CN108957004A - 检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，特别是涉及医学诊断领域，更为具体的说是涉及检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用，从而可以通过对胃癌预后预测，并利用免疫组化化学技术检测H3K9me2和H3K36me3的表达水平，从而获得预测胃癌预后情况，且H3K9me2和H3K36me3的引入方式简单，整个预测评估简便易行，可行性高。

Description

检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估 试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及医学诊断领域，更为具体的说是涉及检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
胃癌属于世界四大癌症之一，我国是胃癌大国，目前发病率虽有所下降，但五年年生存率并没有明显提高。这主要是因为目前尚无有效的靶向药物。同时，由于胃癌患者的遗传基础不同，同样的化疗用药后可能形成具有明显差异的疗效。目前国内外尚没有能够有效进行术后预后预测的技术手段。
专利CN106990245A中公开了检测PITX1表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用，在此基础上，发明人及所在课题组继续对术后预后预测的技术手段进行深入研究。
发明内容
本发明的目的在于针对胃癌提供一种可靠的预后评估试剂盒，从而可以监控胃癌患者的预后情况，使其能够及时就诊；同时利用预后评估结果指定个体化治疗方案，合理应用化疗药物，避免无效的化疗，有效提高患者生存期。
为了实现上述发明目的，我们公开了检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。
并且，进一步的我们公开了检测H3K9me2表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用，以及检测H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。
胃癌患者的生存期与H3K9me2和H3K36me3的表达有关，可以通过检测患者该基因的表达水平指导临床胃癌化疗用药，提高疗效。据此，我们提出H3K9me2和H3K36me3基因检测可以应用于胃癌预后判定与化疗耐药评估。从而可以精确地预测胃癌预后，并且可以基于预测的预后有效地建立最佳的个体治疗方案，以显著减少由胃癌引起的死亡。
在本发明中我们公开了对H3K9me2和H3K36me3采用免疫组化方法检测。
利用免疫组化方法检测中我们所采用的检测试剂主要是由H3K9me2和H3K36me3抗体、HRP标记二抗和组化试剂盒DAB显色剂组成。
其中H3K9me2单克隆抗体具体来说是指(1:200，小鼠源性，Abcam，ab1220)，H3K36me3多克隆抗体具体来说是指 (1:200，兔源性，Novus Biologicals，Abcam， ab9050)，HRP标记二抗是指DAKO、K5007即用型，组化试剂盒DAB显色剂是指DAKO、K5007, 1:100。
试剂盒中包含有检测生物样品中检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂，用于该检测的生物样品为福尔马林固定和/或石蜡包埋的胃癌组织。
所述的检测试剂盒，通过以下步骤用于胃癌的预后判断：（a）.检测生物样品中的H3K9me2和H3K36me3表达量，（b）.根据（a）中检测到的H3K9me2和H3K36me3表达量将结果分为高表达和低表达（或者为不表达）两种，（1）H3K9me2高表达患者：病人胃癌组织H3K9me2蛋白表达量高者，预后较不/低表达患者差。（2）H3K9me2和H3K36me3高表达患者：病人胃癌组织H3K9me2和H3K36me3蛋白表达量同时低者或者不一致者（即一高一低），因其预后都较同时高表达组好，要密切随访病人，及时复查相应的肿瘤指征。
这里所说的低表达是指阴性、假阳性和弱阳性，高表达是指阳性和强阳性。
由于胃癌患者H3K9me2和H3K36me3基因的表达水平与患者病理状态及预后有关，尤其H3K9me2在胃癌中的高表达可以作为胃癌预后不良的独立风险因素。可以通过检测患者该基因的表达水平指导临床制定个体化的化疗方案，提高疗效。
采用本发明公开的技术方案后，可以通过对胃癌预后预测，并利用免疫组化化学技术检测H3K9me2和H3K36me3的表达水平，从而获得预测胃癌预后情况，且H3K9me2和H3K36me3的引入方式简单，整个预测评估简便易行，可行性高。
附图说明
图1为胃癌组织H3K9me2的表达与患者生存期的相关性133例胃癌术后患者的Kaplan-Meier（KM）生存曲线。
图2为胃癌组织H3K36me3的表达与患者生存期的相关性133例胃癌术后患者的Kaplan-Meier（KM）生存曲线。
图3为胃癌组织H3K9me2/H3K36me3综合表达与患者生存期的相关性133例胃癌术后患者的Kaplan-Meier（KM）生存曲线。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例和附图对本发明进行进一步的阐述，但值得注意的是本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或者可以按照文献方法制备。本发明实施例中未注明的具体条件的试验方法均按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 H3K9me2和H3K36me3表达量的免疫组化检测方法
1.手术切除的胃癌标本，中性福尔马林固定后切成厚度为2-3 mm的组织块，石蜡包埋，切片，厚度为3-4 mm；
2.烤片：65 ℃, 1~2小时；
