KR102082099B1

KR102082099B1 - 신장 세포암의 예후 예측방법

Info

Publication number: KR102082099B1
Application number: KR1020197029006A
Authority: KR
Inventors: 야에 카나이; 에리 아라이; 잉 티안
Original assignee: 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2020-02-26
Also published as: JP2018139601A; KR20190115118A; EP2848697A1; KR20150031231A; KR20190116551A; KR102082096B1; JP6532071B2; JP6335118B2; JP6532070B2; KR102082098B1; KR20190116549A; WO2013168644A1; CN105408494B; EP2848697A4; JP2018139600A; JP6532072B2; KR102067849B1; JP2018148900A; KR102082097B1; US20200199684A1

Abstract

간편하고 매우 높은 감도 및 특이성을 가진 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 하여 정상 신장 조직, 신장 세포암 환자 유래의 비암 조직 및 신장 세포암에 대해서 메틸롬 분석을 행했다. 그 결과, FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, SLC13A5 및 NKZ6-2 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 검출함으로써 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출할 수 있는 것을 발견했다.

Description

신장 세포암의 예후 예측방법{METHOD FOR PREDICTING PROGNOSIS OF RENAL CELL CARCINOMA}

본 발명은 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 것을 포함해서 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

신장 세포암(RCC)은 노동 인구에 속하는 장년기에도 자주 발생하여 신장 절제 수술로 근치하는 증례군이 대세를 이루는 반면 급속하게 원격 전이를 초래하는 증례군도 분명히 존재해 양자의 임상 경과에는 큰 차이가 있다. 또한, 전이해서도 면역 요법·분자 표적 치료약 등이 성공하는 증례가 알려져 있다. 재발의 가능성이 높은 증례는 밀접하게 경과 관찰해서 재발을 조기에 진단하고, 후요법을 추가하면 예후가 개선될 가능성이 있다. 그러나, 병리 조직학적으로 저이형도에서 가장 흔한 조직형인 투명세포형 RCC에 속하면서 급속하게 원격 전이를 초래하는 증례가 경험되어 기존의 임상병리학적 인자 등에 의한 예후 예측이 곤란하다.

투명세포형 RCC는 VHL 종양 억제 유전자의 불활성화를 특징으로 하는 것이 잘 알려져 있다. 또한, RCC의 체계적인 리시퀀싱 및 엑손 분석이 암 게놈 아틀라스 계획, 암 게놈 프로젝트 및 다른 국제적 시험에서 실시되고 있다. 그리고, 이러한 시험에서 신장 세포암 발생에는 히스톤 H3 리신 36 메틸전달효소인 SETD 2, 히스톤 H3 리신 4 탈메틸효소인 JARID1C(KDM5C), 히스톤 H3 리신 27 탈메틸효소인 UTX(KDM6A), SWI/SNF 크로마틴 리모델링 인자인 PBRM1 등의 히스톤 수식 유전자의 불활성화가 기여하고 있는 것이 드러나 있다(비특허문헌 1~3). 또한, RCC에 있어서, NF2 유전자의 비동의 변이 및 MLL2 유전자의 결실형 변이도 보고되어 있다(비특허문헌 1). 그렇지만, 이러한 유전자 변이는 상술한 RCC에서의 임상 경과의 차이 등(임상병리학적인 다양성)을 완전하게 설명할 수는 없다.

암의 발생 경과에 있어서, 유전적인 사상뿐만 아니라 후생적인 사상이 인지되고, 이들 양쪽의 사상이 다양한 조직에서 서로 연관되면서 임상병리학적인 다양성을 초래한다. 또한, DNA 메틸화의 변화는 인간암에서의 주요한 후생적 변화의 하나라 생각된다.

실제, RCC에 관해서 메틸화 특이적 PCR(MSP), COBRA(바이설파이트와 제한 효소의 병용에 의한 분석) 및 세균 인공 염색체(BAC) 어레이에 기초해서 메틸화 CpG 아일랜드 증폭법(BAMCA법)에 의한 분석에 의해서, 본 발명자들은 RCC 환자로부터 얻은 비암 신장 피질 조직이 DNA 메틸화 상태의 변화에 관련된 전암 단계에 이미 있음을 나타내고 있다(특허문헌 1 및 비특허문헌 4~7). 또한, BAMCA법에 의한 게놈 와이드한 분석에 의해서, 전암 단계에 있는 비암 신장 피질 조직의 DNA 메틸화의 변화가 동일 환자의 대응하는 RCC에 이어지고 있는 것도 드러나 RCC 증례의 예후를 예측하는 방법을 개발하는 것에 성공하고 있다(특허문헌 1 및 비특허문헌 6).

그렇지만, BAMCA법에 의한 DNA 메틸화 상태의 평가 기술은 번잡하거나, 이러한 BAMCA법에 의한 RCC 증례의 예후 예측에서는 발명 당시 BAC 클론으로 커버할 수 있는 염색체 영역이 매우 한정되어 있으므로 실제 진단 능력이 높은 메틸화 CpG 사이트가 확인되지 않는다.

또한, 암에서의 DNA 메틸화에 관하여 대장암 및 위암에서 증례의 임상병리학적 인자와 상관하는 CpG 아일랜드의 DNA 메틸화 항진이 축적되는 암의 형질(C1MP)의 존재가 드러나 있다(비특허문헌 8~11).

그렇지만, 신장 세포암에서는 CIMP 양성 형질과 신장 세포암의 관련은 아직 드러나 있지 않다고 생각된다(비특허문헌 12). 실제, 개별 종양에서의 메틸화 CpG의 수가 기대되는 프와송 분포와는 다른 분포를 나타낸다는 지견에 기초해서 신장 세포암의 일부는 CIMP를 나타낼 가능성이 추정되고 있지만, 신장에서 CIMP 양성 신장 세포 암의 존재는 확정되지 않아 특징으로 이루어지는 명확한 CpG 사이트는 확인되지 않고 있다(비특허문헌 13).

이러한 상황으로부터, 신장 세포암에서도 RCC의 임상병리학적 인자와 강하게 상관된 CpG 아일랜드에서의 DNA 메틸화가 축적되는 형질(CIMP)의 존재를 나타내고, CIMP의 마커가 되는 CpG 부위를 확인해서 간편하고 매우 높은 감도 및 특이성을 가진 RCC의 예후를 예측할 수 있는 방법이 희구되고 있지만, 실용화되고 있지 않는 것이 현상이다.

특허공개 2010-63413호 공보

Dalgliesh, G.L. 등, Nature, 2010년, 463권, 360~363페이지 van Haaften, G. 등, Nat. Genet., 2009년, 41권, 521~523페이지 Varela, I. 등, Nature, 2011년, 469권, 539~542페이지 Arai, E. 등, Clin. Cancer Res., 2008년, 14권, 5531~5539페이지 Arai, E. 등, Int. J. Cancer, 2006년, 119권, 288~296페이지 Arai, E. 등, Carcinogenesis, 2009년, 30권, 214-221페이지 Arai, E. 등, Pathobiology, 2011년, 78권, 1~9페이지 Issa, J. P., Nat. Rev. Cancer., 2004년, 4권, 988~993페이지 Toyota, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999년, 96권, 8681~8686페이지 Shen, L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007년, 104권, 18654~18659페이지 Toyota, M. 등, Cancer Res., 1999년, 59권, 5438~5442페이지 Morris, M. R. 등, Genome Med., 2010년, 2(9):59 McRonald, F. E. 등, Mol. Cancer, 2009년, 8:31

간편하고 매우 높은 감도 및 특이성을 갖는 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 결정하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서, 1CpG 해상도 인피니엄(infinium) 어레이를 사용하고, 29개의 정상 신장 피질 조직 (C)샘플, 투명세포형 신장 세포암(clear cell RCC)의 환자로부터 얻어진 107개의 비암 신장 피질 조직 (N)샘플 및 109개의 암 조직 (T)샘플에 대해서 메틸롬 분석을 행했다. 그 결과, N샘플의 DNA 메틸화 레벨은 C샘플과 비교해서 4830 CpG 사이트에서 이미 변화하고 있는 것이 드러났다. 또한, N샘플에서 DNA 메틸화의 변화가 생기고 있고, 그것의 변화가 T샘플로 이어져 항진되고 있는 사이트, 801 CpG 사이트를 확인하여 이 801 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨에 기초해서 자율 계층적 클러스터 분석을 행했다. 그 결과, 신장 세포암은 클러스터 A(n=90)와 클러스터 B(n=14)로 나뉘는 것을 발견했다. 그리고, 이 클러스터 B에는 임상병리학적으로 악성도가 높은 종양이 집적하고 있고, 또한 이 클러스터 B에 속하는 환자의 무암 생존율(무재발 생존율) 및 전체적인 생존율(전제 생존율)은 클러스터 A에 속하는 환자의 그것들보다 유의하게 낮다는 것도 발견했다. 즉, 클러스터 B에 속하는 신장 세포암은 CpG 아일랜드에서의 DNA 고메틸화의 축적에 의해서 특징지어져 CpG 아일랜드 메틸화 형질(CIMP) 양성 암인 것을 드러냈다.

또한, FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, SLC13A5 및 NKZ6-2 유전자의 CpG 사이트에서의 DNA 고메틸화는 신장 세포암에서의 CIMP의 특징인 것도 처음으로 발견했다.

또한, 특허문헌 1 및 비특허문헌 6에 나타낸 DNA 메틸화의 유무를 조사함으로써 신장 세포암의 예후 예측에 유효하다고 확인된 신장 세포암 관련 영역(70개의 BAC 클론)에는 이번 확인된 17 유전자의 CpG 사이트는 하나도 포함하지 않았다.

또한, 이들 17 유전자의 CpG 사이트에서의 고메틸화 상태는 인피니엄 어레이를 사용한 분석 이외의 방법(파이로시퀀싱법 및 질량 분석계를 사용한 DNA 메틸화 분석법)에서도 검출될 수 있다는 것도 인지되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명은, 보다 상세하게는 하기의 것이다.

<1> 하기 (a)~(c)의 공정을 포함하는 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하는 방법으로서,

(a) 피험체의 신장 조직 유래의 게놈 DNA를 조제하는 공정,

(b) 공정 (a)에서 조제한 게놈 DNA에 대해서 FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, SLC13A5 및 NKZ6-2로 이루어지는 유전자 군으로부터 선택되는 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 공정,

(c) 공정 (b)에서 검출한 DNA 메틸화 레벨로부터 상기 피험체가 예후 불량군으로 분류되는지 아닌지를 결정하는 공정을 포함하는 방법.

<2> <1>에 있어서, 공정 (b)는 공정 (a)에서 조제한 게놈 DNA를 바이설파이트 처리하여 상기 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 공정인 방법.

<3> <1> 또는 <2>에 기재된 방법을 사용하기 위한, 적어도 12 염기의 쇄 길이를 갖는 하기 (a)~(b)에 기재된 어느 하나인 올리고뉴클레오티드로서,

(a) 상기 유전자군으로부터 선택되는 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트를 끼워 넣도록 설계된 한 쌍의 프라이머인 올리고뉴클레오티드

(b) 상기 유전자 군으로부터 선택되는 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트를 포함한 뉴클레오티드에 혼성화되는 프라이머 또는 프로브인 올리고뉴클레오티드.

신장 세포암의 예후 불량 리스크를 간편하고 매우 높은 감도 및 특이성을 갖도록 결정할 수 있다.

