DE19860313A1

DE19860313A1 - Verfahren zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene

Info

Publication number: DE19860313A1
Application number: DE19860313A
Authority: DE
Inventors: Friedrich Felsenstein; Fritz Thuemmler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1998-12-24
Publication date: 2000-06-29
Anticipated expiration: 2018-12-25
Also published as: DE19860313B4

Abstract

Bereitgestellt wird ein Verfahren, insbesondere Screening-Verfahren, zur Erkennung und/oder Charakterisierung der anti-pflanzenpathogenen Wirksamkeit von Agenzien, insbesondere von Fungiziden, Insektiziden, Bakteriziden, virotoxischen Stoffen, nematotoxischen Stoffen oder Zusammensetzungen, die einen oder mehrere dieser Stoffe enthalten. Die Erkennung bzw. die Charakterisierung der Wirksamkeit anhand der Veränderung der Expressionsstärke der Gene erfolgt auf molekularer Ebene, insbesondere auf RNA-, Proteinebene oder Promotor-Ebene.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung und/oder zur Cha rakterisierung der anti-pflanzenpathogenen Wirksamkeit von Agenzien, ins besondere ein Screening-Verfahren für derartige Agenzien. Des weiteren betrifft die Erfindung die mit diesem Verfahren erhältlichen DNA-Sequenzen, insbesondere aus Kartoffeln bzw. Phytophthora infestans (Kraut- und Knol lenfäule), die Verwendung derartiger Sequenzen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Es handelt sich dabei um ein in vivo-Verfahren, bei dem die Inter aktion zwischen Pflanze und Pathogen auf Genebene analysiert wird. Ana lysiert wird die differentielle Expression von Genen, deren Expression durch Pathogeninfektion verändert wird. Der Verlauf und die Stärke der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen dient als Parameter zur Abschätzung der an tipflanzenpathogenen Wirksamkeit einer Substanz. Die Betrachtung ist da bei im Rahmen der Erfindung nicht auf das Pathogen fixiert, sondern be rücksichtigt in hohem Ausmaß den Wirtsorganismus und seine entsprechen den Reaktionen.

Der Wirtsorganismus und seine infektionsabhängige differentielle Genexpression sind ein wichtiger Informationsbestandteil für die Erkennung und Charakterisierung der antipflanzenpathogenen Wirksamkeit eines Agens.

Die bisher angewandten Verfahren zur Erkennung pathogenwirksa mer Substanzen, d. h. von gegen ein Pathogen wirkenden Agenzien, zielen vornehmlich darauf ab, anhand der Reaktion des Erregers die Wirksamkeit der Substanzen zu erkennen und zu quantifizieren. Im Mittelpunkt der bis herigen Betrachtungsweise gemäß dem Stand der Technik steht folglich das Pathogen, insbesondere sein Wachstum, seine Entwicklung, Ausbreitung und erkennbare Symptomausprägung.

Bei fakultativen Pathogenen werden die Untersuchungen im sog. Massen-Screening zumeist an den Pathogenen in geeigneten Nährmedien vorgenommen, die mit der zu untersuchenden Substanz versetzt sind. Hier zu dient vielfach das Mikrotiter-Verfahren. Eine Beschreibung findet sich in PIJLS et al., (1994) "A rapid test to evaluate in vitro sensitivity of Septoria tri tici to flutriafol using a microtitre plate reader" (Plant Pathology 43, 726-732). Hierbei ergeben sich jedoch oftmals grundlegende Probleme: Zum einen können aufgrund der methodischen Schwankungsbreite die Substanzen nicht immer als wirksam identifiziert werden, zum anderen sind die Befunde über etwaige potentielle Wirkstoffe nicht automatisch auf die Pflanze über tragbar, da hier noch eine ganze Reihe weiterer Faktoren wie beispielsweise die etwaige Umwandlung einer Substanz im Wirtsorganismus (Metabolis mus) die Wirksamkeit positiv oder negativ beeinflussen können. Folgeunter suchungen an der Pflanze im Gewächshaus oder im Feld können daher zu Ergebnissen führen, die den Ergebnissen der in vitro-Versuche widerspre chen. Fehleinschätzungen und -planungen sowie größere ökonomische Ein bußen sind damit die zwangsläufige Folge.

Zudem stehen für das Folgescreening an der Pflanze in der Regel nur sehr geringe Substanzmengen zur Verfügung, wobei gleichzeitig die Anzahl der zu prüfenden Substanzen möglichst hoch sein soll. Beide Gesichtspunk te sind mit dem herkömmlichen Gewächshausversuchswesen nur schwer in den Griff zu bekommen und limitieren wie ein Flaschenhals den Substanz durchsatz. Ein Verfahren, das eine Miniaturisierung und Beschleunigung des Prüfsystems erlaubt, böte hier erhebliche Vorteile.

Bei obligaten Erregern erfolgt auch das Massenscreening an leben dem Pflanzenmaterial. Dabei werden als Parameter die Entwicklung, das Wachstum, die Symptomausprägung oder die Reproduktion des Krankheits erregers herangezogen. Der von Pathogen zu Pathogen unterschiedlich ho he Zeitbedarf bis zur Symptomausprägung ist als ein Nachteil dieser Metho de anzuführen. Des weiteren unterliegt die Symptomausprägung bei etlichen Krankheitserregern (z. B. Rostkrankheiten) oftmals einem breiteren Schwan kungsbereich, was eine korrekte Beurteilung der Substanz erheblich er schwert. Eine Miniaturisierung der bisherigen Systeme ist zudem nur schwer zu realisieren, so daß der Umgang mit den nur in kleinen Mengen zur Verfü gung stehenden Probesubstanzen ebenfalls ein limitierendes Problem dar stellt.

Weitere Probleme ergeben sich aus der Art der Auswertung der Bio tests; diese erfolgt zumeist von Auge durch hierfür extra geschulte Perso nen. Dabei müssen eine Vielzahl von Proben in kurzer Zeit bonitiert werden und die untersuchende Person muß schnell und spontan den Infektionsgrad der Proben visuell erkennen - ein Nacharbeiten der subjektiven Ergebnisse ist zu einem späteren Zeitpunkt in der Regel nicht mehr möglich.

