CN117487888A - 一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒及其应用,属于生物检测技术领域。本发明提供了一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒,先根据原位测序设计双连接探针分别与组织样本中的靶标核酸进行杂交,接着通过连接酶将双连接探针环化,经过滚环扩增后得到扩增产物,将检测探针与扩增产物杂交,检测探针上偶联着易于区分的荧光基团,被荧光激发后可以在荧光显微镜下直接被观察;在进行了原位测序的组织样本上,加入靶向靶标蛋白的第一抗体进行特异性结合,随后第二抗体与第一抗体结合,携带荧光基团的酪胺分子在过氧化氢和过氧化酶的催化下与靶标蛋白上的氨基酸残基结合,从而沉淀在靶标蛋白周围,荧光基团在荧光的激发下可以在荧光显微镜下直接被观察。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒及其应用,属于生物检测技术领域。
背景技术
转录组信息可以揭示特定样本的功能映射,而蛋白质组信息可以提供空间表型以及细胞领域信息。转录组与蛋白质组的结合检测可以推断出细胞类型与位置信息,探寻细胞功能可能发生的变化;可以探索新的空间生物标志物,并发现有关肿瘤问题的关键机制;同时,可以在临床上用于早期癌症筛查、诊断、反应评估和预后预测。因此,需要合适的技术用于转录组和蛋白质组信息的共检测,从而为生物学和临床的研究提供更合适的工具。
伴随着单细胞成像技术的的发展,单个RNA分子的亚细胞原位可视化成为可能。目前单分子RNA检测方法基于荧光信号的原位成像技术,例如:RNAscope技术和滚环扩增(RCA)技术等。于此同时,针对蛋白质的原位成像技术包括免疫荧光法和基于酪胺信号放大(TSA)反应的方法等。
然而,RNA Scope需要结合多个探针,通过多轮杂交来产生可见信号,过程复杂,需要投入大量的成本和劳动力。与此同时,免疫荧光技术检测靶标蛋白对仪器的要求较高,从而显著地提高了成本,且使用了免疫荧光法的样本无法长时间保存。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒,所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒包括双连接探针杂交试剂、双连接探针连接试剂、双连接探针环化试剂、滚环扩增试剂、至少一种检测探针杂交试剂、过氧化酶抑制试剂、至少一种抗体标记试剂、过氧化酶标记试剂、酪胺信号放大试剂和抗原修复试剂;所述双连接探针杂交试剂包括至少一组双连接探针组;所述双连接探针组能够与靶标核酸特异性结合,形成杂合体;所述双连接探针连接试剂用于将杂合体连接;所述双连接探针环化试剂包括夹板序列,用于将杂合体环化,形成环化产物,并引发以环化产物为模板的滚环扩增;所述滚环扩增试剂用于将环化产物滚环扩增,形成环状扩增产物;所述检测探针杂交试剂包括检测探针组;所述检测探针组能够与环状扩增产物特异性结合,并且,所述检测探针组的探针上偶联有第一荧光标记物;所述过氧化酶抑制试剂用于抑制内源性过氧化物酶的活性;所述抗体标记试剂包括第一抗体;所述第一抗体能够与靶标蛋白特异性结合;所述过氧化酶标记试剂包括偶联有过氧化物酶的第二抗体;所述第二抗体能够与第一抗体特异性结合;所述酪胺信号放大试剂包括酪胺工作溶液;所述酪胺工作溶液包括酪胺分子和过氧化氢;所述酪胺分子能够在过氧化酶和过氧化氢的催化作用下通过酪胺分子和蛋白残基之间的共价结合沉淀在靶标蛋白周围,并且,所述酪胺分子上偶联有第二荧光标记物;所述抗原修复试剂用于洗脱靶标蛋白上标记的第一抗体。
在本发明的一种实施方式中,所述检测探针杂交试剂还包括至少一种锚定序列;所述锚定序列用于与滚环扩增产物杂交,使得检测探针组能够通过锚定序列与环状扩增产物特异性结合。
在本发明的一种实施方式中,所述酪胺信号放大试剂还包括酪胺反应终止溶液;所述酪胺反应终止溶液用于终止酪胺分子与靶标蛋白之间的共价结合。
在本发明的一种实施方式中,所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒还包括封闭试剂;所述封闭试剂用于减少第一抗体的非特异结合位点,以提高第一抗体与靶标蛋白之间的特异性结合能力。
在本发明的一种实施方式中,所述双连接探针组和所述检测探针杂交试剂的数量与靶标核酸的数量一一对应;所述抗体标记试剂的数量与靶标蛋白的数量一一对应。
在本发明的一种实施方式中,所述第一荧光标记物偶联于检测探针组的探针的5’端。
在本发明的一种实施方式中,所述第一荧光标记物包括荧光基团;所述荧光基团包括Cy5、Cy3、TXR和/或Alexa Fluor 750。
在本发明的一种实施方式中,所述第二荧光标记物包括荧光基团;所述荧光基团包括Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 594和/或荧光基团Alexa Fluor488。
在本发明的一种实施方式中,所述第一抗体为单克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中,所述偶联有过氧化物酶第二抗体包括多聚辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗和/或多聚辣根过氧化物酶偶联鼠抗兔二抗。
在本发明的一种实施方式中,所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒还包括封片剂;所述封片剂为含DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的抗淬灭封片剂。
在本发明的一种实施方式中,所述靶标核酸包括TTF-1基因的mRNA、TP63基因的mRNA、PTPRC基因的mRNA和/或PECAM1基因的mRNA。
在本发明的一种实施方式中,所述靶标蛋白包括CD45蛋白、P63蛋白、TTF1蛋白、CD31蛋白、VIM蛋白和/或CK-PAN蛋白。
在本发明的一种实施方式中,所述双连接探针组包括第一双连接探针组、第二双连接探针组、第三靶标核酸以及第四双连接探针组;所述第一双连接探针组以TTF-1基因的mRNA为第一靶标核酸;所述第二双连接探针组以TP63基因的mRNA为第二靶标核酸;所述第三双连接探针组以PTPRC基因的mRNA为第三靶标核酸;所述第四双连接探针组以PECAM1基因的mRNA为第四靶标核酸。
在本发明的一种实施方式中,所述第一双连接探针组包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.14所示的探针;所述第二双连接探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.30所示的探针;所述第三双连接探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.46所示的探针;所述第四双连接探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.47~SEQID NO.62所示的探针。
在本发明的一种实施方式中,所述检测探针杂交试剂包括第一检测探针杂交试剂、第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂以及第四检测探针杂交试剂;所述第一检测探针杂交试剂、第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂以及第四检测探针杂交试剂分别包含第一检测探针组、第二检测探针组、第三检测探针组以及第四检测探针组。
在本发明的一种实施方式中,所述第一检测探针组包括核苷酸序列如ACTCANNAG、ACTCANNCT、ACTCANNGA、ACTCANNTC所示的探针;所述第二检测探针组包括核苷酸序列如AGNNACTCA、CTNNACTCA、GANNACTCA、TCNNACTCA所示的探针;所述第三检测探针组包括核苷酸序列如ACTCAAGNN、ACTCACTNN、ACTCAGANN、ACTCATCNN所示的探针;所述第四检测探针组包括核苷酸序列如NNAGACTCA、NNCTACTCA、NNGAACTCA、NNTCACTCA所示的探针(N是指简并碱基,为“A”、“C”、“G”或“T”)。
在本发明的一种实施方式中,所述第一检测探针杂交试剂和第二检测探针杂交试剂均包括第一锚定序列;所述第一锚定序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示。
在本发明的一种实施方式中,所述第三检测探针杂交试剂和第四检测探针杂交试剂均包括第二锚定序列;所述第二锚定序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。
在本发明的一种实施方式中,所述抗体标记试剂包括第一单克隆抗体标记试剂、第二单克隆抗体标记试剂、第三单克隆抗体标记试剂、第四单克隆抗体标记试剂;所述第一单克隆抗体标记试剂以CD45蛋白为第一靶标蛋白;所述第二单克隆抗体标记试剂以P63蛋白为第二靶标蛋白;所述第三单克隆抗体标记试剂以TTF1蛋白为第三靶标蛋白;所述第四单克隆抗体标记试剂以CD31蛋白为第四靶标蛋白。
在本发明的一种实施方式中,所述第一单克隆抗体为CD45单克隆抗体;所述第二单克隆抗体为P63单克隆抗体;所述第三单克隆抗体为TTF1单克隆抗体;所述第四单克隆抗体为CD31单克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中,所述夹板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示。
在本发明的一种实施方式中,所述双连接探针杂交试剂包括SSC缓冲液、甲酰胺、聚乙二醇-4000、DEPC水以及双连接探针组。
在本发明的一种实施方式中,所述双连接探针连接试剂包括Splint R连接酶反应缓冲液、甘油、SplintR连接酶、RiboLock RNase Inhibitor、BSA(胎牛血清)以及DEPC水。
在本发明的一种实施方式中,所述双连接探针环化试剂包括T4 DNA连接酶缓冲液、ATP、BSA、T4 DNA连接酶、RiboLock RNase Inhibitor、夹板序列以及DEPC水。
在本发明的一种实施方式中,所述滚环扩增试剂包括Phi29 DNA聚合酶缓冲液、dNTPs、BSA、甘油、Phi29聚合酶、RiboLock RNase Inhibitor以及DEPC水。
在本发明的一种实施方式中,所述检测探针杂交试剂包括T4 DNA连接酶缓冲液、ATP、BSA、T4 DNA连接酶、锚定序列、检测探针组以及DEPC水。
在本发明的一种实施方式中,所述抗原修复试剂包括柠檬酸盐抗原修复液。
在本发明的一种实施方式中,所述过氧化酶抑制试剂为H2O2溶液。
在本发明的一种实施方式中,所述酪胺工作溶液包括反应缓冲液、H2O2以及AlexaFluor tyramide reagent。
在本发明的一种实施方式中,所述酪胺反应终止溶液包括反应终止液以及DEPC-PBS溶液。
在本发明的一种实施方式中,所述封闭试剂为含山羊血清的封闭缓冲液。
本发明还提供了一种核酸与蛋白质的共检测方法,所述方法非疾病的诊断和治疗目的,所述方法使用上述核酸与蛋白质的共检测试剂盒对待测样本进行检测。
在本发明的一种实施方式中,所述方法包括如下步骤:
双连接探针杂交步骤:在组织切片上滴加双连接探针杂交试剂至完全覆盖组织样本后孵育,使双连接探针与靶标核酸充分杂交;孵育结束后,清洗组织切片;
双连接探针连接步骤:组织切片上滴加双连接探针连接试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
双连接探针环化步骤:在组织切片上滴加双连接探针环化试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
滚环扩增步骤:在组织切片上滴加滚环扩增试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;在组织切片上滴加多聚甲醛溶液至完全覆盖组织样本后孵育以对组织进行固定;回收组织切片上的废液后清洗组织切片;
检测探针杂交步骤:在组织切片上滴加检测探针杂交试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
封片步骤:先将组织切片干燥,再在组织切片上滴加封片剂,最后盖上盖玻片以进行封片;
探针洗脱步骤:将组织切片进行脱片;移去盖玻片后清洗组织切片;洗脱组织样本上连接的检测探针组;检测探针组洗脱结束后,用缓冲液清洗组织切片;
靶标核酸的检测步骤:通过检测探针组中探针连接的第一荧光标记物观察样本上的靶标核酸的表达量与位置,拍摄图片后进行定量分析;
下一个检测探针杂交步骤:重复检测探针杂交步骤、封片步骤、探针洗脱步骤和靶标核酸的检测步骤,重复次数=需检测靶标核酸的数量-1;重复检测探针杂交步骤时,根据靶标核酸的不同使用含有不同检测探针组的检测探针杂交试剂;最后一次重复时,封片步骤结束后无需进行探针洗脱步骤,直接进行靶标核酸的检测步骤;
抗原修复步骤:将组织切片进行脱片;移去盖玻片后清洗组织切片;将组织切片浸泡于抗原修复试剂中加热后冷却;冷却结束后,对组织切片进行清洗;
过氧化酶抑制步骤:在组织切片上滴加过氧化酶抑制试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
封闭步骤:在组织切片上滴加封闭试剂至完全覆盖组织样本后孵育;
单克隆抗体标记步骤:在组织切片上滴加第一抗体至完全覆盖组织切片后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
过氧化酶标记步骤:在组织切片上滴加过氧化酶标记试剂至完全覆盖组织切片后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
酪胺标记步骤:在组织切片上滴加酪胺工作液至完全覆盖组织样本后孵育;孵育完成后,移去切片上的酪胺工作液;在组织切片上滴加酪胺反应终止液至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
抗体洗脱步骤:将组织切片浸泡于抗原修复试剂中加热后冷却;冷却结束后,对组织切片进行清洗;
下一个单克隆抗体标记步骤:重复过氧化酶抑制步骤、封闭步骤、单克隆抗体标记步骤、过氧化酶标记步骤、酪胺标记步骤和抗体洗脱步骤,重复次数=需检测靶标蛋白的数量-1;重复单克隆抗体标记步骤时,根据靶标蛋白的不同使用不同的第一抗体;最后一次重复时,酪胺标记步骤结束后无需进行抗体洗脱步骤;
封片步骤:先将组织切片干燥,再在组织切片上滴加封片剂,最后盖上盖玻片以进行封片;
靶标蛋白的检测步骤:通过酪胺分子上偶联的第二荧光标记物观察组织切片上靶标蛋白的信号点质量并进行定量分析。
在本发明的一种实施方式中,所述方法包括如下步骤:
双连接探针杂交步骤:在组织切片上滴加双连接探针杂交试剂至完全覆盖组织样本后孵育,使双连接探针与靶标核酸充分杂交;孵育结束后,先用缓冲液清洗组织切片,再用含甲酰胺的缓冲液清洗组织切片,最后用缓冲液清洗组织;
双连接探针连接步骤:组织切片上滴加双连接探针连接试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;
双连接探针环化步骤:在组织切片上滴加双连接探针环化试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;
滚环扩增步骤:在组织切片上滴加滚环扩增试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;在组织切片上滴加多聚甲醛溶液至完全覆盖组织样本后孵育以对组织进行固定;回收组织切片上的废液后用缓冲液清洗组织切片;
检测探针杂交步骤:在组织切片上滴加第一检测探针杂交试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;
封片步骤:先将组织切片干燥,再在组织切片上滴加封片剂,最后盖上盖玻片以进行封片;
探针洗脱步骤:将组织切片进行脱片;移去盖玻片后用缓冲液清洗组织切片;先用含TritonX和甲酰胺的溶液清洗组织切片,再用甲酰胺清洗组织切片,最后用缓冲液清洗组织切片;
靶标核酸的检测步骤:通过激光扫描仪或荧光显微镜观察样本上的靶标核酸的表达量与位置,拍摄图片后进行定量分析;
下一个检测探针杂交步骤:重复检测探针杂交步骤、封片步骤、探针洗脱步骤和靶标核酸的检测步骤,共重复三次;重复检测探针杂交步骤时,分别使用第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂和第四检测探针杂交试剂替换第一检测探针杂交试剂;最后一次重复时,封片步骤结束后无需进行探针洗脱步骤,直接进行靶标核酸的检测步骤;
抗原修复步骤:将组织切片进行脱片;移去盖玻片后用缓冲液清洗组织切片;将组织切片浸泡于抗原修复试剂中加热后冷却;冷却结束后,先用含Tween 20的缓冲液对组织切片进行清洗,再用缓冲液对组织切片进行清洗;
过氧化酶抑制步骤:在组织切片上滴加过氧化酶抑制试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;
封闭步骤:在组织切片上滴加封闭试剂至完全覆盖组织样本后孵育;
单克隆抗体标记步骤:用封闭缓冲液稀释第一单克隆抗体;在组织切片上滴加经稀释的第一单克隆抗体至完全覆盖组织切片后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;
过氧化酶标记步骤:在组织切片上滴加过氧化酶标记试剂至完全覆盖组织切片后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;
酪胺标记步骤:在组织切片上滴加酪胺工作液至完全覆盖组织样本后孵育;孵育完成后,移去切片上的酪胺工作液;在组织切片上滴加酪胺反应终止液至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,用缓冲液清洗组织切片;
抗体洗脱步骤:用蒸馏水稀释抗原修复试剂;将组织切片浸泡于经稀释的抗原修复试剂中加热后冷却;冷却结束后,用缓冲液对组织切片进行清洗;
下一个单克隆抗体标记步骤:用封闭缓冲液稀释第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体;重复过氧化酶抑制步骤、封闭步骤、单克隆抗体标记步骤、过氧化酶标记步骤、酪胺标记步骤和抗体洗脱步骤,共重复三次;重复单克隆抗体标记步骤时,分别使用经稀释的第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体替换经稀释的第一单克隆抗体;最后一次重复时,酪胺标记步骤结束后无需进行抗体洗脱步骤;
封片步骤:先将组织切片干燥,再在组织切片上滴加封片剂,最后盖上盖玻片以进行封片;
靶标蛋白的检测步骤:通过荧光显微镜观察组织切片上靶标蛋白的信号点质量并进行定量分析。
在本发明的一种实施方式中,双连接探针杂交步骤之前,所述方法还包含样本预处理步骤;所述样本预处理步骤为:将组织切片进行脱蜡、固定和透化。
在本发明的一种实施方式中,单克隆抗体标记步骤以及下一个单克隆抗体标记步骤中,所述第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体的稀释比例分别为1:100~1000、1:10~100、1:100~1000和1:200~1000。
在本发明的一种实施方式中,单克隆抗体标记步骤以及下一个单克隆抗体标记步骤中,所述第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体的稀释比例分别为1:500、1:50、1:500和1:1000。
在本发明的一种实施方式中,抗体洗脱步骤中,所述抗原修复试剂的稀释比例为1:5~50。
在本发明的一种实施方式中,抗体洗脱步骤中,所述抗原修复试剂的稀释比例为1:20。
在本发明的一种实施方式中,抗体洗脱步骤中,所述加热是指先于微波炉大火煮2~8min至沸,随后转小火煮8~20min。
在本发明的一种实施方式中,抗体洗脱步骤中,所述加热是指先于微波炉大火煮3min至沸,随后转小火煮15min。
在本发明的一种实施方式中,酪胺标记步骤中,滴加酪胺工作液后的孵育时间为5~10min。
在本发明的一种实施方式中,酪胺标记步骤中,滴加酪胺工作液后的孵育时间为8min。
本发明还提供了上述核酸与蛋白质的共检测试剂盒或上述核酸与蛋白质的共检测方法在靶标核酸和/或靶标蛋白检测中的应用,所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
本发明技术方案,具有如下优点:
本发明提供了一种基于双重显色的核酸与蛋白质的共检测试剂盒,所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒包括双连接探针杂交试剂、双连接探针连接试剂、双连接探针环化试剂、滚环扩增试剂、至少一种检测探针杂交试剂、过氧化酶抑制试剂、至少一种抗体标记试剂、过氧化酶标记试剂、酪胺信号放大试剂和抗原修复试剂;所述双连接探针杂交试剂包括至少一组双连接探针组;所述双连接探针组能够与靶标核酸特异性结合,形成杂合体;所述双连接探针连接试剂用于将杂合体连接;所述双连接探针环化试剂包括夹板序列,用于将杂合体环化,形成环化产物,并引发以环化产物为模板的滚环扩增;所述滚环扩增试剂用于将环化产物滚环扩增,形成环状扩增产物;所述检测探针杂交试剂包括检测探针组;所述检测探针组能够与环状扩增产物特异性结合,并且,所述检测探针组的探针上偶联有第一荧光标记物;所述过氧化酶抑制试剂用于抑制内源性过氧化物酶的活性;所述抗体标记试剂包括第一抗体;所述第一抗体能够与靶标蛋白特异性结合;所述过氧化酶标记试剂包括偶联有过氧化物酶的第二抗体;所述第二抗体能够与第一抗体特异性结合;所述酪胺信号放大试剂包括酪胺工作溶液;所述酪胺工作溶液包括酪胺分子和过氧化氢;所述酪胺分子能够在过氧化酶和过氧化氢的催化作用下通过酪胺分子和蛋白残基之间的共价结合沉淀在靶标蛋白周围,并且,所述酪胺分子上偶联有第二荧光标记物;所述抗原修复试剂用于洗脱靶标蛋白上标记的第一抗体。本发明的共检测试剂盒先根据原位测序方法设计双连接探针分别与组织样本中的靶标核酸靶序列进行杂交,接着通过连接酶将双连接探针环化,经过滚环扩增后得到扩增产物,将检测探针与扩增产物杂交,检测探针上偶联着易于区分的荧光基团,被荧光激发后可以在荧光显微镜下直接被观察,同时,在进行了原位测序的组织样本上,加入靶向靶标蛋白的第一抗体进行特异性结合,随后第二抗体与第一抗体结合,携带荧光基团的酪胺分子在过氧化氢和过氧化酶的催化下与靶标蛋白上的氨基酸残基结合,从而沉淀在靶标蛋白周围,荧光基团在荧光的激发下可以在荧光显微镜下直接被观察。研究表明,使用所述共检测试剂盒可以在临床肺鳞癌组织样本中检测到颜色分明的PECAM1基因、PTPRC基因和TP63基因及其对应的CD31蛋白、CD45蛋白和P63蛋白,可以在临床肺腺癌组织样本中检测到颜色分明的PECAM1基因、PTPRC基因和TTF-1基因及其对于的CD31蛋白、CD45蛋白和TTF1蛋白,区域性效果很好,且可以实现共定位与共检测,并且显示出更好的特异性和更高的灵敏度。因此,所述共检测试剂盒可以应用于多种细胞类型中原位检测基因的核酸(例如,mRNA)和蛋白质的表达。
