CN102159728A - 乳腺癌转移的判断方法及血清的评价方法 - Google Patents

乳腺癌转移的判断方法及血清的评价方法 Download PDF

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Abstract

检测采自乳腺癌摘除术后患者的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb的各自CpG岛中的甲基化，当在由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少其中之一的CpG岛检测出甲基化时，判断为乳腺癌转移。

Description

乳腺癌转移的判断方法及血清的评价方法
技术领域：
本发明涉及一种用于判断接受过乳腺癌摘除手术的患者有无乳腺癌转移的乳腺癌转移判断方法，以及有助于获得判断乳腺癌转移的指标的血清的评价方法。
本申请要求于2008年9月19日申请的日本国专利申请第2008-241302号的优先权，在此引用其全部内容。
背景技术：
在接受了乳腺癌摘除手术的患者中，确认有无乳腺癌转移对于决定术后治疗方针上非常重要。特别是当发现有癌转移到远离原发灶的脏器和淋巴结的远处转移时，在对患者施以适当治疗的基础上，确认有无乳腺癌转移极为重要。
诊断因术后乳腺癌转移而导致的癌症复发的方法已知有超音波(echo)、MRI(核磁共振)、乳房X光摄影检查等图像检查。然而，这些图像检查有一些缺陷，比如需要熟练的技术，做图像检查时所使用的装置会给患者带来不快，且成本高等。
在人等高等真核生物的染色体DNA中，CG二核苷酸序列构成的CpG部位的胞嘧啶有时会被甲基化。此CpG部位的胞嘧啶甲基化发挥着抑制基因表达的功能。比如，基因的启动子区存在含有大量CpG部位的区域，此基因的启动子区胞嘧啶有无甲基化控制着该基因的DNA的转录的开关。
DNA甲基化对基因表达的控制在早期胚胎发育、组织特异性的基因表达、基因印记、X染色体失活、染色体稳定化、DNA复制类型等各种现象中发挥着重要的作用。已有报告称，很有可能DNA的甲基化与癌症等疾病有很大关系。
分析上述DNA甲基化的方法已知有甲基化特异性PCR法。此方法用亚硫酸氢盐等将非甲基化胞嘧啶转化为其他碱基基的试剂(非甲基化胞嘧啶转化剂)，将待分析DNA的非甲基化的胞嘧啶(非甲基化胞嘧啶)转化为其他碱基(非甲基化胞嘧啶转化处理)。然后用引物组对扩增胞嘧啶未转成其他碱基的序列，进行PCR反应，通过检查有无扩增产物即可检测出DNA有无甲基化。
在此，已知GSTP1、RASSF1A和RARb都是CpG岛在乳腺癌原发灶高度甲基化的基因。非专利文献1上记述了一种乳腺癌鉴别方法，即通过调查采自患者的血清中所含APC、GSTP1、RASSF1A以及RARb的CpG岛有无甲基化来鉴别乳腺癌。然而，非专利文献1关于判断术后患者中有无乳腺癌转移的方法毫无记述。
先行技术文献
非专利文献
非专利文献1：穆罕默德·O·霍克(Mohammad O.Hoque)等人，《乳腺癌检测用血浆DNA中的四基因异常甲基化检测(Detection of Aberrant Methylation of Four Genes in Plasma DNA for the Detection of Breast Cancer)》，临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology)，第24卷，第26号，2006年9月10日，p.4262-4269。
发明内容：
本发明的目的是提供一种可以在不给患者带来痛苦的情况下、低成本、便捷地判断接受了乳腺癌摘除术后的患者有无乳腺癌转移的乳腺癌转移判断方法。本发明的另一个目的是一种血清评价方法，该方法可以在不给患者带来不快的情况下、低成本、便捷地获取帮助判断接受了乳腺癌摘除术后的患者有无乳腺癌转移的指标。
即，本发明涉及：
(1)一种乳腺癌转移判断方法，包括以下步骤：
获取步骤，获取乳腺癌摘除术后患者的血清；
检测步骤，检测在获取步骤中获得的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛中的甲基化；
判断步骤，当检测步骤从选自由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少之一的CpG岛检测出甲基化时，判断为乳腺癌转移；
(2)根据上述(1)所述方法，其特征在于，转移是远处转移；
(3)根据上述(1)所述方法，其特征在于，在检测步骤用甲基化特异性PCR法检测GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛的甲基化；
(4)根据上述(1)所述方法，其特征在于，甲基化特异性PCR法用以下三个引物组实施：
含有序列号1和序列号2所示引物的第一引物组，
含有序列号3和序列号4所示引物的第二引物组，
含有序列号5和序列号6所示引物的第三引物组；
(5)一种乳腺癌转移的判断方法，包括：
获取步骤，获取乳腺癌摘除术后患者的血清；
检测步骤，检测在获取步骤中获得的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛的甲基化；
