CN112105743A - 复用型催化报告分子沉积 - Google Patents

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S·亨内克
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Abstract

提供了一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括复用型催化报告分子沉积(CARD)。

Description

复用型催化报告分子沉积
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月8日提交的美国临时申请号62/682,765以及2018年11月13日提交的美国临时申请号62/760,450的优先权益，所有申请的内容均出于任何目的以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本申请总体上涉及分析物(例如，靶标)检测领域，并且具体地涉及使用催化报告分子沉积(CARD)的检测方法。
背景技术
对于研究和医学应用，可能需要检测单个细胞或组织样品内的多个生物学相关分子。免疫学方法通常用于此目的。此类方法总体涉及将抗体与样品中的目标分子结合，生成与抗体相关联的可检测信号以使得每个目标分子彼此区分开，以及使用分析方法检测信号。在此类免疫学方法中已使用催化报告分子沉积(CARD)来产生与抗体相关联的增强信号。CARD的典型工作流程是将靶标分子-特异性抗体施用于样品，然后施用识别一级抗体的二级抗体。二级抗体连接到酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶)，所述酶将底物转化为与附近的酚类残基结合的反应剂(例如酪氨酸)。因为细胞样品中酚类残基十分丰富，因此结果是在一级抗体附近有密集标记。
CARD的一个技术问题是难以从样品中去除二级抗体。当需要使用额外一级抗体来探测相同样品中的额外目标分子时，就会出现此问题。可以使用加热或微波来去除二级抗体，但是此方法可损坏样品，从而降低后续测试的质量。此外，此处理经常是耗时的。
因此，一种避免严苛的样品处理并允许在单个样品中检测多种目标分子的方法将是有用的CARD方法学改进。
发明内容
根据说明书，提供一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，以复用催化报告分子沉积(catalyzed reporter deposition，CARD)并实现更高水平的复用检测。
在一个实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还包括在成像的步骤(8)之前重复步骤(3)-(7)。
在一些实施方案中，在步骤(5)中，使包含所述可检测地标记的底物的所述底物缀合物与所述酶反应以形成活化的底物缀合物，并且所述活化的底物缀合物与所述活化的底物缀合物的受体结合。此外，所述活化的底物缀合物的所述受体可以存在于所述样品中，其固定化在固体支撑物上，从而导致所述可检测标记沉积。
在另一个实施方案中，所述方法还可包括(10)在步骤(8)之后通过释放所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链或其一部分。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述结合对的所述第一成员使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与任选地使用第三可释放接头来连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用第四可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地释放所述结合对的所述结合的第一成员或第二成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还可包括(11)在步骤(9)之后通过裂解所述标记与所述底物之间的所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(11)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链或其一部分。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第四可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
在一些实施方案中，使用可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，在步骤(10)中，通过裂解步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和步骤(8)的所述可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，不使用可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，通过使核酸链去杂化来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，通过使与来自步骤(5)的所述核酸链结合的来自步骤(8)的所述核酸链去杂化来释放所述结合的标记。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增步骤(5)的所述核酸链结合底物的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
在一些实施方案中，所述方法还可包括首先扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)并且其次扩增步骤(5)的所述核酸链结合底物的所述核酸链。在一些实施方案中，第一扩增步骤在步骤(3)之前进行；并且第二扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与HRP结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述HRP使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物；
(7)任选地对所述样品进行成像以检测可检测的标记；
(8)任选地释放所述结合的标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(7)之前重复步骤(1)-(6)或其任何子集。
在一些实施方案中，在步骤(5)之后，将酚部分酶促地转化为活化态，从而导致所述标记沉积。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地使所述结合的酶失活；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还包括(11)在步骤(9)之后通过裂解所述标记与所述底物之间的所述可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(9)和(11)中的任一者。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第一可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第二可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
在一些实施方案中，使用可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，在步骤(10)中，通过裂解步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和步骤(8)的所述可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，不使用可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，通过使核酸链去杂化来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，通过使与来自步骤(5)的所述核酸链结合的来自步骤(8)的所述核酸链去杂化来释放所述结合的标记。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增步骤(5)的所述核酸链结合底物的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
在一些实施方案中，所述方法还可包括首先扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)并且其次扩增步骤(5)的所述核酸链结合底物的所述核酸链。在一些实施方案中，第一扩增步骤在步骤(3)之前进行；并且第二扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与HRP结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物；
(7)任选地使所述HRP失活；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其子集。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，使用酶失活剂使所述酶失活，其中所述酶失活剂包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、还原型谷胱甘肽、过氧化物、氰化物、氟化物或叠氮化物。
在一些实施方案中，使所述结合的酶失活的步骤(7)进行少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟或少于或等于1分钟。在一些实施方案中，使所述结合的酶失活的步骤(7)进行少于20分钟。在一些实施方案中，使所述结合的酶失活的步骤(7)进行少于10分钟。在一些实施方案中，使所述结合的酶失活的步骤(7)进行少于5分钟。在一些实施方案中，使所述结合的酶失活的步骤(7)进行少于2分钟。在一些实施方案中，使所述结合的酶失活的步骤(7)进行少于或等于1分钟。
额外的目的和优点部分将在以下描述中列出，并且部分将由描述而变得显而易见，或可以通过实践来学习。所述目的和优点将借助在所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现和达到。
应当理解，前述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和说明性的并且不限制本权利要求书。
并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图说明了一种(若干种)实施方案，并且连同描述一起用来解释本文所述的原理。
附图说明
专利或申请文件包含至少一张彩色附图。根据要求并支付必需费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A-图1B示出了复用型催化报告分子沉积(CARD)的两种示意图。图1A提供不涉及堆积的示意图。图1B提供涉及堆积的示意图。
图2提供使用结合对进行的复用型催化报告分子沉积(CARD)的示意图，其中所述结合对是核酸链(其是条形码或包含条形码)和互补核酸链。
图3示出了示例性实施方案，其中使用本文所述的复用方法检测两个靶标分子。
图4A示出了示例性实施方案，其中所述酶被裂解。
图4B示出了示例性实施方案，其中使所述酶失活。
图5示出了示例性实施方案，其中使用底物条形码。
图6示出了用于合成示例性底物条形码的方案。
图7示出了根据实施例1使用荧光酪酰胺试剂的顺序沉积获得的CD8、CD68、PD-L1和CK靶标的四重图像(未示出核复染剂)。CD8示出为绿色；CD68示出为红色；PD-L1以青色示出；CK以洋红色示出。未示出所述核复染剂。
图8A-图8B示出了根据实施例2使用TCEP处理的HRP酶的失活(图8A)对比未使用TCEP处理的对照(图9B)的比较。
图9示出了根据实施例3使用核酸条形码的顺序沉积获得的CD8、CD68、PD-L1和CK靶标的四重图像。CD8示出为绿色；CD68示出为红色；PD-L1以青色示出；CK以洋红色示出。未示出所述核复染剂。
具体实施方式
I.定义
术语“沉积”意指活化的底物缀合物与受体的定向结合，这是由形成如下文所述的特异性结合对的相互作用导致的。
术语“受体”意指通过形成如下文所述的特异性结合对的相互作用而将与活化的底物缀合物结合的位点。
术语“活化的底物缀合物”意指底物缀合物已由报告酶所引发以与受体结合。