Muß zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Substanz bis zur Sym tomausprägung gewartet werden, so birgt das noch einen zusätzlichen, ganz erheblichen Nachteil in sich, nämlich die Kreuzkontaminationsgefahr be nachbarter Testansätze. Bisher konnte einer derartigen Kontaminationsge fahr nur durch erhöhten technischen Aufwand entgegengewirkt werden, wo bei eine klare räumliche Trennung zumeist mit einem sehr hohen Platzbe darf verbunden ist. Auch mit hohem Aufwand ist jedoch mit der bisherigen Methode die Gefahr der Kreuzkontamination nicht ganz zu vermeiden und diese stellt somit einen nicht zu unterschätzenden limitierenden Faktor dar.

Unter Berücksichtigung des Standes der Technik und der vorstehend genannten, dabei auftretenden Probleme liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein schnelles, kostengünstiges und zuverlässiges Verfahren zur Untersuchung der anti-pflanzenpathogenen Wirksamkeit von Agenzien be reitzustellen, das die vorstehend erwähnten Nachteile der gängigen Unter suchungsverfahren vermeidet. Es soll insbesondere auch für Screening- Verfahren verwendbar sein.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren, insbesondere Screening- Verfahren, zur Erkennung und/oder Charakterisierung der anti-pflanzen pathogenen Wirksamkeit von Agenzien gelöst, wobei die Erkennung bzw. die Charakterisierung der Wirksamkeit anhand der Veränderung der Ex pressionsstärke der Gene auf molekularer Ebene bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen erfolgt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Interaktionen von Pflanze und Pathogen auf Ebene der Genexpression von Beginn an qualita tiv und quantitativ bestimmt werden. Der Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß die infektionsabhängig veränderte Genexpression (differentielle Genex pression) sowohl seitens des Wirts (Pflanze) als auch seitens des Erregers sichtbar gemacht werden kann. Das Verfahren kann zur Aufdeckung und näheren Charakterisierung wirksamer Substanzen gegen Pathogene genutzt werden. Die gewonnenen - molekularen - Daten sind eine hervorragende Informationsgrundlage zur raschen und sicheren Abschätzung der Wirksam keit der untersuchten Substanzen. Mit Hilfe der Ergebnisse lassen sich die Nachteile der bisher genutzten Verfahren (Fehleinschätzungen u. a., s. o.) vermeiden. Man befindet sich auf der untersten Reaktionsebene (Erken nungs- und Genaktivierungsebene) der Infektion (Wirt-Parasit-Interaktion). Man ist damit beispielsweise nicht mehr auf eine sichtbare (makroskopische bzw. mikroskopische) Symptomausprägung durch den Krankheitserreger mit all den damit verbundenen Schwierigkeiten und Unzulänglichkeiten ange wiesen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in seinen verschiedenen Aspekten ergeben sich klar quantifizierbare Unterschiede in der Intensität der Ausprägung der molekulargenetischen Parameter und es läßt sich ex plizit die Wirksamkeit einer Substanz bestimmen.

Des weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund seines differentiellen Ansatzes zur Klärung von Wirkmechanismen der antipathoge nen Substanz am Pathogen beitragen, da die Wirt-Pathogen-Interaktion so wohl in ihrer Qualität, Quantität als auch hinsichtlich ihrer Kinetik darstellbar wird. So ließe sich anhand der differentiellen Genexpression beispielsweise aufzeigen, in welchem Infektionsstadium eine antipathogene Substanz auf das Pathogen einwirkt.

Außerdem hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß die objektiven in vivo Daten direkt von einem Computer gesammelt werden und auch zu einem viel späteren Zeitpunkt beliebig oft ausgewertet und überar beitet werden können.

Aufgrund der Möglichkeit zur Identifizierung und Charakterisierung infektionsspezifischer Gene auf der Pathogenseite ergeben sich aus dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Perspektiven zur Aufklärung von Resi stenzmechanismen bei Pathogenen gegenüber Wirkstoffen. Daneben ist die Bestimmung von neuen Targets für das Fungizidscreening denkbar.

Gemäß einem ersten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens er folgt die Erkennung bzw. die Charakterisierung der Wirksamkeit anhand der Genexpression auf der Ebene der RNA.

Eine erste bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt umfaßt die Schritte:

a) Anlegen einer Genbank mit Gensequenzen, deren Expression sich bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen ändert,
b) Behandlung von pflanzlichen Strukturen mit dem auf anti- pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Behandlung mit dem Pathogen,
c) Isolierung der RNA des Behandlungsansatzes von Schritt b), be vorzugterweise Isolierung der mRNA,
d) Herstellung einer Hybridisierungssonde zu der RNA von Schritt c),
e) Hybridisierung der in Schritt a) erhaltenen Gensequenzen mit der Sonde von Schritt d) und/oder mit der RNA aus Schritt c) und
f) Nachweis einer Veränderung der Expression der Gensequenzen von Schritt a).

Erfindungsgemäß wird hierbei und nachfolgend unter einer pflanzli chen Struktur ein beliebiger Teil einer Pflanze verstanden, d. h. also etwa ein Blatt, Sproßteile, Teile von Wurzeln oder auch Pflanzenzellen, z. B. auch aus der Kultur. Natürlich ist auch jedes Gemisch derartiger Strukturen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar.

Beim vorstehend beschriebenen Verfahrensschritt b), der die Behand lung von pflanzlichen Strukturen mit dem auf anti-pflanzenpathogene Wirk samkeit zu prüfenden Agens sowie die Behandlung mit dem Pathogen be trifft, ist die Reihenfolge der Behandlung mit dem Pathogen und mit dem auf anti-pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens gleichgültig; es kann also die pflanzliche Struktur sowohl zuerst mit dem Pathogen und dann mit dem auf anti-pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens be handelt werden, als auch umgekehrt. Die Beliebigkeit der Reihenfolge der Behandlung mit dem Pathogen und mit dem auf anti-pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens gilt auch für alle übrigen Varianten des er findungsgemäßen Verfahrens.

Unter Hybridisierungssonde wird jegliche Nukleinsäurestruktur ver standen, die mit den Gensequenzen von Verfahrensschritt a) zu hybridisie ren in der Lage ist. Wie diese Sonde hergestellt wird, ist primär nicht ent scheidend. Es kann sich dabei also um eine chemisch synthetisierte oder aber auch um eine mittels moderner molekularbiologischer Methoden her gestellte Nukleinsäure-Sequenz handeln, insbesondere eine cDNA. Auch kann die RNA direkt ohne Modifizierung eingesetzt werden.