定量步骤，测定在获取步骤中获得的血清中所含乳腺癌肿瘤标志物的量；
判断步骤，当检测步骤从选自由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中的至少之一的CpG岛中检测出甲基化，且在定量步骤获得的肿瘤标志物含量为异常量时，判断为乳腺癌转移；
(6)根据上述(5)所述方法，其特征在于，乳腺癌的肿瘤标志物是CEA和/或CA15-3；
(7)一种血清评价方法，包括：
(A)步骤，测定从乳腺癌摘除术后患者采集的血清所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛有无甲基化；及
(B)步骤，当上述(A)步骤从血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少其中之一的CpG岛检测出甲基化时，评价该血清是采自乳腺癌转移患者的血清；
(8)一种血清评价方法，包括：
(a)步骤，测定从乳腺癌摘除术后患者采集的血清所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛有无甲基化；
(b)步骤，测定上述血清中所含乳腺癌肿瘤标志物的量；及
(c)步骤，当(a)步骤从血清中的选自由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少其中之一的CpG岛中检测出甲基化，且在(b)步骤获得的血清中肿瘤标志物含量为异常量时，评价该血清是否为从乳腺癌转移患者采集的血清。
附图说明：
图1为实施例1中运用PITPNM1引物组进行实时PCR的扩增曲线图。
图2为实施例1中运用GSTP1引物组进行实时PCR的扩增曲线图。
图3为实施例1中运用RASSF1A引物组进行实时PCR的扩增曲线图。
图4为实施例1中运用RARb引物组进行实时PCR的扩增曲线图。
图5为关于琼脂糖凝胶电泳确认在实施例1中实时PCR所产生的扩增产物的确认结果的、代替附图用的照片。
图6为实施例2中根据CA15-3和CEA含量以及GSTP1、RASSF1A和RARb的CpG岛有无甲基化来判断乳腺癌转移的结果示图。
具体实施方式：
(乳腺癌转移的判断方法)
本发明第一实施方式涉及的乳腺癌转移的判断方法(也称“判断方法1”)包括：获取步骤，获取进行了乳腺癌摘除手术后的患者的血清；检测步骤，检测获取步骤中获得的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛的甲基化；判断步骤，当检测步骤从GSTP1、RASSF1A和RARb构成的群体中的至少其中之一的CpG岛中检测出甲基化时，判断有乳腺癌转移。根据此判断方法1可以判断进行了乳腺癌摘除手术后的患者有无乳腺癌转移。
在本判断方法1中，对于进行了乳腺癌摘除手术后的患者无特别限定，但最好是乳腺癌摘除手术后三天以上的患者。这是因为术后三天以上，手术前存在的血液中的DNA将被分解，可以抑制被摘除的乳腺癌的DNA对判断结果的影响。
在本判断方法1中，获取患者血清的方法无特别限定，用通用的方法即可。比如可以将采自患者的血液注入试管，放置一会儿，使之分离成血清和血块。再对此分离成血清和血块的试样进行离心分离，完全分离出血清和血块。以此获得的离心分离后的上清可以作为血清。
上述GSTP1是谷胱甘肽S转移酶pi1基因。GSTP1的碱基序列如基因数据库登记号(Gene Bank accession No)：NC_000011所示。
上述RASSF1A是Ras相关区域家族1A基因。RASSF1A的碱基序列如基因数据库登记号：XM_011780所示。
上述RARb是维甲酸受体β基因。RARb的碱基序列如基因数据库登记号：S82362所示。
在本实施方式中，血清所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自CpG岛的甲基化可以用通用的方法检测出来。通用的方法比如有甲基化特异性PCR法和亚硫酸氢钠测序法(bisulfite sequencing)等。在这些方法中，用非甲基化胞嘧啶转换剂将待分析DNA的非甲基化胞嘧啶转化为胞嘧啶以外的碱基(非甲基化胞嘧啶转化处理)。
甲基化特异性PCR法使用的引物组可以在待分析DNA的胞嘧啶未变为尿嘧啶时用PCR法进行核酸扩增。在运用此引物组的PCR中，当检出核酸扩增产物时，就可以知道待分析DNA的胞嘧啶是甲基化胞嘧啶。上述引物组，可列举出由第一引物和第二引物构成的引物组等，该第一引物与上述GSTP1、RASSF1A和RARb中含CpG岛的碱基序列中CpG位点以外的胞嘧啶变为其他碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶等)的碱基序列构成的转化核酸发生退火反应，该第二引物与上述转化核酸的互补链发生退火反应。在本说明书中，“(与转化核酸或互补链)发生退火反应”指在甲基化特异性PCR的退火步骤中所采用的反应温度下，通过氢键与转化核酸或互补链结合。在本说明书中，后述“杂交”这一用语也指同样的意思。
亚硫酸氢钠测序法可以通过决定非甲基化胞嘧啶转化处理后的待分析DNA碱基序列来分析待分析DNA的甲基化。
