CN107915764A - 一种基于吖啶酮的β‑葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针及其应用 - Google Patents

一种基于吖啶酮的β‑葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针及其应用 Download PDF

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Abstract

一种基于吖啶酮的β‑葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针及其应用，其属于生物医药技术领域。它可用于测定不同来源生物体系中β‑葡萄糖醛酸苷酶的酶活性。以HC‑glu作为特异性探针反应底物，借助β‑葡萄糖醛酸苷酶体外反应体系，以β‑葡萄糖醛酸苷水解反应为探针反应，通过定量检测单位时间内苷元代谢产物的生成量来测定各生物样品中β‑葡萄糖醛酸苷酶的活性。本发明可用于不同个体来源人和动物组织样本、不同种属细胞及细胞制备物、以及各种植物和微生物中β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的定性、定量测定，并可实现对β‑葡萄糖醛酸苷酶处置药物能力的评估，以及β‑葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的开发筛选。

Description

一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针及其应用。
背景技术
β-葡萄糖醛酸苷酶 (β-glucuronidase) 是一种糖苷水解酶，能将β-葡萄糖醛酸苷类化合物水解为相应的苷元和β-葡萄糖醛酸。目前，已在动物、植物以及微生物中发现β-葡萄糖醛酸苷酶的存在。人体中的β-葡萄糖醛酸苷酶是一种内源酶，由机体自身组织细胞产生、合成并分泌，目前已在各种组织和体液中分离得到，如巨噬细胞、血细胞、肝、脾、肾、肠、肺、肌肉、胆汁、肠液、尿以及血清等。在内脏器官细胞的溶酶体中，β-葡萄糖醛酸苷酶也有丰富的表达。作为糖蛋白定位于溶酶体的酸性水解酶，参与机体的生理、病理及药物代谢过程，能维持机体正常的生理活动，主要负责溶酶体中多糖蛋白的降解，在降解皮肤素以及硫酸角质素过程中发挥重要作用。
近年的研究显示， β-葡萄糖醛酸苷酶对疾病的诊断具有重要意义。首先，β-葡萄糖醛酸苷酶介导的水解反应，是维持机体代谢稳态的重要反应。β-葡萄糖醛酸苷酶与戊糖、葡萄糖醛酸酯、卟啉、淀粉以及蔗糖等多种代谢物的互变异构紧密相关，并在生理、病理情况下参与细胞外基质成分重塑，同时辅助维生素D、甲状腺激素、胆红素以及雌性激素等物质的肝肠循环。β-葡萄糖醛酸苷酶能够促进体内潜在毒物、激素以及许多药物的解离，并与多种重要的中间体代谢路径相关，如参与抗坏血酸的生物合成。缺乏此酶会表现出mucopoly saccharidosis type VII (MPS-VII) 或Slysyndrome 等症状。此外，它还能够水解基底膜中的主要成分——蛋白多糖，直接参与细胞外基质的降解过程，从而在胃癌、乳腺癌等肿瘤的侵袭和转移以及炎症的发展过程中发挥重要作用。研究已经证明，肿瘤区域组织匀浆中的β-葡萄糖醛酸苷酶活性明显高于周边正常组织，而且结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌等肿瘤患者的体液（血清、尿液、胃液、唾液）中β-葡萄糖醛酸苷酶活性显著升高。考察β-葡萄糖醛酸苷酶活性能够对这些癌症的前期诊疗起到积极作用，因此，定量测定不同个体、器官组织以及其他各种生物样品中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，对内外源性物质的代谢平衡、肿瘤的预测诊断具有重要价值。
由于β-葡萄糖醛酸苷酶的重要性，建立快速灵敏高效的检测β-葡萄糖醛酸苷酶活性及功能的分析方法十分必要。在诸多的检测方法中，比色法以及荧光法是最常见的检测手段。目前，已报道的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光底物有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂、羟基喹啉-β-葡糖苷酸苷、对硝基苯酚基-β-葡萄糖酸苷、4-甲基伞形酮-β-葡糖苷酸等，分别利用吲哚、羟基喹啉、对硝基酚、4-甲基伞形酮等有色产物作为酶活检测指标。然而基于小分子荧光探针检测β-葡萄糖醛酸苷酶活性仍处于起步阶段，最为常见的检测β-葡萄糖醛酸苷酶活性的荧光探针为4-甲基伞形酮-β-葡萄糖醛酸苷，其激发、发生波长较短，易受背景荧光干扰。因此，在β-葡萄糖醛酸苷酶荧光探针开发上，仍存在很大的改进空间，选择性高、干扰低的β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物的开发和应用，是目前临床诊断、药物开发与合理使用等领域厄待解决的科学问题。
发明内容
本发明提供一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针及其应用，应用该特异性荧光探针作为底物，借助体外反应体系，经β-葡萄糖醛酸苷酶选择性的水解，通过荧光检测器定量测定荧光属性明显改变的水解产物，从而实现。利用该探针反应可对多种生物体系中β-葡萄糖醛酸苷酶的分布和功能进行定量评价，并可用于β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的筛选。
本发明公开的β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物，分别为1,3-二氯-7- O-β-D-葡萄糖醛酸-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮（简写为DDAO-glu）。
DDAO-glu
本发明还公开了上述化合物作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物的应用：采用上述DDAO-glu作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过检测单位时间内水解产物的生成量来定量测定不同生物体系（包括重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞、微生物及植物等生物体系）中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性；具体反应条件如下：
——体系中以DDAO-glu作为特异性探针底物；底物浓度选择10 μM。
——在磷酸盐缓冲液中，反应温度为20 ℃至60 ℃之间，优选37 ℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5 ~ 10.5之间，优选pH 6.0为最优反应pH值；
——反应时间为0~60分钟，确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应；
——测定单位时间内底物减少量或水解产物生成量作为β-葡萄糖醛酸苷酶活性的评价指标。
本发明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性荧光探针底物的应用，该探针底物及其水解产物具有不同的光学属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；水解产物荧光检测条件分别为：激发波长600 nm，最大发射波长为660 nm。
