CN105408494A

CN105408494A - 预测肾细胞癌的预后的方法

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Publication number: CN105408494A
Application number: CN201380036415.8A
Authority: CN
Inventors: 金井弥荣; 新井惠吏; 田迎
Original assignee: JAPAN GOVERNMENT
Current assignee: JAPAN GOVERNMENT
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2033-04-30
Also published as: US20200199684A1; JP6532069B2; EP2848697A1; JP6532072B2; KR20190115118A; JP6532071B2; US20150118681A1; KR102082098B1; JP6532070B2; JP6335118B2; CN105408494B; JP2018148900A; EP2848697B1; JP2018139599A; KR20190116550A; KR102082099B1; KR20150031231A; JPWO2013168644A1; JP2018139600A; KR102067849B1

Abstract

为了提供简便且灵敏度和特异性高的检测肾细胞癌预后不良的风险的方法，对正常肾组织、来自肾细胞癌患者的非癌组织和肾细胞癌进行了甲基化组分析。结果表明，通过检测FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5和NKX6-2基因的至少一个CpG位点的DNA甲基化水平，能够检测肾细胞癌预后不良的风险。

Description

预测肾细胞癌的预后的方法

技术领域

本发明涉及包含检测DNA甲基化水平的用于检测肾细胞癌预后不良风险的方法。而且，本发明还涉及用于该方法的寡核苷酸。

背景技术

肾细胞癌(RCC)经常会发生在属于劳动力的壮年期，一方面有很多病例通过肾切除术而根治，然而迅速引起远处转移的病例也明显存在，两组病例在临床过程有很大差异。此外，即使发生转移，免疫疗法和分子靶向治疗药物等有效的病例是公知的。如果对复发可能性高的病例密切观察，早期诊断复发，追加后期治疗，有可能能够改善预后。然而，即使是属于组织病理学异型性低、组织学类型最常见的透明细胞型RCC，也有造成急速远处转移的病例，根据现有的临床病理因子等预测预后是困难的。

公知透明细胞型RCC的特征在于VHL肿瘤抑制基因的失活。此外，RCC系统性的再测序和外显子分析在癌基因组图谱计划，癌基因组计划以及其它的国际策略中实施。而且，通过这样的策略，已经阐明作为组蛋白H3赖氨酸36甲基转移酶的SETD2，作为组蛋白H3赖氨酸4去甲基化酶的JARID1C(KDM5C)，作为组蛋白H3赖氨酸27去甲基化酶的UTX(KDM6A)，作为SWI/SNF染色质重塑因子的PBRM1等的组蛋白修饰基因的失活参与肾细胞癌的发生(非专利文献1～3)。另外，也报道了在RCC中的NF2基因的非同义突变和MLL2基因的缺失突变(非专利文献1)。然而，这些基因突变并不能完全解释上述RCC中的临床过程的差异等(临床病理学的多样性)。

在癌症的发生过程中，不仅认识到遗传现象，也认识到外遗传现象，这两种现象在各种组织中彼此相关而导致临床病理学的多样性。此外，认为DNA甲基化的改变是人类癌症中主要的外遗传变化之一。

实际上，对于RCC，本发明者们根据基于甲基化特异性PCR(MSP)，COBRA(组合使用亚硫酸氢盐和限制性酶的分析)以及细菌人工染色体(BAC)阵列的甲基化CpG岛的扩增方法(BAMCA方法)，通过分析，已经发现从RCC患者获得的非癌肾皮质组织表现出与DNA甲基化状态的改变相关的癌前阶段(专利文献1和非专利文献4-7)。此外，根据BAMCA法的全基因组分析，表明在癌前阶段中非癌肾皮质组织的DNA甲基化的改变，也延续到同一患者相应的RCC中，已成功地开发了用于预测RCC病例预后的方法(专利文献1和非专利文献6)。

然而，通过BAMCA方法评价DNA甲基化状态的技术是复杂的，而且，在通过所述BAMCA方法预测RCC病例的预后的情况中，由于发明当时BAC克隆可覆盖的染色体区域非常有限，并没有真正鉴定到诊断能力高的甲基化CpG位点。

另外，已经明确了癌症与DNA甲基化相关，在大肠癌和胃癌等中，存在以下癌症性状:积累与病例临床病理因子相关的CpG岛的DNA甲基化的增强(CIMP)(非专利文献8～11)。

然而，对于肾细胞癌，认为CIMP阳性性状和肾细胞癌的关联并不明确(非专利文献12)。事实上，各肿瘤中甲基化CpG的数目表现出不同于预期的泊松分布的分布，虽然基于该发现，推定一部分的肾细胞癌表现出CIMP的可能性，但是，在肾脏中，并没有确定CIMP阳性肾细胞癌的存在，也没有鉴定出特征性的明确的CpG位点(非专利文献13)。

由于所述状况，对于肾细胞癌，虽然一直期待表明肾细胞癌中存在与RCC临床病理因子强烈相关的CpG岛中DNA甲基化积累的特征(CIMP)，鉴定成为CIMP标志物的CpG位点，获得能够方便且高灵敏度和高特异性地预测RCC预后的方法，但是现状是这些都还没有实用化。

现有技术

专利文献

专利文献1:特开2010-63413号公报

非专利文献

非专利文献1:DalglieshG.L.等人，Nature，2010年463卷，第360-363页

非专利文献2:VanHaaftenG.等人，Nat.Genet.，2009年第41卷，第521-523页

非专利文献3:VarellaI.等人，Nature，2011年第469卷，第539-542页

非专利文献4:AraiE.等人，Clin.CancerRes.，2008年第14卷，第5531-5539页

非专利文献5:AraiE.等人，IntJCancer，2006年第119卷，第288-296页

非专利文献6:AraiE.等人，Carcinogenesis，2009年第30卷，第214-221页

非专利文献7:AraiE.等人，Pathobiology，2011年第78卷，第1-9页

非专利文献8:IssaJ.P.，Nat.Rev.Cancer，2004年第4卷，第988-993页

非专利文献9:ToyotaM.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999年第96卷，第8681-8686页

非专利文献10:ShenL等人，ProcNatlAcadSciUSA，2007年第104卷，第18654-18659页

非专利文献11:ToyotaM.等人，CancerRes.，1999年第59卷，第5438-5442页

非专利文献12:Morris,M.R.等人，GenomeMed.，2010年2(9):59

非专利文献13:McRonald,F.E.等人，Mol.Cancer，2009年8:31

发明概述

发明所要解决的课题

本发明的目的是提供一种方便且高灵敏度和高特异性的用于确定肾细胞癌预后不良的风险的方法。

解决课题的手段

为了达到上述目的，本发明者们采用1个CpG分辨率的Infinium阵列，对29个正常肾皮质组织(C)样本，透明细胞型肾细胞癌(透明细胞RCC)患者获得的107个非癌肾皮质组织(N)样本和109个癌组织(T)样本，进行了甲基化组(methylome)分析。其结果表明，样本N的DNA甲基化水平与样本C比较，在4830个CpG位点已经发生了改变。另外，鉴定了801个CpG位点，这些位点在样本N中产生DNA甲基化的改变，而且在样本T中这些改变继续增强，根据在这801个CpG位点上的DNA甲基化水平，进行了无监督层次聚类分析。其结果发现肾细胞癌可分为集群A(n＝90)和集群B(14例)。而且，在该集群B中，聚集了临床病理学上恶性度高的肿瘤，而且，发现属于该集群B的患者的无癌存活率(无复发存活率)和总体存活率(总存活率)与属于集群A的患者相比显著降低。即，明确了属于集群B的肾细胞癌具有基于CpG岛中DNA高度甲基化的积累所带来的特征，是CpG岛甲基化性状(CIMP)阳性的癌症。

此外，也第一次发现FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5以及NKX6-2基因的CpG位点中DNA高度甲基化是肾细胞癌中CIMP的特征。

另外，专利文献1和非专利文献6所表明的，通过检查DNA甲基化的有无，鉴定的有效预测肾细胞癌预后的与肾细胞癌相关的区域(70个BAC克隆)中，不包含本发明鉴定的17个基因的CpG位点的任一个。