进一步地,使用所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒进行检测时,选择1:500作为最佳的第一单克隆抗体的稀释比例、选择1:50作为最佳的第二单克隆抗体的稀释比例、选择1:500作为最佳的第三单克隆抗体的稀释比例、选择1:1000作为最佳的第四单克隆抗体的稀释比例,此稀释比例的检测效果优于使用其它稀释比例时的效果,具有更高质量的荧光信号。
进一步地,使用所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒进行检测时,将酪胺信号放大反应的时间为8min,此酪胺信号放大反应时间下信号点达到饱和。
进一步地,选择的抗体洗脱方法为使用抗原修复试剂进行抗原热修复,选择的抗原热修复时间为3min,此抗体洗脱方法和抗原热修复时间下,组织样本的细胞核形变较小,且抗体洗脱较为干净。
附图说明
图1:核酸与蛋白质的共检测试剂盒的检测原理图。
图2:定量分析在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的可行性结果(VIM蛋白)。
图3:定量分析在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的可行性结果(CK-PAN蛋白)。
图4:定量分析在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的可行性结果(CD45蛋白)。
图5:定量分析在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的可行性结果(CD31蛋白)。
图6:不同抗体稀释比在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的结果。
图7:不同酪胺新信号放大条件下在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的结果。
图8:定量分析在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的结果。
图9:定量分析在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的可行性结果。
图10:不同抗原修复条件在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的结果(A组)。
图11:不同抗原修复条件在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的结果(B组)。
图12:不同抗原修复条件在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的结果(C组)。
图13:不同抗原修复条件在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的结果(D组)。
图14:不同抗原修复条件在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的结果(E组)。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1:一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒
本实施例提供了一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒(检测原理图见图1),所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒以TTF-1基因的mRNA为第一靶标核酸,以TP63基因的mRNA为第二靶标核酸,以PTPRC基因的mRNA为第三靶标核酸,以PECAM1基因的mRNA为第四靶标核酸,以PTPRC基因对应的CD45蛋白为第一靶标蛋白,以PECAM1基因对应的CD31蛋白为第二靶标蛋白,以波形蛋白VIM蛋白为第三靶标蛋白,以广谱角蛋白CK-PAN蛋白为第四靶标蛋白,包括双连接探针杂交试剂、双连接探针连接试剂、双连接探针环化试剂、滚环扩增试剂、第一检测探针杂交试剂、第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂、第四检测探针杂交试剂、抗原修复试剂、过氧化酶抑制试剂、封闭试剂、第一单克隆抗体标记试剂、第二单克隆抗体标记试剂、第三单克隆抗体标记试剂、第四单克隆抗体标记试剂、过氧化酶标记试剂、酪胺信号放大试剂和封片剂;
所述双连接探针杂交试剂(50μL)由15μL 20×SSC缓冲液(Sigma)、5μL浓度为1%(v/v)的甲酰胺(Sigma)、5μL浓度为50%(v/v)的聚乙二醇-4000(Thermo)、20μL DEPC水、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以TTF-1基因的mRNA为第一靶标核酸的第一双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以TP63基因的mRNA为第二靶标核酸的第二双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以PTPRC基因的mRNA为第三靶标核酸的第三双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以PECAM1基因的mRNA为第四靶标核酸的第四双连接探针组组成;所述第一双连接探针组(SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.14)、第二双连接探针组(SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.30)、第三双连接探针组(SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.46)和第四双连接探针组(SEQ ID NO.47~SEQ ID NO.62)的探针序列见表1;
所述双连接探针连接试剂(50μL)由含5μL 2×Splint R连接酶反应缓冲液(NEB)、12.5μL浓度为50%(v/v)甘油、1μL浓度为25U/μL的SplintR连接酶(NEB)、1.25μL浓度为40U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)和25.25μLDEPC水组成;
所述双连接探针环化试剂(50μL)由5μL 2×T4 DNA连接酶缓冲液(Thermo)、5μL浓度为2mM的ATP(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、1μL浓度为5U/μL的T4 DNA连接酶(Thermo)、1.25μL浓度为40U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)、5μL浓度为50%的聚乙二醇-4000(Thermo)、2.5μL浓度为10μM的夹板序列和25.25μL DEPC水组成;所述夹板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示(GGCTCCACTAAATAGACGCA);
所述滚环扩增试剂(50μL)由5μL 2×Phi29 DNA聚合酶缓冲液(NEB)、2μL浓度为2mM的dNTPs(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、2.5μL浓度为10%(v/v)的甘油、5μL浓度为10U/μL的Phi29聚合酶(NEB)、1.25μL浓度为1U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)和29.25μL DEPC水组成;
所述第一检测探针杂交试剂(50μL)由5μL 2×T4 DNA连接酶缓冲液(Thermo)、5μL浓度为2mM的ATP(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、1μL浓度为5U/μL的T4 DNA连接酶(Thermo)、5μL浓度为2μM的第一锚定序列、10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组和19μL DEPC水组成;所述第一锚定序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.80所示(CTATTTAGTGGAGCC);所述第一检测探针组(nS3PMAG-Cy5、nS3PMCT-TXR、nS3PMGA-Cy3、nS3PMTC-750)的探针序列及荧光基团修饰见表2;
所述第二检测探针杂交试剂为在第一检测探针杂交试剂的基础上,将10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组替换为10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第二检测探针组;所述第三检测探针杂交试剂和第四检测探针杂交试剂为在第一检测探针杂交试剂的基础上,将10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组分别替换为10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第三检测探针组、10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第四检测探针组,并且,将5μL浓度为2μM的第一锚定序列替换为5μL浓度为2μM的第二锚定序列;所述第二锚定序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示(TGCGTCTATTTAGTG);所述第二检测探针组(nSPAGM-Cy5、nSPCTM-TXR、nSPGAM-Cy3、nSPTCM-750)、第三检测探针组(nS3PAGM-Cy5、nS3PCTM-TXR、nS3PGAM-Cy3、nS3PTCM-750)和第四检测探针组(nSPMAG-Cy5、nSPMCT-TXR、nSPMGA-Cy3、nSPMTC-750)的探针序列及荧光基团修饰见表2;
所述抗原修复试剂为柠檬酸盐抗原修复液(中杉金桥,pH 6.0);
所述过氧化酶抑制试剂为浓度为3%(v/v)的H2O2溶液(Thermo);
所述封闭试剂为含10%(v/v)山羊血清的1×封闭缓冲液(Thermo);