도 1은 투명세포형 신장 세포암 환자에 유래하는 비암 신장 피질 조직(N)과 종양성 조직(T)의 조직학적 차이를 나타낸 현미경 사진이다. 즉, N은 주로 근위 세뇨관으로 이루어진다. 한편, T에는 포상 구조가 인지되고, 또한 종양 세포의 세포질은 지질 및 글리코겐으로 충만되고 있어 뚜렷한 세포막으로 둘러싸여 있다. 또한, 종양 세포의 핵은 원형 형상을 취하는 경향이 있고, 미세한 과립 형상의 균일하게 분산된 크로마틴을 동반하는 것을 나타낸 현미경 사진이다.
도 2는 ZFP42 유전자의 CpG 사이트에 관해서 인피니엄 에세이에 의해서 검출된 DNA 메틸화 레벨(β값)과, 파이로시퀀싱에 의해서 검출된 DNA 메틸화 레벨의 상관을 나타낸 그래프이다.
도 3은 ZFP154 유전자의 CpG 사이트에 관해서 인피니엄 에세이에 의해서 검출된 DNA 메틸화 레벨(β값)과, 파이로시퀀싱에 의해서 검출된 DNA 메틸화 레벨의 상관을 나타낸 그래프이다.
도 4는 ZFF540 유전자의 CpG 사이트에 관해서 인피니엄 에세이에 의해서 검출된 DNA 메틸화 레벨(β값)과, 파이로시퀀싱에 의해서 검출된 DNA 메틸화 레벨의 상관을 나타낸 그래프이다.
도 5는 투명세포형 신장 세포암의 환자 104명의 801 프로브(CpG 사이트)에서의 암 조직(T)과 비암조직(N)의 DNA 메틸화 레벨의 차(Δβ_T-N)를 자율 계층적 클러스터링함으로써 클러스터 A(n=90) 및 클러스터 B(n=14)에 서브 클러스터화할 수 있는 것을 나타낸 도면이다. 또한, 상기 801 프로브에서의 DNA 메틸화는 상기 암 단계에서 변화가 생기고 있어 지속적인 신장 세포의 암화에 기여하고 있는 것으로 생각된다.
도 6은 투명세포형 신장 세포암의 환자(클러스터 A에 속하는 환자 및 클러스터 B에 속하는 환자)에 관해서 후술하는 무재발 생존율의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 투명세포형 신장 세포암의 환자(클러스터 A에 속하는 환자 및 클러스터 B에 속하는 환자)에 관해서 후술하는 전체 생존율의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 인피니엄 에세이의 검출 대상이 된 26454개의 모든 프로브에 대하여 투명세포형 신장 세포암 환자의 비암 조직(N샘플)과 상기 환자의 암 조직(T샘플)에서 DNA 메틸화 레벨의 차(Δβ_T-N의 절대값)가 0.1 이상 인지된 프로브의 비율을 나타낸 그래프이다. 도면 중, "전체 증례"는 분석한 투명세포형 신장 세포암 환자 모두의 결과를 나타내고, "A"는 분석한 투명세포형 신장 세포암 환자 중 클러스터 A에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자를 나타내며, "B"는 분석한 투명세포형 신장 세포암 환자 중 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자를 나타낸다. 바는 SD(표준편차)를 나타내고, "NS"는 유의차가 인지되지 않은 것을 나타낸다(도 9~12에 있어서 동일).
도 9는 인피니엄 에세이의 검출 대상이 된 26454개의 모든 프로브에 대하여 N샘플과 T샘플에서 DNA 메틸화 레벨의 차(Δβ_T-N의 절대값)가 0.2 이상 인지된 프로브의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 인피니엄 에세이의 검출 대상이 된 26454개의 모든 프로브에 대하여 N샘플과 T샘플에서 DNA 메틸화 레벨의 차(Δβ_T-N의 절대값)가 0.3 이상 인지된 프로브의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 인피니엄 에세이의 검출 대상이 된 26454개의 모든 프로브에 대하여 N샘플과 T샘플에서 DNA 메틸화 레벨의 차(Δβ_T-N의 절대값)가 0.4 이상 인지된 프로브의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 인피니엄 에세이의 검출 대상이 된 26454개의 모든 프로브에 대하여 N샘플과 T샘플에서 DNA 메틸화 레벨의 차(Δβ_T-N의 절대값)가 0.5 이상 인지된 프로브의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 13은 클러스터 A에 속하는 대표적인 투명세포형 신장 세포암 환자(케이스 1~4)에 관하여 신장 세포암 조직(T샘플)에서의 DNA 메틸화 레벨(β값)과, 비암 신장 조직(N샘플) 그것들의 조직화를 행한 결과를 나타낸 산포도이다.
도 14는 클러스터 B에 속하는 대표적인 투명세포형 신장 세포암 환자(케이스 5~8)에 관하여 신장 세포암 조직(T샘플)에서의 DNA 메틸화 레벨(β값)과, 비암 신장 조직(N샘플) 그것들의 조직화를 행한 결과를 나타낸 산포도이다. 도면 중의 동그라미로 둘러싸여 있는 부분은 DNA 메틸화 레벨이 N샘플에서 낮아 DNA 고메틸화의 정도가 대응되는 N샘플과 비교해서 T샘플의 것이 현저한 프로브의 분포를 나타낸다.
도 15는 표 14에 나타낸 CpG 아일랜드 메틸화 형질(CIMP)의 특징으로 이루어지는 16 프로브(16CpG 사이트)의 DNA 메틸화 레벨과, 상기 클러스터 A 또는 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자의 대응을 나타낸 도면이다. 도면 중, 검게 색칠된 개소는 Δβ_T-N이 0, 4를 초과하는 것을 나타낸다.
도 16은 클러스터 A와 클러스터 B 사이에서 현저하게 DNA 메틸화 레벨(Δβ_T-N)이 다른 869 프로브(FDR[q=0.01])를 사용하여 랜덤 포레스트 분석을 행한 결과를 나타낸 그래프이다. 도면 중, 꺽은선은 위에서 순서대로 스팸(3), 아웃 오브 백(OOB), 논스팸(1)을 나타낸다. 가로축은 나무(tree)의 수를 나타내고, 세로축은 추측 오차(Error)를 나타낸다.
도 17은 클러스터 A와 클러스터 B 사이에서 현저하게 DNA 메틸화 레벨(Δβ_T-N)이 다른 869 프로브(FDR[q=0.01])를 사용하여 랜덤 포레스트 분석을 행한 결과를 나타낸 플롯 도면이다. 도면 중, 가로축은 Gini 계수의 평균값(MeanDecreaseGini)을 나타내고, 세로축은 인피니엄 에세이에 사용된 프로브(CpG 사이트)를 나타낸다.
도 18은 클러스터 A 또는 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자에서의 SLC13A5 유전자의 CpG 아일랜드에서의 DNA 메틸화 레벨을 MassARRAY에 의해서 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 또한, 도면 중, SLC13A5_10 "CpG_40"은 인피니엄 에세이에 의해서도 클러스터 B에서 높은 DNA 메틸화 레벨이 검출된 CpG 사이트(프로브 ID: cg22040627, NCBI 데이터베이스 Genome Build 37 상의 위치: 17번 염색체 6617030)이다.
도 19는 클러스터 A 또는 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자에서의 RIMS4 유전자의 CpG 아일랜드에서의 DNA 메틸화 레벨을 MassARRAY에 의해서 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 클러스터 A 또는 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자에서의 PCDHAC1 유전자의 CpG 아일랜드에서의 DNA 메틸화 레벨을 MassARRAY에 의해서 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 클러스터 A 또는 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자에서의 ZNF540 유전자의 CpG 아일랜드에서의 DNA 메틸화 레벨을 MassARRAY에 의해서 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 클러스터 A 또는 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자에서의 TRH 유전자의 CpG 아일랜드에서의 DNA 메틸화 레벨을 MassARRAY에 의해서 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 클러스터 A 또는 클러스터 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암 환자에서의 PRAC 유전자의 CpG 아일랜드에서의 DNA 메틸화 레벨을 MassARRAY에 의해서 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 컷오프 값(진단 역치)을 충족하는 CpG 사이트의 수에 따라서 클러스터 A 또는 클러스터 B에 투명세포형 신장 세포암 환자를 분별한 결과를 나타낸 그래프이다. 컷오프 값에 대해서는 표 19~27을 참조할 것. 또한, 이 분별에서 지표가 된 CpG 사이트는 표 19~27에 기재된 AUC가 0.95보다 큰 CpG 사이트 23개소(32의 CpG 사이트)이다.

본 발명은 하기 (a)~(c)의 공정을 포함한 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하는 방법을 제공한다.

(a) 피험체의 신장 조직 유래의 게놈 DNA를 조제하는 공정,

(b) 공정 (a)에서 조제된 게놈 DNA에 대해서 FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, SLC13A5 및 NKX6-2로 이루어지는 유전자군으로부터 선택되는 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 공정,

(c) 단계 (b)에서 검출된 DNA 메틸화 레벨에서 상기 피험체가 예후 불량군으로 분류되는지 여부를 결정하는 공정을 포함하는 방법.

본 발명에서 "신장 세포암"이란 신장의 세뇨관 상피 세포가 암화(癌化)된 것이고, 그 병리학적 특징으로부터 투명세포형, 과립세포형, 색소혐성형, 방추형, 낭포수반형, 낭포유래형, 낭포성형, 유두형상형으로 분류되는 암이다. 또한, 본 발명에 의한 "피험체"로서는, 예를 들면 신장 적출 수술 등에 의해서 신장 세포암의 치료가 실시된 환자를 들 수 있다.

본 발명에 의한 "신장 세포암의 예후 불량 리스크"란, 예를 들면 피험체의 예후(신장 적출술 등)의 생존율이 낮은 것을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 후술하는 도 6에 나타낸 바와 같이 수술 후 500일 경과 후의 무재발 생존율(무암 생존율)이 50% 이하가 되는 것을 들 수 있으며, 후술하는 도 7에 나타낸 바와 같이 수술 후 1500일 경과 후의 전체 생존율(전체적인 생존율)이 70% 이하가 되는 것을 들 수 있다.

본 발명에서 "CpG 사이트"란 시토신(C)과 구아닌(G)의 사이를 인산디에스테르 결합(p)하고 있는 부위를 의미하고, "DNA 메틸화"란 상기 CpG 사이트에서 시토신의 5위치의 탄소가 메틸화되어 있는 상태를 의미한다. "DNA 메틸화 레벨"이란 검출의 대상이 되는 특정한 CpG 사이트에서 메틸화되고 있는 비율을 의미하고, 예를 들면 검출의 대상이 되는 특정한 CpG 사이트에서의 전체 시토신 수(메틸화 시토신 및 비메틸화 시토신)에 대한 메틸화 시토신 수의 비율로 나타낼 수 있다.

본 발명에 의한 "신장 조직 유래의 게놈 DNA의 조제"는 특별히 제한은 없고, 페놀클로로포름 처리법 등의 공지의 방법을 적절히 선택해서 사용함으로써 행할 수 있다.

이러한 방법에 의해 게놈 DNA가 조제되는 신장 조직으로서, 예를 들면 신장 적출 수술 등에서 채취한 그대로의 신장 조직, 신장 적출 수술 등에서 채취한 후 동결한 신장 조직, 신장 적출 수술 등에 처해서 채취한 후 포르말린 고정 및 파라핀 포매를 실시한 신장 조직을 들 수 있다. 이들 신장 조직에서는, 본 발명의 검출방법으로 제공될 때까지 신장 조직 중의 게놈 DNA의 분해 등을 억제하고, 또한 후술하는 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 공정에서 보다 효율적으로 바이설파이트 처리, PCR 등을 행할 수 있다는 관점으로부터 동결된 신장 조직을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 인피니엄 에세이에 의해 17유전자(FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, SLC13A5 및 NKX6-2)의 18CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 검출함으로써 예후 불량의 신장 세포암(CIMP 양성 신장 세포암)과 비교적 양호한 신장 세포암을 명확하게 판별할 수 있다는 것을 드러냈다. 또한, 질량 분석계를 사용한 DNA 메틸화 분석법에 의해서, 이러한 CpG 사이트를 포함한 CpG 아일랜드 전체 영역에 있어서도 예후 불량의 신장 세포암에서 고메틸화 상태가 지속되고 있다는 것을 드러냈다.

따라서, 본 발명에 의한 "CpG 사이트"란 다른 유전자보다 상기 17유전자군 중 적어도 1의 유전자에 가까운 위치에 존재하는 CpG 사이트를 의미하고, 바람직하게는 다른 유전자보다 상기 유전자에 가까운 위치에 존재하는 CpG 아일랜드 중의 적어도 1의 CpG 사이트이며, 보다 바람직하게는 상기 17유전자군의 프로모터 영역에 위치하는 적어도 1의 CpG 사이트이고, 특히 바람직하게는 기준 인간 게놈 서열인 NCBI 데이터베이스 Genome Build 37 상의 위치가 표 1-4에 기재된 염색체 번호 및 염색체 상의 위치인 적어도 1의 CpG 사이트이다.

