EP1102856A1 - Verfahren zur erhöhung der widerstandskraft von kulturpflanzen gegen phytopathogene pilze und bakterien mit hilfe molekulargenetischer methoden - Google Patents

Verfahren zur erhöhung der widerstandskraft von kulturpflanzen gegen phytopathogene pilze und bakterien mit hilfe molekulargenetischer methoden

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EP1102856A1
EP1102856A1 EP00945715A EP00945715A EP1102856A1 EP 1102856 A1 EP1102856 A1 EP 1102856A1 EP 00945715 A EP00945715 A EP 00945715A EP 00945715 A EP00945715 A EP 00945715A EP 1102856 A1 EP1102856 A1 EP 1102856A1
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EP
European Patent Office
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resistance
plant
hydroxylase
activity
enzyme
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00945715A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Wilhelm Rademacher
John-Bryan Speakman
Eberhard Ammermann
Thorsten Jabs
Karin Herbers
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing the resistance of crop plants to bacterial and fungal pathogens, characterized in that a plant is produced using molecular genetic methods in which the activity of the enzyme flavanone-3-hydroxylase is reduced.
  • the method is further characterized in that the enzyme flavanone-3-hydroxylase by molecular biological methods (eg anti-sense construct, co-suppression, the expression of specific antibodies or the expression of specific inhibitors) in whole or in part, continuously or temporarily, in the entire plant or in parts of the plant is inhibited in its activity.
  • molecular biological methods eg anti-sense construct, co-suppression, the expression of specific antibodies or the expression of specific inhibitors
  • the present invention furthermore relates to plants with increased resistance to bacterial and fungal pathogens, characterized in that the activity of the enzyme flavanone-3-hydroxylase is reduced by molecular genetic methods.
  • the productivity of crops can be reduced in many ways by stress factors. These include: viral diseases, bacterial and fungal pathogens, damaging insects, nematodes, snails, bite, heat, cool, cold, lack of water, too high water content in the soil, salinity, too high radiation intensity, too high ozone content, competition for light , Water and nutrients due to accompanying flora, improper or inapplicable herbicide applications (especially in fruit crops), treatments with herbicides, insecticides, fungicides, bioregulators or foliar fertilizers with insufficient selectivity, foliar applications of plant protection products or fertilizers during intensive sun exposure.
  • the object of the invention was to find a simple and inexpensive method for permanently improving the resistance 15 to bacterial and fungal pathogens, in particular in crop plants.
  • Cimectacarb 25 tere designation: Cimectacarb are used as bioregulators to inhibit plant growth. Their bioregulatory effect arises from the fact that they block the biosynthesis of gibberellins that promote length growth. They inhibit due to their structural relationship
  • Luteoliflavan does not normally occur in apple tissue and eriodyctiol occurs as an intermediate of the flavonoid substance echse only in small amounts.
  • the expected flavonoids catechin and cyanidin were not detectable in the treated tissue or occurred only in significantly reduced amounts (p Ro melt et al, lecture 8 th International Workshop on Fire Blight, Kusadasi, Turkey, 12th-15th October over 1998).
  • prohexadione-Ca, trinexapac-ethyl and other acylcyclohexadiones inhibit 2-oxoglutaric acid-dependent hydroxylases, which are important in the metabolism of phenolic substances. These are primarily chalcone synthetase (CHS) and flavanone-3-hydroxylase (F3H) (W. Heller and G. Forkmann, Biosynthesis, in: The Flavonoids, Harborne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York, 1988). However, it cannot be excluded that acylcyclohexadiones also inhibit other, previously unknown, 2-oxoglutaric acid-dependent hydroxylases.
  • CHS chalcone synthetase
  • F3H flavanone-3-hydroxylase
  • the flavonoids eriodictyol, proanthocyanidins which are substituted on the C atom 3 with hydrogen, e.g. Luteforol, luteoliflavan, apigeniflavan and tricetiflavan, as well as homogeneous and heterogeneous oligomers and polymers are increasingly formed from the above-mentioned and structurally related substances.
  • flavanon-3-hydroxylase F3H
  • Increased concentrations of the phenols hydroxycinnamic acid (p-coumaric acid, ferulic acid, sinapic acid), salicylic acid or umbelliferone, including the homogeneous and heterogeneous oligomers and polymers formed from them, are reduced after reducing the enzyme activity of the enzyme flavanone-3-hydroxylase (F3H ) in plants detected.
  • the concentration of the chalcones, such as phloretin, and the stilbene, such as resveratrol also increases.