而且，还确认了可以使用除Infinium阵列(使用焦磷酸测序法和质谱仪的DNA甲基化分析法)分析以外的方法检测这17个基因的CpG位点中高度甲基化状态，并完成了本发明。更具体地，本发明如下所述。

<1>一种检测肾细胞癌的预后不良风险的方法，其包括以下(a)～(c)的步骤

(a)制备来自受试者肾脏组织的基因组DNA的步骤，

(b)检测步骤(a)制备的基因组DNA中基因的至少一个CpG位点的DNA甲基化水平的步骤，所述基因选自以下基因组成的基因群:FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5和NKX6-2，

(c)根据步骤(b)检测到的DNA甲基化水平，确定所述受试者是否分类为预后不良组的步骤。

<2>根据<1>所述的方法，其中步骤(b)是通过亚硫酸氢盐处理步骤(a)制备的基因组DNA，检测所述CpG位点的DNA甲基化水平的步骤。

<3>一种用于<1>或<2>所述方法中的寡核苷酸，其具有至少12个碱基的链长度，所述寡核苷酸为下述(a)～(b)中记载的任一个

(a)寡核苷酸，所述寡核苷酸是设计成夹着选自上述基因群的基因的至少一个CpG位点的一对引物，

(b)寡核苷酸，所述寡核苷酸是与含有选自上述基因群的基因的至少一个CpG位点的核苷酸杂交的引物或探针。

发明的效果

能够方便且高灵敏度和高特异性地确定肾细胞癌预后不良的风险。

附图的简单说明

图1是显示来自透明细胞型肾细胞癌患者的非癌肾皮质组织(N)和肿瘤组织(T)的组织学差异的显微镜照片。即，N主要由近端肾小管组成。另一方面，在T中观察到胞状构造，而且，肿瘤细胞的细胞质中充满脂质和糖原，清晰地由细胞膜包围。此外，显微镜照片显示肿瘤细胞的细胞核倾向呈圆形，伴有细粒状均匀分布的染色质。

图2显示通过Infinium测试检测到的ZFP42基因CpG位点相关的DNA甲基化水平(β值)与通过焦磷酸测序检测到的ZFP42基因CpG位点相关的DNA甲基化水平的相关性的图。

图3显示通过Infinium测试检测到的ZFP154基因CpG位点相关的DNA甲基化水平(β值)与通过焦磷酸测序检测到的ZFP154基因CpG位点相关的DNA甲基化水平的相关性的图。

图4显示通过Infinium测试检测到的ZFF540基因CpG位点相关的DNA甲基化水平(β值)与通过焦磷酸测序检测到的ZFF540基因CpG位点相关的DNA甲基化水平的相关性的图。

图5是显示能够通过无监督层次聚类分析，采用801个探针(CpG位点)测定的癌组织(T)和非癌组织(N)间DNA甲基化水平的差值(Δβ_T-N)进行细分群，将104例透明细胞型肾细胞癌患者细分群为集群A(n＝90)和集群B(14例)的图。另外，采用上述801个探针测定的DNA甲基化，在癌前阶段已经发生变化，可以认为其参与后继的肾细胞的癌变。

图6是显示透明细胞型肾细胞癌患者(属于集群A的患者和属于集群B的患者)术后无复发存活率的随时间变化的图。

图7是显示透明细胞型肾细胞癌患者(属于集群A的患者和属于集群B的患者)术后总存活率的随时间变化的图。

图8是显示相对于Infinium测试检测对象的所有26454个探针，透明细胞型肾细胞癌患者的非癌组织(样本N)和该患者的癌组织(样本T)之间的DNA甲基化水平的差(Δβ_T-N的绝对值)在0.1以上的探针比率的图。在图中，“全部病例”表示分析的所有透明细胞型肾细胞癌患者的结果，“A”表示分析的透明细胞型肾细胞癌患者中，属于集群A的透明细胞型肾细胞癌患者，“B”表示分析的透明细胞型肾细胞癌患者中，属于集群B的透明细胞型肾细胞癌患者。棒表示SD(标准偏差)，“NS”表示没有观察到显著差异(图9-12同样如此表示)。

图9是显示相对于Infinium测试检测对象的所有26454个探针，样本N和样本T之间的DNA甲基化水平的差(Δβ_T-N的绝对值)在0.2以上的探针比率的图。

图10是显示相对于Infinium测试检测对象的所有26454个探针，样本N和样本T之间的DNA甲基化水平的差(Δβ_T-N的绝对值)在0.3以上的探针比率的图。

图11是显示相对于Infinium测试检测对象的所有26454个探针，样本N和样本T之间的DNA甲基化水平的差(Δβ_T-N的绝对值)在0.4以上的探针比率的图。

图12是显示相对于Infinium测试检测对象的所有26454个探针，样本N和样本T之间的DNA甲基化水平的差(Δβ_T-N的绝对值)在0.5以上的探针比率的图。

图13是散布图，其显示对属于集群A的代表性透明细胞型肾细胞癌患者(案例1-4)，对肾细胞癌组织(样本T)的DNA甲基化水平(β值)与非癌肾组织(样本N)的DNA甲基化水平进行关联的结果。

图14是散布图，其显示对属于集群B的代表性透明细胞型肾细胞癌患者(案例5-8)，对肾细胞癌组织(样本T)的DNA甲基化水平(β值)与非癌肾组织(样本N)的DNA甲基化水平进行关联的结果。该图中被圈的部分表示DNA甲基化水平在样本N中低，与对应的样本N比较，样本T的DNA高度甲基化程度更显著的探针的分布。

图15是显示表14所示的以CpG岛甲基化性状(CIMP)为特征的16个探针(16CpG位点)的DNA甲基化水平与属于上述集群A或集群B的透明细胞型肾细胞癌患者相关联的图。在该图中，实心黑色区域表示该Δβ_T-N是大于0.4。

图16是表示使用集群A和集群B之间DNA甲基化水平(Δβ_T-N)显著不同的869个探针(FDR[q＝0.01])，进行随机森林分析的结果的图。在该图中，折线从上到下表示垃圾信息(spam)(3)，袋外信息(out-of-bag；OOB)，非垃圾信息(nonspam)(1)。横轴表示树(tree)的数量，纵轴表示推测误差(Error)。

图17是表示使用集群A和集群B之间DNA甲基化水平(Δβ_T-N)显著不同的869个探针(FDR[q＝0.01])，进行随机森林分析的结果的图。在该图中，横轴表示基尼系数的平均值(MeanDecreaseGini)，纵轴表示用于Infinium测试的探针(CpG位点)。

图18是表示通过MassARRAY分析属于集群A或集群B的透明细胞型肾细胞癌患者中SLC13A5基因的CpG岛中DNA甲基化水平的结果的图。另外，在图中，SLC13A5_10“CpG_40”是通过Infinium测试也能检测到的集群B中DNA甲基化水平高的CpG位点(探针ID：cg22040627，NCBI数据库基因组Build37上的位置：17号染色体6617030)。

图19是表示通过MassARRAY分析的属于集群A或集群B的透明细胞型肾细胞癌患者中RIMS4基因的CpG岛中DNA甲基化水平的结果的图。

图20是表示通过MassARRAY分析的属于集群A或集群B的透明细胞型肾细胞癌患者中PCDHAC1基因的CpG岛中DNA甲基化水平的结果的图。

图21是表示通过MassARRAY分析的属于集群A或集群B的透明细胞型肾细胞癌患者中ZNF540基因的CpG岛中DNA甲基化水平的结果的图。

图22是表示通过MassARRAY分析的属于集群A或集群B的透明细胞型肾细胞癌患者中TRH基因的CpG岛中DNA甲基化水平的结果的图。

图23是表示通过MassARRAY分析的属于集群A或集群B的透明细胞型肾细胞癌患者中PRAC基因的CpG岛中DNA甲基化水平的结果的图。

图24是表示根据达到截止值(诊断阈值)的CpG位点的数目，区分集群A或集群B透明细胞型肾细胞癌患者的结果的图。截止值参照表19-27。另外，作为区分指标的CpG位点是表19～27中记载的AUC大于0.95的23处CpG位点(32个CpG位点)。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测肾细胞癌预后不良的风险的方法，所述方法包括以下(a)～(c)的步骤。