또한, 본 발명에서 전형적으로는 FAM150A는 RefSeq ID: NP_997296으로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, GRM6은 RefSeq ID: NP_000834로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, ZNF540은 RefSeq ID: NP_689819로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, ZFP42는 RefSeq ID: NP_777560으로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, ZNF154는 RefSeq ID: NP_001078853으로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, RIMS4는 RefSeq ID: NP_892015로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, PCDHAC1은 RefSeq ID: NP_061721로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, KHDRBS2는 RefSeq ID: NP_689901로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, ASCL2는 RefSeq ID: NP_005161로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, KCNQ1은 RefSeq ID: NP_000209로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, PRAC는 RefSeq ID: NP_115767로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, WNT3A는 RefSeq ID: NP_149122로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, TRH는 RefSeq ID: NP_009048로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, FAM78A는 RefSeq ID: NP_203745로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, ZNF671은 RefSeq ID: NP_079109로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이고, SLC13A5는 RefSeq ID: NP_808218로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이며, NKX6-2 RefSeq ID: NP_796374로 특정되는 단백질을 코드하는 유전자이다.

본 발명에서 "DNA 메틸화 레벨을 검출하는 방법"으로서는 특정한 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 정량할 수 있는 방법이면 좋고, 공지한 방법을 적절히 선택해서 행할 수 있다. 이러한 공지한 방법으로서는, 예를 들면 하기에 나타낸 제1~제7의 방법을 들 수 있다.

제1의 방법은 다음 원리에 기초한 방법이다. 우선, 상기 게놈 DNA에 중아황산염(바이설파이트) 처리를 실시한다. 또한, 이 바이설파이트 처리에 의해서 비메틸화 시토신 잔기는 우라실로 변환되지만, 메틸화 시토신 잔기는 변환되지 않는다(Clark SJ 등, Nucleic Acids Res, 1994년, 22권, 2990~7페이지 참조). 이어서, 이와 같이 바이설파이트 처리한 게놈 DNA를 주형으로 해서 전체 게놈 증폭을 행하고, 효소에 의한 단편화(통상 300~600bp 정도의 단편화)를 행해 단쇄로 해리시킨다.

또한, 제1의 방법에 있어서, 바이설파이트 처리에 의해서 변환된 게놈 DNA에 혼성화되는 프로브에 있어서, 상기 프로브의 3'말단의 염기는 상기 CpG 사이트의 시토신에 상보적인 염기가 되는 프로브를 조제한다. 즉, 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있는 경우에는 프로브의 3'말단의 염기는 구아닌이 되고, 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있지 않은 경우에는 프로브의 3'말단의 염기는 아데닌이 된다.

그리고, 이러한 상기 CpG 사이트에 상보적인 3'말단의 염기에만 다른 2종류의 프로브와, 상기 단편화 게놈 DNA를 혼성화시켜 형광 표식된 염기 존재 하에 1염기 신장 반응을 행한다. 그 결과, 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있는 경우에는 3'말단의 염기가 구아닌인 프로브(메틸화 검출용 프로브)에 형광 표식된 염기가 채워 넣어지게 되고, 한편 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있지 않은 경우에는 3'말단의 염기가 아데닌인 프로브(비메틸화 검출용 프로브)에 형광 표식된 염기가 채워 넣어지게 되기 때문에 메틸화 검출용 프로브 및/또는 비메틸화 검출용 프로브가 발하는 형광의 강도로부터 DNA 메틸화 레벨을 산출할 수 있다.

또한, 이러한 제1의 방법에서는 다른 태양으로서, 상기 메틸화 검출용 프로브 및 비메틸화 검출용 프로브 대신에 바이설파이트 처리에 의해서 변환된 게놈 DNA에 혼성화되는 프로브에 있어서, 상기 프로브의 3'말단의 염기는 상기 CpG 사이트의 구아닌에 상보적인 염기가 되는 프로브를 사용해도 좋다. 그리고, 이러한 프로브와 상기 단편화 게놈 DNA를 혼성화시켜 형광 물질로 표식된 구아닌 및/또는 상기 형광 물질과는 다른 형광 색소로 표식된 아데닌의 존재 하에 1염기 신장 반응을 행한다. 그 결과, 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있는 경우에는 해당 프로브에 형광 표식된 구아닌이 채워 넣어지게 되고, 한편 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있지 않은 경우에는 해당 프로브에 형광 표식된 아데닌이 채워 넣어지게 되기 때문에 상기 프로브에 채워 넣어진 각 형광 물질이 발하는 형광의 강도로부터 DNA 메틸화 레벨을 산출할 수 있다.

제1의 방법으로서는, 예를 들면 비즈 어레이법(예를 들면, 인피니엄(등록상표) 에세이)을 들 수 있다.

또한, 이러한 제1의 방법에 있어서, DNA 메틸화 레벨의 검출 대상이 되는 상기 CpG 사이트로서는 바람직하게는 기준 인간 게놈 서열인 NCBI 데이터베이스 Genome Build 37 상의 위치가 제8 염색체 53, 478, 454위치, 제5 염색체 178, 422, 244위치, 제19 염색체 38, 042, 472위치, 제4 염색체 188, 916, 867위치, 제19 염색체 58, 220, 662위치, 제20 염색체 43, 438, 865위치, 제5 염색체 140, 306, 458위치, 제6 염색체 62, 995, 963위치, 제11 염색체 2, 292, 004위치, 제11 염색체 2, 466, 409위치, 제17 염색체 46, 799, 640위치, 제19 염색체 58, 220, 494위치, 제1 염색체 228, 194, 448위치, 제3 염색체 129, 693, 613위치, 제9 염색체 134, 152, 531위치, 제19 염색체 58, 238, 928위치, 제17 염색체 6, 617, 030위치 및 제10 염색체 134, 599, 860위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1의 CpG 사이트이다. 또한, 본 발명에 의한 제1의 방법에서는 상기 18CpG 사이트 중 적어도 하나의 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 것이 바람직하지만, 예후 불량 리스크의 검출에서의 감도 또는 특이성을 보다 향상시킬 수 있다는 관점에서 복수의 CpG 사이트(예를 들면, 2사이트, 5사이트, 10사이트, 15사이트)를 DNA 메틸화 레벨의 검출 대상으로 하는 것이 보다 바람직하고, 상기 18CpG 사이트 모두를 DNA 메틸화 레벨의 검출 대상으로 하는 것이 특히 바람직하다.

제2의 방법은 다음 원리에 기초한 방법이다. 우선, 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 이어서, 바이설파이트 처리된 게놈 DNA를 주형으로 해서 상기 CpG 사이트를 적어도 하나 포함한 DNA를 T7 프로모터를 부가한 프라이머에서 증폭한다. 이어서, RNA에 전사하여 RNase에 의해 염기 특이적인 절단 반응을 행한다. 그리고, 이러한 절단 반응 산물을 질량 분석계에 달아 질량 측정을 행한다.

그리고, 질량 측정에 의해서 얻어진 메틸화 시토신 잔기 유래의 질량(시토신의 질량)과 비메틸화 시토신 잔기 유래의 질량(우라실의 질량)과 비교하여 상기 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 산출한다.

제2의 방법으로서는, 예를 들면 질량 분석계를 사용한 DNA 메틸화 분석방법(예를 들면, MassARRAY(등록상표), Jurinke C 등, Mutat Res, 2005년, 573권, 83~95페이지 참조)을 들 수 있다.

또한, 이러한 제2의 방법에 있어서 DNA 메틸화 레벨의 검출 대상이 되는 상기 CpG 사이트로서 바람직하게는 서열 번호: 1~16에 기재된 염기 서열에 포함되는 적어도 1의 CpG 사이트이고, 예후 불량 리스크의 검출에서의 감도 또는 특이성을 보다 향상시킬 수 있다는 관점에서 보다 바람직하게는 후술하는 ROC 곡선 하 면적(AUC)이 0.90보다 크고, 하기 표 5~8에 기재된 CpG 사이트군 중 적어도 1의 CpG 사이트이며, 더욱 바람직하게는 하기 표 5~8에 기재된 AUC가 0.95보다 큰 CpG 사이트군 중 적어도 1의 CpG 사이트이고, 해당 AUC가 0.95보다 큰 CpG 사이트군 모두를 DNA 메틸화 레벨의 검출 대상으로 하는 것이 특히 바람직하다.

또한, 표 5~8에 기재된 "염색체 번호" 및 "염색체 상의 위치"는 기준 인간 게놈 서열인 NCBI 데이터베이스 Genome Build 37 상의 위치를 나타낸다. "표적 유전자명_프라이머 세트명_CpG 사이트"는 후술되는 질량 분석계를 사용한 DNA 메틸화 분석(실시예 5)에서 표 17 및 18에 기재된 프라이머 세트를 사용해서 증폭한 PCR 산물 중의 CpG 사이트의 순서를 나타낸다. "AUC값", "컷오프 값", "특이도", "감도" 및 "1-특이도"에 대해서는 후술하는 실시예 5를 참조할 것.

제3의 방법은 다음 원리에 기초한 방법이다. 우선, 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 또한, 이 바이설파이트 처리에 의해서 비메틸화 시토신 잔기는 우라실로 변환되지만, 하기 신장 반응(시퀀스 반응)에서는 우라실은 티민으로서 나타낸다. 이어서, 이와 같이 바이설파이트 처리한 게놈 DNA를 주형으로 해서 상기 CpG 사이트를 적어도 하나 포함한 DNA를 증폭한다. 그리고, 증폭된 DNA를 단쇄로 해리시킨다. 이어서, 해리된 단쇄 DNA 중 한쪽 쇄만을 분리한다. 그리고, 상기 CpG 사이트 염기의 근처로부터 1염기씩 신장 반응을 행하고, 이때 생성되는 피로인산을 효소적으로 발광시켜 발광의 강도를 측정한다. 이렇게 해서 얻어진 메틸화 시토신 잔기 유래의 발광 강도(시토신의 발광 강도)와 비메틸화 시토신 잔기 유래의 발광 강도(티민의 발광 강도)를 비교하고, 예를 들면 하기 식에 의해서 상기 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨(%)을 산출한다.

DNA 메틸화 레벨(%)=시토신의 발광 강도×100/(시토신의 발광 강도+티민의 발광 강도).

제3의 방법으로서는, 예를 들면 파이로시퀀싱법(등록상표, Pyrosequencing)(Anal. Biochem. (2000) 10:103-110 참조) 등을 들 수 있다.

제4의 방법은 다음 원리에 기초한 방법이다. 우선, 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 이어서, DNA 이중쇄 사이에 삽입되는 형광을 발하는 삽입제를 포함한 반응계에서 상기 바이설파이트 처리된 게놈 DNA를 주형으로 해서 상기 CpG 사이트를 적어도 1개 포함한 뉴클레오티드를 증폭한다. 이어서, 상기 반응계의 온도를 변화시켜 상기 삽입제가 발하는 형광 강도의 변동을 검출한다. 상기 CpG 사이트를 적어도 1개 포함한 뉴클레오티드의 융해 곡선을 메틸화·비메틸화 대조 검체를 주형으로 하는 증폭 산물의 융해 곡선과 비교하여 상기 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 산출한다.

제4의 방법으로서는, 예를 들면 메틸화 감수성 고해상능 융해 곡선 분석(methylation-sensitive high resolution melting: MS-HRM, Wojdacz TK 등, Nat Protoc., 2008년, 3권, 1903~8페이지 참조)을 들 수 있다.

제5의 방법은 다음 원리에 기초한 방법이다. 우선, 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 이어서, 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있는 경우에 증폭 가능한 프라이머 세트, 및 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있지 않은 경우에 증폭 가능한 프라이머 세트를 조제한다. 그리고, 상기 바이설파이트 처리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 상기 CpG 사이트를 적어도 1개 포함한 뉴클레오티드를 이들 프라이머 세트를 사용해서 각각 증폭한다. 그리고, 얻어진 증폭 산물의 양, 즉 메틸화 CpG 사이트 특이적인 증폭 산물의 양, 및 비메틸화 CpG 사이트 특이적인 증폭 산물의 양을 비교함으로써 상기 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 산출한다.