Der Hybridisierungsschritt selbst erfolgt unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. "Molecular cloning, a laboratory manual", 2. Aufl., J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Labora tory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Der Nachweis einer Veränderung der Expression der Gensequenzen [in Schritt f)] des vorstehend erwähnten Schritts a) kann mit verschiedenen Techniken geführt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver fahrens erfolgt der Nachweis der Veränderung der Expression der Gense quenzen in Schritt f) mittels reverser Northernhybridisierung von DNA- Arrays. Grundsätzlich ist aber auch der Einsatz einer Northern-blot- Hybridisierungstechnik denkbar ebenso wie Nuklease-Protektion oder klas sische RNA-Dotblot-Hybridisierungs sowie der direkte Nachweis von RNA mit elektrochemischen Reportersystemen (elektrischer DNA-Chip).

Eine bevorzugte zweite Ausführungsform des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfaßt die Schritte:

a) Anlegen einer Genbank mit Gensequenzen, deren Expression sich bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen ändert,
b) Behandlung von pflanzlichen Strukturen mit dem auf anti- pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Behandlung mit dem Pathogen,
c) Isolierung der RNA des Behandlungsansatzes von Schritt b), be vorzugterweise Isolierung der mRNA,
d) Herstellung einer cDNA zu der RNA von Schritt c),
e) Nachweis einer Veränderung der Expression der Gensequenzen von Schritt a).

Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird der Nachweis der Veränderung der Expression der Gensequenzen, d. h. ob sich die Menge und/oder die Zusammensetzung der in Schritt c) isolierten RNA geändert hat, in Schritt e) mittels einer PCR (polymerase-chain-reaction) unter Einsatz entsprechender Primer durchgeführt (Methode der RT-PCR). Dazu wird die zu untersuchende RNA-Population mit Hilfe der reversen Transkriptase (RT) und entsprechender Oligonukleotidprimer in cDNA umge schrieben. Die Anwesenheit bzw. die Konzentration einer cDNA für ein Gen von Interesse kann dann mit Hilfe der PCR-Reaktion mit den genspezifi schen Oligonukleotidprimern und den bei der PCR-Reaktion üblichen Nach weisverfahren bestimmt werden.

Erfindungsgemäß erfolgt bei den verschiedenen Aspekten des erfin dungsgemäßen Verfahrens das Anlegen der Genbank - in Schritt a) - vorzugsweise, indem

1. a-1) pflanzliche Strukturen mit dem Pathogen behandelt werden,
2. a-2) mRNA aus den Strukturen von a-1), aus nicht-behandelten pflanzlichen Strukturen und aus dem Pathogen isoliert wird,
3. a-3) cDNA der in Schritt a-2) erhaltenen mRNA hergestellt wird,
4. a-4) aus der cDNA von Schritt a-3) unter Einsatz von subtraktiver Hy bridisierung und Suppressions-PCR die Genbank angelegt wird.

Gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung wird erfindungsgemäß zur Lösung der Aufgabe ein Verfahren bereitgestellt, bei dem die Erkennung der Wirksamkeit anhand der Genexpression auf Promotorebene erfolgt.

Bei diesem zweiten Aspekt der Erfindung umfaßt eine bevorzugte Ausführungsform die Schritte:

a) Isolierung der Promotor-Sequenzen von Genen, deren Aktivität sich bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen ändert,
b) Herstellung eines Reporter-Konstrukts, enthaltend den Promotor und ein Reportergen,,
c) Einbringen des Konstrukts in eine pflanzliche Struktur,
d) Behandlung der pflanzlichen Struktur mit dem auf antipflanzenpa thogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Behandlung mit dem Pa thogen,
e) Nachweis einer Veränderung der Expression des Reporter-Kon strukts in den behandelten pflanzlichen Strukturen.

Auch hier ist die Reihenfolge der Behandlung mit dem auf anti pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens und mit dem Pathogen gleichgültig.

Unter Reportergenen werden solche Gene verstanden, deren Gen produkte Enzyme darstellen, welche biochemische Reaktionen katalysieren, bei denen gefärbte bzw. fluoreszierende Substanzen entstehen, die sehr leicht in den transgenen Zellgeweben nachgewiesen werden können. Die Stärke der Farb- bzw. Fluoreszenzreaktion ist dabei ein Maß für die Menge an synthetisiertem Reporter-Enzym. Für das erfindungsgemäße Verfahren sind dabei insbesondere die β-Glucuronidase, die Luciferase oder das "Green Fluorescent Protein" (GFP) von Bedeutung.

Der Begriff "Konstrukt" bedeutet hier und nachfolgend, daß darunter alle chimären Gene zu verstehen sind, die am 5'-Ende aus dem aus Schritt a) isolierten Promotorfragment, zentral aus einem der erwähnten Re portersequenzen und 3' aus einer Terminatorsequenz, wie z. B. dem NOS- Terminator, zusammengesetzt sind. Das chimäre Gen ist dabei in ein gängi ges Pflanzen-Transformations-Plasmid ligiert, welches Wachstum und Se lektion des Konstrukts in E.coli-Zellen ermöglicht und zum anderen den pflanzlichen Selektionsmarker trägt.

Das Einbringen der Konstrukte kann mit Standard-Techniken erfolgen wie z. B. mit Hilfe von Agrobakterien oder durch direkten DNA-Transfer mit tels Mikropartikelbombardierung von Pflanzengewebe oder Elektroporation oder Polyethylenglycol(PEG)-Behandlung von pflanzlichen Protoplasten. Die verschiedenen Methoden sind in dem Buch "Practical Application of Plant Molecular Biology" (Henry 1997, Chapman & Hall, London) zusammenfas send beschrieben.

Gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung wird erfindungsgemäß zur Lösung der Aufgabe ein Verfahren, insbesondere Screening-Verfahren, zur Erkennung und/oder Charakterisierung der anti-pflanzenpathogenen Wirk samkeit von Agenzien bereitgestellt, wobei die Erkennung bzw. die Charak terisierung der Wirksamkeit anhand der Veränderung der Expressionsstärke der Gene auf molekularer Ebene, nämlich auf Proteinebene, bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen erfolgt.