该特异性探针底物为较长发射波长荧光探针，其在β-葡萄糖醛酸苷酶活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组β-葡萄糖醛酸苷酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中β-葡萄糖醛酸苷酶活性的定量测定；同时也可作为载体及动物整体β-葡萄糖醛酸苷酶的探针底物，评估β-葡萄糖醛酸苷酶的个体及种属差异。该探针底物及水解代谢产物的荧光检测方法还可用于β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
作为高特异性的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针底物，该化合物可以用来检测β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系产生的β-葡萄糖醛酸苷酶活性测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等生物样品中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性标定。
选用本发明所述β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性探针底物检测β-葡萄糖醛酸苷酶体外活性具有以下突出优势：
(1) 高特异性：DDAO-glu可被β-葡萄糖醛酸苷酶高特异性代谢成水解产物。
(2) 廉价易得：DDAO-glu可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。
(3) 高灵敏度：DDAO-glu具有较长的荧光发射波长，可以较好的减弱生物背景荧光的干扰。
附图说明
图1 DDAO-glu及其酶解产物的发射光谱。
图2 不同水解酶对DDAO-glu的筛选实验结果。
图3 β-葡萄糖醛酸苷酶水解DDAO-glu的抑制实验结果。
图4不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶催化DDAO-glu的动力学实验结果。
图5不同个体粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶催化DDAO-glu的反应速率实验结果。
具体实施方式
实施例1. 体外测定不同水解酶的选择性
（1）预先准备99 µL 体外代谢反应体系，包括pH 6.0的磷酸盐缓冲液（50 mM）、不同种类水解酶 (0.1 mg/mL)，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的DDAO-glu起始反应；
（3）60分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAO-glu：Ex=600 nm，Em=660 nm）。结果显示，只有β-葡萄糖醛酸苷酶（GLU）催化反应，反应速率远远高于其它水解酶，说明β-葡萄糖醛酸苷酶催化DDAO-glu的反应有很好的选择性，本发明可应用于β-葡萄糖醛酸苷酶的活性测定（图2）。
实施例2. 体外β-葡萄糖醛酸苷酶的抑制实验
（1）预先准备99 µL 体外代谢反应体系，包括pH 6.0的磷酸盐缓冲液（50 mM）、β-葡萄糖醛酸苷酶 (0.1 mg/mL)，以及不同浓度的抑制剂（终浓度分别为50, 200, 600 μM）于37℃条件下震荡预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的DDAO-glu起始反应；
（3）60分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAO-glu：Ex=600 nm，Em=660 nm）。结果显示，只有黄芩苷呈剂量依赖的抑制β-葡萄糖醛酸苷酶（GLU）的催化反应，而BNPP和LAP（羧酸酯酶）以及α-galactose（半乳糖）均不抑制β-葡萄糖醛酸苷酶（GLU）的催化活性，说明β-葡萄糖醛酸苷酶催化DDAO-glu的反应有很好的选择性，本发明可应用于β-葡萄糖醛酸苷酶的抑制剂筛选（图3）。
实施例3不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶的活性测定
（1）预先准备99 µL 体外代谢反应体系，包括pH 6.0的磷酸盐缓冲液（50 mM）、不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶 (0.1 mg/mL)，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的DDAO-glu起始反应；
（3）60分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAO-glu：Ex=600 nm，Em=660 nm）。结果显示，不同来源β-葡萄糖醛酸苷酶，包括重组表达单酶以及E.coli、E.coli IX和E.coli VII-A等亚型大肠杆菌来源β-葡萄糖醛酸苷酶均可催化HC-glu和DDAO-glu反应，但是各种来源的β-葡萄糖醛酸苷酶具有显著不同的酶活和催化反应特点，说明DDAO-glu作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性探针底物，可以灵敏的反应不同来源的β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，本发明可应用于不同来源的β-葡萄糖醛酸苷酶的活性评价（图4）。
实施例4 不同个体粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性测定
（1）收集粪便样品，称取 200 mg ，加入3倍体积生理盐水，涡旋，离心（500 g，5 min），上清冻融裂解，离心（10000 g，20 min）取上清 ，得到粪便酶样品，测定蛋白浓度备用。
（2）准备99 µL 体外代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液（50 mM）、不同个体来源粪便酶 (0.1 mg/mL)，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
（3）向反应体系中加入1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的DDAO-glu起始反应；
（4）60分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（5）用高速冷冻离心机在4℃、20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（DDAO-glu：Ex=600 nm，Em=660 nm）。结果显示，不同个体的粪便中均可催化DDAO-glu反应，但是不同个体的β-葡萄糖醛酸苷酶具有显著不同的反应速率，说明DDAO-glu作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性探针底物，可以灵敏的反应不同个体粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，本发明可应用于个体间粪便中β-葡萄糖醛酸苷酶活的评价（见图5）。