또한, 이러한 제5의 방법에서는 다른 태양으로서 우선 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 이어서, 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있는 경우에 혼성화되는 것이 가능한 뉴클레오티드를 갖고, 리포터 형광 색소 및 켄쳐 형광 색소가 표식된 올리고뉴클레오티드 프로브를 조제한다. 또한, 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있지 않은 경우에 혼성화되는 것이 가능한 뉴클레오티드를 갖고, 상기 리포터 형광 색소와는 다른 리포터 형광색, 및 켄쳐 형광 색소가 표식된 올리고뉴클레오티드 프로브를 조제한다. 그리고, 바이설파이트 처리된 게놈 DNA에 상기 올리고뉴클레오티드 프로브를 혼성화시키고, 또한 상기 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화된 게놈 DNA를 주형으로 해서 상기 CpG 사이트를 포함한 뉴클레오티드를 증폭한다. 그리고, 상기 증폭에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브의 분해에 의해 상기 리포터 형광 색소가 발하는 형광을 검출한다. 이렇게 해서 검출된 메틸화 시토신 CpG 사이트 특이적인 리포터 형광 색소가 발하는 형광의 강도와, 비메틸화 시토신 CpG 사이트 특이적인 리포터 형광 색소가 발하는 형광의 강도를 비교함으로써, 상기 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 산출한다.

제5의 방법으로서는, 예를 들면 TaqMan 프로브(등록상표)를 사용한 MethyLight법 등의 메틸화 특이적 정량 PCR법(methylation-specific polymerase chain reaction(MS-PCR) using real-time quantitative PCR)을 들 수 있다.

제6의 방법은 다음 원리에 기초한 방법이다. 우선, 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 이어서, 바이설파이트 변환된 상기 CpG 사이트를 포함한 뉴클레오티드를 주형으로 해서 직접 시퀀싱 반응을 행한다. 그리고, 결정된 염기 서열에 기초해서 형광 강도, 즉 메틸화 시토신 잔기 유래의 형광 강도(시토신의 형광 강도)와 비메틸화 시토신 잔기 유래의 형광 강도(티민의 형광 강도)를 비교함으로써 상기 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 산출한다.

또한, 이러한 제6의 방법에서는 다른 태양으로서 우선 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 이어서, 바이설파이트 변환된 상기 CpG 사이트를 포함한 뉴클레오티드를 PCR 반응 등에 의해서 클로닝한다. 그리고, 얻어진 복수의 클로닝 산물의 염기 서열을 각각 결정하고, 메틸화 시토신 CpG 사이트 특이적인 염기 서열을 갖는 클로닝 산물의 개수와 비메틸화 시토신 CpG 사이트 특이적인 염기 서열을 갖는 클로닝 산물의 개수를 비교함으로써 상기 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 산출한다.

제6의 방법으로서는, 예를 들면 바이설파이트 직접 시퀀싱(bisulfite direct sequencing), 바이설파이트 클로닝 시퀀싱(bisulfite cloning sequencing)을 들 수있다(Kristensen LS 등, Clin Chem, 2009년, 55권, 1471~83페이지 참조).

제7의 방법은 다음 원리에 기초한 방법이다. 우선, 상기 게놈 DNA에 바이설파이트 처리를 실시한다. 이어서, 바이설파이트 변환된 상기 CpG 사이트를 포함한 뉴클레오티드를 주형으로 해서 상기 CpG 사이트를 포함한 영역을 PCR에서 증폭한다. 이어서, 증폭된 DNA 단편을 상기 CpG 사이트가 메틸화되어 있는 경우와 되어 있지 않은 경우에서 서열이 다른 개소를 인식하는 제한 효소로 처리한다. 그리고, 전기 영동함으로써 분획된 메틸화 CpG 사이트에 유래하는 제한 효소 단편과 비메틸화 CpG 사이트에 유래하는 제한 효소 단편의 밴드 농도를 정량적으로 분석함으로써 상기 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 산출할 수 있다.

제7의 방법으로서는, 예를 들면 COBRA(바이설파이트와 제한 효소의 병용에 의한 분석)를 들 수 있다.

이상, 본 발명의 "DNA 메틸화 레벨을 검출하는 방법"으로서 바람직하게 사용할 수 있는 방법을 예시하지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상술한 대로 DNA 메틸화 레벨을 검출할 때 피험체로부터 조제된 게놈 DNA는 또한 바이설파이트 처리에 제공된다. 따라서, 본 발명의 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하는 방법으로서 상기 공정(b)이 상기 공정(a)에서 조제된 게놈 DNA를 바이설파이트 처리하고, 상기 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 공정인 방법도 취할 수 있다.

본 발명에서 공정(b)에서 검출된 DNA 메틸화 레벨에서 상기 피험체가 예후 불량군으로 분류되는지 여부를 결정하기 위한 지표는 당업자라면 적절 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 방법과 아울러 설정할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 실시예와 같이 각 CpG 사이트에 대하여 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 행하여 감도(양성률) 및 특이도를 구하고, 또한 감도 및 특이도의 합이 최대가 되는 DNA 메틸화 레벨을 상기 지표(컷오프 값, 진단 역치)로서 설정할 수 있고, 검출한 DNA 메틸화 레벨이 상기 컷오프 값보다 높으면 그 피험체를 예후 불량군으로 분류할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서는 신장 세포암의 예후 불량 리스크의 검출에서의 감도 또는 특이성을 보다 향상시킬 수 있다는 관점에서 DNA 메틸화 레벨뿐만 아니라, 상기 컷오프 값보다 높은 값을 나타낸 CpG 사이트의 수를 상기 피험체가 예후 불량군으로 분류되는지 여부를 결정하기 위한 지표로서도 좋다. 예를 들면, 후술하는 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의한 CpG 사이트 23개소에서 상기 컷오프 값을 충족하는 개소가 15 이상인 경우에 그 피험체를 예후 불량군으로 분류할 수 있다(후술되는 도 24 참조).

이와 같이, 본 발명에 의하면 조직학적 관찰 등의 기존의 분류 기준으로는 감지할 수 없고, 신장 절제 수술 후의 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 판정할 수 있다. 신장 세포암의 치료방법으로서는 신장 절제 수술이 제1 선택이지만, 전이·재발을 조기에 발견할 수 있으면, 그들에 대해서 면역 요법이나 분자 표적 치료제 등의 주효를 기대할 수 있다.

따라서, 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 예후 불량군으로 분류된 피험체에 분자 표적 치료약을 투여하는 공정 및/또는 면역 요법을 실시하는 공정을 포함한 신장 세포암의 치료방법을 제공할 수도 있다.

또한, 본 발명에 의해 신장 절제 수술의 대상이 되는 대다수의 신장 세포암 증례에서 예후 불량군으로 분류된 환자는 보다 정밀한 전이·재발 스크리닝을 행하고, 그 경우에는 조기 발견에 의해 치료 성적을 향상시킬 수 있다고 기대되지만, 한편으로 예후 불량군에는 분류되지 않은 환자에서는 전이·재발 스크리닝의 부담을 경감시킬 수 있다.

본 발명은 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하는 방법에 사용하기 위한 적어도 12염기의 쇄 길이를 갖는 하기 (a)~(b)에 기재된 어느 하나인 올리고뉴클레오티드를 제공한다

(a) 상기 CpG 사이트군으로부터 선택되는 적어도 1개의 사이트를 끼워 넣도록 설계된 한 쌍의 프라이머인 올리고뉴클레오티드

(b) 상기 CpG 사이트군으로부터 선택되는 적어도 1개의 사이트를 포함한 뉴클레오티드에 혼성화되는 프라이머 또는 프로브인 올리고뉴클레오티드.

이러한 (a) 상기 CpG 사이트군으로부터 선택되는 적어도 1개의 사이트를 끼워 넣도록 설계된 한 쌍의 프라이머로서는, 예를 들면 바이설파이트 변환된 상기 CpG 사이트군으로부터 선택되는 적어도 1개의 사이트를 포함한 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머(폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 프라이머(포워드 프라이머 및 리버스 프라이머))를 들 수 있다. 해당 프라이머는 상기 CpG 사이트군으로부터 선택되는 적어도 1개의 사이트 양측의 바이설파이트 변환된 각 뉴클레오티드에 혼성화되는 프라이머이다.

또한, (b) 상기 CpG 사이트군으로부터 선택되는 적어도 1개의 사이트를 포함한 뉴클레오티드에 혼성화되는 프라이머로서는, 예를 들면 바이설파이트 변환된 상기 CpG 사이트의 염기 근처로부터 1염기씩 신장 반응을 행할 수 있는 프라이머(시퀀싱 프라이머)를 들 수 있다. 또한, (b) 상기 CpG 사이트군으로부터 선택되는 적어도 1개의 사이트를 포함한 뉴클레오티드에 혼성화되는 프로브로서는, 예를 들면 바이설파이트 변환된 상기 CpG 사이트를 포함한 뉴클레오티드에 혼성화되는 프로브(소위 TaqMan 프로브)를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 쇄 길이는 적어도 12염기이지만, 바람직하게는 적어도 15염기, 보다 바람직하게는 적어도 20염기이다.

특정한 뉴클레오티드에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드는 해당 특정한 뉴클레오티드에 상보적인 염기 서열을 갖지만 혼성화되는 한 완전하게 상보적이지 않아도 좋다. 이들 올리고뉴클레오티드의 서열은 바이설파이트 변환된 또는 되지 않은 상기 CpG 사이트를 포함한 염기 서열에 기초해서 당업자라면 공지의 방법에 의해, 예를 들면 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이 MassARRAY법 프라이머 디자인 소프트웨어 EpiDesigner(http://www.epidesigner.com, SEQUENOM사 제품), 파이로시퀀싱 에세이 디자인 소프트웨어 ver. 1.0(QIAGEN사 제품) 등을 사용해서 적절히 설계할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 "CpG 사이트를 포함"이란 CpG 사이트 전부, 즉 시토신 및 구아닌 양쪽을 포함할 뿐만 아니라 그 일부(시토신, 구아닌, 또는 비메틸화 시토신이 바이설파이트 변환된 후의 우라실 또는 티민)를 포함해도 좋다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드로서는 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 질량 분석계를 사용한 DNA 메틸화 분석방법에서는 서열 번호: 17~48에 기재된 염기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머가 바람직하다(표 17 및 표 18 참조). 또한, 후술되는 실시예에 나타낸 바와 같이, 파이로시퀀싱에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드로서는 서열 번호: 49~57에 기재된 염기 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프라이머가 바람직하다(표 9 참조).

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드를 포함한 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하는 방법에 사용되기 위한 키트도 제공할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드의 표본에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 필요에 따라서 고정화되어 있어도 좋다. 예를 들면, 인피니엄 에세이에 의해서 검출할 경우는 비즈에 고정된 프로브를 사용할 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 필요에 따라서 표식되어 있어도 좋다. 예를 들면, 파이로시퀀싱법에 의해서 검출할 경우는 비오틴 표식된 프라이머를 사용할 수 있고, TaqMan 프로브법에 의해서 검출할 경우는 리포터 형광 색소 및 켄쳐 형광 색소를 표식한 프로브를 사용할 수 있다.

본 발명의 키트에서는 상기 올리고뉴클레오티드의 표본 이외의 표본을 포함할 수 있다. 이러한 표본으로서는 바이설파이트 변환에 필요한 시약(예를 들면, 아황산수소나트륨 용액 등), PCR 반응에 필요한 시약(예를 들면, 디옥시리보뉴클레오티드나 내열성 DNA 폴리메라아제 등), 인피니엄 에세이에 필요한 시약(예를 들면, 형광 물질로 표식된 뉴클레오티드), MassARRAY에 필요한 시약(예를 들면, 염기 특이적인 절단 반응을 행하기 위한 RNase), 파이로시퀀싱에 필요한 시약(예를 들면, 피로인산의 검출을 위한 ATP 설프릴라아제, 아데노신-5'-포스포황산, 루시페라아제, 및 루시페린이나 단쇄 DNA를 분리하기 위한 스트렙타아비딘 등), MS-HRM법에 필요한 시약(예를 들면, DNA 이중쇄 사이에 삽입되는 형광을 발하는 삽입제 등)을 들 수 있다. 또한, 상기 표식의 검출에 필요한 시약(예를 들면, 기질이나 효소, 양성 대조나 음성 대조, 또는 시료(피험체의 신장 조직 유래의 게놈 DNA 등)의 희석이나 세정에 사용되는 완충액 등)를 들 수 있다. 또한, 키트에는 그 사용 설명서를 포함할 수 있다.