(a)制备来自受试者肾脏组织的基因组DNA的步骤，

在本发明中，“肾细胞癌”指肾脏的肾小管上皮细胞的癌变，根据其病理特征，分为透明细胞型，颗粒细胞型，嫌色细胞型，纺锤型，伴有囊肿的类型，来自囊胞的类型，囊胞性型，乳头状型的癌。另外，本发明中所述的“受试者”可例举为，例如，通过肾切除术进行了肾细胞癌治疗的患者。

本发明中所述的“肾细胞癌预后不良的风险”可例举为，例如，受试者预后(肾切除术等)的存活率低，更具体地，如以下图6中所示，例如，术后经过500天后的无复发存活率(无癌存活率)是50％以下，如以下图7所示，术后经过1500天后的总体存活率(总存活率)是70％或更低。

在本发明中，“CpG位点”指胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)之间形成磷酸二酯键(p)的部位，“DNA甲基化”指在上述CpG位点中，胞嘧啶的5-位碳被甲基化的状态。“DNA甲基化水平”指作为检测对象的特定CpG位点中被甲基化的比率，例如，可以用作为检测对象的特定CpG位点中，相对于总胞嘧啶数(甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶)的甲基化胞嘧啶数的比率来表示。

本发明中所述的“制备来自肾脏组织的基因组DNA”，没有特别的限定，可以使用适当选择的苯酚-氯仿处理等已知的方法进行。

通过上述方法制备其基因组DNA的肾脏组织可以例举为，例如，通过肾切除术等采样的无任何处理的肾脏组织，通过肾切除术等采样后冷冻的肾脏组织，通过在肾切除术等期间采样后进行福尔马林固定和石蜡包埋的肾脏组织。在这些肾脏组织中，从以下观点考虑，优选使用冷冻的肾脏组织:直到进行本发明的检测方法前，抑制肾脏组织中基因组DNA的降解等，以及在之后的检测DNA甲基化水平的步骤中，更有效地进行亚硫酸氢盐处理，PCR等。

此外，如下面的实施例所示，本发明者们已经表明，根据Infinium测试，通过检测17个基因(FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5和NKX6-2)的18个CpG位点中DNA甲基化水平，能够明确判断预后不良的肾细胞癌(CIMP阳性肾细胞癌)和相对较好的肾细胞癌。此外，通过使用质谱仪的DNA甲基化分析法，明确了在预后不良的肾细胞癌中，含有所述CpG位点的CpG岛全部区域也持续处在高甲基化状态。

因此，本发明中所述“CpG位点”指，与其他基因相比，更接近上述17个基因的群的至少1个基因的位置存在的CpG位点，优选地，所述“CpG位点”指与其他基因相比，更接近上述基因的位置存在的CpG岛中的至少一个CpG位点，更优选地，所述“CpG位点”指位于上述17个基因的群的启动子区域中的至少一个CpG位点，特别优选地，作为人类基因组序列参照的NCBI数据库基因组Build37上的位置是表1-4中记载的染色体号以及染色体上的位置的至少一个CpG位点。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

另外，通常在本发明中，FAM150A是编码RefSeqID：NP_997296中限定的蛋白质的基因，GRM6是编码RefSeqID：NP_000834中限定的蛋白质的基因，ZNF540是编码RefSeqID：NP_689819中限定的蛋白质的基因，ZFP42是编码RefSeqID：NP_777560中限定的蛋白质的基因，ZNF154是编码RefSeqID：NP_001078853中限定的蛋白质的基因，RIMS4是编码RefSeqID：NP_892015中限定的蛋白质的基因，PCDHAC1是编码RefSeqID：NP_061721中限定的蛋白质的基因，KHDRBS2是编码RefSeqID：NP_689901中限定的蛋白质的基因，ASCL2是编码RefSeqID：NP_005161中限定的蛋白质的基因，KCNQ1是编码RefSeqID：NP_000209中限定的蛋白质的基因，PRAC是编码RefSeqID：NP_115767中限定的蛋白质的基因，WNT3A是编码RefSeqID：NP_149122中限定的蛋白质的基因，TRH是编码RefSeqID：NP_009048中限定的蛋白质的基因，FAM78A是编码RefSeqID：NP_203745中限定的蛋白质的基因，ZNF671是编码RefSeqID：NP_079109中限定的蛋白质的基因，SLC13A5是编码RefSeqID：NP_808218中限定的蛋白质的基因，NKX6-2是编码RefSeqID：NP_796374中限定的蛋白质的基因。

在本发明中，作为“检测DNA甲基化水平的方法”，优选是能够定量确定CpG位点中DNA甲基化水平的方法，可适当选择公知的方法进行。所述公知的方法包括，例如，如下第一种至第七种方法所例举的。

第一种方法是基于以下原理的方法。首先，对上述基因组DNA进行重亚硫酸盐(亚硫酸氢盐)处理。其中，通过该亚硫氢盐酸处理，非甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶残基不转换(参见ClarkSJ等人，NucleicAcidsRes，1994年22卷，2990-7页)。然后，所述亚硫酸氢盐处理的基因组DNA作为模板，进行全基因组扩增，通过酶进行片段化(通常为300～600bp左右的片段)，并使其解链为单链。

另外，在第一种方法中，具有与通过亚硫酸氢盐处理转变的基因组DNA杂交的探针，所述探针的3'末端碱基制备成与上述CpG位点的胞嘧啶互补的碱基。也就是说，当所述CpG位点被甲基化的情况下，探针的3'末端碱基是鸟嘌呤，当所述CpG位点未被甲基化的情况下，探针3'末端的碱基是腺嘌呤。

因而，使如上所述的两种类型的探针(所述探针仅在与上述CpG位点互补的3'末端碱基不同)和上述片段化的基因组DNA杂交，在荧光标记的碱基的存在下，进行单碱基延伸反应。结果，所述CpG位点被甲基化的情况下，3'末端碱基是鸟嘌呤的探针(甲基化检测用探针)中掺入荧光标记的碱基，另一方面，上述CpG位点未被甲基化的情况下，3'末端碱基为腺嘌呤的探针(非甲基化检测用探针)中掺入荧光标记的碱基，所以，能够通过甲基化检测用探针和/或非甲基化检测用探针发出荧光的强度计算DNA甲基化水平。

另外，作为所述第一种方法的另一个实施方案，可以用如下探针代替所述甲基化检测用探针和非甲基化检测用探针:所述探针是与通过亚硫酸氢盐处理转变的基因组DNA杂交的探针，所述探针的3'末端碱基成为与上述CpG位点的鸟嘌呤互补的碱基。然后，用所述探针与上述片段化的基因组DNA进行杂交，在荧光物质标记的鸟嘌呤和/或与该荧光物质不同的荧光色素标记的腺嘌呤的存在下，进行单碱基延伸反应。结果，当所述CpG位点被甲基化的情况下，该探针中掺入荧光标记的鸟嘌呤，另一方面，当所述CpG位点未被甲基化的情况下，该探针中掺入荧光标记的腺嘌呤，所以，能够通过上述探针中掺入的各荧光物质发出荧光的强度计算DNA甲基化水平。

作为第一种方法，例如，可以提及微珠阵列法(例如，Infinium(注册商标)测试法)。

此外，在所述第一种方法中，作为DNA甲基化水平检测对象的上述CpG位点，优选为选自以下位点组成的群中的至少一个CpG位点:作为人类基因组序列参考的NCBI数据库基因组Build37上的位置，8号染色体53,478,454位，5号染色体178,422,244位，19号染色体38,042,472位，4号染色体188,916,867位，19号染色体58,220,662位，20号染色体43,438,865位，5号染色体140,306,458位，6号染色体62,995,963位，11号染色体2,292,004位，11号染色体2,466,409位，17号染色体46,799,640位，19号染色体58,220,494位，1号染色体228,194,448位，3号染色体129,693,613位，9号染色体134,152,531位，19号染色体58,238,928位，17号染色体6,617,030位以及10号染色体134,599,860位。另外，在本发明的所述第一种方法中，优选检测上述18个CpG位点中的至少一个位点的DNA甲基化水平，然而，在预后不良风险的检测中，考虑到为了进一步提高灵敏度或特异性，更优选将一个以上CpG位点(例如，2个位点，5个位点，10个位点，15个位点)作为DNA甲基化水平的检测对象，特别优选将所有上述18个CpG位点作为DNA甲基化水平的检测对象。