Bei diesem dritten Aspekt der Erfindung umfaßt eine bevorzugte Ausführungsform die Schritte:

a) Behandlung von pflanzlichen Strukturen mit dem auf anti pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Behandlung mit dem Pathogen,
b) Herstellen eines Proteinextraktes aus der pflanzlichen Struktur von Schritt a),
c) Nachweis einer Induktion und/oder einer Veränderung des Gehalts der Zielproteine in dem Extrakt von Schritt b).

Der Nachweis der Zielproteine in Schritt c), d. h. der jeweils interessie renden Proteine, die natürlich gegebenenfalls auch in modifizierter Form - etwa glykosyliert etc. - vorliegen können, erfolgt bevorzugterweise mit Hilfe von Antikörpern, insbesondere mittels eines ELISA-Verfahrens oder auch mittels der Enzymaktivität der Proteine von Interesse in einem Enzymtest.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis einer Verände rung der Genexpression auf Proteinebene anhand der Enzymäktivität sind dabei die Chitinase Klasse II und die basische Beta-1,3-Glucanase Klasse III von besonderer Bedeutung. Die entsprechenden Enzymtests können, wie bei Wirth und Wolf (1992, Soil Biological Biochemistry 24, 511-519) bzw. Lever (1972, Analytical Biochemistry 47, 273-279) beschrieben, durchge führt werden.

Bei den in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Pathoge nen handelt es sich vorzugsweise um Insekten, Viren, Bakterien, Pilze oder Nematoden. Besonders erwähnt seien dabei die Pathogene, die im einzel nen in den bekannten Phytomedizinbüchern aufgeführt sind (z. B. "Parasitäre Krankheiten und Schädlinge an landwirtschaftlichen Kulturpflanzen", G. M. Hoffmann & H. Schmutterer, Hrsg., Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart, 1983 und "Krankheiten der Wald- und Parkbäume", H. Butin, Hrsg., Georg Thieme Verlag Stuttgart-New York, 1996).

Als Agens kommen für den Einsatz bei dem erfindungsgemäßen Ver fahren in allen seinen Aspekten grundsätzlich alle chemisch synthetisierten und/oder natürlichen Substanzen in Frage. Diese können eine anti-pflanzen pathogene Wirksamkeit, insbesondere fungizide, insektizide, bakterizide, vi rotoxische oder namatotoxische Wirksamkeit besitzen.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Gensequen zen sind aus Gensequenzen ausgewählt, die bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen differentiell exprimiert werden, d. h. ihre Expression ist geändert, was einerseits bedeuten kann, daß die Expression entweder induziert oder gegenüber einem Basiswert verstärkt wird, andererseits aber auch, daß sie reduziert werden kann.

Bei diesen Gensequenzen handelt es sich insbesondere um solche der pflanzlichen Abwehrantwort, bevorzugt um ein Abwehrgen, ein wund induziertes Gen oder deren Homologe. Hierbei und auch sonst im Verlaufe der Beschreibung der Erfindung ist "ein" immer im Sinne von "irgendein", d. h. auch beliebig mehrere, zu verstehen, sofern nichts anders angegeben ist.

Unter homologen Genen werden im Rahmen der Erfindung Gene verstanden, welche in verschiedenen Organismen identische Funktionen ausüben; insbesondere sind solche Gene gemeint, die bei einer Hybridisie rung unter bestimmten Bedingungen, etwa [30% (v/v) Formamid, 6 × SSC, 5 × Denhardts, 0,1% SDS, bei 42°C; gewaschen mit 2 × SSC bei 65°C] in der Lage sind, miteinander zu hybridisieren.

Zu den Genen der pflanzlichen Abwehrantwort gehören insbesondere (zusammengefasst in den Lehrbüchern "Phytopathologie - Allgemeine und biochemische Grundlagen", E. F. Elstner, W. Oswald und I. Schneider, Hrsgg, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1996, und "Plant Patho logy", 4. Aufl., G. N. Agrios Ed., Academic Press San Diego, 1997): Abwehr gene, insbesondere die "Pathogenesis Related" Gene (PR-Gene) [Kombrink und Somssich, "The Mycota V, Part A, Plant Relationships", Carroll/Tud zynski (Hrsg.), S. 107 bis 128, Springer Verlag Berlin Heidelberg New York (1997)], Gene der "Systemic Acquired Resistance" (SAR-Gene) wie z. B. das Gene des Prosystemins oder Proteinaseinhibitoren-Gene (pin1 und 2), Gene des Hypersensitiven Respons (HR-Gene) wie etwa das Gen der ACC- Synthetase, ACC-Oxidase oder der NADH-Oxidase, Gene für die Papillen bildung wie etwa der hydoxyprolinreichen Glykoproteine (HPRG) oder der glycin-prolinreichen Proteine, wundinduzierte Gene, stressinduzierte Gene wie Lipoxygenase, Katalase, Glutathion S-Transferase (GST) oder Enzyme des Phenol- und Phytoalexin-Stoffwechsels wie Phenylalaninammoniumlya se (PAL), Chalconsynthase (CHS), 4-Cumaryl-CoA-Ligase (4CL), Stilben synthetase (STS), Peroxidasen (POD), Polyphenoloxidasen (PPO). Erfin dungsgemäß kann es sich bei der differentiell exprimierten Gensequenz auch um ein in planta induziertes (ipi) Gen des Pathogens handeln, wie z. B. das ipiO-Gen (West et al. 1998, Fungal Genet. Biol. 23, 126-138), Avirulenz- Gene (avr/pth), hpr-Gene (Gene für HR und Pathogenität), Gene für Patho genitäts-Faktoren (pat) oder "disease-specific" Gene (dsp), Gene für zell wandabbauende Enzyme wie pectolytische Enzyme, Cutinasen oder Cellu lasen (zusammengefasst in "Plant Pathology", 4. Aufl., G. N. Agrios Hrsg., Academic Press San Diego, 1997).