所述第一单克隆抗体标记试剂为以PTPRC基因对应的CD45蛋白为第一靶标蛋白的第一单克隆抗体;所述第二单克隆抗体标记试剂为以PECAM1基因对应的CD31蛋白为第二靶标蛋白的第二单克隆抗体;所述第三单克隆抗体标记试剂为以波形蛋白VIM蛋白为第三靶标蛋白的第三单克隆抗体;所述第四单克隆抗体标记试剂为以广谱角蛋白CK-PAN蛋白为第四靶标蛋白的第四单克隆抗体;所述第一单克隆抗体为CD45单克隆抗体(Thermo);所述第二单克隆抗体为CD31单克隆抗体(Thermo);所述第三单克隆抗体为VIM单克隆抗体(Thermo);所述第四单克隆抗体为CK-PAN单克隆抗体(Thermo);
所述过氧化酶标记试剂由多聚辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗(Thermo)或多聚辣根过氧化物酶偶联鼠抗兔二抗(迈新)组成;
所述酪胺信号放大试剂由酪胺工作溶液和酪胺反应终止溶液组成;所述酪胺工作溶液(510μL)由500μL 1×反应缓冲液(Thermo)、5μL质量分数为0.03%的H2O2溶液(Thermo,溶剂为水)和5μL Alexa FluorTMtyramide reagent(Thermo)组成;所述酪胺反应终止溶液(550μL)由50μL 20×反应终止液(Thermo)和500μL 1×DEPC-PBS溶液(武汉塞维尔)组成(酪胺分子上荧光基团根据原位测序的基因表达结果来选择,先通过原位测序的基因表达结果来推断蛋白质的表达量情况,再根据表达量的多和少匹配最合适的荧光基团,例如,表达量差异较大的两种蛋白之间尽量选择激发波长不重叠或距离较远的荧光基团);
所述封片剂为抗淬灭封片剂;所述抗淬灭封片剂为使用SlowFade试剂稀释至浓度为0.5μg/μL的DAPI封片剂溶液(Thermo,DAPI封片剂的母液浓度为10μg/mL)。
表1双连接探针的探针序列
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表2检测探针的探针序列
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表1~2中的探针均由上海生工合成,其中,TXR是指Texas Red,Alexa Fluor 750,P是指磷酸基团。
实验例1:在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的可行性验证
本实施例提供了使用实施例1的试剂盒在石蜡包埋组织切片上对多重靶标蛋白进行检测的可行性验证实验,此实验以免疫组化方法(倪灿荣等,免疫组织化学实验技术及应用,2006)作为对比,以临床肺鳞癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)和临床肺腺癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)作为待测样本,检测待测样本中CD45蛋白、CD31蛋白、CK-PAN蛋白和VIM蛋白的表达水平,实验过程如下:
样本预处理步骤:
将组织切片于60℃烘箱中烤片30min;烤片后置于通风橱内使切片温度降至室温(25℃),置于二甲苯Ⅰ缸中中浸泡15min;随后取出切片,置于二甲苯Ⅱ缸中浸泡10min;取出切片,依次置于100%(v/v)乙醇、95%(v/v)乙醇、70%(v/v)乙醇中浸泡以附水,每次浸泡2min;随后用DEPC水覆盖组织5min;
抗原修复步骤:
移去组织切片上的DEPC水,将组织切片置于盛满柠檬酸盐抗原修复液的玻璃缸中,于微波炉中火煮8min至沸,停火8min保温,随后转中小火煮7min,室温(25℃)自然冷却;在室温(25℃)条件下,用含0.1%(v/v)Tween 20的DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次5min;随后再用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为5min;
过氧化酶抑制步骤:
在组织切片上滴加浓度为3%(v/v)的H2O2溶液至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育60min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次30s;
封闭步骤:
在组织切片上滴加封闭试剂至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育60min;
单克隆抗体标记步骤:
用1×封闭缓冲液稀释第一单克隆抗体,稀释比例为1:100(单克隆抗体:1×封闭缓冲液);在组织切片上滴加经稀释的第一单克隆抗体至完全覆盖组织切片,在室温(25℃)下孵育60min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次10min;
过氧化酶标记步骤:
在组织切片上滴加多聚辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗(Thermo)至完全覆盖组织切片,在室温(25℃)下孵育60min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次10min;
酪胺标记步骤:
在每张组织切片上滴加酪胺工作液(CD45单克隆抗体使用Alexa FluorTM546作为酪胺分子上荧光基团)至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育8min,孵育完成后移去切片上的酪胺工作液;在组织切片上滴加酪胺反应终止液至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育5min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次30s;
抗体洗脱步骤:
用蒸馏水稀释柠檬酸盐抗原修复液,稀释比例为1:20(柠檬酸盐抗原修复液:蒸馏水);将组织切片置于500mL经稀释的柠檬酸盐抗原修复液中,于微波炉大火煮8min至沸,随后转小火煮15min,在室温(25℃)条件下自然冷却;在室温(25℃)条件下,用DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次30s;
下一个单克隆抗体标记步骤:
用1×封闭缓冲液稀释第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体,稀释比例分别为1:50、1:140和1:200(单克隆抗体:1×封闭缓冲液);重复过氧化酶抑制步骤、封闭步骤、单克隆抗体标记步骤、过氧化酶标记步骤、酪胺标记步骤和抗体洗脱步骤,共重复三次;重复单克隆抗体标记步骤时,分别使用经稀释的第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体替换经稀释的第一单克隆抗体;最后一次重复时,酪胺标记步骤结束后无需进行抗体洗脱步骤(CD31单克隆抗体使用Alexa FluorTM647作为酪胺分子上荧光基团、CK-PAN单克隆抗体使用Alexa FluorTM488作为酪胺分子上荧光基团、VIM单克隆抗体使用Alexa FluorTM594作为酪胺分子上荧光基团);
封片步骤:
将组织切片于室温(25℃)下干燥;在组织切片上滴加20μL DAPI封片剂溶液后,盖上干净的盖玻片进行封片;
检测步骤:
通过Leica倒置荧光显微镜观察组织切片上靶标蛋白的信号点质量并进行定位定量分析,定位定量分析结果见图2~5。
由图2~5可知,通过与免疫组化的结果进行对比,未进行原位测序(即未经过核酸检测)的石蜡包埋组织切片上的靶标蛋白的表达位置与免疫组化内的表达位置是基本对应的,证明实施例1的试剂盒在未进行原位测序的石蜡包埋组织切片上检测靶标蛋白具有可行性。
实验例2:单克隆抗体的稀释比例对共检测试剂盒检测效果的影响
本实施例提供了单克隆抗体的稀释比例对实施例1的共检测试剂盒检测效果的影响实验,此实验以临床肺鳞癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)和临床肺腺癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)作为待测样本,检测待测样本中CD45蛋白、CD31蛋白、CK-PAN蛋白和VIM蛋白的表达水平,实验过程如下:
在实验例1的基础上,将单克隆抗体标记步骤中第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体的稀释比例分别由1:100、1:50、1:140和1:200(单克隆抗体:1×封闭缓冲液)替换为:
A组:第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体的稀释比例分别为1:100、1:50、1:140和1:200(单克隆抗体:1×封闭缓冲液);
B组:第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体的稀释比例分别为1:1000、1:50、1:1000和1:1000(单克隆抗体:1×封闭缓冲液);
C组:第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体的稀释比例分别为1:1000、1:50、1:500和1:1000(单克隆抗体:1×封闭缓冲液);
D组:第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体的稀释比例分别为1:500、1:50、1:500和1:1000(单克隆抗体:1×封闭缓冲液)。
检测步骤所得定量分析结果见图6。
由图6可知,第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体稀释比例分别为1:500、1:50、1:500和1:1000时的检测效果优于使用其它稀释比例时的效果,具有更高质量的荧光信号,故选择1:500作为最佳的第一单克隆抗体的稀释比例、选择1:50作为最佳的第二单克隆抗体的稀释比例、选择1:500作为最佳的第三单克隆抗体的稀释比例、选择1:1000作为最佳的第四单克隆抗体的稀释比例。
实验例3:酪胺信号放大反应的时间对共检测试剂盒检测效果的影响
本实施例提供了酪胺信号放大反应的时间对实施例1的共检测试剂盒检测效果的影响实验,此实验以临床肺鳞癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)和临床肺腺癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)作为待测样本,检测待测样本中CD45蛋白、CD31蛋白、CK-PAN蛋白和VIM蛋白的表达水平,实验过程如下:
在实验例1的基础上,将酪胺标记步骤中滴加酪胺工作液后的孵育时间分别设置为8min和10min。检测步骤所得定量分析结果见图7。
由图7可知,在未进行原位测序(即未经过核酸检测)的石蜡包埋组织切片上观察到,酪胺信号放大反应时间为8min时的检测效果与10min时的效果未见明显差异,故选择8min作为最佳的酪胺信号放大反应时间。