术语“可检测标记的”底物缀合物意指底物可以偶合至可检测标记(术语“报告分子”可以互换使用)或特异性结合对的未标记的第一成员，以促进沉积后的检测。当底物偶合至未标记的特异性结合对的成员时，在沉积之后，底物特异性结合对复合物与偶合至报告分子(或标记)的结合对的第二成员反应。可替代地，底物特异性结合对复合物可以在沉积之前与可检测标记的特异性结合对的第二成员进行预反应。
如本文所述，术语“扩增(amplifying/amplification)”是指增加核酸序列(诸如核酸链或其一部分(诸如条形码))的拷贝数，使得核酸序列的多个拷贝连接到相应的靶标特异性结合配偶体。可以使用本领域已知的各种扩增方法来增加核酸序列的拷贝数。核酸扩增方法的实例包括杂交链反应(HCR)(Dirks等,2014,PMID:15492210,24712299)、基于DNA发夹的树突聚合反应(HDR)(Yin等,2008,PMID 18202654)、滚环扩增(RCA)、引物交换反应(PER)以及其他核酸扩增方法，例如，如WO 2018/107054；WO 2017/143006；WO 2018/132392A2中所述，所述专利各自的内容以引用的方式并入本文。这种扩增不同于由CARD产生的信号扩增。
II.复用型催化报告分子沉积的方法
本申请公开了一种用于复用催化报告分子沉积(CARD)的方法。在图1A、图1B、图2和图3中提供了复用型催化报告分子沉积的示意图。
根据说明书，在一些实施方案中，一种测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体任选地使用可释放接头来连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与酶或特异性结合对的成员接触用于进行后续酶标记，所述酶或成员连接到与靶标特异性结合配偶体上的链互补的核酸链，其中如果没有使用可释放接头来连接与靶标特异性结合配偶体结合的核酸链，则使用可释放接头来将酶或特异性结合对的成员连接到步骤(3)的互补链，并且如果使用可释放接头来连接与靶标特异性结合配偶体结合的核酸链，则任选地使用可释放接头来将酶或特异性结合对的成员连接到步骤(3)的互补链，
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶或特异性结合对成员；
(5)如果在步骤(3)中利用特异性结合对的成员，则使所述样品与任选地使用可释放接头来连接到酶的特异性结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述特异性结合对的未结合的酶连接的第二成员；
(6)使所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物，
(8)任选地释放所述结合的酶、第一特异性结合对成员或第二特异性结合对成员，
(9)任选地检测结合的可检测标记，
(10)任选地重复步骤(1)–(9)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在检测的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
A.使用与探针链结合的酶的复用CARD
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。
在一些实施方案中，在步骤(5)中，使包含所述可检测地标记的底物的所述底物缀合物与所述酶反应以形成活化的底物缀合物，并且所述活化的底物缀合物与所述活化的底物缀合物的受体结合。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，所述活化的底物缀合物的所述受体存在于所述样品中，从而导致所述可检测标记沉积。
在一些实施方案中，所有标记都被去除，并且以上标记步骤再次开始(“堆积”)以实现另一轮复用。在一些实施方案中，所述方法还包括(10)在所述成像步骤(8)之后释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集。在一些实施方案中，使用可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，在步骤(10)中，通过裂解第三可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，不使用可释放接头来释放所述结合的标记。
图1A-图1B示出了不涉及堆积(图1A)和涉及堆积(图1B)的复用CARD的方法的实施方案。
在如图1A所示的无堆积的复用CARD中，首先提供与靶标特异性结合配偶体(抗体，101)结合的样品(组织，100)，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到包含条形码(条形码，102)的核酸链，并且使所述样品与连接到核酸链(探针，104)的酶(103)接触，所述核酸链与包含连接到抗体(101)的条形码(条形码，102)的核酸链互补。包含条形码(条形码，102)的核酸链使用第一可释放接头(105)来连接到抗体(101)。可替代地，酶(103)使用第二可释放接头(106)连接到互补核酸链，所述互补核酸链包含与条形码(探针，104)互补的序列。任选地，去除连接到互补核酸链的未结合的酶。
然后，使样品(100)与含有可检测标记(108)的底物缀合物(标记的底物，107)接触。使可检测的标记与酶反应以形成活化的底物缀合物，并且活化的底物缀合物与样品中存在的活化底物缀合物的受体结合，从而导致可检测的标记沉积在样品(108)上。任选地通过洗涤步骤来去除未结合的底物缀合物(107)。然后，通过使用裂解剂裂解可释放接头来释放酶。根据第一可释放接头(105)或第二可释放接头(106)的使用，在可释放接头裂解后，去除连接到互补核酸链(探针，104)的酶(103)(左下)或裂解所述核酸链(右下)，使得酶、连接到抗体(101)的包含条形码(条形码，102)的核酸链和连接到酶的互补核酸链(探针，104)被去除。对于每个靶标，可重复可检测标记的以上沉积。然后，对所述样品进行成像以检测不同靶标的结合的可检测标记。
在如图1B所示的使用堆积的复用CARD中，可以使用第三可释放接头(109)来连接底物(107)和标记(108)；并且在成像步骤之后，通过裂解第三可释放接头(109)来去除所有结合的标记，并且重复上文所述的步骤以使用于检测更多靶标的标记沉积(“堆积”)。
图3还示出了示例性实施方案，其中使用本文所述的方法来检测两个靶标分子。在组织样品中，将两个靶标1和2与相应的抗体结合，每个抗体连接到不同的核酸链(步骤A)。将连接到核酸链(酶探针1)的酶(其中所述核酸链与连接到靶标1的抗体的核酸链互补)与连接到靶标1的抗体的核酸链结合，并且任选地洗涤未结合的酶探针(步骤B)。然后，将标记的底物加入到样品中(步骤C)，并使其与酶反应以形成活化的底物缀合物。将活化的底物缀合物与样品中存在的活化的底物缀合物的受体结合，从而导致可检测标记沉积(步骤D)。通过使用裂解剂裂解可释放接头(步骤E)或通过酶抑制剂(或酶减活剂)使酶失活(步骤F)来释放酶探针1。在步骤3中，根据可释放接头的位置，去除酶，或将条形码和连接到酶的探针也与酶一起去除(步骤G)。对于靶标2，可重复标记的以上沉积(步骤H和I)。然后，对所述样品进行成像以检测两个靶标的结合的可检测标记。任选地，通过使用本领域熟知的方法(例如，化学漂白、光漂白和/或光化学漂白)，必要时可降低来自标记的信号。
B.使用结合对的复用CARD
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述结合对的所述第一成员使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与任选地使用第三可释放接头来连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用第四可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地释放所述结合对的所述结合的第一成员或第二成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，对于堆积，所述方法还包括(11)任选地释放所述结合的可检测标记。在一些实施方案中，通过释放所述标记与所述底物之间的第三可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，不使用可释放接头来释放所述结合的标记。
在一些实施方案中，所述方法还包括(11)在所述成像步骤(9)之后通过释放所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且还包括任选地重复步骤(1)-(11)或其任何子集。在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第四可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
在一些实施方案中，使用可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，通过裂解步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和步骤(8)的所述可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，不使用可释放接头来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，通过使彼此结合的核酸链去杂化来释放所述结合的标记。在一些实施方案中，通过使与步骤(5)中的所述核酸链结合的步骤(8)中的所述核酸链去杂化(dehybridzation)来释放所述结合的标记。可以通过本领域已知的常规方法，包括加热、添加离液剂(例如尿素、甲酰胺和氯化胍)和低离子强度来实现核酸的去杂化。提高温度或降低含有核酸链的介质的离子强度破坏了核酸链之间的结合亲和力。加热、一种或多种离液剂和低离子强度可各自独立地用于使核酸去杂交；或者可以使用这些条件中一种或多种的组合。如本文所用，“低离子强度”意指由介质中的盐浓度的量所测量的小于300mM的介质离子强度。在一个实施方案中，盐浓度低于使Tm低于环境温度所需的浓度，例如低于70mM。杂交速率随着盐浓度降低而降低。可以通过常规方法，例如通过添加水来降低盐(例如，Na+)浓度来实现低离子强度下的去杂化。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增步骤(5)的所述核酸链结合底物的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
在一些实施方案中，所述方法还可包括首先扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)并且其次扩增步骤(5)的所述核酸链结合底物的所述核酸链。在一些实施方案中，第一扩增步骤在步骤(3)之前进行；并且第二扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
图2示出了使用结合对的复用型催化报告分子沉积(CARD)的方法的实施方案，其中所述结合对是核酸链(其是条形码或包含条形码)和互补核酸链。
首先，提供与靶标特异性结合配偶体(抗体，201)结合的样品(组织，200)，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到包含条形码(条形码，202)的核酸链，并且使所述样品与连接到核酸链(探针，204)的酶(203)接触，所述核酸链与连接到抗体(201)的核酸链(条形码，202)互补。所述核酸链(条形码，202)使用第一可释放接头(205)来连接到所述抗体(201)。可替代地，所述酶(203)使用第二可释放接头(206)来连接到所述互补核酸链(探针，204)。任选地，去除连接到互补核酸链(202)的未结合的酶(203)。
然后，使所述样品(200)与核酸链结合的底物(217)接触，其中所述底物(217)和核酸链(227)沉积在组织上。然后，通过使用裂解剂(如TCEP、DTT或高碘酸盐)裂解可释放接头来去除未结合的底物缀合物和/或结合的酶。对于每个靶标，可重复核酸结合底物的以上沉积。对于最后一轮沉积，洗涤步骤是任选的。
然后，使组织样品(200)与核酸链结合的可检测标记(208)接触，所述可检测标记任选地使用第四可释放接头(209)来连接，其中所述核酸链(探针，208)是与探针(227)互补的所述核酸链的特异性结合对成员。如果提供与四个不同的靶标结合的四种初级抗体，则提供四种不同的标记探针(208)。然后，对所述组织样品(200)进行成像以检测与不同靶标结合的可检测标记。为了检测额外的靶标，在成像步骤之后，通过洗涤步骤去除所有结合的标记，以使用裂解剂裂解在所述标记与所述探针(208)之间的第三可释放接头(209)，并且重复上文所述的步骤以使用于检测更多靶标的标记沉积(“堆积”)。根据需要重复上文所述的步骤或其任何子集以用于检测更多靶标。
C.使用酚类底物的实施方案