Erfindungsgemäß werden die Gene der vorstehend erläuterten pflanzlichen Abwehrantwort oder die in planta induzierten Gene eines Pa thogens, insbesondere die vorstehend genannten wundinduzierten Gene, stressinduzierten Gene sowie die in der nachfolgenden Tab. I aufgelisteten Gene oder Homologe der genannten Gene zur Erkennung und/oder Charak terisierung der Wirksamkeit anti-pflanzenpathogener Agenzien, insbesonde re zum Screening anti-pflanzenpathogener Agenzien verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren in allen seinen Varianten eignet sich prinzipiell für alle Pflanzen bzw. deren Gene. Zu diesen Pflanzen gehö ren insbesondere Pflanzen, die in Deutschland angebaut werden. Dazu ge hören Pflanzen des Ackerbaus (Getreide einschließlich Mais, Kartoffel, Zucker- und Futterrübe, Raps und Rübsen, Klee, Lupine, Luzerne, Tabak, Hop fen sowie Pflanzen aus der Grünlandbewirtschaltung), Pflanzen des Gemü sebaus (Erbse, Bohne, Gurke, Tomate, Kohl und Kohlrübe, Rettich und Ra dieschen, Möhre, Salat und Endivie, Sellerie, Zwiebel und Lauch, Spargel), Pflanzen des Obstbaus (Apfel, Birne, Kirsche, Pflaumen und Zwetschge, Pfirsich, Erdbeere, Johannisbeere, Stachelbeere, Himbeere, Weinrebe), ebenso forstwirtschaftliche Pflanzen (Fichte, Kiefer, Tanne, Lärche, Dougla sie, Eiche, Rotbuche, Ahorn, Esche, Ulme, Vogelkirsche, Linde, Hainbuche, Birke, Pappel, Aspe, Rosskastanie, Robinie, Weide), aber auch alle wirt schaftlich genutzten Pflanzen, die in Deutschland nicht angebaut werden können. Dazu gehören insbesondere die Pflanzen die in dem vorstehend erwähnten Lehrbuch "Plant Pathology" (G. N. Agrios, Hrsg.) aufgeführt sind.

Insbesondere können die folgenden DNA-Sequenzen für die ver schiedenen Aspekte des Verfahrens zur Erkennung der anti-pflanzenpatho genen Wirksamkeit von Agenzien, insbesondere Screening-Verfahren, ein gesetzt werden, wobei es sich dabei um Sequenzen handelt, die beim Anle gen der Genbanken mittels Kartoffeln und dem Pathogen Phytophtora in festans gefunden wurden:

Tabelle I

Hierbei bedeutet N ein beliebiges Nukleotid, ausgewählt aus A, C, G, T.

Die Isolierung bzw. Herstellung der in Tab. 1 wiedergegebenen DNA- Sequenzen erfolgt mit einem Verfahren, umfassend die Schritte

a) Behandlung von pflanzlichen Strukturen von Kartoffeln mit dem Pathogen Phytophthora infestans,
b) Isolierung der mRNA aus den Strukturen von a), aus nicht- behandelten pflanzlichen Strukturen und aus dem Pathogen,
c) Herstellung der cDNA von der in Schritt b) erhaltenen mRNA,
d) Anlegen einer Genbank aus der cDNA von Schritt c) unter Einsatz von subtraktiver Hybridisierung und Suppressions-PCR.

Im einzelnen sind die vorstehend genannten Verfahrensschritte, die bei der Isolierung der Kartoffel- bzw. Phytophthora infestans-DNA- Sequenzen durchgeführt wurden, in den Erläuterungen zu dem erfindungs gemäßen Verfahren, insbesondere Screening-Verfahren, zur Erkennung und/oder Charakterisierung der anti-pflanzenpathogenen Wirksamkeit von Agenzien, wobei die Erkennung bzw. die Charakterisierung der Wirksamkeit anhand der Veränderung der Expressionsstärke der Gene auf molekularer Ebene bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen erfolgt, näher ausgeführt.

Die Erfindung wird nachfolgend durch die Beispiele und die beigefügten Figuren näher erläutert. Es zeigen die Figur:

Fig. 1 zeigt das Ergebnis des Anwendungsbeispiels 1, bei dem die in den Herstellungsbeispielen 1 und 2 erzeugte Genbank nach differentiell exprim ierten Genen untersucht wurde.

Fig. 2 zeigt das Ergebnis des Anwendungsbeispiels 2, bei dem die Wirk samkeit eines Fungizids mit Hilfe differentiell exprimierter Gene und DNA- Array-Hybridisierungstechnik sichtbar gemacht ist.

Beispiele Sichtbarmachung der fungiziden Wirksamkeit einer Substanz bei der Infektion von Kartoffelblättern mit einer Zoosporensupension des Oomyceten Phytophthora infestans (Erreger der Krautfäule an Kartoffel und Tomate)

Bei den Beispielen wurden zunächst (Herstellungsbeispiel 1) cDNA- Fragmente von Genen isoliert, welche ausschließlich bzw. verstärkt in Phytophthora-infizierten Kartoffelblättern exprimiert werden (differentiell ex primierte Gene sowohl der Pflanze als auch des Erregers).

Anschließend wurden Proben der differentiell exprimierten Gene auf Membranfilter gitterförmig aufgetragen (Herstellungsbeispiel 2), wodurch sog. cDNA-Filter-Arrays entstanden. Für rund die Hälfte der gedotteten Ge ne konnte mit Hilfe von "reverser Northernhybridisierung" differentielle Ex pression in infizierten Blättern nachgewiesen werden (Anwendungs beispiel 1). Die cDNA-Arrays wurden anschließend dazu benutzt, die fungi zide Wirksamkeit einer Substanz (Metalaxyl) zu erkennen (Anwendungsbeispiel 2).

Herstellungsbeispiel 1 Klonierung von Genen, deren Expression durch die Infektion induziert wird, mit Hilfe von cDNA-Subtraktion und "Suppressions-PCR" (Gen- Identifizierung)

Zur Identifizierung der Gene, welche ausschließlich bzw. verstärkt im infiziertem Gewebe exprimiert werden (sowohl Pflanzengene als auch Gene des Erregers), wurde die Methode der subtraktiven Hybridisierung gekoppelt mit Suppressions-PCR angewandt. Das Experiment wurde mit dem "CLONTECH PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit" der Fa. CLONTECH (www.clontech.com) (U. S. Patent #5,565,340) (Katalog-Nr. K1804-1) exakt nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Methode ist datailliert von Ulrich Thoenes in Biospektrum 2. Jahrgang, 6.96, S. 51-52, beschrieben. Sie wird in der Literatur auch als "Suppression Subtractive Hybridization" (SSH) bezeichnet (Diatchenko L. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6025-6030). Sie dient dazu, in cDNA umgeschriebene mRNA-Populationen mit einander zu vergleichen und differentiell exprimierte Gene, die nur in einer mRNA-Population vertreten sind, selektiv anzureichern, wodurch die ent sprechenden cDNAs isoliert und charakterisiert werden können.