  • the concentration of the glycosides of the flavonoids, the phenolic compounds, the chalcones and the stilbene is also increased by reducing the enzyme activity of the enzyme flavanon-3-hydroxy-lase.
  • the process according to the invention for increasing the resistance to attack by bacterial and fungal pathogens by reducing the flavonone-3-hydroxylase enzyme activity can be successfully carried out on the following crop plants: wheat, barley, rye, oats, rice, corn, millet, sugar cane, Banana, tomato, tobacco, bell pepper, potato, rapeseed, sugar beet, soya, cotton, fruit trees from the rosacea family, such as apple and pear, plum, plum, peach, nectarine and cherry, and grapevines.
  • the method according to the invention is particularly suitable for increasing the resistance to Venturia inaequalis in apple and pear and to Botrytis cinerea in grapevines.
  • Plants whose flavanone 3-hydroxylase was reduced with the help of molecular genetic methods also showed an increased resistance to attack by Erwinia amylovora and other phytopathogenic bacteria.
  • the most important phytopathogenic bacteria can be found in the publication "European Handbook of Plant Diseases", Eds. Smith, I.M., Dunez, J., Lelliott, R.A. Phillips, D.H. and Archer, S.A. Blackwell Scientific Publications, 1988.
  • the method according to the invention is particularly suitable for increasing the resistance to the following phytopathogenic fungi:
  • Erysiphe graminis (powdery mildew) on cereals Erysiphe cichoracearum and Sphaerotheca fuliginea on pumpkin plants Podosphaera leucotricha on apples, Uncinula necator on vines, Puccinia species on cereals,
  • Rhizoctonia species on cotton, rice and lawn Ustilago species on cereals and sugar cane, Venturia species (scab) on apples and pears Helminthosporium species on cereals, Septoria species on wheat
  • Botrytis cinerea (gray mold) on strawberries, vegetables, ornamental plants and vines, Cercospora arachidicola on peanuts, Pseudocercosporella herpotrichoides on wheat and barley, Pyricularia oryzae on rice,
  • Ripe tomato fruits from Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymakers were washed, dried and, using a sterile blade, the pericarp of seeds, middle columnella and wooden parts freed.
  • the pericarp (approx. 50 g) was frozen in liquid nitrogen.
  • the material was then crushed in a mixer.
  • the comminuted material was mixed with 100 ml homogenizing medium in a pre-cooled mortar.
  • the suspension was then transferred to centrifuge cups by pressing through sterile gauze cloths. Then 1/10 vol 10% SDS was added and mixed well. After 10 minutes on ice, 1 volume of phenol / chloroform was added, the centrifuge cup closed and mixed well.
  • the supernatant was transferred to a new reaction vessel. This was followed by three further phenol / chloroform extractions and one chloroform extraction. In the following, 1 vol 3 M NaAC and 2.5 vol ethanol were added. The nucleic acids were precipitated overnight at -20 ° C. The next morning, the nucleic acids were pelleted for 15 minutes at 10,000 rpm in a refrigerated centrifuge (4 ° C). The supernatant was discarded and the pellet resuspended in 5 ml of cold 3 M NaAc. This washing step was repeated twice. The pellet was washed with 80% ethanol. The completely dried pellet was taken up in about 0.5 ml of sterile DEPC water and the RNA concentration was determined photometrically.
  • RNA 20 ⁇ g of total RNA was first mixed with 3.3 ⁇ l of 3M sodium acetate solution, 2 ⁇ l of IM magnesium sulfate solution and made up to 100 ⁇ l of final volume with DEPC water. In addition, a microliter
  • 5'-TCI (A / C) G (A / G) TGG CC (A / C / G) GA (C / T) AA (A / G) CC-3.
  • the sequence of the oligonucleotide derived using the peptide sequence DHQAW (amino acid 276281 in the sequence FL3H PETHY from Petunia hybridaj was as follows: 5'-CTT CAC ACA (C / G / T) GC (C / T) TG (A / G) G (A / G) TC-3.5. 5
  • the PCR reaction was carried out using the Perkin-Elmer tTth polymerase according to the manufacturer's instructions. 1/8 of the cDNA was used as template (corresponds to 0.3 ⁇ g RNA). The PCR program was: 10
  • the fragment was cloned into Promega's vector pGEM-T according to the manufacturer's instructions.
  • the correctness of the fragment was checked by sequencing.
  • the PCR fragment was isolated using the restriction sites Ncol and Pstl present in the polylinker of the vector pGEM-T and the protruding ends were blunt-ended using the T4 polymerase. This fragment
  • Fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the CaMV (nucleotides 6909 to 7437 of the cauliflower mosaic virus).