(실시예)

이하, 실시예에 기초해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예에서 사용된 시료 및 방법은 하기에 나타낸 대로이다.

<환자 및 조직 샘플>

109의 암 조직 (T)샘플 및 대응하는 107의 비암 신장 피질 조직 (N)샘플은 원발성의 투명세포형 신장 세포암을 앓고 있는 110명의 환자로부터 수술에 의해서 적출된 시료로부터 얻은 것이고, N샘플에는 현저한 조직학적 변화는 인지되지 않는다.

또한, 이들 환자는 수술 전의 치료는 받지 않고, 국립 암 연구 센터 병원에서 신장 적출 수술을 받은 환자이다. 79명의 남성과 31명의 여성으로 이루어지고, 평균 연령은 62.8±10.3세(평균±표준편차 36~85세)이다.

또한, 샘플의 조직학적 진단은 WHO의 분류에 따라서 행했다(Eble, J.N. 등 "신장 세포암 종양 WHO 분류 병리학 및 유전학 남성 생식기 및 비뇨계의 종양", 2004년, IARC출판, Lyon, 10~43페이지, 도 1 참조).

또한, 모든 종양의 조직학적 이형도는 "Fuhrman, S.A. 등, Am.J.Surg.Pathol., 1982년 6권, 655~663페이지"에 기재된 기준에 따라서 평가하고, TNM 분류는 "Sobin, L.H. 등, 국제대암연합(UICC), TNM 악성 종양의 분류, 제6판, 2002년, Wiley-Liss, New York, 193~195페이지"에 따라서 분류했다.

또한, 신장 세포암의 육안 분류의 기준으로서 간 세포암(HCC)에서 확립된 기준을 채용했다(비특허문헌 4-6 참조). 또한, 타입 3(다결절유합형) HCC는 타입 1(단결절형) 및 타입 2(단결절주위증식형)의 HCC보다 조직학적 분화도는 낮아 간 내의 전이 발생률은 높다(Kanai, T. 등, Cancer, 1987년, 60권, 810~819페이지 참조).

혈관 침습의 유무는 헤마톡실린-에오신 및 엘라스티카·밴·기슨 염색을 실시한 슬라이드를 현미경으로 관찰함으로써 조사했다.

신장 정맥의 주관(main duct)에서의 종양 혈전의 유무는 육안적 관찰에 의해서 조사했다. 또한, 신장 세포암은 통상 섬유성 피막으로 둘러싸여 있으며, 그 경계가 명료하다. 또한, 신장 세포암의 암세포 사이에 섬유성 간질은 거의 포함되지 않는다. 따라서, 비암 상피 세포나 간질 세포를 혼재시키지 않고, 외과 시료로부터 암세포를 얻을 수 있다.

또한, 상기 RCC 환자와 비교하기 위해서, 원발성 신장 종양을 앓고 있지 않은 환자 29명으로부터 수술에 의해서 적출된 시료에서 정상 신장 피질 조직(C1~C29) 29샘플을 얻었다. 샘플을 얻은 원발성 신장 종양을 앓고 있지 않은 환자는 18명의 남성과 11명의 여성으로 이루어지고, 평균 연령은 61.4±10.8세(평균±표준편차 31~81세 )이다. 또한, 이들 환자 중 22명은 신우에서의 요로 상피암을 위한 신장 적출 수술을 받은 환자이며, 6명은 신장 주위의 후복막 종양의 절제와 함께 신장 적출 수술을 받은 환자이다. 나머지 1명은 전이성 배아 세포 종양을 위한 대동맥 주위 림프절 적출 수술을 받은 환자이며, 신장 동맥을 유지하는 것이 어렵기 때문에 동시에 신장 적출 수술도 실시했다.

이번 연구 대상인 모든 환자로부터는 서면에 의한 인폼드 컨센트를 얻었다. 또한, 본 연구는 국립 암 연구 센터의 윤리 위원회의 승인을 받아서 실시된 것이다.

<인피니엄 에세이>

상기 환자로부터 얻은 신선 동결 조직 샘플을 페놀-클로로포름으로 처리하고, 이어서 투석을 실시함으로써 고분자량 DNA를 추출했다(Sambrook, J. 등, 분자 클로닝: 실험 매뉴얼 제3판, 콜드 스프링 하버 출판, NY, 6. 14~6. 15페이지 참조).

그리고, DNA 500ng을 EZ DNA 메틸레이션-골드(TM) 키트(Zymo Research사 제품)를 사용하여 바이설파이트 변환 처리에 제공했다.

이어서, 27578CpG 부위에서의 DNA 메틸화 상태를 인피니엄 인간 메틸레이션 27 비즈 어레이(Illumina사 제품)을 사용하여 1CpG 사이트의 해상도에서 분석했다. 이 어레이는 NCBI 데이터베이스에 등록되어 있는 14475유전자(콘센서스 코딩 어레이)의 전사 개시 부위에서의 근위 프로모터 영역 내에 위치하는 CpG 사이트가 포함되어 있다. 또한, 평균해서 1유전자당 2개의 사이트가 선택되고, 또한 200 이상의 암 관련 유전자 및 임프린팅 유전자에 대해서는 1유전자당 3~20의 CpG 사이트가 선택되어 이 어레이에 탑재되어 있다. 또한, 각 어레이에는 40의 컨트롤 프로브가 탑재되어 있다. 이 컨트롤 프로브는 염색, 혼성 형성, 신장 및 바이설파이트 변환의 컨트롤 및 네가티브 컨트롤이 포함되어 있다.

또한, 상기 바이설파이트 변환된 DNA를 자동적으로 처리하기 위해서 Evo 로봇(Tecan사 제품)을 사용했다. 또한 인피니엄 분석 키트(Illumina사 제품)를 사용해서 전체 게놈 증폭 처리를 행했다(Bibikova, M. 등, Epigenomics, 2009년, 1권, 177~200페이지 참조).

그리고, 이렇게 해서 증폭된 DNA 단편과 상기 어레이 상의 프로브를 혼성화한 후, 특이적으로 혼성화한 DNA를 1염기 신장 반응으로 형광 표식했다. 이어서, 제조 회사의 프로토콜에 따라서 비즈 스캔 리더(Illumina사 제품)를 사용해서 해당 DNA를 검출했다. 얻어진 데이터는 게놈 스튜디오 메틸레이션 소프트웨어(Illumina사 제품)를 사용해서 분석했다.

또한, 각 CpG 사이트에서 형광 신호의 비율은 메틸화 프로브 및 비메틸화 프로브의 합계에 대한 메틸화 프로브의 상대비를 이용하여 측정했다. 즉, 소위 β값(범위: 0.00~1.00)은 CpG 사이트 각각에서의 메틸화 레벨을 반영한 것이다.

<통계 분석>

상기 인피니엄 에세이에서 분석한 조직 샘플 모두에 대하여 콜률(call proportion, 백그라운드 이상의 신호 검출에서의 P값<0.01)이 90% 이하였던 프로브는 32개였다. 이러한 낮은 콜률은 프로브의 CpG 사이트에서의 다형에 기인하고 있는지도 모르기 때문에, 본 에세이에서는 이들 32 프로브를 제외했다. 또한, 성특이적인 메틸화의 바이어스를 회피하기 위해 X염색체 및 Y염색체에서의 모든 CpG 사이트는 제외했다. 그 결과, 상염색체 상의 CpG 사이트 26454가 최종적인 분석 대상으로서 남았다.

로지스틱 모델에 의해, 29의 C샘플과 107의 N샘플 사이에서 DNA 메틸화 레벨의 유의한 차를 나타낸 인피니엄 프로브를 확인했다.

누적 로지트 모델에 의해, 29의 C샘플, 107의 N샘플 및 109의 T샘플에서 C샘플, N샘플, T샘플과 DNA 메틸화 레벨이 단계적으로 변화하는(Ordered difference) 프로브를 확인했다.

1의 환자 유래의 N샘플과 대응하는 T샘플의 104의 쌍에서의 DNA 메틸화 상태의 차를 윌 콕슨 부호 순위 에세이에 의해 조사했다.

q=0.01의 오류 검출률(FDR)을 유의하게 보았다.

DNA 메틸화 레벨(Δβ_T-N)에 기초해서 투명세포형 신장 세포암의 환자에 대해서 자율 계층적 클러스터링(유클리드 거리, 와드법)을 행했다.

환자의 클러스터와 임상병리학적 인자의 상관은 윌 콕슨 순위 에세이 및 피셔의 직접 확률 에세이에 의해 조사했다.

각 클러스터에 속하는 환자의 생존율 곡선은 카플란·마이어법에 의해 산출했다. 그리고, 로그 순위 에세이에 의해 차를 비교했다.

각 클러스터에서 DNA 고메틸화 또는 DNA 저메틸화를 나타낸 인피니엄 에세이 프로브의 수와, 각 클러스터에서의 평균 DNA 메틸화 레벨(Δβ_T-N)을 P<0.05를 유의 수준으로 하는 윌 콕슨 순위 에세이에 의해서 조사했다.

클러스터를 식별할 수 있는 CpG 사이트를 피셔의 직접 확률 에세이 및 랜덤 포레스트법에 의해 확인했다(Breiman, L., Mach. Learn., 2001년, 45권, 5~32페이지 참조).

(실시예 1)

<신장 세포암 발생에서의 DNA 메틸화의 변화>

우선, 상기 인피니엄 에세이에 의해서 찾아낸 대표적인 CpG 사이트에 대해서 표 9에 나타낸 조건으로 파이로시퀀싱법을 행함으로써 확인했다. 그 결과, 도 2~4에 나타낸 대로, 각 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨에 관하여 정량성이 높은 파이로시퀀싱법에 의한 분석 결과(도 2~4의 종축)와 인피니엄 에세이에 의한 분석 결과(도 2~4 횡축) 사이에는 강한 상관이 있었다.

이와 같이, 이번 인피니엄 에세이 데이터는 신뢰성이 높은 것임이 확인되었다.

신장의 전암 상태에 대해서는 지금까지 거의 논의되고 있지 않다. 그렇지만, 본 발명자들에 의해서 비암 조직은 조직학적인 현저한 변화는 인지되지 않고, 만성 염증 및 바이러스나 병원성 미생물의 지속 감염의 관련도 인지되지 않지만, DNA 메틸화가 변화되고 있다는 관점에서 이미 전암 단계에 있다는 것이 시사되고 있다(특허문헌 1 및 비특허 문헌 4~7).

이 점과 관련하여, 이번 인피니엄 에세이 결과를 로지스틱 모델에 의해서 분석한 결과, 4830의 프로브에서 N샘플의 DNA 메틸화 레벨은 C샘플의 그것들과 비교해서 이미 변화되고 있는 것이 밝혀졌다(FDR q=0.01, 표 10의 (a) 참조).

또한, DNA 메틸화의 변화가 신장 세포암 자체에 이어져 있는지를 밝히기 위해서 누적 로지트 모델에 의해 C샘플, N샘플, T샘플과 DNA 메틸화 레벨이 단계적으로 변화하는 프로브를 확인했다. 그 결과, 이와 같이 DNA 메틸화 레벨이 단계적으로 변화하는 프로브는 11089개였다(FDR q=0.01, 표 10의 (b) 참조).

또한, 암화에 강하게 기여하는 DNA 메틸화의 변화를 밝히기 위해서 N샘플과 T샘플의 104쌍을 윌 콕슨 부호 순위 에세이에 의해 조사했다. 그 결과, N샘플과 대응하는 신장 세포암 사이에 유의차가 인지된 프로브는 10870개였다(FDR q=0.01, 표 10의 (c) 참조).