非甲基化胞嘧啶诱变处理可以用众所周知的方法进行。这种方法无特别限制。进行非甲基化胞嘧啶转化处理的方法可以列举出用非甲基化胞嘧啶转化剂的方法等。此非甲基化胞嘧啶转化剂比如有亚硫酸氢钠等亚硫酸氢盐等。在非甲基化胞嘧啶转化处理中，如果使用亚硫酸氢盐作为非甲基化胞嘧啶转化剂，则非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。在使用亚硫酸氢盐的非甲基化胞嘧啶转化处理中，亚硫酸氢盐的浓度只要能充分转化血清中所含DNA的非甲基化胞嘧啶即可，无特别限定。更具体而言，从使血清中所含DNA的非甲基化胞嘧啶充分转化的观点出发，亚硫酸氢盐的浓度以1M以上为宜，1-15M更好，最好是3-10M。比如，当在血清中添加亚硫酸氢钠至最终浓度为4M时，在50-80℃下经过10-90分钟的培养，可以进行非甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的转化。当使用低浓度亚硫酸氢盐时，只要适当变更时间和温度，使非甲基化胞嘧啶可以充分转化即可。
用甲基化特异性PCR法检测GSTP1的CpG岛甲基化所用的具体引物组包含以下序列号：1和序列号：2所示各引物。序列号：1所示引物是正向引物(sense primer)(GSTP1正向引物)。序列号：2所示引物是反向引物(antisense primer)(GSTP1反向引物)。
5’-TTCGCGGGATTTTTTAGAAGAGC-3’(序列号：1)
5’-CACTAATAACGAAAACTACGACGACG-3’(序列号：2)
用序列号：1和序列号：2所示各引物进行核酸扩增的目标—含GSTP1启动子区的DNA碱基序列如序列号：13所示。
5’-TCCGCGGGACCCTCCAGAAGAGCGGCCGGCGCCGTGACTCAGCACTGGGGCGGAGCGGGGCGGGACCACCCTTATAAGGCTCGGAGGCCGCGAGGCCTTCGCTGGAGTTTCGCCGCCGCAGTCTTCGCCACCAGTG-3’(序列号：13)
序列号：1所示引物与序列号：13的第1-23位范围的碱基序列中与CpG位点以外的胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列互补的碱基序列的核酸杂交。序列号：2所示引物与序列号：13的第111-136号范围的碱基序列中CpG位点以外的胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交。
用于检测RASSF1A的CpG岛甲基化的具体引物组包含以下序列号：3和序列号：4所示各引物。序列号：3所示引物是正向引物(RASSF1A正向引物)。序列号：4所示引物是反向引物(RASSF1A反向引物)。
5’-ATAGTTTTTGTATTTAGGTTTTTATTGCGC-3’(序列号：3)
5’-ACCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG-3’(序列号：4)
用序列号：3和序列号：4所示各引物进行核酸扩增的目标—含RASSF1A启动子区的DNA的碱基序列如序列号：14所示。
5’-ACAGTCCCTGCACCCAGGTTTCCATTGCGCGGCTCTCCTCAGCTCCTTCCCGCCGCCCAGTCTGGATCCTGGGGGAGGCGCTGAAGTCGGGGCCCGCCCTGTGGCCCCGCCCGGCCCGCGCTTGCTAGCGCCCAAAGCCAGCGAAGCACGGGC-3’(序列号：14)
序列号：3所示引物与序列号：14的第1-30位范围的碱基序列中与CpG位点以外胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列互补的碱基序列的核酸杂交。序列号：4所示引物与序列号：14的第129-153位范围的碱基序列中由CpG位点以外的胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交。
用于检测RARb的CpG岛甲基化的具体引物组包含以下序列号：5和序列号：6所示各引物。序列号：5所示引物是正向引物(RARb正向引物)。序列号：6所示引物是反向引物(RARb反向引物)。
5’-GAATATCGTTTTTTAAGTTAAGTCGTC-3’(序列号：5)
5’-GAAACGCTACTCCTAACTCACG-3’(序列号：6)
用序列号：5和序列号：6所示各引物进行核酸扩增的目标—含RARb启动子区的DNA的碱基序列如序列号：15所示。
5’-GAACACCGTTTTCCAAGCTAAGCCGCCGCAAATAAAAAGGCGTAAAGGGAGAGAAGTTGGTGCTCAACGTGAGCCAGGAGCAGCGTCCC-3’(序列号：15)
序列号：5所示引物与序列号：15的第1-27位范围的碱基序列中与CpG位点以外的胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列互补的碱基序列的核酸杂交。序列号：6所示引物与序列号：15的第68-89位范围的碱基序列中CpG位点以外的胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列的核酸杂交。