第二种方法是基于以下原理的方法。首先，对上述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。然后，以亚硫酸氢盐处理的基因组DNA作为模板，用添加T7启动子的引物扩增含有至少一个上述GpG位点的DNA。然后转录成RNA，使用RNA酶进行碱基特异性切割反应。然后，对所述切割反应产物进行质谱仪分析，测定质量。

然后，比较通过质量测定所得的甲基化胞嘧啶残基来源的质量(胞嘧啶的质量)，和非甲基化胞嘧啶残基来源的质量(尿嘧啶的质量)，计算上述CpG位点中的DNA甲基化水平。

作为第二种方法，例如，可以提及使用质谱仪的DNA甲基化分析方法(例如，MassARRAY(注册商标)，参见JurinkeC等人，MutatRes，2005年573卷，第83-95页)。

此外，在所述第二种方法中，作为DNA甲基化水平检测对象的所述CpG位点，优选为SEQIDNO：1-16中记载的碱基序列所含有的至少一个CpG位点，考虑到在预后不良风险的检测中，为了能够进一步提高灵敏度或特异性，更优选地，下述的ROC曲线下面积(AUC)大于0.90，所述CpG位点为以下表5-8中记载的CpG位点群中的至少一个CpG位点，更优选地，所述CpG位点为以下表5-8中记载的AUC大于0.95的CpG位点群中的至少一个CpG位点，特别优选地，所述AUC大于0.95的CpG位点群中的所有CpG位点作为DNA甲基化水平的检测对象。

[表5]

表6

[表7]

[表8]

另外，表5-8中记载的“染色体号”和“染色体上的位置”表示作为人类基因组序列参考的NCBI数据库基因组Build37上的位置。“靶标基因名_引物组名_CpG位点”表示在使用以下质谱仪的DNA甲基化分析(实施例5)中，使用表17和18中记载的引物组扩增的PCR产物中的CpG位点的顺序。关于“AUC值”，“截止值”，“特异性”，“灵敏度”和“1-特异性”，参照以下的实施例5。

第三种方法是基于以下原理的方法。首先，对上述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。另外，通过该亚硫酸氢盐处理，虽然非甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但是在下面的延伸反应(测序反应)中尿嘧啶表示为胸腺嘧啶。然后，所述以亚硫酸氢盐处理的基因组DNA作为模板，扩增含有至少一个上述CpG位点的DNA。然后，使扩增的DNA解链为单链。然后，只分离解链的单链DNA中的一条链。然后，从上述CpG位点的碱基旁进行每次1个碱基的延伸反应，可以通过酶使反应时所产生的焦磷酸发光，测定发光强度。比较如上所述获得的甲基化胞嘧啶残基来源的发光强度(胞嘧啶的发光强度)和非甲基化的胞嘧啶残基来源的发光强度(胸腺嘧啶的发光强度)，例如，通过下式计算上述CpG位点中DNA甲基化水平(％)。

DNA甲基化水平(％)＝胞嘧啶发光强度×100/(胞嘧啶发光强度+胸腺嘧啶发光强度)。

作为第三种方法中，例如，可提及焦磷酸测序法(注册商标，Pyrosequencing)(参照Anal.Biochem.(2000)10：103-110)等。

第四种方法是基于以下原理的方法。首先，对上述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。然后，在含有被插入DNA双链之间时就发出荧光的嵌入剂的反应体系中，以上述亚硫酸氢盐处理的基因组DNA作为模板，扩增含有至少一个所述CpG位点的核苷酸。然后，改变上述反应体系的温度，检测上述嵌入剂发出的荧光强度的变化。比较含有至少一个所述CpG位点的核苷酸的解链曲线与甲基化·非甲基化对照样本作为模板的扩增产物的解链曲线，计算上述CpG位点中的DNA甲基化水平。

作为第四种方法，例如，可以提及甲基化敏感性高分辨率解链曲线析(参考methylation-sensitivehighresolutionmelting:MS-HRM，WojdaczTK等人，2008年第3卷，1903-8页)。

第五种方法是基于以下原理的方法。首先，对上述因组DNA进行亚硫酸氢盐基处理。然后，制备上述CpG位点被甲基化的情况时可扩增的引物组，以及上述CpG位点未被甲基化的情况时可扩增的引物组。然后，上述亚硫酸氢盐处理的基因组DNA作为模板，使用所述引物组分别扩增含有至少一个所述CpG位点的核苷酸。然后，通过比较所得到的扩增产物的量，即，比较甲基化CpG位点特异性扩增产物的量和非甲基化的CpG位点特异性扩增产物的量，计算上述CpG位点中DNA甲基化的水平。

此外，在所述第五种方法的另一个实施方案中，首先对所述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。然后，制备当所述CpG位点被甲基化的情况时具有能够与其杂交的核苷酸，并且被报告荧光色素和淬灭荧光色素标记的寡核苷酸探针。而且，还制备当所述CpG位点未被甲基化的情况时具有能够与其杂交的核苷酸，并且被不同于上述报告荧光色素的荧光色素和淬灭荧光色素标记的寡核苷酸探针。然后，所述亚硫酸氢盐处理的基因组DNA被上述寡核苷酸探针杂交，进一步将上述寡核苷酸探针杂交的基因组DNA作为模板，扩增含有上述CpG位点的核苷酸。并且，通过分解伴随着前述扩增的寡核苷酸探针，检测上述报告荧光色素发射的荧光。通过这种方式检测的甲基化胞嘧啶CpG位点特异性报告荧光色素发出的荧光强度与非甲基化胞嘧啶CpG位点特异性报告荧光色素发出的荧光强度进行比较，从而计算上述CpG位点中DNA甲基化水平。

作为第五种方法，例如，可以例举使用TaqMan探针(注册商标)的MethyLight法等的甲基化特异性定量PCR方法(使用实时定量PCR的甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR))。

第六种方法是基于以下原理的方法。首先，对上述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。接着，以含有亚硫酸氢盐转换的上述CpG位点的核苷酸作为模板，进行直接测序反应。然后，基于所确定的碱基序列的荧光强度，即，通过比较甲基化胞嘧啶残基来源的荧光强度(胞嘧啶的荧光强度)，和非甲基化胞嘧啶残基来源的荧光强度(胸腺嘧啶的荧光强度)，来计算上述CpG位点中的DNA甲基化水平。

另外，作为所述第六种方法的其它实施方案，首先，对上述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。接着，通过PCR反应等克隆含有亚硫酸氢盐转换的上述CpG位点的核苷酸。并且，分别确定所获得的多个克隆产物的碱基序列，通过比较带有甲基化胞嘧啶CpG位点特异性碱基序列的克隆产物数目与带有非甲基化胞嘧啶CpG位点特异性碱基序列的克隆产物数目，计算上述CpG位点中的DNA甲基化水平。

作为第六种方法，例如，可以例举亚硫酸氢盐直接测序(bisulfitedirectsequencing)，亚硫酸氢盐克隆测序(bisulfitecloningsequencing)等(参见KristensenLS等人，ClinChem，2009年55卷第1471至1483页)。

第七种方法是基于以下原理的方法。首先，对上述基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。然后，以含有亚硫酸氢盐转化的所述CpG位点的核苷酸作为模板，通过PCR扩增含有CpG位点的区域。然后，使用限制性酶处理扩增的DNA片段，其中所述限制性酶识别所述CpG位点被甲基化以及未被甲基化时序列不同的地方。从而，通过电泳分级，并通过定量分析来自甲基化CpG位点的限制性酶切片段与来自非甲基化CpG位点限制性酶切片段的条带密度，能够计算该CpG位点的DNA甲基化水平。

作为第七种方法，例如，可以提及COBRA(通过组合使用亚硫酸氢盐与限制性酶的分析)。

虽然以上举例说明了可适合用作本发明的“检测DNA甲基化水平的方法”的方法，但本发明不限于此。也如上所述，在检测DNA甲基化水平时，从受试者制备的基因组DNA被进一步进行亚硫酸氢盐处理。因此，作为检测本发明的肾细胞癌的预后不良的风险的方法，所述步骤(b)可以是采用对所述步骤(a)中制备的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，来检测所述CpG位点的DNA甲基化水平的步骤。