实施例2:一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒
本实施例提供了一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒(检测原理图见图1),所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒以TTF-1基因的mRNA为第一靶标核酸,以TP63基因的mRNA为第二靶标核酸,以PTPRC基因的mRNA为第三靶标核酸,以MS4A1基因的mRNA为第四靶标核酸,以PTPRC基因对应的CD45蛋白为第一靶标蛋白,以TP63基因对应的P63蛋白为第二靶标蛋白,以TTF-1基因对应的TTF1蛋白为第三靶标蛋白,以PECAM1基因对应的CD31蛋白为第四靶标蛋白,包括双连接探针杂交试剂、双连接探针连接试剂、双连接探针环化试剂、滚环扩增试剂、第一检测探针杂交试剂、第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂、第四检测探针杂交试剂、抗原修复试剂、过氧化酶抑制试剂、封闭试剂、第一单克隆抗体标记试剂、第二单克隆抗体标记试剂、第三单克隆抗体标记试剂、第四单克隆抗体标记试剂、过氧化酶标记试剂、酪胺信号放大试剂和封片剂;
所述双连接探针杂交试剂(50μL)由15μL 20×SSC缓冲液(Sigma)、5μL浓度为1%(v/v)的甲酰胺(Sigma)、5μL浓度为50%(v/v)的聚乙二醇-4000(Thermo)、20μL DEPC水、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以TTF-1基因的mRNA为第一靶标核酸的第一双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以TP63基因的mRNA为第二靶标核酸的第二双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以PTPRC基因的mRNA为第三靶标核酸的第三双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以MS4A1基因的mRNA为第四靶标核酸的第四双连接探针组组成;所述第一双连接探针组(SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.14)、第二双连接探针组(SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.30)、第三双连接探针组(SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.46)和第四双连接探针组(SEQ ID NO.63~SEQ ID NO.78)的探针序列见表1和表3;
所述双连接探针连接试剂(50μL)由含5μL 2×Splint R连接酶反应缓冲液(NEB)、12.5μL浓度为50%(v/v)甘油、1μL浓度为25U/μL的SplintR连接酶(NEB)、1.25μL浓度为40U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)和25.25μLDEPC水组成;
所述双连接探针环化试剂(50μL)由5μL 2×T4 DNA连接酶缓冲液(Thermo)、5μL浓度为2mM的ATP(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、1μL浓度为5U/μL的T4 DNA连接酶(Thermo)、1.25μL浓度为40U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)、5μL浓度为50%的聚乙二醇-4000(Thermo)、2.5μL浓度为10μM的夹板序列和25.25μL DEPC水组成;所述夹板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示(GGCTCCACTAAATAGACGCA);
所述滚环扩增试剂(50μL)由5μL 2×Phi29 DNA聚合酶缓冲液(NEB)、2μL浓度为2mM的dNTPs(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、2.5μL浓度为10%(v/v)的甘油、5μL浓度为10U/μL的Phi29聚合酶(NEB)、1.25μL浓度为1U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)和29.25μL DEPC水组成;
所述检测探针杂交试剂(50μL)由5μL 2×T4 DNA连接酶缓冲液(Thermo)、5μL浓度为2mM的ATP(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、1μL浓度为5U/μL的T4 DNA连接酶(Thermo)、5μL浓度为2μM的第一锚定序列、10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组和19μL DEPC水组成;所述第一锚定序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.80所示(CTATTTAGTGGAGCC);所述第一检测探针组(nS3PMAG-Cy5、nS3PMCT-TXR、nS3PMGA-Cy3、nS3PMTC-750)的探针序列及荧光基团修饰见表2;
所述第二检测探针杂交试剂为在第一检测探针杂交试剂的基础上,将10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组替换为10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第二检测探针组;所述第三检测探针杂交试剂和第四检测探针杂交试剂为在第一检测探针杂交试剂的基础上,将10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组分别替换为10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第三检测探针组、10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第四检测探针组,并且,将5μL浓度为2μM的第一锚定序列替换为5μL浓度为2μM的第二锚定序列;所述第二锚定序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示(TGCGTCTATTTAGTG);所述第二检测探针组(nSPAGM-Cy5、nSPCTM-TXR、nSPGAM-Cy3、nSPTCM-750)、第三检测探针组(nS3PAGM-Cy5、nS3PCTM-TXR、nS3PGAM-Cy3、nS3PTCM-750)和第四检测探针组(nSPMAG-Cy5、nSPMCT-TXR、nSPMGA-Cy3、nSPMTC-750)的探针序列及荧光基团修饰见表2;
所述抗原修复试剂为柠檬酸盐抗原修复液(中杉金桥,pH 6.0);
所述过氧化酶抑制试剂为浓度为3%(v/v)的H2O2溶液(Thermo);
所述封闭试剂为含10%(v/v)山羊血清的1×封闭缓冲液(Thermo);
所述第一单克隆抗体标记试剂为以PTPRC基因对应的CD45蛋白为第一靶标蛋白的第一单克隆抗体;所述第二单克隆抗体标记试剂为以TP63基因对应的P63蛋白为第二靶标蛋白的第二单克隆抗体;所述第三单克隆抗体标记试剂为以TTF-1基因对应的TTF1蛋白为第三靶标蛋白的第三单克隆抗体;所述第四单克隆抗体标记试剂为以PECAM1基因对应的CD31蛋白为第四靶标蛋白的第四单克隆抗体组成;所述第一单克隆抗体为CD45单克隆抗体(Thermo);所述第二单克隆抗体为P63单克隆抗体(Thermo);所述第三单克隆抗体为TTF1单克隆抗体(Thermo);所述第四单克隆抗体为CD31单克隆抗体(Thermo);
所述过氧化酶标记试剂由多聚辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗(Thermo)或多聚辣根过氧化物酶偶联鼠抗兔二抗(迈新)组成;
所述酪胺信号放大试剂包括酪胺工作溶液和酪胺反应终止溶液;所述酪胺工作溶液(510μL)由500μL 1×反应缓冲液(Thermo)、5μL质量分数为0.03%的H2O2溶液(Thermo,溶剂为水)和5μL Alexa FluorTMtyramide reagent(Thermo)组成;所述酪胺反应终止溶液(550μL)由50μL 20×反应终止液(Thermo)和500μL 1×DEPC-PBS溶液(武汉塞维尔)组成(酪胺分子上荧光基团根据原位测序的基因表达结果来选择,先通过原位测序的基因表达结果来推断蛋白质的表达量情况,再根据表达量的多和少匹配最合适的荧光基团,例如,表达量差异较大的两种蛋白之间尽量选择激发波长不重叠或距离较远的荧光基团);
所述封片剂为抗淬灭封片剂;所述抗淬灭封片剂为使用SlowFade试剂稀释至浓度为0.5μg/μL的DAPI封片剂溶液(Thermo,DAPI封片剂的母液浓度为10μg/mL)。
表3双连接探针的探针序列
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表3中的探针均由上海生工合成。
实验例4:在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸进行检测的可行性验证
本实施例提供了使用实施例2的试剂盒在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸进行检测的可行性验证实验,此实验以苏木精伊红染色方法(倪灿荣等,免疫组织化学实验技术及应用,2006)作为对比,以临床肺鳞癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)和临床肺腺癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)作为待测样本,检测待测样本中TTF-1基因、TP63基因和PTPRC基因的表达水平(mRNA),实验过程如下:
样本预处理步骤:
将组织切片于60℃烘箱中烤片30min;烤片后置于通风橱内使切片温度降至室温(25℃),置于二甲苯Ⅰ缸中中浸泡15min;随后取出切片,置于二甲苯Ⅱ缸中浸泡10min;取出切片,依次置于100%(v/v)乙醇、95%(v/v)乙醇、70%(v/v)乙醇中浸泡以附水,每次浸泡2min;用DEPC水覆盖组织5min;移去组织切片上的DEPC水,用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为2min;在组织切片上滴加4%(w/v,g/100mL)多聚甲醛(碧云天)至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育10min对组织进行固定;回收组织切片上的废液,并在室温(25℃)下用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为2min;将浓度为0.1M的盐酸溶液于烘箱内预热至37℃;在预热后的浓度为0.1M的盐酸溶液内加入0.3mg/mL的胃蛋白酶(Sigma)后震荡离心,得到透化剂;将透化剂滴加于组织切片上至完全覆盖组织样本后,在37℃条件下孵育30min对组织进行透化;移去组织切片上的废液,并室温(25℃)下用DEPC水对组织切片进行清洗,清洗时间为5min;随后用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为2min;将组织切片依次置于70%(v/v)乙醇、95%(v/v)乙醇、无水乙醇中浸泡以脱水,每次浸泡1min;待组织切片完全干燥后,根据HE染色结果在肿瘤区域画出组化圈;