In dem beispielsgemäßen Verfahren wurde die mRNA-Population von infiziertem Blattmaterial ("natürliche" Mischung aus Wirt- und Errerger- mRNA) mit der mRNA-Population, bestehend aus einer "künstlichen" Mi schung aus mRNA von nicht infizierten Blätter und mRNA vom kultivierten Erreger, miteinander verglichen. Dabei "eliminieren" sich die RNAs, welche beiden RNA-Pools angehören, gegenseitig. Nur die spezifisch im infizierten Blattmaterial gebildeten mRNAs (in Form der umgeschriebenen cDNAs) bleiben übrig.

mRNA-Isolation

Hierzu wurden Kartoffelblätter mit einer Suspension von Phytophthora infestans Zoosporen infiziert. Kontrollblätter wurden nur mit Wasser behan delt. Anschließend wurden die behandelten Blätter für drei Tage in einer Klimakammer inkubiert. Nach der Inkubation wurde aus den Blättern die Ge samt-RNA präpariert. Ebenso wurde die Gesamt-RNA aus einer Phytophtho ra-Kultur gewonnen, die auf einem Nähragar aus Gemüsesaft gewachsen war. Die Methode der RNA-Isolation ist bei Pasentsis et al. [The Plant Jour nal (1998) 13 (1), 51-61] genau beschrieben. Bei der RNA-Präparation aus infizierten Blättern handelt es sich um eine Mischung aus Wirtspflanzen- RNA und RNA des Erregers, welcher sich in der Wirtspflanze vermehrt hat. Aus den Gesamt-RNAs wurden anschließend die entsprechenden mRNAs isoliert. Dies geschah durch Chromatographie der Gesamt-RNAs an Oligo- dT-Zellulose mit Hilfe von kleinen Spinsäulchen der Fa. Pharmacia (www.apbiotech.com) (Produkt-Nr. 27-9258-01) laut Firmenanleitung. Ent sprechend der Zusammensetzung der Gesamt-RNA bestand die mRNA- Präparation aus den infizierten Blättern, wie bereits erwähnt, aus einer Mi schung von mRNA der Wirtspflanze und mRNA des Erregers. Ebenso wurde die mRNA aus der Gesamt-RNA isoliert, welche aus der Phytophthora-Kultur gewonnen worden war.

cDNA-Synthese, Subtraktive Hybridisierung und Suppressions-PCR

Dabei wurde genau nach Kit-Vorschrift verfahren, wobei die oben be schriebenen mRNA-Präparationen in den Versuch eingesetzt wurden. Der eine Ansatz (in der Kitanleitung als 'Tester" bezeichnet) enthielt die "künst liche" Mischung aus mRNA der Kontrollblätter und der Phytophthora-Kultur, der andere Ansatz (in der Kitanleitung als "Driver") enthielt die mRNA der mit Zoosporen behandelten Blätter. Die Driver-mRNA-Population enthält die mRNAs, deren Expression spezifisch durch die Infektion induziert wird. Te ster- und Driver-mRNA wurden mit Hilfe des modifizierten Oligo-dT-cDNA- Syntheseprimers (Kit-Bestandteil) in cDNA umgeschrieben. Die synthetisier ten cDNA-Populationen wurden mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung miteinander verglichen und die im infizierten System differentiell exprimier ten Gene (Pflanze und Pilz) wurden anschließenden mit Suppressions-PCR (Diatchenko L. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6025-6030) spezfisch vermehrt.

Klonierung der Genfragmente, Herstellung einer Genbank

Die PCR-Fragmente der differentiell exprimierten Gene wurden dann mit Hilfe des TA-Klonierungsystems der Fa. INVITROGEN (www.clontech.com) (U. S. Patent #5,487,993) (Katalog-Nr. K2030-01) in den Vektor pCR1.2 ligiert und der Ligationsansatz wurde in competente E.coli- Zellen TOP10F' (Fa. INVITROGEN) transformiert. Aus der entstandenen Genbank, die rund 100.000 primäre Transformanten enthält und die ange reichert ist auf Gene, die infektionsabhängig exprimiert werden, wurden 96 Klone zufällig herausgepickt. Mittels Kolonie-PCR wurde aus den entspre chenden Bakterienkolonien die klonierten Genfragmente herausamplifiziert. Die durch die PCR-Reaktionen entstandenen doppelsträngigen DNA- Fragmente wurden mit Hilfe von Natronlauge (Endkonzentration = 0,2 M) zur Einzelstrangform denaturiert.

Herstellungsbeispiel 2: Anlegen von cDNA-Arrays

Aliquots der im Herstellungsbeispiel 1 erhaltenen einzelsträngigen DNA-Proben wurden dann gitterförmig im Muster von 96-Well Mikrotiterplat ten auf Membranfilter gedottet (cDNA-Array), wobei der Abstand der einzel nen Dots zueinander nach oben, nach unten und zu beiden Seiten je 4,5 mm betrug.

Anwendungsbeispiel 1 Sichtung der Genbank nach differentiell exprimierten Genen

Die benutzte Technik wird als reverse "Northernhybridisierung" oder auch als "Multiplex Messanger Assay" (MMA) bezeichnet. Dazu werden identische cDNA-Arrays mit komplexen Proben hybridisiert, die durch die Umschreibung von mRNA in markierte cDNA unter Verwendung eines Oligo- dT-Primers hergestellt werden. Ein entsprechender Versuch ist im Zusam menhang mit der T-Zellen-Aktivierung von Kanne Bernard et al. (Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 8, 1435-1442) beschrieben worden.