  • Fragment B the fragment of the F3H gene in antisense orientation.
  • Fragment C (192 bp) contains the termination signal of the octopine syn
  • the 5'RACE method (System for Rapid amplification of cDNA ends) was used to clone a larger fragment of the F3H.
  • the cDNA first strand synthesis was carried out according to the manufacturer's instructions using the GSP-1 (gene-specific primer) 5'-TTCAC-CACTGCCTGGTGGTCC-3 '. Following RNase digestion, the cDNA was purified using the GlassMAX spin system from Life Tecgnologies TM according to the manufacturer's instructions.
  • a cytosine homopolymer was added to the 3 'end of the purified single-stranded F3H cDNA using the terminal deoxynucleotydil transferase according to the manufacturer's instructions.
  • the 5 'extended F3H cDNA was amplified using a second gene-specific primer (GSP-2) which binds in the region 3' before the GSP-1 recognition sequence and thus enables a "nested" PCR Manufacturer supplied "5'RACE abrided anchor primer” used, which is complementary to the homopolymeric dC tail of the cDNA.
  • GSP-2 second gene-specific primer
  • the cDNA fragment amplified in this way and designated as FSH extended was cloned into the vector pGEM-T from Promega according to the manufacturer's instructions.
  • the identity of the cDNA was confirmed by sequencing.
  • the F3He ⁇ en de c - cDNA fragment was isolated using the restriction sites Ncol and Pstl present in the polylinker of the vector pGEM-T and the protruding ends were transferred using the T4 polymerase and blunt ends.
  • This fragment was cloned into a Smal (blunt) cut vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990) (see Figure 3).
  • This vector mediates resistance to the antibiotic kanamycin in plants.
  • the DNA constructs obtained contained the PCR fragment in sense and antisense orientation. The antisense construct was used to generate transgenic plants.
  • Fragment A (529 bp) contains the 35S promoter of the CaMV (nucleotides 6909 to 7437 of the cauliflower mosaic virus).
  • Fragment B the fragment of the F3H gene in the antisense orientation.
  • Fragment C (192 bp) contains the termination signal of the octopine synthase gene.
  • Tomato seeds (Lycopersicon esculentum Mill. Cv. Moneymaker) were incubated for 10 minutes in 4% sodium hypochlorite solution, then washed 3-4 times with sterile distilled water and on MS medium with 3% sucrose, pH 6.1 Germination designed. After a germination period of 7-10 d, the cotyledons could be used for the transformation.
  • Cmm was cultured on yeast dextrose Ca agar (YDC) at 28 ° C for 2 days.
  • the bacteria were washed off with sterile water and their cell density was determined.
  • the cell density was adjusted to 10 6 cells / ml with sterile water.
  • the injections were carried out with injection needles (No. 20), which were filled with the bacterial suspension. They were done in the
  • Leaf axil of the top fully developed leaf of young plants, which had a total of 3-4 leaves.
  • the infection was evaluated by assessing the developing phenotype.

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Abstract

Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, dass mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraf von Kulturpflanzen gegen phytopathogene Pilze und Bakterien mit Hilfe molekulargenetischer Methoden
Beschreibung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.
Das Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Flavanon-3-hydroxylase durch molekularbiologische Verfahren (z.B. Anti-Sense-Konstrukt, Co-Suppression, der Expression spezifischer Antikörper oder der Expression spezifischer Inhibitoren) ganz oder teilweise, andauernd oder vorübergehend, in der gesamten Pflanze oder in Teilen der Pflanze in seiner Aktivität gehemmt wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Pflanzen mit erhöhter Widerstandskraft gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß durch molekulargenetische Methoden die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.
Die Produktivität von Kulturpflanzen kann in vielfältiger Weise durch Streßfaktoren reduziert werden. Zu nennen sind hier unter anderem: Virenerkrankungen, bakterielle und pilzliche Pathogene, schädigende Insekten, Nematoden, Schnecken, Wildverbiß, Hitze, Kühle, Kälte, Wassermangel, zu hoher Wassergehalt des Bodens, Bodenversalzung, zu hohe Strahlungsintensität, zu hoher Ozongehalt, Konkurrenz um Licht, Wasser und Nährstoffe durch Begleitflora, unsachgemäße oder nicht optimal auszubringende Herbizidanwendungen ( besonders in Obstkulturen ) , Behandlungen mit Herbiziden, Insektiziden, Fungiziden, Bioregulatoren oder Blattdüngern von zu geringer Selektivität, Blattapplikationen von Pflanzenschutzmitteln oder Düngern während intensiver Sonneneinstrahlung.