在本发明中，根据步骤(b)检测的DNA甲基化水平，本领域技术人员能够结合适当的检测DNA甲基化水平的方法，设定为了确定上述受试者是否分类为预后不良组的指标。例如，如下面的实施例所示，对每个CpG位点进行接受者操作特征(ROC)分析，计算灵敏度(阳性率)和特异性，进一步地将灵敏度和特异性的和最大的DNA甲基化水平设定为上述指标(截止值，诊断阈值)，如果检测的DNA甲基化水平比该截止值高时，可以将该受试者分类为预后不良组。

另外在本发明中，在检测肾细胞癌预后不良的风险中，从能够进一步改善灵敏度或特异性的观点出发，不仅是DNA甲基化水平，还可以将呈现出比上述截止值更高的值的CpG位点数作为确定上述受试者是否分类于预后不良组的指标。例如，如以下实施例所示，在本发明涉及的23处CpG位点中，有15个以上满足上述截止值的情况下，该受试者可以被分类为预后不良组(见如下图24)。

因此，根据本发明，能够判断不能通过现有的组织学观察等分类标准检测的，肾切除术后的肾细胞癌预后不良的风险。作为治疗肾细胞癌的方法，虽然肾切除术首选，但是，如果能早期发现转移和复发，则能够预期针对转移和复发有效的免疫治疗法和分子靶向治疗药物等。

因此，本发明还可以提供肾细胞癌的治疗方法，上述方法包括向根据本发明的方法分类为预后不良组的受试者施用分子靶向治疗药物的步骤和/或进行免疫疗法的步骤。

此外，本发明能够预期在作为肾切除术对象的大多数肾细胞癌病例中，对分类为预后不良组的患者进行更精确的转移或复发的筛选，通过在筛选中的早期发现而使治疗效果得到改善，另一方面，还能够减少对没有分类于预后不良组的患者进行转移或复发筛选的负担。

本发明提供了一种用于检测肾细胞癌预后不良风险的方法中的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有至少12个碱基的链长，且为下述(a)～(b)中记载的任一个

(a)寡核苷酸，所述寡核苷酸是设计成夹着选自上述CpG位点群的至少一个位点的一对引物，

(b)寡核苷酸，所述寡核苷酸与含有选自上述CpG位点群的至少一个位点的核苷酸杂交的引物或探针。

作为所述(a)的设计成夹着选自上述CpG位点群的至少一个位点的一对引物，例如，可以例举能够扩增含有选自亚硫酸氢盐转换的上述CpG位点群的至少一个位点的DNA的引物(聚合酶链反应(PCR)引物(正向引物和反向引物))。所述引物是杂交选自上述CpG位点群的至少一个位点的两侧的、经亚硫酸氢盐转换的各核苷酸的引物。

另外，作为(b)的与含有选自上述CpG位点群的至少一个位点的核苷酸杂交的引物，例如，可以例举能够从亚硫酸氢盐转换的上述CpG位点的碱基旁进行每次1个碱基的延伸反应的引物(测序引物)。此外，作为(b)的与含有选自上述CpG位点群的至少一个位点的核苷酸杂交的探针，例如，可以例举与含有亚硫酸氢盐转换的上述CpG位点的核苷酸杂交的探针(所谓的TaqMan探针)。

另外，本发明的寡核苷酸的链长为至少12个碱基，优选至少15个碱基，更优选至少20个碱基。

杂交到特定核苷酸的寡核苷酸具有与所述特定核苷酸互补的碱基序列，但是，只要能杂交，其也可能不是完全互补的。根据含有亚硫酸氢盐变换的或者未变换的上述CpG位点的碱基序列，本领域技术人员通过公知的技术，例如，如下面实施例中所示，使用MassARRAY方法的引物设计软件EpiDesigner(http：//www.epidesigner.com,SEQUENOM公司制)，焦磷酸测序测定设计软件1.0版本(QIAGEN公司制)等，可以适当地设计这些寡核苷酸的序列。另外，本发明涉及的“含有CpG位点”，不仅仅指所有CpG位点，即包括胞嘧啶和鸟嘌呤二者的位点，也可以是含有其一部分的位点(胞嘧啶，鸟嘌呤，或非甲基化的胞嘧啶被亚硫酸氢盐转化后的尿嘧啶或胸腺嘧啶)。

如以下的实施例所示，在利用质谱仪的DNA甲基化分析中，本发明的寡核苷酸优选是选自SEQIDNO：17～48中记载的碱基序列组成的组的引物(见表17和表18)。此外，如以下的实施例所示，在焦磷酸测序中，本发明的寡核苷酸优选是选自SEQIDNO：49～57中记载的碱基序列组成的组的引物(见表9)。

此外，本发明能够提供用于检测肾细胞癌预后不良的风险的方法中的试剂盒，其包含上述寡核苷酸。

在上述寡核苷酸的制备物中，根据需要也可以固定上述寡核苷酸。例如，当通过Infinium测试检测时，可以使用固定在珠子的探针。另外，根据需要，上述寡核苷酸也可以被标记。例如，通过焦磷酸测序法检测时，可以使用生物素标记的引物，通过TaqMan探针法检测时，可以使用报告荧光色素和淬灭荧光色素标记的探针。

在本发明的试剂盒中，可以含有上述寡核苷酸制备物以外的其它试剂。作为其它试剂，可以例举为亚硫酸氢盐转换所需的试剂(例如，亚硫酸氢钠溶液，等等)，PCR反应所需的试剂(例如，脱氧核糖核苷酸或热稳定的DNA聚合酶等)，Infinium测试所需的试剂(例如，标记有荧光物质的核苷酸)，MassARRAY所需的试剂(例如，进行碱基特异性切割反应的RNA酶)，焦磷酸测序所需的试剂(例如，为检测焦磷酸的ATP硫酸化酶，腺苷-5'-磷酰硫酸，萤光素酶，萤光素，和用于分离单链DNA的链霉亲和素等)，MS-HRM方法所需的试剂(例如，插入DNA双链间就发出荧光的嵌入剂)。此外，也可以例举为检测上述标记所需的试剂(例如，底物和酶，阳性对照和阴性对照，或者在稀释或洗涤样本(来自受试者肾脏组织的基因组DNA等)中使用的缓冲液)。此外，试剂盒中可以包括用于其使用的说明书。

实施例

下面，根据实施例更具体地说明本发明，但是，并不用以下的实施例限定本发明。此外，在实施例中使用的样本和方法如下所示。

<患者和组织样本>

从110名患有原发性透明细胞型肾细胞癌患者手术摘除的样本获得109例癌组织(T)样本和对应的107例非癌肾皮质组织(N)样本，在N样本中没有观察到显著的组织学变化。

应当指出的是，这些患者未接受过术前治疗，是在国家癌症研究中心医院接受肾切除术的患者。其中包括79名男性和31名女性，平均年龄为62.8±10.3岁(平均值±标准差，36-85岁)。

此外，样本的组织学诊断根据世界卫生组织的分类进行(参照Eble，J.N.等人,“肾细胞癌肿瘤WHO分类病理学和遗传学男性生殖器和泌尿系统肿瘤”，2004年，IARC出版，Lyon，10～43页，图1)。

此外，所有肿瘤的组织学异型性根据“Fuhrman，S.A.等人，Am.J.Surg.Pathol，1982年，第6卷，655-663页”中记载的标准进行评价，TNM分类根据“Sobin，L.H.等人，国际抗癌联盟(UICC)，TNM恶性肿瘤的分类，第6版，2002年，Wiley-Liss，纽约，193～195页”进行分类。

此外，作为肾细胞癌肉眼分类的标准，采用肝细胞癌(HCC)中的既定标准(参见非专利文献4-6)。此外，3型(多结节愈合型)HCC，比1型(单结节型)和2型(单结节周围增殖型)HCC的组织学分化程度低，肝内转移的发生率高(见Kanai，T.等，Cancer，1987年第60卷，810-819页)。

通过对苏木精-伊红和Elastica-oneGieson染色的玻片在显微镜下进行观察，检查是否存在血管浸润。

通过肉眼观察检查在肾静脉主干是否存在肿瘤血栓。此外，肾细胞癌通常是由纤维囊包裹，使其边界变得清晰。另外，肾细胞癌的癌细胞之间几乎不含有纤维间质。因此，不存在非癌上皮细胞和间质细胞的混合，可以从手术样本获得癌细胞。