在一些实施方案中，所述复用CARD方法是已经复用的酪酰胺信号扩增(TSA)方法。还可以使用TSA扩增方法，其中荧光团可以很容易被漂白。例如，许多花菁荧光团和Alexa荧光团在酸性或碱性条件下很容易被过氧化氢漂白(PMID：26399630)。可替代地，可以合成在酪酰胺与荧光团之间含有可裂解键的TSA染料。在此情况下，可以通过裂解此键并洗涤来使荧光团失活。
在一些实施方案中，一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法包括：(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，(3)使所述样品与HRP结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且(ii)所述HRP使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；(6)任选地去除未结合的底物；(7)任选地对所述样品进行成像以检测样品；(8)任选地释放所述结合的标记；以及(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(7)之前重复步骤(1)-(6)或其任何子集。
在一些实施方案中，在步骤(5)之后，将酚类底物酶促地转化为活化态，从而导致所述标记沉积。在一些实施方案中，所述酚类底物是酪酰胺。
在一些实施方案中，所述方法还可包括扩增连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。在一些实施方案中，所述扩增步骤在使所述样品与HRP结合的核酸链接触的步骤(3)之前进行，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补。催化报告分子沉积是一种信号扩增方法，并且其利用直接或间接偶合至靶标特异性结合配偶体的酶，所述酶催化包含可检测地标记的底物的底物缀合物转化为活化的底物缀合物(与活化的底物缀合物的受体结合)，从而导致可检测标记沉积。先前的催化报告分子沉积的实例描述于例如美国专利号5,196,306、5,583,001和5,731,158中。
催化报告分子沉积已被利用来增强免疫组织化学、免疫细胞化学、原位杂交、ELISA、流式细胞仪、电子显微镜和其他应用中的信号。
然而，在先前的催化报告分子沉积中存在若干种限制。限制之一是复用(即在同一测定中检测多个测定靶标)的能力。当在测定中利用来自相同物种的抗体时，所述限制加重。已通过使用催化报告分子沉积来检测一个靶标，并且对第二个靶标进行标准检测来完成利用相同种类抗体的两个靶标的检测(Shindler J.Histochem Cytochem 1996第44卷第11期1331-1335)。
在先前的使用催化报告分子沉积来复用免疫组织化学测定的尝试中，在每轮报告分子沉积之间对组织切片进行微波(Toth J.Histochem Cytochem 2007第55卷(6)545-554)。微波去除所述抗体和报告酶，而所述可检测标记保持完整。因为需要依次地添加每种抗体和报告分子，然后通过微波来去除它们，因此微波增加了许多步骤。作为使用微波的实例，OpalTM 7实体瘤免疫试剂盒(PerkinElmer)每个周期需要90分钟以上，并且整个过程需要两天来完成。微波还可以改变或损坏正在成像的样品。
在另一种先前的尝试中，使用热失活来检测5重测定(Zhang,W.,Hubbard,A.,Jones,T.等,j.immunotherapy cancer(2015)3(增补版2):P111)。四个热失活循环导致所使用的五个荧光标记的荧光减少了12％-50％。所述测定花费九个小时来完成。加热的其他变化已描述于美国专利号9,689,875和9,874,571中，所述专利以引用的方式并入本文以用于教导加热变化。然而，热失活可能改变或损坏正在成像的样品。
在循环之间进行微波或热失活的情况下，可检测靶标的数量仍受限于阅读器和软件可以分辨的标记数量。在免疫肿瘤学领域，需要被检测的靶标数量已经在12至20个范围内，并且这远超出了阅读器和软件的限度。
根据本公开的上文所述的方法提供了一种信号扩增方法，其可以更简单且更快的方式进行复用，从而避免严苛的样品处理，诸如加热和微波，并且具有在更高水平下进行复用的能力。
D.试剂盒
在一些实施方案中，试剂盒包括组合物，所述组合物包含(1)一种或多种靶标特异性结合配偶体，每种结合配偶体与核酸链结合，(2)连接到核酸链的酶，所述核酸链与所述一种或多种靶标特异性结合配偶体结合的核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到每种靶标特异性结合配偶体；并且(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；以及(3)包含可检测地标记的底物的底物缀合物，其中所述底物和所述标记任选地使用第三可释放接头来连接。
在一些实施方案中，试剂盒包括组合物，所述组合物包含含有以下物质的组合物：(1)一种或多种靶标特异性结合配偶体，每种结合配偶体与核酸链结合，(2)含有以下的结合对：连接到与结合至每种靶标特异性结合配偶体的核酸链互补的核酸链的第一成员，以及连接到酶的第二成员，其中满足以下(i)或(ii)或两者：(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到每种靶标特异性结合配偶体；并且(ii)所述结合对的所述第一成员使用第二可释放接头来连接到互补核酸链；以及(3)包含可检测地标记的底物的底物缀合物，其中所述底物和所述标记任选地使用第三可释放接头来连接，其中所述结合对的第二成员使用第四可释放接头来连接到酶。
在一些实施方案中，试剂盒还包括用于进行流体交换步骤的流体系统、用于控制流体系统和时间和/或使流体步骤与成像步骤同步的软件。在一些实施方案中，试剂盒还包括使用至少一个光学透明面粘在目标样品上以允许对所述样品进行成像的成像室。
III.方法的组分
A.用于CARD的酶
适用于直接或间接偶合至靶标特异性结合配偶体的酶包括水解酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶异构酶、连接酶、过氧化物酶、氧化酶、磷酸酶、酯酶和糖苷酶。特定实例包括碱性磷酸酶、脂肪酶、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶(HRP)。如果需要的话，可以将多于一种酶与每种酶的独特底物缀合物结合来同时使用。
B.特异性结合对
适用于实践本发明的特异性结合对的成员可以是免疫类型或非免疫类型的。免疫特异性结合对的实例为抗原/抗体系统或半抗原/抗半抗原系统。结合对的抗体成员，无论是多克隆抗体、单克隆抗体或其免疫反应性片段，都可以通过本领域技术人员熟悉的惯常方法来产生。术语免疫反应性抗体片段或免疫反应性片段意指含有抗体的结合区的片段。此类片段可以是被定义为没有Fc部分的片段的Fab型片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2片段，其通过还原性裂解连接完整抗体的重链组分的二硫键来获得。片段也可以是源自重链或轻链抗体的单域抗体，并且可以包括纳米抗体。如果特异性结合对的抗原成员不具有免疫原性，例如半抗原，则可以将其共价偶合至载体蛋白以使其具有免疫原性。
非免疫结合对包括其中两个组分彼此共享天然亲和力但不是抗体的系统。示例性非免疫结合对是生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白、互补探针核酸叶酸-叶酸结合蛋白等。还包括彼此形成共价键的非免疫结合对。示例性共价结合对包括巯基反应性基团(诸如马来酰亚胺和卤代乙酰基衍生物)和胺反应性基团(诸如异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物和点击化学)以及偶合剂染料(诸如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-(二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB))等。
互补探针核酸可用于通过使用诸如滚环扩增(Paul M Lizardi等,NatureGenetics,19(3):225-232,1998)和引物交换反应(WO 2017/143006 Al)的方法增加核酸探针的结合位点数量来增加信号。
C.靶标特异性结合配偶体
适用于实施本发明的靶标特异性结合配偶体可以是免疫类型或非免疫类型的。免疫特异性结合对的实例为抗原/抗体系统。结合对的抗体成员，无论是多克隆抗体、单克隆抗体或其免疫反应性片段，都可以通过本领域技术人员熟悉的惯常方法来产生。术语免疫反应性抗体片段或免疫反应性片段意指含有抗体的结合区的片段。此类片段可以是被定义为没有Fc部分的片段的Fab型片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2片段，其通过还原性裂解连接完整抗体的重链组分的二硫键来获得。片段也可以是源自重链或轻链抗体的单域抗体，并且可以包括纳米抗体。如果特异性结合对的抗原成员不具有免疫原性，例如碳水化合物或磷酸化氨基酸，则可以将其共价偶合至载体蛋白以使其具有免疫原性。
表1提供了靶标和对应靶标识别部分的代表性列表。
Figure BDA0002772298480000301
表2提供了额外靶标的列表。这些靶标的抗体和其他已知的结合配偶体可以用作靶标识别部分。
Figure BDA0002772298480000302
Figure BDA0002772298480000311
非免疫结合对包括其中两个组分彼此共享天然亲和力但不是抗体的系统。
示例性非免疫结合对包括互补探针核酸和适体。互补探针核酸是核酸(例如，DNA或RNA)靶标的合适靶标特异性结合配偶体。
1.在结合对中使用的核酸链
在一些实施方案中，在结合对中使用的核酸是单链核酸，诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可以包括改变的磷酸骨架、改变的戊糖和/或改变的核碱基。核酸类似物可以包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，核酸链包含单链核酸，并且可以是长约5至20个核苷酸、长约8至15个核苷酸或约10至12个核苷酸。在一些实施方案中，核酸链长约5、8、9、10、11、12、13、14、15、18或20个核苷酸。
核酸链可以是独立元件，或者可以是靶标识别部分的一部分。
核酸链可以在液体介质或缓冲溶液中提供。
靶标特异性结合配偶体可以在液体介质或缓冲溶液中提供。
D.活化的底物缀合物与受体的结合
活化的底物缀合物与受体的定向结合是由形成特异性结合对的相互作用导致的。适用于使活化底物与受体结合的特异性结合对的成员可以是免疫类型或非免疫类型的。免疫特异性结合对的实例为抗原/抗体系统或半抗原/抗半抗原系统。结合对的抗体成员，无论是多克隆抗体、单克隆抗体或其免疫反应性片段，都可以通过本领域技术人员熟悉的惯常方法来产生。术语免疫反应性抗体片段或免疫反应性片段意指含有抗体的结合区的片段。此类片段可以是被定义为没有Fc部分的片段的Fab型片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2片段，其通过还原性裂解连接完整抗体的重链组分的二硫键来获得。
非免疫结合对包括其中两个组分彼此共享天然亲和力但不是抗体的系统。示例性非免疫结合对是彼此形成共价键的对。示例性共价结合对包括但不限于酚类部分(例如，酪胺和酪氨酸)、巯基反应性基团(诸如马来酰亚胺和卤代乙酰基衍生物)和胺反应性基团(诸如异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物和点击化学)以及偶合剂染料(诸如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-(二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB))的二聚。
E.报告分子或标记
多种报告分子(或标记)可用于偶合至底物以产生底物缀合物或以偶合至特异性结合对的成员。报告分子(或标记)可以是但不限于酶、荧光材料、比色材料、化学发光材料、质量标签、磁性材料、等离激元材料或电化学材料。
在一些实施方案中，可以使用发荧光的分子，诸如有机小分子，包括但不限于荧光团，诸如但不限于荧光素、若丹明(rhodamine)、花菁染料、Alexa染料、DyLight染料、Atto染料等。
发色、荧光和化学发光材料可以包括但不限于3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)和5-溴-4-氯-3-吲哚基(indoyl)-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)。