이상의 결과로부터, 암에 이르는 과정에서 DNA 저메틸화도 관찰되었지만, 신장 세포암 발생의 극히 초기 단계에서 DNA 고메틸화는 잠깐 발생하는 것으로 드러났다.

또한, 표 10의 (a), (b) 및 (c)에 기재된 기준 모두를 충족하고, 즉 DNA 메틸화가 이미 비암 단계에서 확실히 변화하고 있으며, 또한 그들의 변화가 신장 세포암에 이어진 항진되고 있는 프로브를 801개 확인했다.

(실시예 2)

<신장 세포암의 후생적 클러스터링>

상기 801 프로브에서의 DNA 메틸화 레벨(Δβ_T-N)을 사용하고, 자율 계층적 클러스터링을 한 결과, 투명세포형 신장 세포암 환자 104명을 클러스터 A(n=90) 및 클러스터 B(n=14)에 서브 클러스터화될 수 있다는 것이 밝혀졌다(도 5 참조). 또한, 상술한 대로 상기 801 프로브에서의 DNA 메틸화는 전암 단계에서 변화가 생기고 있어 이어진 신장 세포의 암화에 기여하고 있는 것으로 생각된다.

이어서, 이들 클러스터 A 및 B에 속하는 투명세포형 신장 세포암에서의 임상병리학적 인자 및 TNM 스테이지에 대해서 조사했다. 얻어진 결과를 표 11에 나타낸다.

또한, 표 11의 "P값"에서 밑줄이 붙어있는 것은 "P<0.05"이고, (b)가 붙어 있는 수치는 윌 콕슨 순위 에세이에 의한 것이며, (c)가 붙어 있는 수치는 피셔의 직접 확률 에세이에 의한 것이다. 또한, (d)가 붙어 있는 임상병리학적 인자에 대해서는 종양이 불균일한 경우에 면적적으로 우세한 영역에서의 소견을 나타내고 있고, (e)가 붙어 있는 임상병리학적 인자에 대해서는 종양이 불균일한 경우에 종양에서 가장 침습성이 높은 특징을 나타내고 있다.

또한, 이들 클러스터 A 및 B에 속하는 환자의 생존율에 대해서도 조사했다. 생존율을 분석한 기간은 42~4024일간(평균 1821일간)이다. 얻어진 결과(카플란·마이어 생존 곡선)를 도 6 및 7에 나타낸다.

표 11에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, 투명세포형 신장 세포암의 직경, 상술한 육안 분류에 의한 단결절 주위 증식형(타입 2) 또는 다결절 유합형(타입 3)의 출현 빈도, 혈관 침습의 빈도, 신장 정맥에서의 종양 혈전 형성의 빈도, 침윤성 증식의 빈도, 종양 괴사 및 신우에의 침윤 빈도, 조직학적 이형도 및 TNM 분류에 의한 병기, 이 점에서 클러스터 B는 클러스터 A보다 컸다(또는 높았다). 또한, 표 11에서 나타낸 대로 신장 세포암의 후색적 클러스터링은 환자의 성별, 연령에 의한 것이 아님은 명백하다.

또한, 도 6 및 7에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, 클러스터 B에 속하는 환자의 무재발 생존율(무암 생존율) 및 전체 생존율(전체적인 생존율)은 클러스터 A에 속하는 환자의 그것들보다 훨씬 낮았다(무암 생존율의 P값은 4.16×10^-6이고, 전체적인 생존율의 P값은 1.32×10^-2이다).

(실시예 3)

<신장 세포암의 DNA 메틸화 프로파일>

이어서, 26454개의 모든 프로브에 대하여 대응되는 N샘플보다 T샘플에서 DNA 고메틸화가 인지된 프로브의 비율을 그 DNA 고메틸화의 차 정도(Δβ_T-N>0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5)마다 분석했다. 또한, 26454개의 모든 프로브에 대하여 대응되는 T샘플보다 N샘플에서 DNA 저메틸화가 인지된 프로브의 비율을 그 DNA 저메틸화의 차 정도(Δβ_T-N<-0.1, -0.2, -0.3, -0.4 또는 -0.5)마다 분석했다. 얻어진 결과를 도 8~12에 나타냈다.

도 8~12에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, 뛰어난 DNA 저메틸화(Δβ_T-N<-0.5)를 나타낸 프로브는 클러스터 A보다 클러스터 B쪽이 약간 집적하고 있었다. 그러나, 클러스터 A 및 클러스터 B에서 DNA 저메틸화의 발생 빈도에 통계적인 유의한 차는 인지되지 않았다(Δβ_T-N<-0.1, -0.2, -0.3 또는 -0.4). 한편, DNA 고메틸화를 나타낸 프로브는 DNA 고메틸화의 차 정도에 관계없이 클러스터 A보다 클러스터 B쪽에 현저하게 집적하고 있었다(Δβ_T-N>0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5).

따라서, 클러스터 B에 속하는 신장 세포암은 DNA 고메틸화의 축적에 의해서 특징지어지는 것으로 드러났다.

또한, 클러스터 A 및 클러스터 B에 관하여 이들 사이에서 DNA 메틸화 레벨에서 현저한 차가 있던 상위 61의 프로브를 표 12 및 13에 나타낸다. 또한, 표 12 및 13의 "표적 ID"는 Illumina사에 의해서 인피니엄 인간 메틸레이션 27 비즈 어레이의 전체 프로브에 부여된 번호를 나타내고, "염색체 번호" 및 "염색체 상의 위치"는 기준 인간 게놈 서열이며, NCBI 데이터베이스 Genome Build 37 상의 위치를 나타낸다(이하, 프로브에 관한 표에 관한 표기에 있어서 동일). "CpG 아일랜드"의 "Y"는 그 프로브가 CpG 아일랜드에 위치하고 있는 것을 나타내고, "N"은 그 프로브가 CpG 아일랜드에 위치하지 않은 것을 나타낸다(표 14 및 15에 있어서도 동일). 또한, "유전자 영역"은 그 프로브가 엑손(Exon), 인트론(Intron) 또는 전사 개시 부위의 상류(TSS)에 위치하고 있는 것을 나타낸다. 또한, "P값"은 윌 콕슨 순위 에세이에 의해 산출된 값을 나타낸다.

전체 26454개의 프로브 중, CpG 아일랜드에 위치해 있는 프로브는 19246개, 72.8%였음에도 불구하고 상기 61개의 프로브 중 클러스터 B에 속하는 신장 세포암에서 DNA 고메틸화를 나타낸 CpG 아일랜드에 위치하는 프로브는 60개, 98.4%도 있었다(Δβ_T-N>0.097, 표 12 및 13). 또한, 상기 61개의 프로브 중 나머지 1개의 프로브는 비CpG 아일랜드에 위치하여 DNA 저메틸화를 나타내는 것이었다(클러스터 B에서 Δβ_T-N>-0.425±0.096).

실시예 2 및 3에 나타낸 결과로부터, 클러스터 B는 임상병리학적 형질과 충분히 상관되어 있고, CpG 아일랜드에서의 고빈도의 DNA 고메틸화에 의해서 특징지어지는 것으로 드러났다.

또한, 클러스터 B에 속하는 신장 세포암의 이러한 특징은 충분히 연구되고 있는 다른 장기(예를 들면, 대장 및 위)의 CpG 아일랜드 메틸화 형질(CIMP) 양성 암의 그것과 유사하다(비특허문헌 8~11). 즉, 본 1CpG 해상 메틸롬 해석에 의해서 CIMP 양성의 신장 세포암이 클러스터 B로서 처음 확인되었다.

(실시예 4)

클러스터 A 및 B에 각각 속하는 대표적인 신장 세포암 환자에 관하여 신장 세포암 조직(T샘플)에서의 DNA 메틸화 레벨(β값)과 비암 신장 조직(N샘플) 그것들의 조직화를 행했다. 얻어진 결과를 산포도로서 도 13 및 14에 나타냈다. 또한, 도 13에 나타낸 Case: 1~4는 클러스터 A에 속하는 대표적인 신장 세포암 환자의 예이고, 도 14에 나타낸 Case: 5~8은 클러스터 B에 속하는 대표적인 신장 세포암 환자의 예이다.

도 13 및 14에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, DNA 메틸화 레벨이 N샘플에서 낮고, DNA 고메틸화의 정도가 대응되는 N샘플과 비교해서 T샘플의 것이 현저한 프로브는 클러스터 B에만 분명히 존재하며, 클러스터 A에서는 인지되지 않았다.

이 결과에 기초해서, 클러스터 B에 속하는 신장 세포암과 클러스터 A에 속하는 것을 구별하기 위해서 모든 N샘플에서의 평균 β값이 0.2 미만이고, 0.4를 초과하는 Δβ_T-N의 출현 빈도가 클러스터 A와 비교해서 클러스터 B의 것이 현저하게 높은(P<1.98×10^-6, 피셔의 직접 확률 에세이) 프로브에 주목했다.

그리고, 이러한 프로브에서 16프로브(15유전자: FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A 및 ZNF671)는 클러스터 B에 속하는 14의 신장 세포암 중 6 이상(42.8% 이상)의 신장 세포암에서 0.4를 초과하는 Δβ_T-N을 나타냈다. 한편, 클러스터 A에 속하는 90의 신장 세포암 중, 상기 16프로브가 0.4를 초과하는 Δβ_T-N을 나타낸 신장 세포암은 2개 이하(2.2% 이하)였다(표 14 참조).

또한, 도 15에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, 클러스터 A와 클러스터 B 사이에서 상기 16CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨(Δβ_T-N)은 완전하게 달랐다.

또한, 클러스터 A와 클러스터 B 사이에서 현저하게 DNA 메틸화 레벨(Δβ_T-N)이 달랐던 869 프로브(FDR[q=0.01])를 사용해서 랜덤 포레스트 분석을 행했다(도 16 및 17 참조). 그 결과, 클러스터 A와 클러스터 B를 식별할 수 있는 상위 4프로브를 더 확인했다(표 15 참조).

또한, 상기 15 유전자와 랜덤 포레스트 분석에 의해서 발견된 클러스터 A와 클러스터 B를 식별할 수 있는 상위 4유전자는 2유전자(FAM150A 및 GRM6)가 중복되어 있었다.

따라서, 이들 17유전자(FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, SLC13A5 및 NKX6-2)에서의 CpG 사이트 CIMP 양성 신장 세포암, 예를 들면 클러스터 B에 속하는 신장 세포암의 특징으로 간주될 수 있다. 즉, 상기 17유전자의 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 검출함으로써 신장 세포암 환자의 예후 불량 리스크를 검출할 수 있는 것으로 드러났다.

또한, 이들 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR에 의해서 분석한 결과, DNA 고메틸화에 의해 이들 유전자의 발현이 억제되고 있다는 것이 드러났다(표 16 참조).

따라서 전암 단계에서 발생하는 DNA 메틸화의 변화는 유전자 발현 레벨의 변화를 통해서 신장 세포암의 악성도 및 환자의 예후를 결정하는 것을 나타냈다.

(실시예 5)

<질량 분석계에 의한 신장 세포암에서의 DNA 메틸화 레벨의 검출>

상기 인피니엄 에세이와는 다른 메틸화 DNA 검출방법, 매스어레이법(MassARRAY법)에서 상기 17유전자의 CpG 사이트에 대해서의 DNA 메틸화 레벨 검출의 유효성을 확인했다.

MassARRAY법은 바이설파이트 처리 후의 DNA를 증폭하여 RNA에 전사하고, 또한 RNAase에 의해 염기 특이적으로 절단한 후 질량 분석계에 의해서 메틸화 DNA 단편과 비메틸화 DNA 단편의 분자량 차를 검출하는 방법이다.

우선, 인피니엄 어레이 프로브 부위인 상기 CpG 사이트를 포함한 CpG 아일랜드에 대하여 EpiDesigner(SEQUENOM사 제품, MassARRAY용 프라이머 설계 소프트웨어)를 사용해서 MassARRAY의 프라이머 설계를 행했다.

또한, MassARRAY에서의 PCR 표적 서열은 100~500bp 정도로 다소 길기 때문에 상기 CpG 사이트 주변의 다수의 CpG 부위의 DNA 메틸화 레벨 아울러서 평가할 수 있다.