双连接探针杂交步骤:
在组织切片上滴加双连接探针杂交试剂至完全覆盖组织样本,在46℃下孵育4h,使双连接探针与靶标RNA充分杂交;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗3次,每次30s;随后用含0.5%(w/v,g/100mL)甲酰胺(Sigma)的2×SSC缓冲液(Sigma)在37℃下清洗组织切片3次,每次30s;清洗结束后用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
双连接探针连接步骤:
在组织切片上滴加双连接探针连接试剂至完全覆盖组织样本,在37℃下孵育30min;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
双连接探针环化步骤:
在组织切片上滴加双连接探针环化试剂试剂至完全覆盖组织样本,在37℃下孵育30min;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
滚环扩增步骤:
在组织切片上滴加滚环扩增试剂至完全覆盖组织样本,在30℃下孵育过夜(16h);孵育结束后,用PBST缓冲液清洗3次,每次30s;在组织切片上滴加4%(w/v,g/100mL)多聚甲醛(碧云天)至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育10min对组织进行固定;回收组织切片上的废液,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
检测探针杂交步骤:
在组织切片上滴加第一检测探针杂交试剂至完全覆盖组织样本,在30℃下孵育45min;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
封片步骤:
将组织切片于室温(25℃)下干燥;在组织切片上滴加20μL DAPI封片剂溶液后,盖上干净的盖玻片进行封片;
探针洗脱步骤:
将组织切片置于DEPC-PBS溶液中浸泡至盖玻片脱落;移去盖玻片后用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;用含0.1%(w/v,g/100mL)TritonX和80%(w/v,g/100mL)甲酰胺的DEPC水在37℃下清洗组织切片2次,每次10min;随后用100%甲酰胺在37℃下清洗组织切片,清洗时间为10min;随后用PBST缓冲液清洗组织样本3次,每次30s;
检测步骤:
通过Leica扫描仪观察样本上的靶标RNA的表达量与位置,拍摄图片后进行定量分析;
下一个检测探针杂交步骤:
重复检测探针杂交步骤、封片步骤、探针洗脱步骤和检测步骤,共重复三次;重复检测探针杂交步骤时,分别使用第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂和第四检测探针杂交试剂替换第一检测探针杂交试剂;最后一次重复时,封片步骤结束后无需进行探针洗脱步骤,直接进行检测步骤;
检测步骤所得定量分析结果见图8。
由图8可知,通过与苏木精伊红染色的石蜡包埋组织切片进行对比,靶标RNA表达的位置与肿瘤区域和肿瘤微环境区域基本符合,证明实施例2的试剂盒在石蜡包埋组织切片上检测靶标核酸具有可行性。
实施例3:一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒
本实施例提供了一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒(检测原理图见图1),所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒以TTF-1基因的mRNA为第一靶标核酸,以TP63基因的mRNA为第二靶标核酸,以PTPRC基因的mRNA为第三靶标核酸,以PECAM1基因的mRNA为第四靶标核酸,以PTPRC基因对应的CD45蛋白为第一靶标蛋白,以TP63基因对应的P63蛋白为第二靶标蛋白,以TTF-1基因对应的TTF1蛋白为第三靶标蛋白,以PECAM1基因对应的CD31蛋白为第四靶标蛋白,包括双连接探针杂交试剂、双连接探针连接试剂、双连接探针环化试剂、滚环扩增试剂、第一检测探针杂交试剂、第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂、第四检测探针杂交试剂、抗原修复试剂、过氧化酶抑制试剂、封闭试剂、第一单克隆抗体标记试剂、第二单克隆抗体标记试剂、第三单克隆抗体标记试剂、第四单克隆抗体标记试剂、过氧化酶标记试剂、酪胺信号放大试剂和封片剂;
所述双连接探针杂交试剂(50μL)由15μL 20×SSC缓冲液(Sigma)、5μL浓度为1%(v/v)的甲酰胺(Sigma)、5μL浓度为50%(v/v)的聚乙二醇-4000(Thermo)、20μL DEPC水、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以TTF-1基因的mRNA为第一靶标核酸的第一双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以TP63基因的mRNA为第二靶标核酸的第二双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以PTPRC基因的mRNA为第三靶标核酸的第三双连接探针组、1.25μL各连接探针浓度均为2μM的以PECAM1基因的mRNA为第四靶标核酸的第四双连接探针组组成;所述第一双连接探针组(SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.14)、第二双连接探针组(SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.30)、第三双连接探针组(SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.46)和第四双连接探针组(SEQ ID NO.47~SEQ ID NO.62)的探针序列见表1;
所述双连接探针连接试剂(50μL)由含5μL 2×Splint R连接酶反应缓冲液(NEB)、12.5μL浓度为50%(v/v)甘油、1μL浓度为25U/μL的SplintR连接酶(NEB)、1.25μL浓度为40U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)和25.25μLDEPC水组成;
所述双连接探针环化试剂(50μL)由5μL 2×T4 DNA连接酶缓冲液(Thermo)、5μL浓度为2mM的ATP(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、1μL浓度为5U/μL的T4 DNA连接酶(Thermo)、1.25μL浓度为40U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)、5μL浓度为50%的聚乙二醇-4000(Thermo)、2.5μL浓度为10μM的夹板序列和25.25μL DEPC水组成;所述夹板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示(GGCTCCACTAAATAGACGCA);
所述滚环扩增试剂(50μL)由5μL 2×Phi29 DNA聚合酶缓冲液(NEB)、2μL浓度为2mM的dNTPs(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、2.5μL浓度为10%(v/v)的甘油、5μL浓度为10U/μL的Phi29聚合酶(NEB)、1.25μL浓度为1U/μL的RiboLock RNase Inhibitor(Thermo)和29.25μL DEPC水组成;
所述第一检测探针杂交试剂(50μL)由5μL 2×T4 DNA连接酶缓冲液(Thermo)、5μL浓度为2mM的ATP(Thermo)、5μL浓度为0.4μg/μL的BSA(NEB)、1μL浓度为5U/μL的T4 DNA连接酶(Thermo)、5μL浓度为2μM的第一锚定序列、10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组和19μL DEPC水组成;所述第一锚定序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.80所示(CTATTTAGTGGAGCC);所述第一检测探针组(nS3PMAG-Cy5、nS3PMCT-TXR、nS3PMGA-Cy3、nS3PMTC-750)的探针序列及荧光基团修饰见表2;
所述第二检测探针杂交试剂为在第一检测探针杂交试剂的基础上,将10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组替换为10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第二检测探针组;所述第三检测探针杂交试剂和第四检测探针杂交试剂为在第一检测探针杂交试剂的基础上,将10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第一检测探针组分别替换为10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第三检测探针组、10μL各检测探针浓度均为2μM的5’端修饰有荧光基团的第四检测探针组,并且,将5μL浓度为2μM的第一锚定序列替换为5μL浓度为2μM的第二锚定序列;所述第二锚定序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示(TGCGTCTATTTAGTG);所述第二检测探针组(nSPAGM-Cy5、nSPCTM-TXR、nSPGAM-Cy3、nSPTCM-750)、第三检测探针组(nS3PAGM-Cy5、nS3PCTM-TXR、nS3PGAM-Cy3、nS3PTCM-750)和第四检测探针组(nSPMAG-Cy5、nSPMCT-TXR、nSPMGA-Cy3、nSPMTC-750)的探针序列及荧光基团修饰见表2;
所述抗原修复试剂为柠檬酸盐抗原修复液(中杉金桥,pH 6.0);
所述过氧化酶抑制试剂为浓度为3%(v/v)的H2O2溶液(Thermo);
所述封闭试剂为含10%(v/v)山羊血清的1×封闭缓冲液(Thermo);