在一些实施方案中，可以使用有机聚合物，诸如p点。在一些实施方案中，可观察的部分可以是生物分子，包括但不限于荧光蛋白或荧光核酸(包括荧光RNA，包括菠菜(Spinach)及其衍生物)。在一些实施方案中，可观察的部分可以是包含Q点的无机部分。在一些实施方案中，可观察的部分可以是通过弹性或非弹性散射的散射起作用的部分，诸如纳米颗粒和表面增强拉曼光谱(SERS)报告分子(例如4-巯基苯甲酸、2,7-巯基-4-甲基香豆素)。在一些实施方案中，可观察的部分可以是化学发光/电化学发光发射体，诸如钌配合物和荧光素酶。可观察的部分可以产生光学信号、电磁信号(在整个电磁波谱中)、原子/分子质量(例如，可通过质谱分析法检测)、有形质量(例如，可通过原子力显微镜检测)、电流或电压。
F.底物
用于底物缀合物的底物对所选择的酶具有特异性，并且是本领域技术人员已知的。已经描述了许多与辣根过氧化物酶一起使用的酚类底物(美国专利号5,196,306、5,583,001、5,573,1158、5,863,748和6,355,443)，所述专利各自以引用的方式并入以用于教导酚类底物。还已经描述了水解酶的底物(美国专利号5,196,306、5,583,001、5,573,1158、7,291,474以及Polaske,Bioconjugate Chemistry(2016))，所述文献各自以引用的方式并入以用于教导水解酶底物。
在一些实施方案中，所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)，并且所述底物是酚类底物(例如，酪胺(图6)和酪氨酸)。在一些实施方案中，所述酶是水解酶，并且所述底物是酯、酰胺或糖苷底物。
G.可释放接头
在整个本公开中，可以提及第一、第二或第三可释放接头，但是在许多实施方案中，它们中的一些或全部是任选的。仅提及第二或第三可释放接头不需要存在两个或三个可释放接头。相反，在整个申请中使用这种编号来命名接头，并使它们彼此区分。因此，包括第二可释放接头的实施方案不必具有两个可释放接头等等。这种语言仅指定存在哪个接头，而不指定存在多少个接头。
可释放接头是那些含有可以连接两个或多个分子，诸如蛋白质、核酸、蛋白质与核酸以及底物与可检测标记，并且并入无需加热或微波即可裂解的键的官能团的接头。可以裂解的示例性键是二硫键(通过诸如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)的还原剂裂解)、酯(通过羟胺裂解)、邻二醇(通过偏高碘酸钠裂解)、砜(在碱性条件下裂解)和可光裂解接头(诸如含有2-硝基苄基的接头)。
使用可释放接头的替代性方法是完全去除与核酸链结合的酶或特异性结合对成员。可通过破坏核酸链之间的结合亲和力或通过酶促裂解独特的核酸序列来促进去除。示例性去除方法包括USER酶(New England Biolabs)、降低介质的离子强度、升高温度和/或使用离液剂，诸如胍、碳酸亚乙酯和/或甲酰胺。
在一些实施方案中，可释放接头包括可以光化学地裂解(例如，通过UV暴露、可见光、红外线、近红外线、X射线、微波、无线电波或伽马射线)的可光裂解接头。在一些实施方案中，可释放接头包含可以被酶裂解的部分。此类酶促可裂解部分的实例包括但不限于核糖核苷酸，其可以被多种RNA酶裂解；脱氧尿苷，其可以被酶组合，诸如USER(New EnglandBiolabs)裂解；以及限制性位点，其可以被序列特异性切口酶或限制性酶裂解。在一些实施方案中，可释放接头包含脱氧尿苷，其中尿嘧啶基团可以被尿嘧啶-DNA糖苷酶裂解。在一些实施方案中，可释放接头包含脱碱基位点，其可以被核酸内切酶裂解。
1.核酸降解酶
许多酶可以破坏核酸分子内的共价键。例如，一些糖苷酶可以从核苷酸的糖部分去除碱基，核酸内切酶可以切割核酸分子内部磷酸二酯桥内的键，而核酸外切酶可以类似地以连续方式破坏核酸分子的5'或3'末端的磷酸二酯桥。另一个实例包括DNA酶或脱氧核酶、具有催化活性的能够裂解核酸分子中的磷酸二酯键的寡核苷酸。可以对所有这些类型的酶进行工程改造以释放可释放接头，并构成酶促裂解、修饰或降解可释放接头。
糖苷酶.如果糖苷酶可以特异性去除参与碱基配对的碱基，则其可以降低两条链之间的相互作用强度。例如，可以使用脱氧尿苷(dU)来代替可释放接头中的脱氧胸苷(dT)。dU可以像dT一样与dA配对，但是其可以被尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG，可商购获得自NewEngland Biolabs，目录#M0280S)特异性去除。此反应将产生连接到可检测标记的核酸链上的脱碱基位点。此类脱碱基位点可以被核酸内切酶VIII进一步裂解。这将进一步促进结合对的残余物之间的解离。包含UDG和核酸内切酶VIII两者的酶共混物也是可商购获得的(例如，来自New England Biolabs，商品名USER，目录#M5505S)。可以在连接到可检测标记的核酸链中放置约1至20、1至15、1至10或1至5个dU核苷酸。使用USER，可以以下方式放置dU：在去除U之后，残余物足够短(例如，小于或等于约9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸)，使其自发且迅速地解离。如果仅使用UDG(即不使用核酸内切酶VIII)，则dU单元的去除可以使链足够不稳定以促进去除。去除dU之后，结合对之间的碱基对总数可以小于或等于9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。因此，在一些实施方案中，可释放接头可包含至少一个能够被USER裂解的U。
残余物的序列以及温度将影响残余物自发解离的时间长短。例如，GC含量高的序列在较短的长度上可能具有比长度更长的另一序列更大的结合亲和力。因此，在一些情况下，9聚体可能足以稳定结合，并且在其他情况下，9聚体可能足以解离。本领域的普通技术人员可以在此处以及下文所讨论的非天然核苷酸的裂解中评估序列、温度和亲和力。
限制性核酸内切酶和切口核酸内切酶.可以工程改造可释放接头中的限制性位点。这允许使用对应的限制性核酸内切酶来切割此类限制性位点，这破坏了可释放接头。例如，Cas9(CRISPR相关蛋白9)是一种RNA引导的核酸内切酶，其可通过工程改造在对应的序列中的特异性识别位点来用于特异性裂解可释放接头。这导致两条链均被裂解，从而阻止了一条链再次询问对应的靶标。为了解决这种问题，可以使用仅切割一条链的切口核酸内切酶。例如，Cas9切口酶是Cas9酶，其已被工程改造成仅包含一个活性裂解位点，从而导致单链切割，同时保留了Cas9的高特异性。具有位点特异性活性的核酸内切酶的其他实例包括但不限于：锌指核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和脱氧核酶。
RNA酶.可以在可释放接头RNA核苷酸(也称为核糖核苷酸)，而不是DNA核苷酸(也称为脱氧核苷酸)中制备一些或全部核苷酸。此类RNA核苷酸可以被RNA酶去除。
聚合酶.可释放接头也可以通过使用具有链置换活性或5'至3'核酸外切酶活性的聚合酶来去除。
非天然核苷酸的裂解.可以使用充当特定酶的底物的非天然核苷酸。例如，8-氧桥鸟嘌呤可以被DNA糖苷酶OGG1裂解。脱碱基位点也可以并入DNA链，诸如连接到可检测标记的DNA链，其可以被核酸内切酶裂解。例如，1',2'-二脱氧核糖、dSpacer、脱嘌呤/脱嘧啶、四氢呋喃或脱碱基呋喃可以被核酸内切酶VIII裂解。因此，在一些实施方案中，连接到可检测标记或中间链的核酸链可包含至少一个能够被核酸内切酶VIII裂解的脱碱基位点。在一些实施方案中，连接到可检测标记或中间链的核酸链可包含至少一个脱氧尿苷和至少一个能够被USER、UDG或核酸内切酶VIII裂解的脱碱基位点。也可以使用可光裂解的间隔子或RNA脱碱基位点，诸如核糖间隔子(rSpacer)或脱碱基II修饰。可以使用其他非天然核苷酸对以及其配对的酶。
H.酶失活
使用可释放接头或去除与核酸链结合的酶或特异性结合对成员的替代性方法是使酶失活。示例性酶失活剂包括但不限于过氧化物、还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP))和还原型谷胱甘肽、二异丙基氟磷酸酯(DFP)、α-二氟甲基鸟氨酸、氟化物盐、氰化物盐、叠氮化物和特异性结合对成员(诸如抗体和适体)。
在一些实施方案中，使用酶失活剂使所述酶失活，其中所述酶失活剂包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、还原型谷胱甘肽、过氧化物、氰化物、氟化物或叠氮化物。
在一些实施方案中，酶的失活进行少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟或少于或等于1分钟。
在一些实施方案中，通过使样品与酶失活剂接触少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟或少于或等于1分钟来进行酶的失活。
I.中间部分/扩增/预扩增子
在一些情况下，连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链通过中间部分与连接到酶的核酸链结合。
在一些实施方案中，中间部分是包含核酸的中间链。在一些实施方案中，所述核酸是单链核酸，诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可以包括改变的磷酸骨架、改变的戊糖和/或改变的核碱基。核酸类似物可以包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，中间链具有与连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链互补的第一区域和与连接到酶的核酸链互补的第二区域。在此类实施方案中，连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链与连接到酶的核酸链互补是不必要的。
在一些实施方案中，不以离散步骤来添加中间链和连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链。在一些情况下，在以单一步骤添加之前，将中间链和连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链杂交在一起。
在一些实施方案中，不以离散步骤来添加中间链和连接到酶的核酸链。在一些情况下，在以单一步骤添加之前，将中间链和连接到酶的核酸链杂交在一起。
在一些实施方案中，中间链是包含重复序列的预制备扩增子，每个序列都能够与连接到酶的核酸链结合。在一些实施方案中，中间链是与连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链的对应区域互补的第一区域以及包含重复序列的第二区域，每个序列直接或间接地与连接到酶的核酸链的对应序列特异性地结合。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括扩增直接或间接地连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链(或其一部分)。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括通过下文进一步描述的引物交换反应(PER)来扩增与连接到步骤(1)的靶标特异性结合配偶体的核酸链结合的中间部分。在一些实施方案中，标记的核苷酸用于扩增反应。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括添加包含重复序列的中间部分。在一些实施方案中，使用本文所述的引物交换反应(PER)来产生重复序列。在一些实施方案中，使用本文所述的滚环扩增(RCA)来产生预扩增子。
1.引物交换反应(PER)
PER可用于制备含有多个探针结合位点(即本文所述的中间部分)的核酸产物；然后可以将此核酸产物与连接到靶标特异性结合配偶体的核酸(或其条形码结构域)结合；在此所述核酸产物可以显示探针结合位点。在此类实施方案中，探针结合位点可以与靶标特异性结合配偶体的条形码结构域不互补。
各种PER和基于PER的信号扩增方法已描述于Saka等，“Highly multiplexed insitu protein imaging with signal amplification by Immuno-SABER”(2018；自2019年6月6日起可作为预印本在www.biorxiv.org/content/10.1101/507566v1处获得)；WO2017/143006；以及WO 2018/132392A2中，所述文献各自的内容以引用的方式并入本文。
PER反应导致形成串联体(重复)序列。PER串联体具有与连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链互补的第一结构域和包含重复序列的第二结构域。重复序列可以与连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链相同。重复序列可以不同于连接到靶标特异性结合配偶体的核酸链。
IV.关于复用成像方法的支持信息
A.光谱复用和时序复用