3.切片脱蜡至水：首先将切片置入二甲苯溶液I中处理15 min，取出后再次置入二甲苯溶液II，并停留15 min，然后将切片取出并置入无水乙醇I中5 min，取出再次置入无水乙醇II停留5 min后，取出并置入85%的乙醇处理5 min，而后取出置入75%乙醇5 min，最后将切片取出放入蒸馏水中清洗5 min；
4.抗原修复：组织切片置于盛满pH 8.0的EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，自然冷却后将玻片置于pH 7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；
5.内源性过氧化物酶阻断：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育20 min，将玻片置于pH 7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；
6.血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加山羊血清，使其均匀覆盖组织，室温封闭30 min；这里的山羊血清是以PBS按照1:20（山羊血清:PBS）的体积比稀释后的山羊血清；
7.一抗孵育：轻轻甩掉封闭液，以卫生纸将圈外液体擦拭干净，然后在圈内滴加配置好的一抗PBS溶液，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜；
8.二抗孵育：玻片置于pH 7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片以卫生纸将圈外液体擦拭干净，然后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（HRP标记，1:2000）覆盖组织，室温孵育1小时。
9.DAB显色：玻片置于pH 7.4的PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片以卫生纸将圈外液体擦拭干净，然后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
10.复染细胞核：Harris苏木素复染3 min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
11.脱水封片：首先将切片放入75%的乙醇中处理6 min，取出，并放入85%的乙醇中处理6 min后，取出后放入无水乙醇中处理两次，每次6 min，然后再将切片取出并放入二甲苯中处理两次，每次5 min，至脱水透明后，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片后显微镜下观察染色情况、并进行评分；
12.评分标准：（1）着色细胞数：放大倍数200的视野选5个，取平均值。 <5%---0分，5~25%---1分，26~50%---2分，51~75%---3分，>75%---4分；（2）：着色强度：无色---0分，淡黄色---1分，棕黄色---2分，棕褐色---3分。两者分数相乘，得数即为阳性等级，具体如下：阴性（-）---0分，弱阳性（+）---1~4分，阳性（++）---5~8分，强阳性（+++）---9~12分。
实施例2 H3K9me2和H3K36me3表达量与胃癌预后的关系
采用实施例1中公开的方式，对133例胃癌患者的三个组蛋白甲基化标记分子的表达水平进行检测，其中阴性、假阳性和弱阳性为低表达组，阳性和强阳性为高表达组，根据Kaplan-Meier（KM）分析H3K9me2和H3K36me3低表达和高表达组与预后的相关性，结果分别如图1-图3中所示。
结果显示，H3K9me2低表达组生存期明显长于高表达组（p =0.016 )，如图1所示；H3K36me3低表达组生存期略长于高表达组（p =0.433 )，如图2所示；H3K9me2/H3K36me3同时高表达组生存期最短、而同时低表达者或者一高一低表达者生存期相仿，都明显长于同时高表达的患者（p =0.004 )，如图3所示。
因此，可以表明：H3K9me2与预后有着明显的相关性，即H3K9me2表达越强，患者预后会越差，反之，H3K9me2表达越弱，则患者预后会越好；H3K36me3表达高者虽较表达低者有预后差的趋势，但并无统计学差异。同时综合两个分子的表达进行分析（图3）可以看出，二个标记分子同时高表达的患者生存期最短，而同时低表达者或者一高一低表达者生存期相仿，都长于同时高表达的患者。
并且值得说明的是，同时考虑H3K9me2和H3K36me3表达强度作为综合预后预测评估的基础，可以更加精确的预测胃癌预后，从而相较于传统的单一表达强度为基础的预测，提高的治疗方案更佳，能够显著减少胃癌引起的死亡。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.检测H3K9me2和H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。
2.检测H3K9me2表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。
3.检测H3K36me3表达量的试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其特征在于：对H3K9me2、H3K36me3采用免疫组化方法检测。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：检测试剂主要是由单克隆抗体、HRP标记二抗和组化试剂盒DAB显色剂组成，其中单克隆抗体为H3K9me2单克隆抗体和/或H3K36me3多克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：试剂盒中包含有检测生物样品中检测H3K9me2和/或H3K36me3表达量的试剂，用于该检测的生物样品为福尔马林固定和/或石蜡包埋的胃癌组织。
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