此外，为了与上述RCC患者进行比较，从29例未患原发性肾肿瘤患者手术摘除的样品获得29个正常的肾皮质组织(C1～C29)样本。获得样本的未患原发性肾肿瘤患者包括18名男性和11名女性，平均年龄61.4±10.8岁(平均值±标准差，31-81岁)。此外，这些患者中的22位是患有肾盂尿路上皮癌而接受肾切除术的患者。6位是接受肾脏旁后腹膜肉瘤切除与肾切除术的患者。剩下的1位是由于患有转移性生殖细胞肿瘤而接受主动脉旁淋巴结摘除术的患者，因为难以保留肾动脉，因而同时实施了肾切除术。

从作为该项研究对象的所有患者获取了书面知情同意书。此外，这项研究得到国家癌症研究中心伦理委员会的批准而实施的。

<Infinium测试>

用苯酚-氯仿处理从上述患者获得的新鲜冷冻的组织样本，之后通过进行透析，提取高分子量的DNA(见Sambrook，J.等，分子克隆：实验室手册，第三版，ColdSpringHarbor出版，NY，6.14至6.15页)。

然后，使用EZDNA甲基化金(TM)试剂盒(ZymoResearch公司制)对500ngDNA进行亚硫酸氢盐转化处理。

然后，使用Infinium人甲基化27小珠阵列(由Illumina公司制)，对27578个CpG位点中的DNA甲基化状态进行1CpG位点分辨率的分析。在该阵列中含有位于NCBI数据库登记的14475个基因(共有编码序列)的转录起始位点近端启动子区域内的CpG位点。此外，平均1个基因选择2个位点，进一步地，200个以上癌症相关基因和印记基因中1个基因选择3至20个CpG位点，并将其负载在阵列上。另外，在各阵列上负载40个对照探针。在对照探针中包括染色，杂交，延伸和亚硫酸氢盐转换的对照以及阴性对照。

另外，为了自动处理上述亚硫酸氢盐转换的DNA，使用Evo机器人(Tecan公司制)。此外，使用Infinium测试试剂盒(Illumina公司制)，进行全基因组扩增处理(参见Bibikova，M.等人，Epigenomics，2009年，第1卷，177-200页)。

因此，通过上述方法扩增的DNA片段与上述阵列上的探针杂交后，对异性杂交的DNA通过单碱基延伸反应进行荧光标记。然后，根据制造商的方案，使用小珠扫描器(Illumina公司制)来检测该DNA。使用基因组工作室甲基化软件(Illumina公司制)分析获得的数据。

另外，在各CpG位点中，荧光信号的比率由相对于甲基化探针和非甲基化探针的总和而言，甲基化探针的相对比率测定。换句话说，所谓的β值(范围：0.00至1.00)旨在反映各CpG位点中的甲基化水平。

<统计分析>

在上述Infinium测试中，相对于所有分析的组织样本，呼出比率(callproportion，检测出大于背景的信号，P值<0.01)为90％以下的探针有32个。这样的低呼出比率可能是由于探针的CpG位点中的基因多态性所引起的，因而，在该测试法中排除了这32个探针。此外，为了避免性别特异性的甲基化偏差，排除了X染色体和Y染色体上所有的CpG位点。结果，将常染色体上的26454个CpG位点作为最终的分析对象。

通过logistic模型，鉴定了在29个C样本和107个N样本之间，显示DNA甲基化水平显著差异的Infinium探针。

通过累积logit模型，在29个C样本，107个N样本和109个T样本中，鉴定了C样本，N样本和T样本中DNA甲基化水平的阶段性变化(ordereddifference)的探针。

通过Wilcoxon符号秩和检验检查了104对同一患者来源的N样本以及对应的T样本的DNA甲基化状态的差异。

q＝0.01的误检出率(FDR)被认为是有显著性的。

根据DNA甲基化水平(Δβ_T-N)，对透明细胞型肾细癌患者进行了无监督层次聚类分析(欧几里得距离，Ward法)。

通过Wilcoxon秩和检验和直接Fisher精确检验检查了患者的集群和临床病理因素的相关性。

通过Kaplan-Meier法计算了属于每个集群的患者存活率曲线。而且，由log-rank检验比较差异。

通过Wilcoxon秩和检验检查每个集群中表示DNA高甲基化或DNA低甲基化的Infinium测试探针的数量，以及各集群平均DNA甲基化水平(Δβ_T-N)，P<0.05即为显著性水平。

通过直接Fisher精确检验和随机森林法鉴定能够识别集群的CpG位点(参见Breiman，L.，Mach.Learn.，2001年45卷，第5-32页)。

实施例1

<在肾细胞癌的发生中DNA甲基化的改变>

首先，通过表9所示条件下的焦磷酸测序法验证由上述Infinium测试发现的代表性CpG位点。其结果是，如图2-4所示，对于每个CpG位点的DNA甲基化水平，通过定量性高的焦磷酸测序法获得的分析结果(图2-4纵轴)与通过Infinium测试获得的分析结果(图2-4横轴)之间有强的相关性。

[表9]

因此，可以确认这样的Infinium测试的数据可信性高。

直到现在几乎没有讨论过关于肾脏的癌前状态。然而，本发明者们表明了，尽管非癌组织没有观察到显著的组织学变化，也没有观察到与慢性炎症和病毒或病原微生物持续感染的相关性，但是，从DNA甲基化改变的观点看来，表明其已经处于癌前阶段(专利文献1和非专利文献4-7)。

关于这一点，通过logistic模型分析本发明的Infinium测试结果，明确了在4830个探针中，N样本的DNA甲基化水平与C样本的DNA甲基化水平相比，已经发生了改变(FDRq＝0.01，参照表10(a))。

此外，为了明确DNA甲基化的改变可延续到肾细胞癌本身，通过累积Logit模型，鉴定了C样本，N样本，T样本的DNA甲基化水平阶段性改变的探针。结果，这样的DNA甲基化水平阶段性改变的探针有11089个(FDRq＝0.01，参见表10(b))。

此外，为了明确对癌变起很大作用的DNA甲基化的改变，通过Wilcoxon符号秩和检验对104对N样本和T样本进行了检查。结果，观察到N样本与相应的肾细胞癌之间存在显著差异的探针有10870个(FDRq＝0.01，参见表10的(c))。

[表10]

以上的结果表明，尽管在形成癌症的过程中观察到DNA低甲基化，但是在肾细胞癌发生的很早期的阶段，经常发生DNA高甲基化。

另外，鉴定了801个表10中(a)，(b)和(c)记载的标准全部满足的探针，即，这些探针在DNA甲基化在非癌阶段已经明显改变，且这样的改变延续至肾细胞癌并增强。

(实施例2)

<肾细胞癌的外遗传学分类>

使用上述801个探针检测的DNA甲基化水平(Δβ_T-N)，进行无监督层次聚类分析的结果表明，可以将104位透明细胞型肾细胞癌患者细分类为集群A(n＝90)和集群B(n＝14)(参照图5)。而且，如上所述，可以看出上述801个探针检测的DNA甲基化在癌前阶段已发生变化，而后继续对肾细胞癌性转变起作用。

然后，研究了属于该集群A和B的透明细胞型肾细胞癌中的临床病理学因素和TNM分期。获得的结果示于表11。

[表11]

此外，对于表11中的“P值”，那些带有下划线的为“P<0.05”，带有(b)的数值是通过Wilcoxon秩和检验获得的，带有(c)的数值是直接Fisher精确检验获得的。另外，对于带有(d)的临床病理因素，肿瘤不均匀的情况下，显示在面积上处于优势的区域中的所见，对于带有(e)的临床病理因素，肿瘤不均匀的情况下，显示肿瘤中侵袭性最高的特征。

此外，还研究了属于这些集群A和B的患者的存活率。分析存活率的期间为42－4024天(平均1821天)。所获得的结果(Kaplan-Meier存活率曲线)示于图6和7。