存在两种用于在交换成像中形成复用的主要方法：光谱复用和时序复用。光谱复用是指在单轮成像中使用不同标记(诸如不同的荧光团)的能力。光谱复用不需要在查看第二个标记之前熄灭来自第一个标记的信号。例如，在荧光团的情况下，可以使用不同激发波长的光来单独激发不同的荧光团。这不需要单独进行几轮成像。时序复用是指通过在第二轮成像之前熄灭来自第一轮成像的信号来在多轮成像中使用相同标记(诸如相同的荧光团)的能力。光谱复用和时序复用可以单独使用或彼此结合使用。然而，使用多于一种复用技术可以显著增加使用者在特定实验期间可以可视化的靶标数量。
在一些实施方案中，使用至少一些相同的荧光团来进行多轮成像。例如，在第一轮成像中，可以使用标记X来对靶标A进行成像，可以使用标记Y来对靶标B进行成像，并且可以使用标记Z来对靶标C进行成像。作为下一步骤，可以熄灭来自这些标记的信号。然后，在第二轮成像中，可以使用标记X来对靶标D进行成像，可以使用标记Y来对靶标E进行成像，并且可以使用标记Z来对靶标F进行成像。又，在一些实施方案中，使用至少两个标记来对至少两个靶标进行成像，熄灭信号，并且然后使用至少一个相同的标记来对至少又一个靶标进行成像，其中成像步骤可以任一顺序进行。这意指步骤的顺序可以颠倒，因此第一成像步骤包括对至少一个靶标进行成像、熄灭信号，并且第二成像步骤包括对至少两个靶标进行成像。
将光谱复用和时序复用两者组合可以为使用者增加进行成像的总体便利性，并减少对正在成像的样品的破坏。
B.对照实验和背景减除
可以使用对照实验和背景减除来进一步改善测试样品中一种或多种靶标的存在的方法的结果。有用的实验都不需要这两个方面；然而，两者都可以改善复用的质量，并且可以单独使用或彼此结合使用。
1.对照实验
通过使样品与具有核苷酸序列(与结合至靶标特异性结合配偶体(或其一部分，诸如条形码)的核酸链不互补)的结合对接触来进行对照步骤，从而可以在复用过程中的多个时间点添加对照测量。
2.背景减除
在贯穿本申请所讨论的任何实施方案中，所述方法可以使用背景减除。在一些实施方案中，所述方法包括对样品进行成像以检测和/或测量背景信号，并从样品的图像中减除背景信号以检测结合的标记。此类背景信号可以包括与来自结合的标记的不完全熄灭的信号相关联的自发荧光和/或残留荧光。在一些实施方案中，在对样品进行成像之前测量背景信号以检测结合的标记。在其他实施方案中，在对样品进行成像之后测量背景信号以检测结合的标记。
C.样品的描述
1.样品的类型
可以使用这些方法来对各种类型的样品进行成像。在一些实施方案中，所述样品是固定的样品。在一些实施方案中，所述样品是细胞、细胞裂解物、组织、组织裂解物和或整个生物体。在一些实施方案中，所述样品是细胞或组织样品、细胞或组织裂解物或体液。在一些实施方案中，所述样品是组织，并且所述成像包括用于免疫染色的组织内复用。
所述样品可以在液体介质或缓冲溶液中提供。
2.抗原修复
在一些实施方案中，使用靶标特异性结合配偶体来对样品染色需要特定条件，并且并非所有靶标特异性结合配偶体都将在相同的条件下与其抗原结合。这可能是因为其靶标抗原在相同的条件下不可用。
3.靶标的描述和在鉴定生物标志物中的用途
在一些实施方案中，所述方法可用于鉴定生物标志物。在一些情况下，对样品进行成像，并对那些样品进行数据分析。在一些实施方案中，针对每个靶标使用对应的靶标特异性结合配偶体来测试多个靶标。在一些情况下，可以评定不同靶标之间的关系；例如，与健康组织相比，使用者可能寻求以确定多种标志物与疾病状态的关系，并得出结论，与不具有所述生物标志物分布的健康组织相比，所述疾病样品的A的水平升高，B的水平降低，并且C的水平在一定范围内。
在一些实施方案中，对至少10、96、100、384或500个样品进行成像，并对那些样品进行数据分析。
在一些实施方案中，针对每个靶标使用对应的靶标特异性结合配偶体来测试至少5、10、15、25、30、50、75或100个或更多个靶标。
D.设备和软件
1.成像室，诸如流动池
在一些实施方案中，可以使用成像室。在一些情况下，成像室是没有入口也没有出口的固定室。在一些实施方案中，成像室具有单一的入口/出口组合。在其他情况下，成像室允许流动并被命名为流动池。流动池可以包括第一光学透明支撑物与第二光学透明材料(诸如玻璃或塑料盖玻片)的组合，以提供具有顶部和底部表面以及在它们之间的流体流动的流动池。如果使用第一和第二光学透明材料，则它们可以彼此平行放置。就平行而言，它包括完全平行的几何排列以及偏离平行最多1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°或10°的几何排列。在一些实施方案中，第二光学透明材料与第一光学透明材料非常接近，诸如约5微米至5mm、50微米至500微米或500微米至5mm。
成像室还可以包括第一光学透明支撑物和垫圈(也称为隔离器或垫片)。垫圈可以在顶部表面上对空气敞开，或者可以是关闭的并具有光学透明的顶部表面。垫圈可具有组合的入口/出口或者它可同时具有入口和出口。垫圈也可以不具有出口。垫圈可以是塑料、橡胶、粘合剂。垫圈可以包括CoverWell室垫圈(Thermo Fisher)、用于正置和倒置显微镜的超薄密封室(Bioscience Tools)或孵育室(Grace Bio-Labs，包括HybriSlipTM杂交盖、HybriWellTM密封系统、CoverWellTM孵育室、成像垫片、SecureSealTM杂交室、FlexWellTM孵育室、FastWellsTM试剂屏障和Silicone IsolatorsTM)。
在一些情况下，可以将垫圈与形成成像室或流动池的顶部表面的盖玻片一起使用。
成像室(诸如但不限于流动池)可以是可重复使用的或一次性的。
2.用于控制流体步骤的软件
在一些实施方案中，所有流体交换步骤都使用流体系统来进行，所述流体系统包括电子、和/或气动、和/或液压、和/或电流体致动器和系统。在某些情况下，所述流体系统由软件控制。在一些实施方案中，其中所述流体系统由软件自动控制，使前述段落中所描述的方法的前述步骤与成像步骤同步。
在一些实施方案中，所述流体系统由软件控制，通过与成像软件通信，参考前述段落中所描述的步骤编号来使方法的前述步骤与成像步骤同步。
在一些实施方案中，所有流体步骤都在样品在成像装置上时进行。
样品可以固定在一次性成像室(诸如流动池)、可重复使用的成像室(诸如流动池)、载玻片、带盖玻片的载玻片或任何其他配置中。
实施例
实施例1.通过HRP循环使荧光报告分子沉积
使用相应荧光酪酰胺试剂的连续沉积来标记四个不同的靶标CD8、CD68、PD-L1和CK。特别地，将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织载玻片烘烤，然后装载到BOND RX自动染色机(Leica Biosystems，Nussloch GmbH)上，用于所有后续步骤。将载玻片脱蜡并使用表位修复溶液2BOND(Leica Biosystems)来修复抗原。用3％H2O2淬灭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下用抗体稀释剂(Ultivue，Cambridge，MA)封闭15分钟。将缀合至核酸条形码并在抗体稀释剂中稀释的四种不同的一级抗体(抗CD8、抗CD68、抗PD-L1和抗CK)的混合物与组织样品一起在室温下孵育30min。将样品用BOND洗涤液(Leica Biosystems)洗涤，然后在室温下与预扩增混合物(Ultivue)一起孵育10min，然后进行额外洗涤步骤。将样品与扩增溶液(Ultivue)一起孵育15-20min，然后洗涤。将与抗CD8抗体缀合物互补并通过二硫键连接到HRP酶的第一组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交15min。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。根据包装说明，将Alexa FluorTM 488酪酰胺试剂(InvitrogenTM)的工作溶液施用于组织样品，以标记CD8靶标。通过添加Tris缓冲液中的TCEP溶液1分钟，使连接到第一组核酸探针链的HRP酶从样品中失活。在使与第一轮CARD相关联的HRP酶失活后，将与抗CD68抗体缀合物互补、通过二硫键连接到HRP酶的第二组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。根据包装说明，将Alexa FluorTM 555酪酰胺试剂(Invitrogen)的工作溶液施用于组织样品，以标记CD68靶标。通过添加Tris缓冲液中的TCEP溶液1分钟，使连接到第二组核酸探针链的HRP酶从样品中失活。在使与第二轮CARD相关联的HRP酶失活后，将与抗PD-L1抗体缀合物互补、通过二硫键连接到HRP酶的第三组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。根据包装说明，将AlexaFluorTM 647酪酰胺试剂(Invitrogen)的工作溶液施用于组织样品，以标记PD-L1靶标。通过添加Tris缓冲液中的TCEP溶液1分钟，使连接到第三组核酸探针链的HRP酶从样品中失活。在使与第三轮CARD相关联的HRP酶失活后，将与抗CK抗体缀合物互补、通过二硫键连接到HRP酶的第四组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。根据包装说明，将Alexa FluorTM 750酪酰胺试剂(Invitrogen)的工作溶液施用于组织样品，以标记CK靶标。将核复染剂施用于载玻片，并将样品盖上盖玻片并使用荧光显微镜进行成像。
图7显示使用相应荧光报告分子的连续沉积成功标记了四个靶标CD8、CD68、PD-L1和CK。框A示出了标记的CD8的示例性位置；框B为标记的CD68；框C为标记的PD-L1；框D为标记的CK。
实施例2.使用于循环沉积的HRP失活
为了使用基于HRP的酶促反应来实现标记的循环沉积，需要在连续的沉积轮次之间去除HRP酶或使其失活。HRP酶可通过基于加热或pH的变性而失活，或通过不稳定的接头从样品中裂解出来(图4A)。在此实施例中，在没有任何不稳定接头的情况下，使用还原剂来使HRP酶失活(图4B)。
将FFPE组织载玻片在60℃下烘烤30分钟，然后脱蜡并用表位修复溶液2BOND(Leica Biosystems)在BOND RX自动染色仪(Leica Biosystems)上修复抗原。将载玻片从BOND RX上移出以用于后续步骤。使用3％H2O2淬灭内源性过氧化物酶活性20min，在PBS中洗涤，然后在室温下用抗体稀释剂(Ultivue，Cambridge，MA)封闭15min。将缀合至核酸条形码的一级抗体(来自实施例1)在抗体稀释剂中稀释，并在室温下与组织样品一起孵育1小时。将样品洗涤，并在室温下与预扩增混合物(Ultivue)一起孵育25min，然后进行额外洗涤步骤。将样品与扩增溶液(Ultivue)一起在30℃下孵育15min，然后在PBS中洗涤。将与抗体缀合的核酸条形码之一互补、连接到HRP酶(不具有二硫键)的第一组核酸探针链加入到样品中，并使其与其配偶体链杂交。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。将组织载玻片暴露于TCEP溶液中5分钟以使HRP失活，或暴露于Tris缓冲液中以作为对照。将AlexaFluorTM 647酪酰胺(Invitrogen)的工作溶液加入到所有载玻片中，在室温下孵育10min，并在PBS中洗去。最后，将载玻片用核复染剂染色，洗涤并盖上盖玻片。在荧光显微镜上对载玻片进行成像。
图8A-图8B显示在使酪酰胺试剂沉积之前用TCEP溶液处理的样品没有导致酪酰胺沉积，而所述酪酰胺试剂被成功沉积在未暴露于TCEP的对照样品中。这种令人惊讶的结果表明TCEP溶液使HRP酶失活。
实施例3.通过HRP循环来使结合对沉积
将FFPE组织载玻片烘烤，并且然后装载到BOND RX自动染色机(LeicaBiosystems)上，用于所有后续步骤。将载玻片脱蜡并使用表位修复溶液2BOND(LeicaBiosystems)来修复抗原。使用3％H2O2淬灭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下用抗体稀释剂(Ultivue，Cambridge，MA)封闭15分钟。将缀合至核酸条形码并在抗体稀释剂中稀释的四种不同的一级抗体(抗CD8、抗CD68、抗PD-L1和抗CK)的混合物与组织样品一起在室温下孵育30min。将样品洗涤，然后在室温下与预扩增混合物(Ultivue)一起孵育10min，然后进行额外洗涤步骤。将样品与扩增溶液(Ultivue)一起孵育15-25min，然后洗涤。将与抗CD8抗体缀合物互补并通过二硫键连接到HRP酶的第一组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交15min。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。将连接到酚HRP反应性底物的核酸条形码(图6)的工作溶液施用于组织样品，以使额外核酸条形码沉积在CD8靶标的位点(例如，描绘于图5)。通过添加Tris缓冲液中的TCEP溶液1分钟，使连接到第一组核酸探针链的HRP酶从样品中失活。在使与第一轮CARD相关联的HRP酶失活后，将与抗CD68抗体缀合物互补、通过二硫键连接到HRP酶的第二组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。将连接到酚HRP反应性底物的核酸条形码的工作溶液施用于组织样品，以使额外核酸条形码沉积在CD68靶标的位点。通过添加Tris缓冲液中的TCEP溶液1分钟，使连接到第二组核酸探针链的HRP酶从样品中失活。在使与第二轮CARD相关联的HRP酶失活后，将与抗PD-L1抗体缀合物互补、通过二硫键连接到HRP酶的第三组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。将连接到酚HRP反应性底物的核酸条形码的工作溶液施用于组织样品，以使额外核酸条形码沉积在PD-L1靶标的位点。通过添加Tris缓冲液中的TCEP溶液1分钟，使连接到第三组核酸探针链的HRP酶从样品中失活。在使与第三轮CARD相关联的HRP酶失活后，将与抗CK抗体缀合物互补、通过二硫键连接到HRP酶的第四组核酸探针链加入到样品中，并允许其与其配偶体链杂交。使用洗涤步骤来去除未结合的HRP偶合的探针。将连接到酚HRP反应性底物的核酸条形码的工作溶液施用于组织样品，以使额外核酸条形码沉积在CK靶标的位点。洗涤样品，并允许与核酸条形码互补的荧光标记探针链的混合物与样品杂交。去除未结合的荧光标记的探针链，并将核复染剂施用于载玻片。将样品盖上盖玻片并使用荧光显微镜进行成像。
