CN101988112A - 一种egfr基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种EGFR表皮生长因子受体基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种EGFR基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【背景技术】

癌症也叫恶性肿瘤，肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的局部肿块。癌症病变的基本单位是癌细胞。人体细胞老化死亡后会有新生细胞取代它，以维持机体功能，人体绝大部分细胞都可以增生，但这种增生是有限度的，而癌细胞的增生则是无止境的，这使患者体内的营养物质被大量消耗。同时，癌细胞还能释放出多种毒素，使人体产生一系列症状，晚期时它转移到全身各处生长繁殖，最后导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及脏器功能受损等，器官功能衰竭而死亡。

EGFR表皮生长因子受体，在生理状态下是细胞生长的调节因子，与其配体如EGF、TGF-α结合后发挥其生理效应，可启动细胞生长周期，即通过一系列细胞内传递体将生长信号传导至核内引起细胞的生长反应，调节细胞的分裂、分化和增殖。在恶性肿瘤中，EGFR过度表达，持续向细胞内传递分裂增殖信号，干扰细胞分化的正常调控状态，引起细胞持续增殖，发生恶性转化。细胞系的实验研究对成釉细胞瘤细胞表面的表皮生长因子受体(ECFR)和C-erbB-2等生长因子受体进行了检测，发现肿瘤细胞表面的EGFR和C-erbB-2的阳性率分别为(42.20±3.42)％和(57.03±5.06)％。肿瘤生长和发展过程中，体内微环境对肿瘤细胞的分裂增殖具有重要意义，微环境和肿瘤细胞之间可通过自分泌、旁分泌和内分泌等方式产生的多种信号因子，单独或联合调控肿瘤细胞的增殖生长。C-erbB-2与EGFR的结构相似，已有实验证明在肺癌和黑色素瘤患者中EGFR阳性细胞的转移和继发生长能力都强于EGFR阴性的细胞亚群。实验中近半数的肿瘤细胞表面存在EGFR和C-erbB-2等生长因子受体，推测成釉细胞瘤本身分泌的生长因子和细胞表面的生长因子受体可能在肿瘤细胞体内增殖和侵袭等过程中起重要作用。有大量文献报道EGFR基因各种癌症发病有关，EGFR基因表达变化明显增加。在肺癌、胰腺癌和结直肠癌等多种肿瘤患者的外周血中可以检测到表皮生长因子受体(EGFR)的表达。肺癌和良性疾病之间外周血血清EGFR水平无差别，但在伴有淋巴结转移的肺癌中的表达与无转移组之间差别显著，血清EGFR水平可作为肺癌淋巴结转移的指标。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到基因水平的早期预测诊断。采用核酸原位杂交技术检测Egfr基因的表达量，对临床各种类型癌症的早期基因水平的诊断有非常重要的临床意义。EGFR基因序列号：NM_005228，5616bp，mRNA，7p12″CDS：247……3879bp。

本发明的原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒的用途。

本发明的再一的目的是，提供一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的另一的目的是，提供一种EGFR基因的原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的疾病是肾癌，胰腺癌，结直肠癌或肺癌。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID N0.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种EGFR基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症发生动态过程，以及用于癌症预防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测EGFR异常表达，在影像医学检查及其它检查未发现占位性癌症病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中肾癌症病人EGFR基因表达图片。

图2是本发明实施例中胰腺癌症病人EGFR基因表达图片。

图3是本发明实施例中肺癌症病人EGFR基因表达图片。

图4是本发明实施例中正常人EGFR基因表达图片。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液        100μl/管  1管/盒    无色透明液体

保护液        100μl/管  1管/盒    无色透明液体

预杂交液      1300μl/管 2管/盒    无色透明液体

正义杂交液    10μl/管   1管/盒    无色透明液体

反义杂交液    10μl/管   1管/盒    无色透明液体

封闭液        1000μl/管 1管/盒    无色透明液体

碱性磷酸酶抗体1μl/管    1管/盒    无色透明液体

显色剂A       175μl/管  1管/盒    黄色液体

显色剂B       320μl/管  1管/盒    无色透明液体

缓冲液I 10x   90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x  80ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x 20m/瓶     3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x  90ml/瓶    1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

固定液        90ml/瓶    1瓶/盒    无色透明液体

阳性对照标本   6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloki ng(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H₂O  360g

KCl  2g

KH₂PO₄2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl  175.3g

柠檬酸钠88.2g

HCl  几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris  121.1g

NaCl 87.66g

HCl  60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种EGFR基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；

按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的EGFR基因表达量，用来确定癌症是否发生。临床研究表明，EGFR基因是癌症的特异基因，因为EGFR基因在正常人中不表达，唯独在癌表达，说明癌症已经发生，用来确定癌症是否发生，或是正常。从而获得癌症的诊断信息。

本发明实施例采样为：肾癌病人5名，胰腺癌病人5名，肺癌病人5名，正常对照组5名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症患者EGFR基因有过度表达，细胞染色；正常对照组EGFR基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1，图2，图3和图4。

实施例3

用EGFR基因试剂盒检测肾癌疾病与用VEGF基因试剂盒检测肾癌疾病之间平行实验。

为了科学评价上述基因各自在肾癌疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例肾癌疾病患者的外周血，同时检测EGFR基因和VEGF基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现EGFR基因在肾癌疾病病人中表达量比VEGF基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，EGFR基因对肾癌疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比VEGF基因更好，原位杂交基因表达图显示，EGFR基因的表达量是70％，VEGF基因的表达量是50％。本发明的试剂盒作于肾癌疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>5616

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

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gagcacaagc cacaagtctt ccagaggatg cttgattcca gtggttctgc ttcaaggctt    4380

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caagagagga tgacacatca aataataact cggattccag cccacattgg attcatcagc    4740

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Claims (10)

1.一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³¹P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种EGFR基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种EGFR基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

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