检测GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛甲基化的引物组可适当设计，不限于上述引物组。
在本判断方法1，最好确认上述非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。进行此确认时，用众所周知的方法即可，无特别限制。比如可通过以下步骤确认非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行：
(1)在要确认非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行的待分析DNA中，先认定含有非甲基化胞嘧啶的区域的一定碱基序列；
(2)用具有能与非甲基化胞嘧啶转化处理后的一定碱基序列的核酸杂交的引物的控制引物组进行PCR，其中所述引物即在PCR的退火步骤中，与上述DNA中非甲基化胞嘧啶全部转化为其他碱基的转化核酸或其互补链发生退火反应的引物；
(3)检出PCR的扩增产物；
在此，如果在上述(3)检出扩增产物，则表示非甲基化胞嘧啶转化处理适当进行。反之，如果在上述(3)未检出扩增产物，则表示非甲基化胞嘧啶转化处理没有适当进行。即当非甲基化胞嘧啶转化处理使一定碱基序列的非甲基化胞嘧啶转化时，可以用控制引物组进行PCR核酸扩增，因此能够检出扩增产物。反之，当特定的碱基序列的非甲基化胞嘧啶未转化时，不能用控制引物组进行PCR核酸扩增，故检测不出扩增产物。
因此，根据用上述控制引物组进行PCR所产生的扩增产物的检测结果，可以确认非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行。
具体的控制引物组可包含以下序列号：7和序列号：8所示各引物。序列号：7所示引物为正向引物。序列号：8所示引物为反向引物。
5’-GGGATATTAAGTGGAGTTATTTTGGTTTTAGTT-3’(序列号：7)
5’-CCCTCCCAACATCCTTCCTAA-3’(序列号：8)
用序列号：7和序列号：8所示各引物进行核酸扩增的目标碱基序列是含磷脂酰肌醇转移蛋白(PITPNM1)的启动子区的DNA碱基序列。核酸扩增目标—含PITPNM1启动子区的DNA碱基序列如序列号：16所示。
5’-GGGATACCAAGTGGAGCCACTCTGGCCTCAGCCTGAGGAGGGCTCACCCCCTGGGAAGAGGACGGAGTGGCTGCCTAGGCGCGTGGAGAGCCGGCGAGGGCCAGGGGTCCAGGAAGGATGCTGGGAGGG-3’(序列号：16)
序列号：7所示引物与序列号：16的第1-33位范围的碱基序列中与胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列互补的碱基序列的核酸杂交。序列号：8所示引物与序列号：16的第109-129位范围的碱基序列中由胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列构成的核酸杂交。在此，序列号：16所示PITPNM1的胞嘧啶已在从乳腺癌组织和正常乳腺提取的DNA的亚硫酸氢钠测序中预先确认过，全都是非甲基化胞嘧啶。
控制引物组可适当设计，不限于上述引物组。
在本判断方法1的判断步骤中，当检测步骤从GSTP1、RASSF1A和RARb构成的群体中的至少其中之一的CpG岛中检测出甲基化时，判断有乳腺癌转移。这与当GSTP1、RASSF1A和RARb全部CpG岛均非甲基化时判断乳腺癌未转移具有同等意义。根据此判断可以灵敏、方便地鉴别乳腺癌转移的患者。
在本判断方法1，当已确认上述非甲基化胞嘧啶转化处理是否适当进行后，在判断步骤可以一并判断判断结果的可靠性。即，当非甲基化胞嘧啶转化处理适当进行时，可以判断为判断结果的可靠性高。反之，当非甲基化胞嘧啶转化处理未适当进行时，可以判断为判断结果的可靠性低。如此连判断结果的可靠性也一并判断，可以更准确地鉴别乳腺癌转移的患者。
本说明书中所谓“乳腺癌转移”指乳腺癌细胞到达与原发灶不同的地方，在那里又增生，第二次生成同一种肿瘤。所谓“远处转移”指癌转移到距原发灶较远的脏器和淋巴结。已知乳腺癌容易远处转移到锁骨上的淋巴结、肺、骨、肝、脑等。
本发明另一实施方式涉及的乳腺癌转移判断方法(也称“判断方法2”)包括：获取步骤，获取进行了乳腺癌摘除手术后的患者的血清；检测步骤，检测在获取步骤中获得的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自CpG岛的甲基化；定量步骤，测定在获取步骤中获得的血清中所含乳腺癌肿瘤标志物的量；判断步骤，当检测步骤从GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛中检测出甲基化，且在定量步骤获得的肿瘤标志物含量异常时，判断有乳腺癌转移。
本判断方法2中的获取步骤及检测步骤分别与上述判断方法1的获取步骤及检测步骤相同。本判断方法2的说明所用用语中，与上述判断方法1的说明所用用语共同的用语，也与上述判断方法1的说明所用用语具有相同意思。