图9显示使用相应荧光报告分子的连续沉积成功标记了四个靶标CD8、CD68、PD-L1和CK。框A示出了标记的CD8的示例性位置；框B为标记的CD68；框C为标记的PD-L1；框D为标记的CK。
实施例4.额外实施方案
以下编号条款为本文的实施方案提供了额外的支持和描述。
条款1.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
条款2.如条款1所述的方法，其中在步骤(5)中，包含所述可检测地标记的底物的所述底物缀合物与所述酶反应以形成活化的底物缀合物，并且所述活化的底物缀合物与所述活化的底物缀合物的受体结合。
条款3.如条款2所述的方法，其中所述活化的底物缀合物的所述受体固定化在固体支撑物上，从而导致所述可检测标记沉积。
条款4.如条款1所述的方法，其还包括(10)在步骤(8)之后通过释放所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集。
条款5.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述结合对的所述第一成员使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与任选地使用第三可释放接头来连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用第四可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地释放所述结合对的所述结合的第一成员或第二成员；
(9)对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集。
条款6.如条款5所述的方法，其还包括(11)在步骤(9)之后通过裂解所述标记与所述底物之间的所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(11)或其任何子集。
条款7.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第四可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)通过释放步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和(8)的所述可释放接头来任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集。
条款8.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与辣根过氧化物酶(HRP)结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述HRP使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物；
(7)对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；
(8)任选地释放所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
条款9.如条款8所述的方法，其中在步骤(5)之后，将所述酚部分酶促地转化为活化态，从而导致所述标记沉积。
条款10.如条款1-9中任一项所述的方法，其中所述可释放接头包括二硫键、酯、邻二醇、砜和可光裂解接头中的至少一者。
条款11.如条款1-10中任一项所述的方法，其中所述酶选自氧化还原酶、水解酶、裂解酶、转移酶、异构酶和连接酶。
条款12.如条款1-11中任一项所述的方法，其中所述酶选自过氧化物酶、氧化酶、磷酸酶、酯酶和糖苷酶。
条款13.如条款12所述的方法，其中所述酶选自辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。
条款14.如条款13所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶。
条款15.如条款1-14中任一项所述的方法，其中所述结合对是免疫类型或非免疫类型。
条款16.如条款15所述的方法，其中所述免疫类型结合对选自抗原-抗体和半抗原-抗半抗原。
条款17.如条款16所述的方法，其中所述结合对的所述抗体成员是多克隆抗体、单克隆抗体或其免疫反应性片段。
条款18.如条款15所述的方法，其中所述非免疫类型结合对选自生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉抗生物素蛋白和互补探针核酸叶酸-叶酸结合蛋白。
条款19.如条款18所述的方法，其中所述非免疫类型结合对通过巯基反应性基团(例如马来酰亚胺和卤代乙酰基衍生物)、胺反应性基团(例如异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物、点击化学)以及偶合剂染料(例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-(二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB))来形成共价键。
条款20.如条款1-19中任一项所述的方法，其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光材料、化学发光材料和电化学材料。
条款21.如条款1-20中任一项所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)，并且所述底物是酚类底物。
条款22.如条款1-21中任一项所述的方法，其中所述酶是水解酶，并且所述底物是酯、酰胺或糖苷底物。
条款23.一种组合物，其包含：
(1)与多于一种靶标特异性结合配偶体结合的样品，每种结合配偶体均与核酸链结合，
(2)与结合至所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补的核酸链的酶，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；以及
(3)包含可检测地标记的底物的底物缀合物，其中所述底物和所述标记任选地使用第三可释放接头来连接。
条款24.一种组合物，其包含：
(1)与多于一种靶标特异性结合配偶体结合的样品，每种结合配偶体均与核酸链结合，
(2)结合对，其包含：
(i)连接到核酸链的第一成员，所述核酸链与结合至所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，以及
(ii)连接到酶的第二成员，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述结合对的所述第一成员使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；以及
(3)包含可检测地标记的底物的底物缀合物，其中所述底物和所述标记任选地使用第三可释放接头来连接，
其中所述结合对的所述第二成员使用第四可释放接头来连接到所述酶。
条款25.一种组合物，其包含：
(1)与多于一种靶标特异性结合配偶体结合的样品，每种结合配偶体均与核酸链结合，
(2)连接到核酸链的酶，所述核酸链与结合至所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；以及
(3)包含核酸链结合的底物的底物缀合物，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第三可释放接头来连接；
(4)核酸链结合的可检测标记，其任选地使用第四可释放接头来连接，其中(4)的所述核酸链是(3)的所述核酸链的特异性结合对成员。
条款26.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
条款27.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地使所述结合的酶失活；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集。
条款28.如条款27所述的方法，其还包括(11)在步骤(9)之后通过裂解所述标记与所述底物之间的所述可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(9)和(11)中的任一者。
条款29.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第一可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第二可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)通过释放步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和(8)的所述接头来任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集。
条款30.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与HRP结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物；
(7)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；
(8)任选地使所述HRP失活；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)的子集。
条款31.如条款26-30中任一项所述的方法，其中所述酶使用二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、还原型谷胱甘肽、过氧化物、氰化物、氟化物或叠氮化物来使其失活。
等效物
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践所述实施方案。前述的描述和实施例详述了某些实施方案，并且描述了发明人所预期的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容多么详细地出现在文本中，所述实施方案都可以许多方式来实践并应当根据所附权利要求书及其任何等效物来解释。
如本文所用，无论是否明确指出，术语约是指数值，包括例如整数、分数和百分比。术语约通常是指本领域普通技术人员认为等效于所列举值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所列举范围的+/-5-10％)。当术语(诸如至少和约)在数值或范围的列表之前时，所述术语会修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包括四舍五入成最接近有效数字的数值。

Claims (43)

1.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)在一个或两个步骤中，使所述样品与(a)连接到核酸链的酶和(b)中间部分接触，所述中间部分包含能够与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链特异性结合的第一结构域；和能够与连接到所述酶的所述核酸链特异性结合的第二结构域；
(3)使来自步骤(2)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(4)任选地使所述结合的酶失活；
(5)任选地检测来自所述结合的可检测标记的信号；以及