Es wurden Proben aus der RNA von Kontrollpflanzen, Phytophthora infizierten Pflanzen und von Phytophthora-Kulturen hergestellt. Die Gegen wart einer mRNA in den RNA-Präparationen (exprimiertes Gen), für welche ein Gen kodiert, von dem ein DNA-Stück auf den Filtern gedottet ist, wird durch ein Signal auf den Filtern erkennbar (schwarze Punkte in Fig. 1). Die Größe eines Dots (Signal) und dessen Schwärzungsgrad ist ein Maß für die Menge der entsprechenden mRNA in der RNA-Probe und damit ein Maß für den Expressionsgrad des entsprechenden Gens. Die Signale (Dots) können mit entsprechenden Geräten (Scanner; Phosphorimager) quantifiziert wer den. Zur besseren Quantifizierung der Signale wurde den RNA-Präparatio nen ein selbst hergestelltes Transkript, welches wie die nativen mRNAs ei nen längeren 5'-terminalen Poly-A-Schwanz trägt, als interner Standard in definierter Konzentration beigemischt. Die Menge des Transkripts korreliert mit der Signalstärke an Position C1 des DNA-Arrays (Fig. 1), an dem sich eine DNA-Probe für das Transkript befindet. Die Stärke der anderen Signale auf dem Array kann dann in Relation zu dem Signal auf Position C1 ange geben werden.

Bei der Probenherstellung wurde wie folgt vorgegangen: 10 µg der entsprechenden Gesamt-RNA-Präparation wurden mit einer definierten Mange Kontroll-Transkript versetzt und dem Ansatz 1 µg Oligo-dT_12-18 der Fa. Pharmacia (www.apbiotech.com) (Produkt-Nr. 27-7878-01) zugegeben. Das Reaktionsvolumen wurde mit sterilem Wasser auf 11 µl eingestellt und der Ansatz zur Denaturierung der RNA für 10 Minuten bei 65°C inkubiert. In der Zwischenzeit wurde ein Reaktionsmix mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Reaktionsmix

5 × RT-Puffer Gibco/BRL	5 µl
0,1 M DTT	2,5 µl
dCTP (0,1 mM)	1,25 µl
dATP/dTTP/dGTP-Mix (jeweils 10 mM)	1,25 µl
RNAguard (Pharmacia) Nr. 27-0815-01; 29,4 U/µl	1 µl
SuperScript II (Gibco/BRL, Nr. 18064-014; 200 U/µl)	1 µl
[α-³²P]dCTP (Amersham, 3000 Ci/mmol; 10 µCi/µl)	2 bis 5 µl

Nach der Denaturierung wurde die RNA-Probe auf 42°C abgekühlt und mit auf 42°C vorgewärmten Reaktionsmix gemischt. Die Synthese der ³²P-markierten cDNA fand dann bei 42°C eine Stunde lang statt. Nicht ein gebautes ³²P-markiertes dCTP wurde von der Probe durch Gelfiltration an einer Sephadex G50-Minisäule (Pharmacia) (www.apbiotech.com) (Produkt- Nr. 27-5330-01) abgetrennt. Für die markierten Proben wurde eine radioak tive Aktivität von rund 1-50 × 10⁶ dpm gemessen. Die cDNA-Array-Filter wurden mit Hybridisierungslösung [1% (w/v) Blocking-Reagenz (Boehringer Mannheim) (biochem.boehringer-mannheim.com) (Produkt-Nr. 1096176), 2 × SSC, 1% (w/v) N-Laurylsarcosinat, 1% (w/v) SDS] bei 65°C für 1 bis 4 Stunden vorhybridisiert. Anschließend wurde die Hybridisierungslösung ab geschüttet und durch 65°C warme Hybridisierlösung ersetzt, die rund 5 × 10⁶ dpm radioaktive cDNA-Probe enthielt. Die Hybridisierung wurde dann für rund 16 Stunden bei 65°C durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter zweimal für rund 20 Minuten mit 2 × SSC, 0,1% (w/v) SDS und dreimal für 20 Minuten mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS (w/v) bei 65°C gewa schen. Danach wurden die Filter kurz getrocknet und mit Hilfe des STROM Phosphor-Imagers (Molecular Dynamics, USA) (www.mdyn.com) ausgewer tet. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.

Wie aus Fig. 1 ersichtlich, liefern eine ganze Reihe von Genen (Dots) mit der Probe, die aus RNA von infizierten Kartoffelblättern hergestellt wur de, Signale. Die meisten dieser Gene reagieren nicht mit Proben, die mit RNAs aus Kontrollblättern oder aus Phytophtora-Kulturen hergestellt wur den. Diese Gene werden also nur bei Infektion exprimiert (differentiell ex primierte Gene). Deren Expressionsgrad stellt eine sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmbare Kenngröße für den Verlauf der Infektion dar.

Die Gene wurden sequenziert und sind in Tab. I aufgelistet.

Ausführungsbeispiel 2 Sichtbarmachung der Wirksamkeit eines Fungizids mit Hilfe der oben beschriebenen differentiell exprimierten Gene und DNA-Array- Hybridisierungstechnik

Grundlage des Nachweises ist die Tatsache, daß die Expression der infektionsinduzierten Gene durch die Metalaxyl-Behandlung aufgrund der fungiziden Wirkung der Substanz deutlich reduziert wird. Die Wirksamkeit kann folglich daran erkannt werden, daß die Signale auf den cDNA-Arrays nach Hybridisierung mit einer Probe aus wirkstoffbehandelten Blattmaterial, verglichen mit der Probe aus unbehandelten Blättern, abgeschwächt sind.

Es wurden Kartoffelblätter mit einer Lösung einer fungizid wirksamen Substanz (Metalaxyl) in einer Konzentration von 250 und 500 ppm behandelt und in einer Klimakammer für 24 Stunden inkubiert. Zur Kontrolle wurden Blätter derselben Kartoffelpflanze nur mit Wasser behandelt und in gleicher Weise wie die Testblätter weiterbehandelt. Die fungizidbehandelten Blätter und die Kontrollblätter würden anschließend mit Phytophthora Zoosporen infiziert und für weitere 12 bis 72 Stunden in einer Klimakammer inkubiert. Nach der Inkubation wurde aus den Blättern die Gesamt-RNA präpariert und aus diesen cDNA-Hybridisierungsproben wie oben beschrieben synthetisiert.

Identische, wie oben beschriebene cDNA-Arrays wurden mit Proben aus in fizierten Blättern, welche mit dem Fungizid bzw. mit Wasser vorbehandelt worden waren, hybridisiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

Wie in Fig. 2 ersichtlich, ist die Intensität der Signale mit der Probe "fungizidbehandelte Blätter" gegenüber der Intensität der Signale mit der Probe "wasserbehandelte Blätter" (Kontrolle) deutlich reduziert. Dies bedeu tet, daß die infektionsinduzierten Gene infolge der Fungizidbehandlung we sentlich schwächer exprimiert werden als in der Kontrollpflanze. Damit ist der Expressionsgrad der Gene, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, ein Maß für die Wirksamkeit des applizierten Fungizids, wobei sich der Expressionsgrad der Gene in der Signalstärke der entsprechenden Dots auf dem DNA-Array widerspiegelt.