在此，乳腺癌的肿瘤标志物比如有CA15-3(糖类抗原15-3)、CEA(癌胚抗原)、BCA225(乳腺癌相关抗原-225)、NCC-ST-439(国家癌症中心-ST439)和HER2(人表皮生长因子受体2)等。尤以CA15-3和CEA为宜。
测定乳腺癌肿瘤标志物量的方法用众所周知的测定方法即可，没有特别限制，比如用乳腺癌肿瘤标志物的抗体以蛋白质水平测定乳腺癌肿瘤标志物的量的方法、用基于编码乳腺癌肿瘤标志物的核酸或其互补链的引物组、探针、多核苷酸等，以核酸水平测定乳腺癌肿瘤标志物量的方法等。测定乳腺癌肿瘤标志物量的装置和试剂通常市场有售。比如，测定CA15-3的量可以用富士REBIO株式会社产LUMIPULSE(注册商标)f全自动化学发光酶免疫分析仪和LUMIPULSE(注册商标)CA15-3测定试剂。测定CEA的量可以采用贝克曼-库尔特公司产UniCel DxI 800 Access(注册商标)全自动化学发光免疫分析系统和Access(注册商标)CEA测定试剂。
在本判断方法2的判断步骤，当从GSTP1、RASSF1A和RARb构成的群体中的至少其中之一的CpG岛中检测出甲基化时，判断有乳腺癌转移，这与上述判断方法2相同。
在此，在本判断方法2的判断步骤，当定量步骤测得的肿瘤标志物量为异常量时也判断为乳腺癌转移。这与当肿瘤标志物量为正常量时判断乳腺癌未转移具有相同意义。据此判断可以更准确地鉴别乳腺癌转移的患者。
在此所谓“异常量”表示获取步骤中获得的血清中乳腺癌肿瘤标志物含量超出健康人血清中所含乳腺癌肿瘤标志物量的范围。另一方面，所谓正常量表示获取步骤中获得的血清中乳腺癌肿瘤标志物含量在健康人血清中所含乳腺癌肿瘤标志物量的范围之内。判断是异常量还是正常量时，可以将在定量步骤获得的肿瘤标志物量与一定阈值比较，根据其比较结果作出判断。更具体而言，可以在定量步骤获得的肿瘤标志物量超过一定阈值时视其为异常量，将一定阈值以下的值视为正常量。一定阈值可以根据数名健康人和数名乳腺癌转移患者的血清中乳腺癌肿瘤标志物含量的测定结果加以设定。当使用上述市售的测定乳腺癌肿瘤标志物量的仪器和试剂时，也可以采用其使用说明书上的阈值。
如上所述，采用本发明的乳腺癌转移判断方法，判断时不使用过去的图像检查所用仪器，可以在不给患者带来不快的情况下，低成本、方便地判断进行了乳腺癌摘除手术后的患者有无乳腺癌转移。根据此乳腺癌转移判断方法，也可以在乳腺癌摘除手术后，定期地用该判断方法判断有无乳腺癌转移、特别是有无乳腺癌远处转移，以便尽早查出由于乳腺癌转移而造成的复发。
(其他应用例)
应用上述乳腺癌判断方法，可以对血清进行评价，评价血清是否为从乳腺癌转移患者采集的血清，即可以提供乳腺癌转移可能性的指标，进行鉴别乳腺癌转移的检查等。这些检查机构提供的乳腺癌转移的信息，可以帮助医生进行诊断。
本发明的血清评价方法之一(评价方法1)，包括：(A)步骤，测定从乳腺癌摘除术后患者采集的血清所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛中有无甲基化；及
(B)步骤，当上述(A)步骤从血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb构成的群体中的至少其中之一的CpG岛检测出甲基化时，评价该血清是采自乳腺癌转移患者的血清。
本发明的血清评价方法之二，包括：(a)步骤，测定从乳腺癌摘除术后患者采集的血清所含GSTP1、RASSF1A和RARb在各自CpG岛中有无甲基化；
(b)步骤，测定上述血清中所含乳腺癌肿瘤标志物的量；及
(c)步骤，当(a)步骤从血清中的GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中的至少其中之一的CpG岛中检出甲基化，且在(b)步骤获得的血清中的肿瘤标志物含量为异常量时，评价该血清为从乳腺癌转移患者采集的血清。
评价方法1和评价方法2说明中所使用的用语中，与前述判断方法1说明所用用语共同的用语，具有与判断方法1的说明中所用用语相同的意思。
评价方法1的(A)步骤和评价方法2的(a)步骤可以与判断方法1的检测步骤同样操作进行。
评价方法1的(B)步骤可以在检查机构等进行。在此(B)步骤中，当上述(A)步骤在从血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少其中之一的CpG岛中检测出甲基化时，就评价该血清是采自乳腺癌转移患者的血清。
在评价方法1的(B)步骤，可以通过将评价方法1的(A)步骤所获得的结果与标准进行比较，以此来评价血清是否为乳腺癌转移患者的血清，这一标准是，当血清含有的DNA在由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少其中之一的CpG岛中存在甲基化时，说明该血清是乳腺癌转移患者的血清。所得比较结果了可以提供给乳腺癌转移判断者，作为乳腺癌转移可能性的指标。
通过这种比较结果，可以获得乳腺癌转移鉴别用数据，以此可判断患者是有乳腺癌转移。
另一方面，评价方法2的(b)步骤可以与判断方法1的定量步骤同样操作进行。评价方法2的(c)步骤可以由检查机构等实施。在此(c)步骤，当上述(a)步骤中，从血清所含GSTP1、RASSF1A和RARb组成的组中至少其中之一的CpG岛检出甲基化，且在(b)步骤血清中肿瘤标志物含量为异常量时，评价该血清是从乳腺癌转移患者采集的血清。