所述第一单克隆抗体标记试剂为以PTPRC基因对应的CD45蛋白为第一靶标蛋白的第一单克隆抗体;所述第二单克隆抗体标记试剂为以TP63基因对应的P63蛋白为第二靶标蛋白的第二单克隆抗体;所述第三单克隆抗体标记试剂为以TTF-1基因对应的TTF1蛋白为第三靶标蛋白的第三单克隆抗体;所述第四单克隆抗体标记试剂为以PECAM1基因对应的CD31蛋白为第四靶标蛋白的第四单克隆抗体组成;所述第一单克隆抗体为CD45单克隆抗体(Thermo);所述第二单克隆抗体为P63单克隆抗体(Thermo);所述第三单克隆抗体为TTF1单克隆抗体(Thermo);所述第四单克隆抗体为CD31单克隆抗体(Thermo);
所述过氧化酶标记试剂由多聚辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗(Thermo)或多聚辣根过氧化物酶偶联鼠抗兔二抗(迈新)组成;
所述酪胺信号放大试剂由酪胺工作溶液和酪胺反应终止溶液组成;所述酪胺工作溶液(510μL)由所述酪胺工作溶液(510μL)由500μL 1×反应缓冲液(Thermo)、5μL质量分数为0.03%的H2O2溶液(Thermo,溶剂为水)和5μL Alexa FluorTMtyramide reagent(Thermo)组成;所述酪胺反应终止溶液(550μL)由50μL 20×反应终止液(Thermo)和500μL1×DEPC-PBS溶液(武汉塞维尔)组成(酪胺分子上荧光基团根据原位测序的基因表达结果来选择,先通过原位测序的基因表达结果来推断蛋白质的表达量情况,再根据表达量的多和少匹配最合适的荧光基团,例如,表达量差异较大的两种蛋白之间尽量选择激发波长不重叠或距离较远的荧光基团);
所述封片剂为抗淬灭封片剂;所述抗淬灭封片剂为使用SlowFade试剂稀释至浓度为0.5μg/μL的DAPI封片剂溶液(Thermo,DAPI封片剂的母液浓度为10μg/mL)。
实验例5:在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的可行性验证
本实施例提供了使用实施例3的试剂盒在石蜡包埋组织切片上对多重靶标核酸和多重靶标蛋白进行共检测的可行性验证实验,此实验以临床肺鳞癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)和临床肺腺癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)作为待测样本,检测待测样本中PECAM1基因、TTF-1基因、TP63基因和PTPRC基因的表达水平(mRNA)以及CD45蛋白、P63蛋白、TTF1蛋白和CD31蛋白的表达水平,实验过程如下:
1、靶标核酸的检测
样本预处理步骤:
将组织切片于60℃烘箱中烤片30min;烤片后置于通风橱内使切片温度降至室温(25℃),置于二甲苯Ⅰ缸中中浸泡15min;随后取出切片,置于二甲苯Ⅱ缸中浸泡10min;取出切片,依次置于100%(v/v)乙醇、95%(v/v)乙醇、70%(v/v)乙醇中浸泡以附水,每次浸泡2min;用DEPC水覆盖组织5min;移去组织切片上的DEPC水,用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为2min;在组织切片上滴加4%(w/v,g/100mL)多聚甲醛(碧云天)至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育10min对组织进行固定;回收组织切片上的废液,并在室温(25℃)下用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为2min;将浓度为0.1M的盐酸溶液于烘箱内预热至37℃;在预热后的浓度为0.1M的盐酸溶液内加入0.3mg/mL的胃蛋白酶(Sigma)后震荡离心,得到透化剂;将透化剂滴加于组织切片上至完全覆盖组织样本后,在37℃条件下孵育30min对组织进行透化;移去组织切片上的废液,并室温(25℃)下用DEPC水对组织切片进行清洗,清洗时间为5min;随后用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为2min;将组织切片依次置于70%(v/v)乙醇、95%(v/v)乙醇、无水乙醇中浸泡以脱水,每次浸泡1min;待组织切片完全干燥后,根据HE染色结果在肿瘤区域画出组化圈;
双连接探针杂交步骤:
在组织切片上滴加双连接探针杂交试剂至完全覆盖组织样本,在46℃下孵育4h,使双连接探针与靶标RNA充分杂交;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗3次,每次30s;随后用含0.5%(w/v,g/100mL)甲酰胺(Sigma)的2×SSC缓冲液(Sigma)在37℃下清洗组织切片3次,每次30s;清洗结束后用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
双连接探针连接步骤:
在组织切片上滴加双连接探针连接试剂至完全覆盖组织样本,在37℃下孵育30min;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
双连接探针环化步骤:
在组织切片上滴加双连接探针环化试剂至完全覆盖组织样本,在37℃下孵育30min;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
滚环扩增步骤:
在组织切片上滴加滚环扩增试剂至完全覆盖组织样本,在30℃下孵育过夜(16h);孵育结束后,用PBST缓冲液清洗3次,每次30s;在组织切片上滴加4%(w/v,g/100mL)多聚甲醛(碧云天)至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育10min对组织进行固定;回收组织切片上的废液,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
检测探针杂交步骤:
在组织切片上滴加第一检测探针杂交试剂至完全覆盖组织样本,在30℃下孵育45min;孵育结束后,用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;
封片步骤:
将组织切片于室温(25℃)下干燥;在组织切片上滴加20μL DAPI封片剂溶液后,盖上干净的盖玻片进行封片;
探针洗脱步骤:
将组织切片置于DEPC-PBS溶液中浸泡至盖玻片脱落;移去盖玻片后用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;用含0.1%(w/v,g/100mL)TritonX和80%(w/v,g/100mL)甲酰胺的DEPC水在37℃下清洗组织切片2次,每次10min;随后用100%甲酰胺在37℃下清洗组织切片,清洗时间为10min;随后用PBST缓冲液清洗组织样本3次,每次30s;
检测步骤:
通过Leica扫描仪观察样本上的靶标RNA的表达量与位置,拍摄图片后进行定量分析;
下一个检测探针杂交步骤:
重复检测探针杂交步骤、封片步骤、探针洗脱步骤和检测步骤,共重复三次;重复检测探针杂交步骤时,分别使用第二检测探针杂交试剂、第三检测探针杂交试剂和第四检测探针杂交试剂替换第一检测探针杂交试剂;最后一次重复时,封片步骤结束后无需进行探针洗脱步骤,直接进行检测步骤;
检测步骤所得定量分析结果见图9。
2、靶标蛋白的检测
抗原修复步骤:
将进行原位测序的组织切片置于DEPC-PBS溶液中浸泡至盖玻片脱落;移去盖玻片后用PBST缓冲液清洗组织切片3次,每次30s;将组织切片置于盛满柠檬酸盐抗原修复液的玻璃缸中,于微波炉中火煮8min至沸,停火8min保温,随后转中小火煮7min,室温(25℃)自然冷却;在室温(25℃)条件下,用含0.1%(v/v)Tween 20的DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次5min;随后再用DEPC-PBS溶液对组织切片进行清洗,清洗时间为5min;
过氧化酶抑制步骤:
在组织切片上滴加浓度为3%(v/v)的H2O2溶液至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育60min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次30s;在组织切片上滴加封闭试剂至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育60min;
单克隆抗体标记步骤:
用1×封闭缓冲液稀释第一单克隆抗体、第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体,稀释比例分别为1:500、1:50、1:500和1:1000(单克隆抗体:1×封闭缓冲液);在组织切片上滴加经稀释的第一单克隆抗体至完全覆盖组织切片,在室温(25℃)下孵育60min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次10min;
过氧化酶标记步骤:
在组织切片上滴加多聚辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔二抗(Thermo)至完全覆盖组织切片,在室温(25℃)下孵育60min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次10min;
酪胺标记步骤:
在每张组织切片上滴加酪胺工作液(CD45单克隆抗体使用Alexa FluorTM546作为酪胺分子上荧光基团)至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育8min,孵育完成后移去切片上的酪胺工作液;在组织切片上滴加酪胺反应终止液至完全覆盖组织样本,在室温(25℃)下孵育5min后用DEPC-PBS溶液清洗3次,每次30s;
抗体洗脱步骤:
用蒸馏水稀释柠檬酸盐抗原修复液,稀释比例为1:20(柠檬酸盐抗原修复液:蒸馏水);将组织切片置于200mL经稀释的柠檬酸盐抗原修复液中,于微波炉大火煮8min至沸,随后转小火煮15min,在室温(25℃)条件下自然冷却;在室温(25℃)条件下,用DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次30s;
下一个单克隆抗体标记步骤:
用1×封闭缓冲液稀释第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体,稀释比例分别为1:50、1:140和1:200(单克隆抗体:1×封闭缓冲液);重复过氧化酶抑制步骤、封闭步骤、单克隆抗体标记步骤、过氧化酶标记步骤、酪胺标记步骤和抗体洗脱步骤,共重复三次;重复单克隆抗体标记步骤时,分别使用经稀释的第二单克隆抗体、第三单克隆抗体和第四单克隆抗体替换经稀释的第一单克隆抗体;最后一次重复时,酪胺标记步骤结束后无需进行抗体洗脱步骤(P63单克隆抗体使用Alexa FluorTM647作为酪胺分子上荧光基团、TTF1单克隆抗体使用Alexa FluorTM488作为酪胺分子上荧光基团、CD31单克隆抗体使用Alexa FluorTM594作为酪胺分子上荧光基团);
封片步骤:
将组织切片于室温(25℃)下干燥;在组织切片上滴加20μL DAPI封片剂溶液后,盖上干净的盖玻片进行封片;
检测步骤:
通过Leica倒置荧光显微镜观察组织切片上靶标蛋白的信号点质量并进行定位定量分析,检测步骤所得定位定量分析结果见图9。