또한, PCR에서의 바이어스의 영향을 배제하기 위해서 1프라이머 세트당 DNA 폴리메라아제 3종과 어닐 온도 4단계 정도의 조건의 조합을 평균해서 시행하여 정량성이 양호한 최적 PCR 조건을 결정했다.

그리고, PCR 표적 서열에 포함된 분석 대상이 되는 모든 CpG 부위에 대해서 채용된 PCR 조건에서 정량성이 양호하다는 것을 확인하고, CIMP 음성 신장 세포암 88 검체와 CIMP 양성 신장 세포암 14 검체에서 MassARRAY 분석을 실시했다.

즉, 우선 상술한 인피니엄 에세이와 마찬가지로 각 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하여 바이설파이트 변환한 후 PCR로 증폭해서 인비트로 전사 반응을 행했다. 이어서, 얻어진 RNA를 RNaseA에 의해 우라실 부위에서 특이적으로 절단하여 각 샘플의 게놈 DNA의 메틸화 유무에 따라 길이가 다른 단편을 생성했다. 그리고, 얻어진 RNA 단편을 1염기의 질량의 차이를 검출할 수 있는 MALDI-TOF MAS(SEQUENOM사 제품, MassARRAY Analyzer 4)로 달아 질량 분석을 행했다. 얻어진 질량 분석 결과를 분석 소프트웨어(EpiTYPER, SEQUENOM사 제품)를 사용해서 레퍼런스 서열에 얼라인먼트하여 메틸화 DNA에 유래하는 RNA 단편과 비메틸화 DNA에 유래하는 RNA 단편의 질량비로부터 메틸화 레벨을 산출했다.

본 분석에 사용된 프라이머의 서열과 상기 프라이머의 세트를 사용해서 증폭된 PCR 산물의 서열을 표 17 및 18 및 서열표에 나타냈다. 얻어진 결과의 일부에 대해서 도 18~23에 나타냈다.

도 18~23에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, MassARRAY의 분석 대상으로 한 모든 영역에 관하여 선행 인피니엄 어레이를 사용한 분석 결과와 마찬가지로 상기 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출함으로써 클러스터 B에 속하는 예후 불량의 신장 세포암(CIMP 양성군)과 클러스터 A에 속하는 예후가 양호한 신장 세포암(CIMP 음성군)을 판별할 수 있는 것을 확인했다. 또한 MassARRAY 분석에 의해서 1CpG 사이트뿐만 아니라 그것을 포함한 CpG 아일랜드 전체 영역(예를 들면, 인피니엄 프로브 부위인 CpG 사이트의 전후 1500bp에 걸친 영역)에서도 CIMP 양성군에서 고메틸화 상태가 계속되고 있는 것이 드러났다.

따라서, 프로모터 전체 영역의 고메틸화 상태에 의해 강고한 사일렌싱 일어나고 있는 영역의 1CpG 사이트가 실시예 4에서 확인되었다는 것이 드러났고, 즉 상기 18CpG 사이트에 한정되지 않으며, 상기 17 유전자의 CpG 아일랜드에 위치하는 적어도 1개의 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출하면 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출할 수 있다는 것이 드러났다.

또한, 이러한 MassARRAY법에 의해 상술한 인피니엄 에세이에서 이미 CIMP 양성군으로 분류된 14증례와 CIMP 음성예 88증례에서 14유전자의 312CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 정량했다. 그리고, 그 결과에 기초해서 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 행하고, 각 CpG 사이트 독립적으로 CIMP 양성군을 CIMP 음성군으로부터 구분할 때의 "감도(양성률)", "특이도" 및 "1-특이도(가양성율)"를 구했다. 또한, 얻어진 이들 값으로부터 ROC 곡선을 제작하고, AUC(area under the curve, ROC 곡선 하 면적)를 산출했다. 또한, 각 CpG 사이트에 대해서는 "감도+특이도"가 최대가 되도록 컷오프 값(진단 역치)을 설정했다. 상기 MassARRAY 분석에서 정량적으로 분석을 행할 수 있는 CpG 사이트에 대해서 얻어진 결과를 표 19~27에 나타낸다. 또한, 표 19~27에서 근접하고, 또한 MassARRAY법의 특성에 따라 모아서 DNA 메틸화 레벨을 측정하는 복수의 CpG 사이트에 대해서는 1개소로 요약해서 기재되어 있다. 또한, 이들 표의 "표적 유전자명_프라이머 세트명_CpG 사이트"는 표 17 및 18에 기재된 프라이머 세트를 사용해서 증폭한 PCR 산물 중의 CpG 사이트의 순서를 나타낸다. 또한, 표 23의 기재에서 SLC13A5_10_CpG_44과 SLC13A5_13_CpG_1이란 다른 프라이머 세트에 의해서 증폭된 영역에서의 44번째 CpG 사이트와 1번째 CpG 사이트를 각각 나타내지만, 게놈 상의 위치(NCBI 데이터베이스 Genome Build 37 상의 위치)는 17번 염색체의 6617077라 하는 동일한 CpG 사이트이다.

표 19~27에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, 진단 능력이 큰 CpG 사이트가 인피니엄 프로브 부위인 상기 CpG 사이트에 가해져서 각 CpG 아일랜드에 다수 존재하는 것이 나타났다. 즉, AUC>0.9인 CpG 사이트수는 141사이트이고, AUC>0.95인 CpG 사이트수는 32사이트였다.

또한, MassARRAY법에서는, 예를 들면 "FAM150A_14_CpG_13.14.15"와 같이 CGCGCG와 연속하는 CpG 사이트에서는 전체에서 1개의 계측값이 주어지므로 상기 AUC>0.9인 141사이트는 AUC 산출의 근거가 되는 계측값으로서는 90개에 해당한다. 또한, 마찬가지로 상기 AUC>0.95인 32사이트는 AUC 산출의 근거가 되는 계측값으로서는 23계측값에 해당한다.

또한, 도 24에 나타낸 결과로부터 알 수 있듯이, AUC가 0.95보다 큰 CpG 사이트 23개소(23계측값)를 지표로서 사용함으로써 CIMP 양성군과 CIMP 음성군을 명확하게 구별할 수 있었다.

(산업상의 이용 가능성)

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 상기 17유전자(FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, SLC13A5 및 NKX6-2) 중 적어도 하나의 CpG 사이트에서의 DNA 메틸화 레벨을 검출함으로써 예후 불량의 신장 세포암(CIMP 양성 신장 세포암)과 비교적 양호한 신장 세포암을 명확하게 분류하는 것이 가능해진다.

이러한 DNA 메틸화 레벨의 예후 불량군과 양호군의 차이는 크므로 병원의 검사실 등에서 이미 보급되고 있는 PCR법 등(예를 들면, 메틸화 특이적 정량 PCR법, COBRA법)에서도 용이하게 검출할 수 있다. 또한 신장 세포암 수술 검체로부터 환자에게 여분의 침습을 가하지 않고, 예후 진단용의 게놈 DNA를 풍부하게 추출시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하는 방법은 치료 성적의 향상을 목표로 한 방법으로서 임상 분야에서 유용하다.

(서열표 프리 텍스트)

서열 번호: 17

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 SLC13A5_MA_10 포워드 프라이머)

서열 번호: 18

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 SLC13A5_MA_10 리버스 프라이머)

서열 번호: 19

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 SLC13A5_MA_13 포워드 프라이머)

서열 번호: 20

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 SLC13A5_MA_13 리버스 프라이머)

서열 번호: 21

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 SLC13A5_MA_15 포워드 프라이머)

서열 번호: 22

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 SLC13A5_MA_15 리버스 프라이머)

서열 번호: 23

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 FAM150A_MA_14 포워드 프라이머)

서열 번호: 24

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 FAM150A_MA_14 리버스 프라이머)

서열 번호: 25

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 GRM6_MA_8 포워드 프라이머)

서열 번호: 26

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 GRM6_MA_8 리버스 프라이머)

서열 번호: 27

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZFP42_MA_2 포워드 프라이머)

서열 번호: 28

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZFP42_MA_2 리버스 프라이머)

서열 번호: 29

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZFP42_MA_5 포워드 프라이머)

서열 번호: 30

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZFP42_MA_5 리버스 프라이머)

서열 번호: 31

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 RIMS4_MA_9 포워드 프라이머)

서열 번호: 32

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 RIMS4_MA_9 리버스 프라이머)

서열 번호: 33

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 TRH_MA_8 포워드 프라이머)

서열 번호: 34

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 TRH_MA_8 리버스 프라이머)

서열 번호: 35

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZNF540_MA_17 포워드 프라이머)

서열 번호: 36

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZNF540_MA_17 리버스 프라이머)

서열 번호: 37

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 PCDHAC1_MA_5 포워드 프라이머)

서열 번호: 38

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 PCDHAC1_MA_5 리버스 프라이머)

서열 번호: 39

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 PRAC_MA_2 포워드 프라이머)

서열 번호: 40

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 PRAC_MA_2 리버스 프라이머)

서열 번호: 41

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZNF671_MA_8 포워드 프라이머)

서열 번호: 42

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ZNF671_MA_8 리버스 프라이머)

서열 번호: 43

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 WNT3A_MA_9 포워드 프라이머)

서열 번호: 44

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 WNT3A_MA_9 리버스 프라이머)

서열 번호: 45

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 KHDRBS2_MA_19 (rev) 포워드 프라이머)

서열 번호: 46

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 KHDRBS2_MA_19 (rev) 리버스 프라이머)

서열 번호: 47

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ASCL2_MA_8 포워드 프라이머)

서열 번호: 48

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(MassARRAY 에세이에 사용된 ASCL2_MA_8 리버스 프라이머)

서열 번호: 49

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP42 포워드 프라이머)

서열 번호: 50

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP42 리버스 프라이머)

서열 번호: 51

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP42 시퀀싱 프라이머)

서열 번호: 52

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP154 포워드 프라이머)

서열 번호: 53

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP154 리버스 프라이머)

서열 번호: 54

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP154 시퀀싱 프라이머)

서열 번호: 55

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP540 포워드 프라이머)

서열 번호: 56

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP540 리버스 프라이머)

서열 번호: 57

<223> 인공적으로 합성된 프라이머의 배열(파이로시퀀싱용 ZFP540 시퀀싱 프라이머)