在上述评价方法2的(c)步骤，通过将上述(a)步骤和(b)步骤获得的结果与标准进行比较，就能够评价血清是否为从乳腺癌转移患者采集的血清。该标准即：当血清中所含DNA在由GSTP1、RASSF1A和RARb组成的物质群中的至少其中之一的CpG岛存在甲基化，且肿瘤标志物量为异常量时，该血清是乳腺癌转移患者的血清。所得比较结果也可以提供给乳腺癌转移的判断者，将其作为乳腺癌转移可能性的指标。
根据上述比较结果还可以获得乳腺癌转移鉴别用数据，并据此患者是否有乳腺癌转移。
采用本发明的血清评价方法，与上述乳腺癌转移的判断方法一样，不用传统的图像检查所使用的仪器，评价时不会给患者带来痛苦，可以低成本、简便地获得判断乳腺癌摘除术后患者是否有乳腺癌转移的指标。
下面举实施例详细说明本发明，但本发明不受这些实施例所限。
实施例
(实施例1)
(1)获得血清
从诊断为乳腺癌远处转移复发的6名患者分别用加有血清分离剂的采血管(泰尔茂株式会社产，商品名：VENOJECT II真空采血管)各采血约6ml。采血30分钟后，对采血管以1200G离心分离10分钟。离心分离后，取上清作为血清。
(2)血清中所含DNA的非甲基化胞嘧啶转化处理
向300μl血清中添加8M盐酸胍水溶液300μl和20mg/ml蛋白酶K(西格玛奥德里奇公司制)水溶液20μl并进行混合，所得混合物在50℃保温1小时。然后，向保温后的混合物中添加10M氢氧化钠水溶液20μl并进行混合，所得混合物在室温下保温10分钟。再在保温后的混合物中添加10M亚硫酸氢钠水溶液600μl并进行混合，所得混合物在80℃保温40分钟，如此进行亚硫酸氢钠处理。用纯化试剂盒(QIAGEN公司制，商品名：Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR purification kit))提纯经亚硫酸氢钠处理的试样中所含的DNA，用50μl蒸馏水溶出提纯物加以回收。在回收的DNA溶液50μl中添加3M氢氧化钠溶液5.5μl并进行混合，室温保温。5分钟后立即用凝胶过滤载体(GE医疗集团制，商品名：sephacryl S-300)纯化所得混合物，以除去氢氧化钠。以回收的DNA溶液为甲基化检测用溶液。
(2)用甲基化特异性PCR法检测甲基化胞嘧啶
用上述甲基化检测用溶液以下述条件进行实时PCR。
(2-1)用PITPNM1引物组进行实时PCR
为确认非甲基化胞嘧啶转化处理是否充分进行，用PITPNM1引物组作为控制引物组进行了实时PCR。PITPNM1引物组包括上述序列号：7所示引物、序列号：8所示引物和以下序列号：9所示荧光标记探针。荧光标记探针在运用了实时PCR法的荧光检测法中，用于检测扩增产物。
FAM-ATTTTTTGGGAAGAGGATGGAGTGGTTGTTTAGG-DarkQuencher(序列号：9)
FAM(5-羧基-萤光素)为荧光色素，DarkQuencher(Dark Quencher(益鹏生物科技(Epoch Biosciences)公司的注册商标))表示淬火剂(激发能吸收剂)。序列号：9所示荧光探针在序列号：16的第46-80位范围的碱基序列中，与由胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列构成的部分杂交。
采用PITPNM1引物组的实时PCR的反应液成分如下：
[表1]
Figure BPA00001331140700151
采用PITPNM1引物组的实时PCR的反应条件如下：
[表2]
Figure BPA00001331140700152
(2-2)采用GSTP1引物组的实时PCR
检测GSTP1的CpG岛甲基化的GSTP1引物组包括序列号：1所示引物、序列号：2所示引物和以下序列号：10所示荧光标记探针。
FAM-ATAAGGTTCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGT-DarkQuencher(序列号：10)
序列号：10所示荧光标记探针在序列号：13的第74-103位范围的碱基序列与由CpG位点以外的胞嘧啶转化为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列构成的部分杂交。
用GSTP1引物组进行实时PCR的反应液其成份如下。
[表3]
Figure BPA00001331140700153
GSTP1引物组进行实时PCR的反应条件与PITPNM1引物组一样。
(2-3)用RASSF1A引物组的实时PCR
检测RASSF1A的CpG岛甲基化的RASSF1A引物组包括序列号：3所示引物、序列号：4所示引物和以下序列号：11所示荧光标记探针。
FAM-TTGAAGTCGGGGTTCGTTTTGTGGTTTCGT-DarkQuencher(序列号：11)
序列号：11所示荧光标记探针在序列号：14的第81-111碱基序列与由CpG位点以外的胞嘧啶转为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列构成的部分杂交。
用RASSF1A引物组进行实时PCR的反应液其组分如下。
[表4]
Figure BPA00001331140700161
RASSF1A引物组进行实时PCR的反应条件与PITPNM1引物组一样。