Claims

1. Verfahren, insbesondere Screening-Verfahren, zur Erkennung und/oder Charakterisierung der anti-pflanzenpathogenen Wirksamkeit von Agenzien, wobei die Erkennung bzw. die Charakterisierung der Wirksamkeit anhand der Veränderung der Expressionsstärke der Gene auf molekularer Ebene bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen er folgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Erkennung bzw. die Charakteri sierung der Wirksamkeit anhand der Genexpression auf der Ebene der RNA erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, umfassend die Schritte:

a) Anlegen einer Genbank mit Gensequenzen, deren Expression sich bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen ändert,
b) Behandlung von pflanzlichen Strukturen mit dem auf anti pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Be handlung mit dem Pathogen,
c) Isolierung der RNA des Behandlungsansatzes von Schritt b), bevor zugterweise Isolierung der mRNA,
d) Herstellung einer Hybridisierungssonde zu der RNA von Schritt c),
e) Hybridisierung der in Schritt a) erhaltenen Gensequenzen mit der Sonde von Schritt d) und/oder mit der RNA aus Schritt c) und
f) Nachweis einer Veränderung der Expression der Gensequenzen von Schritt a).

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Nachweis der Veränderung der Expression der Gensequenzen in Schritt f) mittels einer Hybridisie rungstechnik erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Schritte:

a) Anlegen einer Genbank mit Gensequenzen, deren Expression sich bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen ändert,
b) Behandlung von pflanzlichen Strukturen mit dem auf anti pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Be handlung mit dem Pathogen,
c) Isolierung der RNA des Behandlungsansatzes von Schritt b), bevor zugterweise Isolierung der mRNA,
d) Herstellung einer cDNA zu der RNA von Schritt c)
e) Nachweis einer Veränderung der Expression der Gensequenzen von Schritt a).

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Nachweis der Veränderung der Expression der Gensequenzen in Schritt e) mittels einer PCR erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Anlegen der Genbank in Schritt a) erfolgt, indem

1. a-1) pflanzliche Strukturen mit dem Pathogen behandelt werden,
2. a-2) mRNAaus den Strukturen von a-1), aus nicht-behandelten pflanz lichen Strukturen und aus dem Pathogen isoliert wird,
3. a-3) cDNA der in Schritt a-2) erhaltenen mRNA hergestellt wird,
4. a-4) aus der cDNA von Schritt a-3) unter Einsatz von subtraktiver Hy-, bridisierung und Suppressions-PCR die Genbank angelegt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Erkennung der Wirksamkeit an hand der Genexpression auf Promotorebene erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, umfassend die Schritte:

a) Isolierung der Promotor-Sequenzen von Genen, deren Aktivität sich bei Infektion von Pflanzen mit Pathogenen ändert,
b) Herstellung eines Reporter-Konstrukts, enthaltend den Promotor und ein Reportergen,
c) Einbringen des Konstrukts in eine pflanzliche Struktur,
d) Behandlung der pflanzlichen Struktur mit dem auf antipflanzenpa thogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Behandlung mit dem Pathogen,
e) Nachweis einer Veränderung der Expression des Reporter-Kon strukts in den behandelten pflanzlichen Strukturen.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Erkennung der Wirksamkeit auf Proteinebene erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend die Schritte:

a) Behandlung von pflanzlichen Strukturen mit dem auf anti pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfenden Agens sowie Behand lung mit dem Pathogen,
b) Herstellen eines Proteinextraktes aus der pflanzlichen Struktur von Schritt a),
c) Nachweis einer Induktion und/oder einer Veränderung des Gehalts; der Zielproteine in dem Extrakt von Schritt b).

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Nachweis in Schritt c) mit Hilfe von Antikörpern erfolgt, insbesondere mittels eines ELISA-Verfahrens.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Nachweis der Proteine mittels der Enzymaktivität der Proteine in einem Enzymtest erfolgt.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Pathogen um Insekten, Viren, Bakterien, Pilze oder Nemato den handelt.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das auf seine anti-pflanzenpathogene Wirksamkeit zu prüfende Agens ein Fungizid, Insektizid, Bakterizid, ein virotoxischer Stoff oder ein nemato toxischer Stoff oder eine Zusammensetzung sein kann, die einen oder mehrere dieser Stoffe enthält.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der geändert exprimierten Gensequenz um ein pflanzliches Gen, insbesondere ein Gen der pflanzlichen Abwehrantwort, ein wundindu ziertes Gen und/oder ein stressinduziertes Gen oder Homologe dieser Gene handelt.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Gensequenz um ein in planta differentiell exprimiertes Gen des Pathogens handelt.

18. Verwendung von pflanzlichen Genen oder von in planta differentiell ex primierten Genen eines Pathogens, insbesondere von Genen der pflanzlichen Abwehrantwort, wundinduzierten Genen und/oder stressinduzierten Genen oder deren Homologen zur Erkennung und/oder Charakterisierung der Wirksamkeit anti-pflanzenpathogener Agenzien, insbesondere zum Screening anti-pflanzenpathogener Agenzien.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei es sich um Gene aus garten baulich, landwirtschaftlich oder forstwirtschaftlich genutzten Pflanzen handelt.

20. DNA-Sequenz oder deren Homologes mit einer der folgenden Stuktu ren 1 bis 20

21. Verfahren zur Herstellung der DNA-Sequenzen nach Anspruch 20, umfassend die Schritte

22. Kartoffel-DNA-Sequenz, erhältlich mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei als Pflanze Kartoffeln und als Pathogen insbesondere Phytophthora infestans eingesetzt werden.

23. Phytophthora infestans-DNA-Sequenz, erhältlich mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei als Pathogen Phytophthora infestans und als Pflanze insbesondere Kartoffeln eingesetzt werden.

24. Verwendung der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 20, 22 oder 23 oder deren Homologe zur Erkennung und/oder Charakerisie rung der Wirksamkeit anti-pflanzenpathogener Agenzien, insbesondere zum Screening anti-pflanzenpathogener Agenzien.