SEQUENCE LISTING <110> National Cancer Center <120> ??????????? <130> IBPF12-517WO <150> US 61/646044 <151> 2012-05-11 <160> 57 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> SLC13A5_MA_10 <400> 1 gaaggacttg aacttggaga catagctcag cgccgaggcc atcgcgcggg agggagactg 60 gcgggcgaga cgagtgaggg gcagctagag gcgccgcggg cttaagaagg ggccacagtc 120 cccggggatt ggggaggggg cggtgacaac tccgccccgc acgggggcgc ctccccgcgg 180 ccctggggcg gggccacccc tcggggtctg tgggacgcgc ctgcccccaa ttctgccacc 240 cggcggcggt gggaggcgtc tttggactcc aacgcttcgg gccagccctc taggggcagc 300 ctgggcccta gcatctcgcg ctgtccaagc ctctcctgcg ctgccgaggc agaggtgcgt 360 cccggggctg ccaagcgggg cgtgttttgg tcactggtgc tgcccgcttt ggcgtaaggc 420 gccctcccgc gtccgcatct gctctttcct gggctctgaa gggtcccgga tgaaactctc 480 tgcaggcctc tgggtctctc 500 <210> 2 <211> 463 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> SLC13A5_MA_13 <400> 2 ctttcctggg ctctgaaggg tcccggatga aactctctgc aggcctctgg gtctctcagg 60 tctatctccc cgatctccct 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ggcctccaat aggcgcgggt gaggagggag atgggtcctg 300 gcgacccaaa gggcccacct gcgggaaagg tgaatgcaga caatctcggg gtccctgggg 360 gagaaggcca gaaggtagcg catcctggag accctggggt cc 402 <210> 9 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRH_MA_8 <400> 9 aacagatctc cagaggtggt gcagaaacga ccccgcgccg gcgccccatc ctgcggccag 60 tgcctccgcg ccccggctcc ggtccccacc gtccccgccc cagatttccg gaggagcagg 120 cgggcggggt cccgcggggc cggctgccgt cagcgcccct tcccggcggc cgcgacccct 180 ccccgctgac ctcactcgag ccgccgcctg gcgcagatat aagcggcggc ccatctgaag 240 agggctcggc aggcgcccgg ggtcctcagc gctgcagact cctgacctgc cgactgcgga 300 tcccgagtcc ccggatcccg gacccatcct gtggagccca ctcctggcag gtaaccgccc 360 caacccctct ccttccgcag acggtgtccg ggagcactgg aaagggagcc ctct 414 <210> 10 <211> 463 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> ZNF540_MA_17 <400> 10 gggcagggca gaaccaggct aaagaaacgt ccagcgtagc ttcaaggatg caccgcgtga 60 tccctatcgg atctccccga cgcgtcaggc ctgcctagac ggtgctggga gcgcgtctcc 120 ttgaacgttg tcccgcctgg gattgcgagg taggtaccgc 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ctcccaaatt 60 cctgggagac cctctcccag ggcctcctga tgcagctacc atactgagcg atccgtcgat 120 aacgcccttg gcccaccgat cagtttacct tattagagag aaaagcactc ttggaggtag 180 taagatgggc cggtccttga tctgagaaat gggcgcacaa catcgctgtt ctctctgcaa 240 aggtggggac cagaatccag cttg 264 <210> 13 <211> 428 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> ZNF671_MA_8 <400> 13 tgggacacag gggctgcagg cactttacga ttcggagtcg gagaaagggt gactgagggc 60 ccggaggacg cagcacccac ccgcgcggag tccgttagct ccgccatagg accgtgggcg 120 cggacagctg ccgggagcgg caggcgtctc gatcggggac gcaggcactt ccgtccctgc 180 agagcatcag acgcgtctcg ggacactggg gacaacatct cctccgcgct ttcccaacac 240 ctccacctgc ggcccacaca agcgttacag aaccccggcc agggacagcc tgacagaaac 300 aaaatgtccg ctacaaggag gagccggaag tcccgcccac gcaccccccg caggcactga 360 aacacccctc tcctgggccc tcattgggta tgcaacgtat aggtttgtgg gtagagtgtg 420 gttcccac 428 <210> 14 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> WNT3A_MA_9 <400> 14 gtccacctgg caatgagggg ctgctgtaga gagagttaag ggtgagttaa gcacggggtg 60 tgaggggctc caggaccctc aatcagaaag cgctgtgctg cgccctccac accagaaaag 120 gcgcgttccg tgagaccctc cccagcctgg cgatggaagt gcagataaac caaaggaagg 180 gtcccgaaag gtctctctca ggcctcccac ctccactgca catatcctgt gggaggggga 240 acggtggcca cactttcgcc agggcttgtg atccctcaga gccctcacca agcaaggatc 300 accccagttc cgaattaagg gcgctctgag atgcccaaga ttgaggaa 348 <210> 15 <211> 422 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> KHDRBS2_MA_19(rev) <400> 15 cctggcacca ccaccaatga gtggttggcg gaggtgggcc gcgtcctgtt cccgcctctc 60 cagttaaggc cgctggtgtg agccggggct ctgcgcgagc gagggacgac ggaagggacg 120 ggcaggtgtg ggcgcggggc cacgcagccc gacggcggga gtcgcaggtg ctgggtgcat 180 gggccagtga ggacgcacag agatccctcg ccgcgcggag gaggagcagc gcgggagcca 240 ggcgctgccc caagaccctg cctgcgtccg agcgagcgga acctcgcgct tcgcccgggg 300 acaatccgaa gtccgcgcta tggaagagga gaaatatttg cctgagctga tggcagagaa 360 agatagcctg gatccatctt ttgtgcatgc gtcgcgcctt ttggcagaag gtaggacttg 420 cc 422 <210> 16 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> ASCL2_MA_8 <400> 16 gctaacaaag ctgggttcct gctgggcccc gccctgctcc tcgcccccgc gactgggctg 60 ggcgcgctgt cccctagcgc agctatgtcc cgagcgcgcc cccacctgtg cgttaatcta 120 ctgggaatgg gggtggactg cgccttacct ggggcggggt ggggcttaag gagtggtcga 180 gactgaggcg gggtgggagg ttcaggttcc cggggcgcct tccccaaccc gccccgcttt 240 ccccgtccct ccacgcgcac cctgcctgtg gtttccgtgc gcccccggcc tgagggctct 300 gggcggcacc ttaacccgga gggcctggag gtctgcacc 339 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (SLC13A5_MA_10 forward p rimer for using MassARRAY assay) <400> 17 aggaagagag gaaggatttg aatttggaga tatagttt 38 <210> 18 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (SLC13A5_MA_10 reverse p rimer for using MassARRAY assay) <400> 18 cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaaaaaccc aaaaacctac aaaaaa 56 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (SLC13A5_MA_13 forward p rimer for using MassARRAY assay) <400> 19 aggaagagag tttttttggg ttttgaaggg tt 32 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (SLC13A5_MA_13 reverse p rimer for using MassARRAY assay) <400> 20 cagtaatacg actcactata gggagaaggc tttatatccc ttcctctcta aaactcc 57 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (SLC13A5_MA_15 forward p rimer for using MassARRAY assay) <400> 21 aggaagagag ttttttttgt tttaggggtt gt 32 <210> 22 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (SLC13A5_MA_15 reverse p rimer for using MassARRAY assay) <400> 22 cagtaatacg actcactata gggagaaggc tccaccaaca taaataaaac tcccc 55 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (FAM150A_MA_14 forward p rimer for using MassARRAY assay) <400> 23 aggaagagag gggaggattt agtagggtaa ttgt 34 <210> 24 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (FAM150A_MA_14 reverse p rimer for using MassARRAY assay) <400> 24 cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttttcaccta aaaaaacact aaaacc 56 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (GRM6_MA_8 forward prime r for using MassARRAY assay) <400> 25 aggaagagag ggtttaggat aagtttgtga tagatg 36 <210> 26 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (GRM6_MA_8 reverse prime r for using MassARRAY assay) <400> 26 cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaaacaaaa aaacaaaccc aaaaat 56 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZFP42_MA_2 forward prim er for using MassARRAY assay) <400> 27 aggaagagag gagttgatgg gtggttgtag ttt 33 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF154_MA_2 reverse pri mer for using MassARRAY assay) <400> 28 cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcccatttaa aaaaaattcc ataaaacaaa 60 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF154_MA_5 forward pri mer for using MassARRAY assay) <400> 29 aggaagagag ggtgaatata ttttagagaa gttaaaatgg 40 <210> 30 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF154_MA_5 reverse pri mer for using MassARRAY assay) <400> 30 cagtaatacg actcactata gggagaaggc ttccctccac taccctaaaa cttaaa 56 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (RIMS4_MA_9 forward prim er for using MassARRAY assay) <400> 31 aggaagagag ggagttttag tttatgaggg aagga 35 <210> 32 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (RIMS4_MA_9 reverse prim er for using MassARRAY assay) <400> 32 cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaaccccaa aatctccaaa atac 54 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (TRH_MA_8 forward primer for using MassARRAY assay) <400> 33 aggaagagag aatagatttt tagaggtggt gtagaaa 37 <210> 34 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (TRH_MA_8 reverse primer for using MassARRAY assay) <400> 34 cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaaaaactc cctttccaat actcc 55 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF540_MA_17 forward pr imer for using MassARRAY assay) <400> 35 aggaagagag gggtagggta gaattaggtt aaagaaa 37 <210> 36 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF540_MA_17 reverse pr imer for using MassARRAY assay) <400> 36 cagtaatacg actcactata gggagaaggc tactaaaatc aataaccccc aaaaaa 56 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (PCDHAC1_MA_5 forward pr imer for using MassARRAY assay) <400> 37 aggaagagag tggtagtttt tgggatataa gaggg 35 <210> 38 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (PCDHAC1_MA_5 reverse pr imer for using MassARRAY assay) <400> 38 cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaactaccc aaatcttaac ctccac 56 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (PRAC_MA_2 forward prime r for using MassARRAY assay) <400> 39 aggaagagag ggtgaaagtt tgttgtttat ttttttt 37 <210> 40 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (PRAC_MA_2 reverse prime r for using MassARRAY assay) <400> 40 cagtaatacg actcactata gggagaaggc tcaaactaaa ttctaatccc cacctt 56 <210> 41 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF671_MA_8 forward pri mer for using MassARRAY assay) <400> 41 aggaagagag tgggatatag gggttgtagg tattt 35 <210> 42 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF671_MA_8 reverse pri mer for using MassARRAY assay) <400> 42 cagtaatacg actcactata gggagaaggc tataaaaacc acactctacc cacaaa 56 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (WNT3A_MA_9 forward prim er for using MassARRAY assay) <400> 43 aggaagagag gtttatttgg taatgagggg ttgtt 35 <210> 44 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (WNT3A_MA_9 reverse prim er for using MassARRAY assay) <400> 44 cagtaatacg actcactata gggagaaggc tttcctcaat cttaaacatc tcaaaa 56 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (KHDRBS2_MA_19(rev) forw ard primer for using MassARRAY assay) <400> 45 aggaagagag tttggtatta ttattaatga gtggttgg 38 <210> 46 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (KHDRBS2_MA_19(rev) reve rse primer for using MassARRAY assay) <400> 46 cagtaatacg actcactata gggagaaggc taacaaatcc taccttctac caaaaaa 57 <210> 47 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ASCL2_MA_8 forward prim er for using MassARRAY assay) <400> 47 aggaagagag gttaataaag ttgggttttt gttgg 35 <210> 48 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ASCL2_MA_8 reverse prim er for using MassARRAY assay) <400> 48 cagtaatacg actcactata gggagaaggc taatacaaac ctccaaaccc tcc 53 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZFP42 forward primer fo r Pyroseqencing) <400> 49 ggaggagttg atgggtggtt gta 23 <210> 50 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZFP42 reverse primer fo r Pyroseqencing) <400> 50 cccaaacact ctactatttc caatacca 28 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZFP42 sequencing primer for Pyroseqencing) <400> 51 gggtggttgt agtttga 17 <210> 52 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF154 forward primer f or Pyroseqencing) <400> 52 ggaaagtagg ttttttgagt ttttattgg 29 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF154 reverse primer f or Pyroseqencing) <400> 53 ccctaaaact taaataaacc atttctcat 29 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF154 sequencing prime r for Pyroseqencing) <400> 54 tgagttttta ttggtttagt a 21 <210> 55 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF540 forward primer f or Pyroseqencing) <400> 55 aggagtaggg tagggtagaa ttaggttaaa g 31 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF540 reverse primer f or Pyroseqencing) <400> 56 acccaaacaa ctcctaaaac tacttaattc tc 32 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence (ZNF540 sequencing prime r for Pyroseqencing) <400> 57 ggtagggtag aattaggtta aa 22

Claims

하기 (a)~(c)의 공정을 포함한 신장 세포암의 예후 불량 리스크를 검출하는 방법으로서,
(a) 피험체의 신장 조직으로부터 분리된 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 조제하는 공정,
(b) 공정 (a)에서 조제한 게놈 DNA에서 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 공정, 및
(c) 공정 (b)에서 검출된 DNA 메틸화 레벨로부터 상기 피험체가 예후 불량군으로 분류되는지 여부를 결정하는 공정을 포함하고,
상기 유전자는 ZNF540인, 방법.
제1항에 있어서, 공정 (b)는 공정 (a)에서 조제된 게놈 DNA를 바이설파이트 처리하여 상기 CpG 사이트의 DNA 메틸화 레벨을 검출하는 공정인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 검출하는 공정은 적어도 12 염기의 쇄 길이를 갖는 하기 (a)~(b)에 기재된 것 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 포함하는 것인, 방법:
(a) 상기 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트를 끼워 넣도록 설계된 한 쌍의 프라이머인 올리고뉴클레오티드, 및
(b) 상기 유전자 중 적어도 하나의 CpG 사이트를 포함하는 뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 프라이머 또는 프로브인 올리고뉴클레오티드.