CN109824743A

CN109824743A - 一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针及其应用

Info

Publication number: CN109824743A
Application number: CN201910158383.8A
Authority: CN
Inventors: 马骁驰; 冯磊; 田象阁; 宁静; 王超; 于振龙; 霍晓奎; 孙成鹏
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: CN109824743B

Abstract

一种检测N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶的荧光探针及其应用，其属于生物医药技术领域。它可用于测定不同来源生物体系中N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶的酶活性。以DDAG作为特异性探针反应底物，借助N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶体外反应体系，以β‑葡萄糖醛酸苷水解反应为探针反应，通过定量检测单位时间内苷元代谢产物的生成量来测定各生物样品中N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶的活性。本发明可用于不同个体来源人和动物组织样本、不同种属细胞及细胞制备物、以及各种植物和微生物中N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶活性的定性、定量测定，并可实现对N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶处置药物能力的评估，以及N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶抑制剂的开发筛选。

Description

一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针及其应用。

背景技术

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶( N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG) 是一种高分子糖蛋白酸性水解酶，广泛存在于体内各种组织的溶酶体中，尤以肾脏中含量最为丰富。在肾小管早期损伤或轻微病变时，肾小管细胞对NAG 的过滤和吸收作用发生变化，引发尿液中NAG 活性明显升高。

尿中NAG是反映肾小管损害敏感且特异的指标，其活性测定广泛应用于各种肾脏疾病的临床监测。目前临床上应用的检测方法都存在灵敏度低、操作复杂等问题，因此，开发具有高灵敏度、抗环境干扰能力强的适用于体内和体外检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特异性荧光探针底物，并建立高灵敏度的科学检测方法，在临床诊断、药物开发与合理使用方面，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针及其应用，该特异性荧光探针底物可被N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶选择性的水解，生成荧光属性明显改变的水解产物，可被荧光检测器检测。利用该探针反应可对多种生物体系中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分布和功能进行定量评价，并可用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。

本发明公开的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特异性荧光探针底物，为1, 3-二氯-7-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷-9, 9-二甲基-2(9H) -吖啶酮（简称DDAG）。

DDAG

本发明还公开了上述化合物作为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特异性荧光探针底物的应用：采用上述DDAG作为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过检测单位时间内水解产物1, 3-二氯-7-羟基-9, 9-二甲基-2(9H) -吖啶酮的生成量来定量测定不同生物体系（包括重组表达N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞、尿、微生物及植物等生物体系）中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性；具体反应条件如下：

——体系中以DDAG作为特异性探针底物；底物浓度选择10 μM。

——在磷酸盐缓冲液中，反应温度为20 ^oC至60 ^oC之间，优选37 ^oC为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5 ~ 10.5之间，优选pH 7.4为最优反应pH值；

——反应时间为0 ~ 60分钟，确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应；

——测定单位时间内底物减少量或水解产物1, 3-二氯-7-羟基-9, 9-二甲基-2(9H)-吖啶酮生成量作为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的评价指标。

本发明提供的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特异性荧光探针底物的应用，该探针底物及其水解产物具有不同的光学属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；水解产物荧光检测条件分别为：激发波长608 nm，最大发射波长为660 nm。

该特异性探针水解产物为较长发射波长荧光探针，其在N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、人及动物组织制备液、尿及各类组织细胞中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的定量测定；同时也可作为载体及动物整体N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的探针底物，评估N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的个体及种属差异。该探针底物及水解代谢产物的荧光检测方法还可用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

作为高特异性的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针底物，该化合物可以用来检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系产生的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等生物样品中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性标定。

选用本发明所述N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特异性探针底物检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶体外活性具有以下突出优势：

(1) 高特异性：DDAG可被N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶高特异性代谢成水解产物1, 3-二氯-7-羟基-9, 9-二甲基-2(9H) -吖啶酮。