由图9可知,在进行原位测序后的石蜡包埋组织切片上观察到靶标蛋白的表达位置与原位测序实验中靶标RNA的表达位置大部分重叠,证明实施例3的试剂盒在石蜡包埋组织切片上共检测靶标核酸和靶标蛋白具有可行性。
实验例6:抗体洗脱条件对共检测试剂盒检测效果的影响
本实施例提供了抗体洗脱条件对实施例3的共检测试剂盒检测效果的影响实验,此实验以临床肺鳞癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)和临床肺腺癌组织样本(石蜡包埋组织切片,取自厦门复旦中山医院)作为待测样本,检测待测样本中TTF-1基因、TP63基因和PTPRC基因的表达水平(mRNA)以及CD45蛋白、P63蛋白、TTF1蛋白和CD31蛋白的表达水平,实验过程如下:
在实验例5的基础上,将抗体洗脱步骤替换为:
A组:用蒸馏水稀释柠檬酸盐抗原修复液,稀释比例为1:20(柠檬酸盐抗原修复液:蒸馏水);将组织切片置于500mL经稀释的柠檬酸盐抗原修复液中,于微波炉大火煮8min至沸,随后转小火煮15min,在室温(25℃)条件下自然冷却;在室温(25℃)条件下,用DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次30s(抗原热修复法);
B组:用蒸馏水稀释柠檬酸盐抗原修复液,稀释比例为1:20(柠檬酸盐抗原修复液:蒸馏水);将组织切片置于500mL经稀释的柠檬酸盐抗原修复液中,于微波炉大火煮6min至沸,随后转小火煮15min,在室温(25℃)条件下自然冷却;在室温(25℃)条件下,用DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次30s(抗原热修复法);
C组:用蒸馏水稀释柠檬酸盐抗原修复液,稀释比例为1:20(柠檬酸盐抗原修复液:蒸馏水);将组织切片置于500mL经稀释的柠檬酸盐抗原修复液中,于微波炉大火煮3min至沸,随后转小火煮15min,在室温(25℃)条件下自然冷却;在室温(25℃)条件下,用DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次30s(抗原热修复法);
D组:用蒸馏水稀释柠檬酸盐抗原修复液,稀释比例为1:20(柠檬酸盐抗原修复液:蒸馏水);将组织切片置于200mL经稀释的柠檬酸盐抗原修复液中,于微波炉大火煮2min至沸,随后转小火煮15min,在室温(25℃)条件下自然冷却;在室温(25℃)条件下,用DEPC-PBS溶液对组织切片清洗2次,每次30s(抗原热修复法);
E组:将SBT-4试剂与100%甲酰胺按照体积比1:1混合,得到抗体洗脱液;在组织切片上滴加抗体洗脱液至完全覆盖组织样本,在60℃条件下孵育8min;
其中,SBT-4试剂为含0.1×SSC缓冲液(Sigma)、40mM Tris-盐酸缓冲液(PH 7.5)和0.1%(w/v,g/mL)SDS(Sigma)的DEPC水。
检测步骤所得定量分析结果见图10~14。
由图10~14可知,相比于用抗体洗脱液进行抗体洗脱,使用抗原热修复法进行抗体洗脱时的抗体洗脱的更为干净,具有更好的洗脱效果;相比于抗原热修复时间为8min、6min和2min,抗原热修复时间为3min时细胞核形变程度更小,且抗体洗脱效果更好。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种核酸与蛋白质的共检测试剂盒,其特征在于,所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒包括双连接探针杂交试剂、双连接探针连接试剂、双连接探针环化试剂、滚环扩增试剂、至少一种检测探针杂交试剂、过氧化酶抑制试剂、至少一种抗体标记试剂、过氧化酶标记试剂、酪胺信号放大试剂和抗原修复试剂;所述双连接探针杂交试剂包括至少一组双连接探针组;所述双连接探针组能够与靶标核酸特异性结合,形成杂合体;所述双连接探针连接试剂用于将杂合体连接;所述双连接探针环化试剂包括夹板序列,用于将杂合体环化,形成环化产物,并引发以环化产物为模板的滚环扩增;所述滚环扩增试剂用于将环化产物滚环扩增,形成环状扩增产物;所述检测探针杂交试剂包括检测探针组;所述检测探针组能够与环状扩增产物特异性结合,并且,所述检测探针组的探针上偶联有第一荧光标记物;所述过氧化酶抑制试剂用于抑制内源性过氧化物酶的活性;所述抗体标记试剂包括第一抗体;所述第一抗体能够与靶标蛋白特异性结合;所述过氧化酶标记试剂包括偶联有过氧化物酶的第二抗体;所述第二抗体能够与第一抗体特异性结合;所述酪胺信号放大试剂包括酪胺工作溶液和酪胺反应终止溶液;所述酪胺工作溶液包括酪胺分子和过氧化氢;所述酪胺分子能够在过氧化酶和过氧化氢的催化作用下通过酪胺分子和蛋白残基之间的共价结合沉淀在靶标蛋白周围,并且,所述酪胺分子上偶联有第二荧光标记物;所述抗原修复试剂用于洗脱靶标蛋白上标记的第一抗体。
2.如权利要求1所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒,其特征在于,所述检测探针杂交试剂还包括至少一种锚定序列;所述锚定序列用于与滚环扩增产物杂交,使得检测探针组能够通过锚定序列与环状扩增产物特异性结合。
3.如权利要求1或2所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒,其特征在于,所述酪胺信号放大试剂还包括酪胺反应终止溶液;所述酪胺反应终止溶液用于终止酪胺分子与靶标蛋白之间的共价结合。
4.如权利要求1~3任一项所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒,其特征在于,所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒还包括封闭试剂;所述封闭试剂用于减少第一抗体的非特异结合位点,以提高第一抗体与靶标蛋白之间的特异性结合能力。
5.如权利要求1~4任一项所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒,其特征在于,所述核酸与蛋白质的共检测试剂盒还包括封片剂;所述封片剂为含DAPI的抗淬灭封片剂。
6.如权利要求1~5任一项所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒,其特征在于,所述靶标核酸包括TTF-1基因的mRNA、TP63基因的mRNA、PTPRC基因的mRNA和/或PECAM1基因的mRNA。
7.如权利要求1~6任一项所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒,其特征在于,所述靶标蛋白包括CD45蛋白、P63蛋白、TTF1蛋白、CD31蛋白、VIM蛋白和/或CK-PAN蛋白。
8.一种核酸与蛋白质的共检测方法,其特征在于,所述方法非疾病的诊断和治疗目的,所述方法使用权利要求1~7任一项所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒对待测样本进行检测。
9.如权利要求8所述的核酸与蛋白质的共检测方法,其特征在于,所述方法包含如下步骤:
双连接探针杂交步骤:在组织切片上滴加双连接探针杂交试剂至完全覆盖组织样本后孵育,使双连接探针与靶标核酸充分杂交;孵育结束后,清洗组织切片;
双连接探针连接步骤:组织切片上滴加双连接探针连接试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
双连接探针环化步骤:在组织切片上滴加双连接探针环化试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
滚环扩增步骤:在组织切片上滴加滚环扩增试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;在组织切片上滴加多聚甲醛溶液至完全覆盖组织样本后孵育以对组织进行固定;回收组织切片上的废液后清洗组织切片;
检测探针杂交步骤:在组织切片上滴加检测探针杂交试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
封片步骤:先将组织切片干燥,再在组织切片上滴加封片剂,最后盖上盖玻片以进行封片;
探针洗脱步骤:将组织切片进行脱片;移去盖玻片后清洗组织切片;洗脱组织样本上连接的检测探针组;检测探针组洗脱结束后,用缓冲液清洗组织切片;
靶标核酸的检测步骤:通过检测探针组中探针连接的第一荧光标记物观察样本上的靶标核酸的表达量与位置,拍摄图片后进行定量分析;
下一个检测探针杂交步骤:重复检测探针杂交步骤、封片步骤、探针洗脱步骤和靶标核酸的检测步骤,重复次数=需检测靶标核酸的数量-1;重复检测探针杂交步骤时,根据靶标核酸的不同使用含有不同检测探针组的检测探针杂交试剂;最后一次重复时,封片步骤结束后无需进行探针洗脱步骤,直接进行靶标核酸的检测步骤;
抗原修复步骤:将组织切片进行脱片;移去盖玻片后清洗组织切片;将组织切片浸泡于抗原修复试剂中加热后冷却;冷却结束后,对组织切片进行清洗;
过氧化酶抑制步骤:在组织切片上滴加过氧化酶抑制试剂至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
封闭步骤:在组织切片上滴加封闭试剂至完全覆盖组织样本后孵育;
单克隆抗体标记步骤:在组织切片上滴加第一抗体至完全覆盖组织切片后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
过氧化酶标记步骤:在组织切片上滴加过氧化酶标记试剂至完全覆盖组织切片后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
酪胺标记步骤:在组织切片上滴加酪胺工作液至完全覆盖组织样本后孵育;孵育完成后,移去切片上的酪胺工作液;在组织切片上滴加酪胺反应终止液至完全覆盖组织样本后孵育;孵育结束后,清洗组织切片;
抗体洗脱步骤:将组织切片浸泡于抗原修复试剂中加热后冷却;冷却结束后,对组织切片进行清洗;
下一个单克隆抗体标记步骤:重复过氧化酶抑制步骤、封闭步骤、单克隆抗体标记步骤、过氧化酶标记步骤、酪胺标记步骤和抗体洗脱步骤,重复次数=需检测靶标蛋白的数量-1;重复单克隆抗体标记步骤时,根据靶标蛋白的不同使用不同的第一抗体;最后一次重复时,酪胺标记步骤结束后无需进行抗体洗脱步骤;
封片步骤:先将组织切片干燥,再在组织切片上滴加封片剂,最后盖上盖玻片以进行封片;
靶标蛋白的检测步骤:通过酪胺分子上偶联的第二荧光标记物观察组织切片上靶标蛋白的信号点质量并进行定量分析。
10.权利要求1~7任一项所述的核酸与蛋白质的共检测试剂盒或权利要求8或9所述的核酸与蛋白质的共检测方法在靶标核酸和/或靶标蛋白检测中的应用,其特征在于,所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN117887820A (zh) * | 2024-03-15 | 2024-04-16 | 北京大学第三医院(北京大学第三临床医学院) | 一种同时原位荧光检测人类rna、dna、蛋白质的方法 |
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2023
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