如从表11所示的结果可知，在以下方面，集群B大于集群A(或高于集群A):透明细胞型肾细胞癌的直径，上述根据肉眼的分类，单结节周围增殖型(2型)或多结节愈合型(3型)的发生频率，血管侵袭的频率，肾静脉中肿瘤血栓形成的频率，浸润性增殖的频率，肿瘤坏死以及浸润到肾盂的频率，组织学异型性和根据TNM分类的病期。且如表11所示，很明显，肾细胞癌的外遗传学分类并不依据患者的性别和年龄。

而且，从图6和7所示的结果可以看出，属于集群B的患者无复发存活率(无癌症存活率)和总存活率(总体存活率)显著低于属于集群A的患者(无癌存活率的P值为4.16×10^-6，总体存活率的P值为1.32×10^-2)。

(实施例3)

<肾细胞癌DNA甲基化谱>

接下来，根据DNA高甲基化差异的各个程度(Δβ_T-N>0.1,0.2,0.3,0.4或0.5)，分析了相对于全部26454个探针，观察到的与相应的N样本相比T样本中DNA高甲基化的探针的比率。此外，根据DNA低甲基化差异的各个程度(Δβ_T-N<-0.1,-0.2,-0.3,-0.4或-0.5)，分析了相对于全部26454个探针，观察到的与相应的T样本相比N样本中DNA低甲基化的探针的比率。所获得的结果示于图8-12。

如图8-12中所示的结果所表明的，显示出显著的DNA低甲基化(Δβ_T-N<-0.5)的探针，与集群A相比在集群B中略微积聚。但是，在集群A和集群B中，没有观察到DNA低甲基化发生频率的统计学上的显著差异(Δβ_T-N<-0.1，-0.2，-0.3或-0.4)。另一方面，显示DNA高甲基化的探针，无论DNA高甲基化的差异程度如何，与集群A相比在集群B中显著积聚(Δβ_T-N>0.1,0.2,0.3,0.4或0.5)。

因此，表明属于集群B的肾细胞癌的特征在于DNA高甲基化的积累。

另外，在表12和13中显示了集群A和集群B之间DNA甲基化水平差异显著的前61个探针。另外，表12和13中的“靶标ID”显示了由Illumina公司分配给Infinium人甲基化27小珠阵列上全部探针的编号，“染色体号”和“染色体上的位置”指的是作为标准人类基因组序列的在NCBI数据库基因组Build37上的位置(与以下涉及探针的表中相关的标记相同)。“CpG岛”的“Y”表示该探针位于CpG岛中，“N”表示该探针不位于CpG岛中(表14和15中也相同)。此外，“基因区域”表示该探针位于外显子(exon)，内含子(intron)，或转录起始位点的上游(TSS)。此外，“P值”表示通过Wilcoxon秩和检验计算的值。

[表12]

[表13]

尽管在全部26454个探针中，位于CpG岛中的探针是19246个，占72.8％，但是，在上述61个探针中，在属于集群B的肾细胞癌中呈现DNA高甲基化的位于CpG岛中的探针有60个，占98.4％(Δβ_T-N>0.097，表12和13)。另外，上述61个探针中，其余的一个探针不位于CpG岛内，是呈现DNA低甲基化(在集群B中，Δβ_T-N>-0.425±0.096)的探针。

从实施例2和3中所示的结果表明，集群B的特征在于，与临床病理学特征非常相关地，在CpG岛中高频率的DNA高甲基化。

另外，所述属于集群B的肾细胞癌的特征与被充分研究的其它器官(例如，大肠和胃)的CpG岛甲基化性状(CIMP)阳性的癌症的特征相似(非专利文献8-11)。即，通过本发明的1CpG分辨率的甲基化组分析，首次鉴定出CIMP阳性的肾细胞癌是集群B。

(实施例4)

<表征CIMP阳性肾细胞癌的CpG位点的鉴定>

对于分别属于集群A和B的代表性肾细胞癌患者，分析了肾细胞癌组织(T样本)中的DNA甲基化水平(β值)和非癌肾组织(N个样本)中的DNA甲基化水平(β值)的对应关系。所获得的结果作为散点图示于图13和14。即，图13所示的病例1-4是属于集群A的代表性肾细胞癌患者，图14所示的病例5-8是属于集群B的代表性肾细胞癌患者。

如从图13和14所示的结果表明，只在集群B中明确地存在如下的探针，其中DNA甲基化水平在N样本中低，与相应的N样本相比，T样本中DNA甲基化程度显著增高。而在集群A中没有观察到这样的探针。

基于该结果，为了区分属于集群B的肾细胞癌和属于集群A的肾细胞癌，关注与集群A相比，集群B中所有N样本的平均β值小于0.2，Δβ_T-N大于0.4的出现频率显著增加(P<1.98×10^-6，直接Fisher精确检验)的探针。

因而，在这样的探针中，16个探针(15个基因：FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A和ZNF671)在属于集群B的14例肾细胞癌的6例以上(42.8％以上)的肾细胞癌中，显示Δβ_T-N超过0.4。另一方面，在属于集群A的90例肾细胞癌中，上述16个探针显示Δβ_T-N大于0.4的肾细胞癌是2例以下(2.2％以下)(见表14)。

[表14]

另外，如从图15所示的结果可知，在集群A和集群B之间上述16个CpG位点中DNA甲基化水平(Δβ_T-N)是完全不同的。

此外，使用集群A和集群B之间DNA甲基化水平(Δβ_T-N)显著不同的869个探针(FDR[q＝0.01])，进行随机森林分析(见图16和17)。结果，进一步鉴定了能够识别集群A和集群B的前4个探针(见表15)。

[表15]

另外，上述15个基因和由随机森林分析发现的能够识别集群A和集群B的前4个基因中，有2个基因(FAM150A和GRM6)重叠。

因此，这17个基因(FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5和NKX6-2)中的CpG位点可以被看作CIMP阳性肾细胞癌(例如属于集群B的肾细胞癌)的特性。也就是说，表明了通过检测该17个基因CpG位点中的DNA甲基化水平，能够检测肾细胞癌患者的预后不良的风险。

另外，通过定量RT-PCR分析这些基因表达量的结果表明，通过DNA高甲基化抑制这些基因的表达(参照表16)。

[表16]

因此，这表明发生在癌前阶段的DNA甲基化的改变通过改变基因表达水平，决定肾细胞癌的恶性度和患者的预后。

(实施例5)

<通过质谱仪检测肾细胞癌中的DNA甲基化水平>

通过不同于上述Infinium测试的甲基化DNA的检测方法，质量阵列法(MassARRAY法)，确认上述17个基因的CpG位点中DNA甲基化水平检测的有效性。

MassARRAY方法是如下的一种方法，其扩增亚硫酸氢盐处理后的DNA，转录为RNA，进一步地由RNA酶碱基特异性切割后，通过质谱仪，检测甲基化的DNA片段和非甲基化的DNA片段之间的分子量的差异。

首先，针对含有上述CpG位点(其是Infinium阵列的探针部位)的CpG岛，使用EpiDesigner(SEQUENOM公司制，用于MassARRAY的引物设计软件)进行MassARRAY的引物设计。

此外，在MassARRAY中由于PCR靶标序列约100～500bp，稍长，其能够一起评价上述CpG位点周围的多个CpG部位的DNA甲基化水平。

另外，为了消除PCR产生的偏差的影响，对每个引物组，通过3种DNA聚合酶和约4个阶段的退火温度的条件组合，平均进行实验，确定定量性良好的最佳PCR条件。

因而，确认了所采用的PCR条件对所有CpG部位(作为PCR靶标序列中含有的分析对象)具有良好的定量性能，并且对88例CIMP阴性肾细胞癌样本和14例CIMP阳性肾细胞癌样本进行了MassARRAY分析。

即，首先，与上述Infinium测试同样地，提取来自各样本的基因组DNA，亚硫酸氢盐转换后，通过PCR扩增，并进行体外转录反应。然后，将所得的RNA由RNA酶A在尿嘧啶位点特异性地切割，生成根据各样本基因组DNA甲基化的有无而长度不同的片段。然后，将得到的RNA片段，通过能够检测单碱基质量差异的MALDI-TOFMAS(SEQUENOM公司制，MassARRAY分析仪4)进行质量分析。使用分析软件(EpiTYPER，由SEQUENOM公司制造)，将获得的质量分析结果与参考序列比对，通过来自甲基化DNA的RNA片段和来自非甲基化DNA的RNA片段的质量比，计算甲基化水平。

