2所对应aPCR模板质粒的检测限LOD为0.045pg/μL。

本发明还提供一种黄龙菌的检测方法，包括以下步骤：从待测样品中提取总DNA并进行aPCR扩增，将扩增产物和DNA walker探针加入反应溶液中反应0.5～2h后，反应溶液选用浓度为25mM的 Tris-HCl溶液，且反应溶液包括Mn²⁺，扩增产物与DNA walker探针的添加量之比为1:10。

将检测结果与T2的检测曲线进行比对，判断是否符合方程 y＝6.09x+23.92，若是，则表明待测样品中含有黄龙菌，并可以对其进行定量。

检测溶液的荧光强度，激发光波长为495nm，收集范围为510 nm～600nm，狭缝长度和宽度均为5nm。

本发明不仅局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本发明相同或相近似的技术方案，均在其保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种基于aPCR和DNA walker的黄龙菌检测方法

<130> 2020.9.1

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgagcctgc gttggattag ct 22

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgagcctgc gttggattag ctagttggta gggtaagagc ctacca 46

<210> 3

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ggaaacgtgt gctaataccg tatacgccct attgggggaa agattttatt ggagagagat 60

gagcctgcgt tggattagct agttggtagg gtaagagcct acca 104

<210> 4

<211> 245

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tggaaacgtg tgctaatacc gtatacgccc tattggggga aagattttat tggagagaga 60

tgagcctgcg ttggattagc tagttggtag ggtaagagcc taccaaggct acgatctata 120

gctggtctga gaggacgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 180

aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg ggcaaccctg atccagccat gccgcgtgag 240

tgaag 245

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

agattttatt ggagagagat gagcctgcgt tggattagct agttggtagg gtaagagc 58

<210> 6

<211> 92

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atacgcccta ttgggggaaa gattttattg gagagagatg agcctgcgtt ggattagcta 60

gttggtaggg taagagccta ccaaggctac ga 92

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

aagagaagct aatccaacgc aggctcat 28

<210> 8

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttgcgttgg attagcttct 60

cttctccgag ccggtcgaaa tagt 84

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tttttttttt ttttcactat raggaagaga t 31

Claims

1.一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：选择待检测靶标并将其与DNAwalker探针作用，绘制标准曲线，所有黄龙菌中均存在所述待检测靶标，所述DNA walker探针包括纳米颗粒，所述纳米颗粒上修饰有特异性酶链DNAzyme和若干带有FAM荧光基团的底物链，所述特异性酶链DNAzyme被封闭链所封闭，所述待检测靶标与特异性酶链DNAzyme作用，使封闭链脱落，所述特异性酶链DNAzyme能够切割底物链上的FAM荧光基团，体系产生荧光，且荧光强度与待检测靶标对应aPCR模板浓度的对数呈线性关系；

从待测样品中提取总DNA并进行aPCR扩增，将扩增产物和DNAwalker探针混合反应0.5～2h后；将检测结果与标准曲线进行比对，判断是否符合标准曲线，若是，则表明待测样品中含有黄龙菌。

2.如权利要求1所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述纳米颗粒为金纳米颗粒，银纳米颗粒或者量子点。

3.如权利要求2所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述纳米颗粒为金纳米颗粒，所述金纳米颗粒的粒径为10～20nm。

4.如权利要求1所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述待检测靶标为单链DNA，且所述待检测靶标含有核心检测靶标T0，所述核心检测靶标T0的核苷酸序列为：ATGAGCCTGCGTTGGATTAGCT。

5.如权利要求1所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述封闭链的核苷酸序列为：AAGAGAAGCTAATCCAACGCAGGCTCAT；

所述特异性酶链DNAzyme的核苷酸序列为：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTTGGATTAGCTTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGT；所述底物链的核苷酸序列为：TTTTTTTTTTTTTTCACTAT/rA/GGAAGAGAT。

6.如权利要求1所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述待检测靶标包括T1、T2、T3、T4、T5；

所述T1的序列为：

ATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCA；

所述T2的序列为：

GGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAAAGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCA；

所述T3的序列为：

TGGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAAAGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAG；

所述T4的序列为：

AGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGC；

所述T5的序列为：

ATACGCCCTATTGGGGGAAAGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGA。

7.如权利要求6所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述待检测靶标为T2。

8.如权利要求1所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述aPCR扩增中，正/反引物比例为100:1，退火温度为56℃。

9.如权利要求1所述的一种基于aPCR和DNAwalker的黄龙菌检测方法，其特征在于：所述DNAwalker的制备方法包括以下步骤：

将0.92μL浓度为100mM的酶链溶液、2.76μL浓度为100μM的封闭链溶液、0.9μL的浓度为100mM的PBS混合均匀，加热至90℃后保温5min，将溶液冷却至室温后，加入1.2μL在醋酸盐缓冲液中活化、浓度为10mM的TCEP溶液，混合均匀后得到溶液A；

将9.2μL浓度为100μM的底物链溶液和1.2μL浓度为100mM的TCEP溶液混合均匀，得到溶液B，将溶液A、溶液B置于室温下孵育1h后混合均匀并缓慢添加到200μL浓度为4.6nM的金纳米颗粒预冷溶液中，得到混合液；

将混合液放入温度为4℃的条件下冷藏16h后离心纯化得到DNAwalker。