(2-4)用RARb引物组的实时PCR
检测RARb的CpG岛甲基化的RARb引物组包括序列号：5所示引物、序列号：6所示引物和以下序列号：12所示荧光标记探针。
FAM-AGGCGTAAAGGGAGAGAAGTTGGTGTTTA-DarkQuencher(序列号：12)
序列号：12所示探针在序列号：15的第38-67位范围碱基序列，与由CpG位点以外的胞嘧啶转为尿嘧啶或胸腺嘧啶的碱基序列构成的部分杂交。
用RARb引物组进行实时PCR的反应液其成份如下。
[表5]
RARb引物组进行实时PCR的反应条件与PITPNM1引物组一样。
(3)乳腺癌转移的判断及血清的评价
图1-4显示了上述实时PCR的扩增曲线的结果。在此，图1是实施例一中运用PITPNM1引物组进行实时PCR的扩增曲线图。图2为实施例一中运用GSTP1引物组进行实时PCR的扩增曲线图。图3为实施例一中运用RASSF1A引物组进行实时PCR的扩增曲线图。图4为实施例一中运用RARb引物组进行实时PCR的扩增曲线图。图5是用照片代替附图，显示了用琼脂糖凝胶电泳确认在实施例一中实时PCR所产生的扩增产物的结果。图1-5中的“蒸馏水”是用蒸馏水代替甲基化检测用溶液进行实时PCR的结果。
从图1和图5所示结果可以看出，用PITPNM1引物组进行实时PCR时，除蒸馏水外的六种样本全部有扩增产物。由此得知，六个样本的非甲基化胞嘧啶转化处理全部适当进行。
从图2和图5所示结果可以看出，在样本1和样本4中发现，用GSTP1引物组进行实时PCR时有扩增产物。由此得知，样本1和样本4的GSTP1的CpG岛己甲基化。
从图3和图5所示结果可以看出，在样本4中发现，用RASSF1A引物组进行实时PCR时有扩增产物。由此得知，样本4的RASSF1A的CpG岛己甲基化。
从图4和图5所示结果可以看出，在样本1、样本2、样本3和样本6中发现用RARb引物组进行实时PCR有扩增产物。由此得知，样本1、样本2、样本3和样本6的RARb的CpG岛己甲基化。
从以上结果得知，从诊断为乳腺癌远处转移复发的6名患者获得的六个样本血清中，有五个样本在GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛检测出甲基化。由此说明，在本实施例，诊断为乳腺癌远处转移复发的六个样本中，有五个样本可以判断为有乳腺癌转移。
由此结果得知，根据血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛有甲基化，就可以判断为乳腺癌远处转移。
可以看出，可以根据检测出血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛有甲基化时，该血清是乳腺癌转移患者的血清这一基准，通过检测血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛的甲基化，来评价上述血清是否为采自乳腺癌转移患者的血清。
(实施例2)
(1)获得血清
用与实施例1相同的方法，从诊断为乳腺癌远处转移复发的34名患者获得血清。
(2)CA15-3及CEA的测定
就获取的血清，分别测定肿瘤标志物CA15-3和CEA的量。CA15-3的量用富士REBIO株式会社产LUMIPULSE(注册商标)f和LUMIPULSE(注册商标)CA15-3测定。CEA的量用贝克曼-库尔特公司产UniCel DxI 800 Access(注册商标)和Access(注册商标)CEA测定。在此，CA15-3在血清中浓度超过30U/ml的样本被判定为乳腺癌转移阳性的样本。CEA在血清中浓度超过5ng/ml的样本被判定为乳腺癌转移阳性的样本。
(3)检测GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛的甲基化
用与上述实施例1同样的方法，分别就所获取的血清，检查GSTP1、RASSF1A和RARb的各CpG岛有无甲基化。在此，GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛检出甲基化的样本被判定为乳腺癌转移阳性的样本。
(4)乳腺癌转移的判断及血清的评价
在实施例2，根据CA15-3和CEA的量以及GSTP1、RASSF1A和RARb的各CpG岛有无甲基化来判断乳腺癌转移的结果见图6。图中，带框的各数字表示以CEA量为指标判定乳腺癌转移为阳性的样本数目、以CA15-3量为指标判定乳腺癌转移为阳性的样本数目或以GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛的甲基化为指标判定乳腺癌转移为阳性的样本数目。图中，二个以上框重叠部分的各数字表示，用相应二个以上指标均判定乳腺癌转移为阳性的样本数目。
从图6所示结果得知，在以CA15-3量和CEA量二者为指标的传统乳腺癌转移的判定方法中，34个样本中的11个样本判定为乳腺癌转移阴性。用判定为阳性的样本数/全部样本数计算上述判定的灵敏度的话，以CA15-3量和CEA量二者为指标判定乳腺癌转移灵敏度仅为68％(判定为阳性的23个样本/全部34个样本)。