在表17和18以及序列表中显示了本分析中使用的引物序列以及使用该引物组扩增的PCR产物的序列。所得结果的一部分显示于图18-23。

[表17]

[表18]

如图18-23中所示的结果表明，关于作为MassARRAY分析对象的所有区域，与前述的使用Infinium阵列分析的结果相同，证实了通过检测上述CpG位点的DNA甲基化水平能够判定属于集群B的预后不良的肾细胞癌(CIMP阳性组)，和属于集群A的预后良好的肾细胞癌(CIMP阴性组)。此外，通过MassARRAY分析，表明不仅仅1个CpG位点，含有该位点的CpG岛的整个区域(例如，跨越作为Infinium探针部位的CpG位点的前后1500bp的区域)中，CIMP阳性组中持续处于高甲基化状态。

因此，表明由于启动子整个区域的高甲基化状态导致强烈沉默的区域的1个CpG位点，已在实施例4中鉴定，即，其表明了不限于上述18个CpG位点，只要检测出位于上述17个基因的CpG岛中的至少一个CpG位点的DNA甲基化水平，则能够检测肾细胞癌预后不良的风险。

此外，通过所述MassARRAY方法，对已经由上述Infinium测试分类的14例CIMP阳性组和88例CIMP阴性组，进行14个基因的312个CpG位点的DNA甲基化水平定量。然后，根据其结果，进行接受者操作特征(ROC)分析，计算单独使用每个CpG位点时从CIMP阴性组中区分CIMP阳性组的“灵敏度(阳性率)”，“特异性”和“1-特异性(假阳性率)”。此外，根据所获得的值绘制ROC曲线，计算AUC(曲线下面积，ROC曲线下面积)。此外，对于各CpG位点，设定使“灵敏度+特异性”最大的截止值(诊断阈值)。在上述MassARRAY分析能够进行定量分析的CpG位点所获得的结果示于表19-27。另外，在表19-27中，距离近并且根据MassARRAY方法的特征能够一起测定其DNA甲基化水平的多个CpG位点归纳为1处列于表中。另外，这些表中的“靶标基因名_引物组名_CpG位点”表示使用表17和18记载的引物组扩增的PCR产物中的CpG位点的顺序。另外，在表23的描述中，SLC13A5_10_CpG_44和SLC13A5_13_CpG_1分别表示不同引物组扩增的区域中的第44个CpG位点和第1个CpG位点，但在基因组上的位置(NCBI数据库基因组Build37上的位置)是17号染色体的6617077，是同一个CpG位点。

[表19]

[表20]

[表21]

[表22]

[表23]

[表24]

[表25]

[表26]

[表27]

如表19-27所示的结果所表明的，明确了诊断功能强的CpG位点，除了是Infinium探针部位的前述CpG位点外，还在各CpG岛中存在多个。即，AUC>0.9的CpG位点数是141个位点，AUC>0.95的CpG位点数是32个位点。

另外，在MassARRAY方法中，例如，因为如“FAM150A_14_CpG_13.14.15”所示的CGCGCG的连续CpG位点整体被赋予一个测量值，所以上述AUC>0.9的141个位点相当于根据AUC计算的测量值的90个。同样地，AUC>0.95的32个位点相当于根据AUC计算的测量值的23个。

另外，如从图24所示的结果可知，通过将23个部位的AUC大于0.95的CpG位点(23个测量值)作为指标使用，能够清楚地区分CIMP阳性组和CIMP阴性组。

[工业实用性]

如上所述，通过检测根据本发明所述的17个基因(FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5和NKX6-2)中的至少一个CpG位点中DNA甲基化水平，能够清楚地分类预后不良的肾细胞癌(CIMP阳性肾细胞癌)和预后比较好的肾细胞癌。

因为预后不良组和预后良好组的所述DNA甲基化水平的差异大，即便是医院检验中已经普及的PCR方法等(例如，甲基化特异性定量PCR法，COBRA法)也能够容易地检测该差异。另外，无需给患者增加额外的侵入性负担，而能够从肾细胞癌手术标本中提取用于预后诊断的足够量的基因组DNA。因此，本发明的肾细胞癌预后不良风险的检测方法，作为旨在改进治疗效果的方法，在临床领域中是有用的。

[序列表独立文本]

SEQIDNO：17

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的SLC13A5_MA_10正向引物)

SEQIDNO：18

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的SLC13A5_MA_10反向引物)

SEQIDNO：19

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用SLC13A5_MA_13正向引物)

SEQIDNO：20

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的SLC13A5_MA_13反向引物)

SEQIDNO：21

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的SLC13A5_MA_15正向引物)

SEQIDNO：22

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的SLC13A5_MA_15反向引物)

SEQIDNO：23

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用FAM150A_MA_14正向引物)

SEQIDNO：24

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的FAM150A_MA_14反向引物)

SEQIDNO：25

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的GRM6_MA_8正向引物)

SEQIDNO：26

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的GRM6_MA_8反向引物)

SEQIDNO：27

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZFP42_MA_2正向引物)

SEQIDNO：28

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZFP42_MA_2反向引物)

SEQIDNO：29

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZFP42_MA_5正向引物)

SEQIDNO：30

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZFP42_MA_5反向引物)

SEQIDNO：31

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的RIMS4_MA_9正向引物)

SEQIDNO：32

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的RIMS4_MA_9反向引物)

SEQIDNO：33

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的TRH_MA_8正向引物)

SEQIDNO：34

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的TRH_MA_8反向引物)

SEQIDNO：35

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZNF540_MA_17正向引物)

SEQIDNO：36

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZNF540_MA_17反向引物)

SEQIDNO：37

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的PCDHAC1_MA_5正向引物)

SEQIDNO：38

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的PCDHAC1_MA_5反向引物)

SEQIDNO：39

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的PRAC_MA_2正向引物)

SEQIDNO：40

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的PRAC_MA_2反向引物)

SEQIDNO：41

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZNF671_MA_8正向引物)

SEQIDNO：42

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ZNF671_MA_8反向引物)

SEQIDNO：43

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的WNT3A_MA_9正向引物)

SEQIDNO：44

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的WNT3A_MA_9反向引物)

SEQIDNO：45

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的KHDRBS2_MA_19(rev)正向引物)

SEQIDNO：46

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的KHDRBS2_MA_19(rev)反向引物)

SEQIDNO：47

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ASCL2_MA_8正向引物)

SEQIDNO：48

<223>人工合成的引物序列(MassARRAY测试中使用的ASCL2_MA_8反向引物)

SEQIDNO：49

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP42正向引物)

SEQIDNO：50

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP42反向引物)

SEQIDNO：51

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP42测序引物)

SEQIDNO：52

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP154正向引物)

SEQIDNO：53

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP154反向引物)

SEQIDNO：54

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP154测序引物)

SEQIDNO：55

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP540正向引物)

SEQIDNO：56

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP540反向引物)

SEQIDNO：57

<223>人工合成的引物序列(焦磷酸测序使用的ZFP540测序引物)

Claims

1.检测肾细胞癌的预后不良风险的方法，其包括以下(a)～(c)的步骤:

(a)制备来自受试者肾脏组织的基因组DNA的步骤，

(b)对于步骤(a)制备的基因组DNA，检测基因的至少一个CpG位点的DNA甲基化水平的步骤，所述基因选自以下基因组成的基因群：FAM150A，GRM6，ZNF540，ZFP42，ZNF154，RIMS4，PCDHAC1，KHDRBS2，ASCL2，KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5和NKX6-2，

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)是通过亚硫酸氢盐处理步骤(a)制备的基因组DNA、检测所述CpG位点的DNA甲基化水平的步骤。

3.用于权利要求1或2所述方法中的寡核苷酸，其具有至少12个碱基的链长度，所述寡核苷酸是下述(a)～(b)中记载的任一个

(a)寡核苷酸，所述寡核苷酸是设计成夹着选自所述基因群的基因的至少一个CpG位点的一对引物，

(b)寡核苷酸，所述寡核苷酸是与含有选自所述基因群的基因的至少一个CpG位点的核苷酸杂交的引物或探针。