(6)任选地重复步骤(1)-(5)或其子集，并且在成像的步骤(5)之前任选地重复步骤(3)-(4)或其任何子集。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述中间部分的第二区域包含重复序列，每个所述序列都直接或间接地与连接到所述酶的所述核酸链的对应序列特异性结合。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括通过核酸扩增反应来扩增与连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链结合的所述中间部分，以形成重复序列的扩增子，每个所述序列都直接或间接地与连接到所述酶的所述核酸链的对应序列特异性结合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸扩增反应包括基于发夹的串联聚合反应或基于发夹的树突聚合反应，任选地所述扩增反应是引物交换反应。
5.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。
6.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地使所述结合的酶失活；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
7.如权利要求6所述的方法，其还包括(11)在步骤(9)之后通过裂解所述标记与所述底物之间的所述可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(9)和(11)中的任一者。
8.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第一可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地使所述结合的酶失活；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第二可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)任选地通过释放步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和(8)的所述接头来任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
9.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，所述方法包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使所述样品与辣根过氧化物酶(HRP)结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物；
(7)任选地使所述HRP失活；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其子集。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述酶使用酶失活剂来使其失活，其中所述酶失活剂包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、还原型谷胱甘肽、过氧化物、氰化物、氟化物或叠氮化物。
11.如权利要求1所述的方法，其中使所述结合的酶失活的步骤(4)进行少于20分钟。
12.如权利要求1所述的方法，其中使所述结合的酶失活的步骤(4)进行少于10分钟。
13.如权利要求1所述的方法，其中使所述结合的酶失活的步骤(4)进行少于2分钟。
14.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(8)之前重复步骤(1)-(7)或其任何子集。
15.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(3)中，包含所述可检测地标记的底物的所述底物缀合物与所述酶反应以形成活化的底物缀合物，并且所述活化的底物缀合物与所述活化的底物缀合物的受体结合。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述活化的底物缀合物的所述受体存在于所述样品中，从而导致所述可检测标记沉积。
17.如权利要求5所述的方法，其还包括(10)在步骤(8)之后通过释放所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集。
18.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的结合对的第一成员接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述结合对的所述第一成员使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的结合对的未结合的第一成员；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与任选地使用第三可释放接头来连接到酶的所述结合对的第二成员接触，并任选地去除连接到所述酶的所述结合对的未结合的第二成员；
(6)使来自步骤(5)的所述样品与包含标记的底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述标记任选地使用第四可释放接头来连接；
(7)任选地去除未结合的底物缀合物；
(8)任选地释放所述结合对的所述结合的第一成员或第二成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；以及
(10)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
19.如权利要求18所述的方法，其还包括(11)在步骤(9)之后通过裂解所述标记与所述底物之间的所述第三可释放接头来任选地释放所述结合的可检测标记，并且任选地重复步骤(1)-(11)或其任何子集。
20.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种或多种靶标特异性结合配偶体接触，其中每种靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接到不同的核酸链；
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；
(3)使来自步骤(1)或任选地步骤(2)的所述样品与连接到核酸链的酶接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含核酸链结合底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述核酸链任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物缀合物；
(7)任选地释放所述结合的酶；
(8)使来自步骤(5)或任选地步骤(6)-(7)的所述样品与核酸链结合的可检测标记接触，所述可检测标记任选地使用第四可释放接头来连接，其中所述核酸链是步骤(5)中的所述核酸链的特异性结合对成员；
(9)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的标记；
(10)任选地通过释放步骤(5)或任选地步骤(8)或任选地步骤(5)和(8)的所述可释放接头来任选地释放来自步骤(8)的所述结合的标记；以及
(11)任选地重复步骤(1)-(10)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在步骤(9)之前重复步骤(1)-(8)或其任何子集。
21.一种用于测试样品中一种或多种靶标的存在的方法，其包括：
(1)使正测试一种或多种靶标的存在的样品与一种靶标特异性结合配偶体接触，其中所述靶标特异性结合配偶体连接到核酸链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与辣根过氧化物酶(HRP)结合的核酸链接触，所述核酸链与连接到所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述HRP使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；
(4)任选地去除连接到互补核酸链的未结合的酶；
(5)使来自步骤(3)或任选地步骤(4)的所述样品与包含可检测地标记的含酚底物的底物缀合物接触，其中所述底物和所述可检测标记任选地使用第三可释放接头来连接；
(6)任选地去除未结合的底物；
(7)任选地对所述样品进行成像以检测所述结合的可检测标记；
(8)任选地释放所述结合的可检测标记；以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)或其任何子集，并且任选地如果使用多于一种靶标特异性结合配偶体，则在成像的步骤(7)之前重复步骤(1)-(6)或其任何子集。
22.如权利要求9所述的方法，其中在步骤(5)之后，将所述酚部分酶促地转化为活化态，从而导致所述标记沉积。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述结合的标记使用可释放接头或不使用可释放接头来释放。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述结合的标记通过裂解所述标记与所述底物之间的所述可释放接头或通过裂解所述底物与所述核酸之间的所述可释放接头来释放。
25.如权利要求8所述的方法，其中所述结合的标记通过使与来自步骤(5)的所述核酸链结合的来自步骤(8)的所述核酸链去杂化来释放。
26.如权利要求5所述的方法，其中所述方法还包括扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链或其一部分，任选地其中所述扩增步骤在步骤(3)之前进行。
27.如权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括扩增步骤(5)的所述核酸链结合的底物的所述核酸链或其一部分，任选地其中所述扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
28.如权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括：首先扩增连接到步骤(1)的所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链或其一部分，任选地其中所述扩增步骤在步骤(3)之前进行；以及其次扩增步骤(5)的所述核酸链结合的底物的所述核酸链或其一部分，任选地其中所述第二扩增步骤在步骤(5)或任选的步骤(6)或任选的步骤(7)之后进行。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述可释放接头包括二硫键、酯、邻二醇、砜和可光裂解接头中的至少一者。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述酶选自氧化还原酶、水解酶、裂解酶、转移酶、异构酶和连接酶。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述酶选自过氧化物酶、氧化酶、磷酸酶、酯酶和糖苷酶。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述酶选自辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶。
34.如权利要求1所述的方法，其中所述结合对是免疫类型或非免疫类型。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述免疫类型结合对选自抗原-抗体和半抗原-抗半抗原。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述结合对的抗体成员是多克隆抗体、单克隆抗体或其免疫反应性片段。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述非免疫类型结合对选自生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉抗生物素蛋白和互补探针核酸叶酸-叶酸结合蛋白。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述非免疫类型结合对通过任选地选自以下的巯基反应性基团、胺反应性基团和偶合剂染料来形成共价键：马来酰亚胺和卤代乙酰基衍生物、异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物、点击化学、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-(二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB)。