Claims (8)

1.一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针，其特征在于：该探针底物可被β-葡萄糖醛酸苷酶特异性催化，使探针底物中的葡糖醛酸苷键加水分解，探针结构式如式（1）所示，
式（1）
该探针底物为1,3-二氯-7- O-β-D-葡萄糖醛酸-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮。
2.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：采用1,3-二氯-7- O-β-D-葡萄糖醛酸-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮作为β-葡萄糖醛酸苷酶的特异性底物，进行水解反应，通过定量检测单位时间内的苷元产物的生成率来定量测定不同生物体系中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性。
3.根据权利要求2所述的一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：所述体外孵育反应条件为：底物浓度介于1/10~10 Km之间；孵育体系pH介于5.5~10.5之间；反应温度介于20~60℃之间。
4.根据权利要求2所述的一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：所述生物体系为重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶、细胞样品、人或动物组织、植物、微生物。
5.根据权利要求2所述的一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：所述底物消除率或产物的生成率低于20%。
6.根据权利要求2所述的一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物的酶解产物具有荧光，酶解产物的检测条件为激发波长600 nm，最大发射波长为660 nm。
7.根据权利要求2所述的一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物还可用于β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
8.根据权利要求2所述的一种基于吖啶酮的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物也可作为载体及动物整体β-葡萄糖醛酸苷酶的探针底物，评估β-葡萄糖醛酸苷酶的个体及种属差异。
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