(2) 廉价易得：DDAG可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。

(3) 高灵敏度：DDAG具有近红外的荧光发射波长，可以较好的减弱生物背景荧光的干扰。

附图说明

图1 DDAG及其酶解产物的紫外吸收及荧光发射光谱。

图2不同水解酶对DDAG的筛选实验结果。

图3不同离子及氨基酸对DDAG的筛选实验结果。

图4 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶催化DDAG探针反应的酶线性变化。

图5应用DDAG对临床临床肾病患者及其正常群体尿液中乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活力的测定及其与商品化试剂盒的相关性分析。

具体实施方式

实施例1. 体外测定不同水解酶的选择性

（1）预先准备99 µL 体外代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液（100 mM）、不同种类水解酶 (0.1 mg/mL)，于37 ^oC条件下震荡预孵3分钟；

（2）向反应体系中加入1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的DDAG起始反应；

（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4 ^oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAG：Ex=608 nm，Em=660 nm）。结果显示，只有N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）催化反应，反应速率远远高于其它水解酶，说明N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶催化DDAG的反应有很好的选择性，本发明可应用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性测定（图2）。

实施例2. 体外测定不同水解酶的选择性

（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4 ^oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAG：Ex=608 nm，Em=660 nm）。结果显示，只有N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）催化反应，其他离子及氨基酸对探针荧光强度没有影响，说明N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶催化DDAG的反应有很好的选择性，本发明可应用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性测定（图3）。

实施例3. N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶催化DDAG探针反应的线性研究

（1）预先准备99 µL 体外代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液（100 mM）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（0-3 μg/mL），于37 ^oC条件下震荡预孵3分钟；

（2）向反应体系中加入1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的NHPO起始反应；

（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4 ^oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAG：Ex=608 nm，Em=660 nm）。结果显示， N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）催化DDAG的探针反应在0-3 μg/mL范围内呈现良好的酶线性关系，r²值为0.9945，说明本发明中DDAG可应用于复杂样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性及其表达量的测定（图4）。

实施例4. DDAG测定正常人及其肾病患者的尿中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活力应用

（1）预先准备正常人（4例）和肾病患者（12例）的新鲜尿液99 µL，于37 ^oC条件下震荡预孵3分钟；

（2）向该尿液中加入1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的DDAG起始反应；

（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4 ^oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAG：Ex=608 nm，Em=660 nm）。结果显示，正常健康人体中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性普遍很小，而肾病患者尿中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性明显普遍升高，相比正常人高出接近10倍，同时本发明中的结果与目前商品化NAG试剂盒的结果呈现良好的相关性，r=0.96。以上结果说明本发明中DDAG可用于人体尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的测定（图5）。

Claims

1.一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针，其特征在于：该探针底物可被N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶特异性催化，使探针底物中的葡糖醛酸苷键分解，探针结构式如式（1）所示，

该探针底物为1, 3-二氯-7-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷-9, 9-二甲基-2(9H) -吖啶酮。

2.根据权利要求1所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：采用1, 3-二氯-7-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷-9, 9-二甲基-2(9H) -吖啶酮作为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过定量检测单位时间内的1, 3-二氯-7-羟基-9, 9-二甲基-2(9H) -吖啶酮的生成率来定量测定不同生物体系中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性。

3.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：所述体外孵育反应条件为：底物浓度介于1/10~10 K _m之间；孵育体系pH介于5.5~ 10.5之间；反应温度介于20 ~ 60 ^oC之间。

4.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：所述生物体系为重组表达N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、细胞样品、人或动物组织、植物、微生物。

5.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：所述底物消除率或产物的生成率低于20%。

6.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物的酶解产物具有荧光，酶解产物的检测条件为激发波长608 nm，最大发射波长为660 nm。

7.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物还可用于N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

8.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物也可作为载体及动物整体N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的探针底物，评估N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的个体及种属差异。

9.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：该探针可用于尿中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性评估。