39.如权利要求1所述的方法，其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光材料、化学发光材料和电化学材料。
40.如权利要求1所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)，并且所述底物是酚类底物。
41.如权利要求1所述的方法，其中所述酶是水解酶，并且所述底物是酯、酰胺或糖苷底物。
42.一种组合物，其包含：
(1)与多于一种靶标特异性结合配偶体结合的样品，每种结合配偶体均与核酸链结合，
(2)与结合至所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补的核酸链的酶，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述酶使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；以及
(3)包含可检测地标记的底物的底物缀合物，其中所述底物和所述标记任选地使用第三可释放接头来连接。
43.一种组合物，其包含：
(1)与多于一种靶标特异性结合配偶体结合的样品，每种结合配偶体均与核酸链结合，
(2)结合对，其包含：
(i)连接到核酸链的第一成员，所述核酸链与结合至所述靶标特异性结合配偶体的所述核酸链互补，以及
(ii)连接到酶的第二成员，
其中满足以下(i)或(ii)或两者：
(i)所述核酸链使用第一可释放接头来连接到所述靶标特异性结合配偶体；并且
(ii)所述结合对的所述第一成员使用第二可释放接头来连接到所述互补核酸链；以及
(3)包含可检测地标记的底物的底物缀合物，其中所述底物和所述标记任选地使用第三可释放接头来连接，
其中所述结合对的所述第二成员使用第四可释放接头来连接到所述酶。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220026433A1 (en) * 2018-11-15 2022-01-27 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Cleavable fluorescent tyramide for sensitive and multiplexed analysis of biological samples
CN114729391A (zh) * 2019-09-30 2022-07-08 阿科亚生物科学股份有限公司 用酶介导的放大的多路复用成像
CA3192588A1 (en) * 2020-09-15 2022-03-24 Ashwin Gopinath Structure and methods for detection of sample analytes
EP4347877A1 (en) 2021-06-01 2024-04-10 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection and probe resolution
CN117751197A (zh) 2021-06-02 2024-03-22 10X基因组学有限公司 使用不对称可环化探针的样品分析
US20230012607A1 (en) 2021-07-09 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for detecting analytes using sparse labelling
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
EP4326898A1 (en) 2021-08-16 2024-02-28 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
WO2023108139A2 (en) 2021-12-10 2023-06-15 10X Genomics, Inc. Multi-resolution in situ decoding
WO2023129898A2 (en) 2021-12-27 2023-07-06 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
WO2023141588A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
WO2023172915A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 10X Genomics, Inc. In situ code design methods for minimizing optical crowding
WO2023192302A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Spectral unmixing combined with decoding for super-multiplexed in situ analysis
WO2023192616A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
WO2023196526A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 10X Genomics, Inc. Methods for multiplex cell analysis
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
US20230408382A1 (en) 2022-05-31 2023-12-21 Ultivue, Inc. Methods and Systems for Removing a Histological Stain From a Sample
WO2023245190A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006104979A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Nanosphere, Inc. Method for detecting a target analyte
CN101374965A (zh) * 2006-01-17 2009-02-25 私募蛋白质体公司 测试样品的多元化分析
WO2012112563A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Magic Technologies, Inc. Methods and compositions for the target-localized anchoring of detectable label
CN102713626A (zh) * 2009-10-20 2012-10-03 丹麦达科有限公司 单个靶实体的免疫化学检测

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196306A (en) 1989-03-29 1993-03-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system
US5863748A (en) 1997-03-14 1999-01-26 New Life Science Products, Inc. p-Hydroxycinnamoyl-containing substrates for an analyte dependent enzyme activation system
US6355443B1 (en) 1999-03-17 2002-03-12 Mark Norman Bobrow 4-(4-hydroxystyryl) pyridine-containing substrates for an analyte dependent enzyme activation system
EP1634074B1 (en) 2003-06-12 2009-08-12 Perkinelmer Las, Inc. Hydrolytic substrates for an analyte-dependent enzyme activation system
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
JP2007089548A (ja) * 2005-09-30 2007-04-12 Univ Of Tokushima シグナル増幅方法
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US10227639B2 (en) 2011-12-22 2019-03-12 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
WO2015028382A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Ventana Medical Systems, Inc. Immunohistochemical assay for detection of cd3 and cd16
WO2016061460A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Carnegie Mellon University Enhanced biomolecule detection assays based on tyramide signal amplification and gammapna probes
JP7085999B2 (ja) 2016-02-17 2022-06-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 分子プログラミングツール
EP3551765A4 (en) 2016-12-09 2020-11-11 Ultivue, Inc. IMPROVED METHODS FOR MULTIPLEX IMAGING USING LABELED NUCLEIC ACID CONTRAST AGENTS
WO2018132392A2 (en) 2017-01-10 2018-07-19 President And Fellows Of Harvard College Multiplexed signal amplification
US10871485B2 (en) * 2018-04-13 2020-12-22 Rarecyte, Inc. Kits for labeling of biomarkers and methods of using the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006104979A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Nanosphere, Inc. Method for detecting a target analyte
CN101374965A (zh) * 2006-01-17 2009-02-25 私募蛋白质体公司 测试样品的多元化分析
CN102713626A (zh) * 2009-10-20 2012-10-03 丹麦达科有限公司 单个靶实体的免疫化学检测
WO2012112563A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Magic Technologies, Inc. Methods and compositions for the target-localized anchoring of detectable label

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IVAN SAKHAROV:, SENSORS,, vol. 18, no. 4, pages 1289 *
YUHONG WANG ET AL: ""Development of Chemiluminescent Lateral Flow Assay for the Detection of Nucleic Acids",", BIOSENSORS, vol. 2, no. 1, pages 32 - 42, XP055592461, DOI: 10.3390/bios2010032 *

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