然而，在以CA15-3量和CEA量二者为指标判定乳腺癌转移的基础上，再加上以甲基化为指标进行的判定时，以CA15-3和CEA各自的量为指标判断为乳腺癌转移阴性的11个样本中，有6个样本判断为乳腺癌转移为阳性，灵敏度提高到85％(判断为阳性的29个样本/全部34个样本)。
同时得知，将以CA15-3量或CEA量为指标判定乳腺癌转移与甲基化检测判定乳腺癌转移组合起来，也有约85％(分别为判断为阳性的29个样本/全部34个样本)的灵敏度。
从以上结果可以知道，在传统的用乳腺癌肿瘤标志物判断乳腺癌转移的基础上，再加上根据GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛内的甲基化来判定乳腺癌转移，可以更灵敏地判断乳腺癌转移。
并得知，根据在血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛内检测出甲基化，且血清中的肿瘤标志物含量为异常量时，根据该血清为乳腺癌转移患者的血清这一标准，通过测定血清中所含乳腺癌肿瘤标志物含量，同时检测此血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb中的至少其中之一的CpG岛内的甲基化，可以评价上述血清是否为采自乳腺癌转移患者的血清。
序列表自由文本
序列号：1为GSTP1正向引物的序列。
序列号：2为GSTP1反向引物的序列。
序列号：3为RASSF1A正向引物的序列。
序列号：4为RASSF1A反向引物的序列。
序列号：5为RARb正向引物的序列。
序列号：6为RARb反向引物的序列。
序列号：7为PITPNM1正向引物的序列。
序列号：8为PITPNM1反向引物的序列。
序列号：9为探针的序列。
序列号：10为探针的序列。
序列号：11为探针的序列。
序列号：12为探针的序列。
Figure IPA00001331140200011
Figure IPA00001331140200021
Figure IPA00001331140200041
Figure IPA00001331140200051

Claims (8)

1.一种乳腺癌转移的判断方法，包括：
获取步骤，获取乳腺癌摘除术后患者的血清；
检测步骤，检测获取步骤中所获取的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛中的甲基化；
判断步骤，当检测步骤中选自由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少之一的CpG岛检测出甲基化时，判断为乳腺癌转移。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，转移是远处转移。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在检测步骤中，用甲基化特异性PCR法检测GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛的甲基化。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，甲基化特异性PCR法用以下三个引物组实施：
含有序列号1和序列号2所示引物的第一引物组，
含有序列号3和序列号4所示引物的第二引物组，
含有序列号5和序列号6所示引物的第三引物组。
5.一种乳腺癌转移的判断方法，包括：
获取步骤，获取乳腺癌摘除术后患者的血清；
检测步骤，检测在获取步骤中所获取的血清中含有的GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛的甲基化；
定量步骤，测定在获取步骤中获得的血清中所含乳腺癌肿瘤标志物的量；
判断步骤，当检测步骤从选自由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少之一的CpG岛中检测出甲基化，且在定量步骤获得的肿瘤标志物含量为异常量时，判断为乳腺癌转移。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，乳腺癌肿瘤标志物是CEA和/或CA15-3。
7.一种血清评价方法，包括：
(A)步骤，测定从乳腺癌摘除术后患者的采集的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛有无甲基化；及
(B)步骤，当所述(A)步骤从血清中所含的选自由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少之一的CpG岛检测出甲基化时，评价该血清是采自乳腺癌转移患者的血清。
8.一种血清评价方法，包括：
(a)步骤，测定从乳腺癌摘除术后患者采集的血清中所含GSTP1、RASSF1A和RARb各自的CpG岛有无甲基化；
(b)步骤，测定所述血清中所含乳腺癌肿瘤标志物的量；及
(c)步骤，当(a)步骤从血清中的选自由GSTP1、RASSF1A和RARb构成的组中至少之一的CpG岛中检测出甲基化，且在(b)步骤获得的血清中肿瘤标志物含量为异常量时，评价该血清是从乳腺癌转移患者采集的血清。
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