Eine Reihe dieser durch Stressoren hervorgerufenen Probleme kann durch den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln, durch die Verwendung resistenten Pflanzenmaterials oder geeigneter Anbautechniken minimiert werden. Der Umfang dieser Möglichkeiten ist jedoch be- grenzt. Insbesondere Bakteriosen sind, wenn überhaupt, nur sehr schwer zu bekämpfen. Dabei werden (z.B. gegen Feuerbrand bei Apfel und Birne) Antibiotika wie Streptomycin oder Tetracycline eingesetzt, was die Gefahr einer Resistenzbildung auch bei Human- pathogenen in sich birgt. Weiterhin zeigen z.B. pilzliche Pathogene häufig eine Anpassung an Fungizide, so daß deren Wirksamkeit nachläßt. Eine ähnliche Anpassung besteht auch bei "pathogenresi - 5 stenten" Züchtungen, die durch konventionelle Verfahren hergestellt werden.
Ein Bedarf an Pflanzen, die gegen Pathogene widerstandsfähig sind, besteht nicht nur bei einjährigen ackerbaulichen oder gärt- 10 nerischen Kulturen, sondern auch bei wertvollen Dauerkulturen wie Obst und Wein.
Aufgabe der Erfindung war es, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur dauerhaften Verbesserung der Widerstandsfähigkeit 15 gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, insbesondere bei Kulturpflanzen, zu finden.
Ausgehend von physiologischen Untersuchungen mit Wachstums - regulatoren aus der Gruppe der Acylcyclohexadione wurden nun 20 überraschend gentechnologische Verfahren verfügbar, mit deren Hilfe sich Kulturpflanzen erzeugen lassen, die gegen eine Reihe von phytopathogenen Bakterien und Pilzen widerstandsfähig sind.
Acylcyclohexadione wie Prohexadion-Ca und Trinexapac-ethyl (äl-
25 tere Bezeichnung: Cimectacarb) werden als Bioregulatoren zur Hemmung des pflanzlichen Längenwachstums eingesetzt. Ihre bioregu- latorische Wirkung kommt dadurch zustande, daß sie die Biosynthese von längenwachstumsfördernden Gibberellinen blockieren. Dabei hemmen sie aufgrund ihrer strukturellen Verwandtschaft zu
30 2-Oxoglutarsäure bestimmte Dioxygenasen, die 2-Oxoglutarsäure als Co-Substrat benötigen (Rademacher, W, Biochemical effects of plant growth retardants, in: Plant Biochemical Regulators, Gaus- man, HW (ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-200 (1991) ) . Es ist bekannt, daß derartige Verbindungen auch in den
35 Stoffwechsel von Phenolen eingreifen und so bei mehreren Pflanzenarten eine Hemmung der Anthocyanbildung bewirken können (Rade- macher, W et al . , The mode of action of acylcyclohexanediones - a new type of growth retardant, in: Progress in Plant Growth Regulation, Karssen, CM, van Loon, LC, Vreugdenhil, D (eds.), Kluwer
40 Academic Publishers, Dordrecht (1992) ) . Derartige Effekte auf den Haushalt phenolischer Inhaltsstoffe werden als ursächlich für die Nebenwirkung von Prohexadion-Ca gegen Feuerbrand angegeben (Rade- macher, W et al., Prohexadione-Ca - a new plant growth regulator for apple with interesting biochemical features, Poster auf dem
45 25th Annual Meeting of the Plant Growth Regulation Society of America, 7.-10. Juli 1998, Chicago). A. Lux-Endrich (Dissertation Technische Universität München in Weihenstephan, 1998) findet im Verlauf ihrer Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Prohexadion- Ca gegen Feuerbrand, daß es in Zellkulturen von Apfel durch Prohexadion-Ca zu einer mehrfachen Erhöhung des Gehaltes an phenolischen Substanzen kommt und daß dabei eine Reihe von sonst nicht vorhandenen Phenolen auftritt. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde weiterhin gefunden, daß unter dem Einfluß von Prohexadion-Ca relativ hohe Mengen von Luteoliflavan und Eriodyctiol in Sproßgewebe von Apfel auftreten. Luteoliflavan kommt in Apfel - gewebe normalerweise nicht vor und Eriodyctiol tritt als Inter- mediat des Flavonoidstoff echseis nur in geringen Mengen auf. Die zu erwartenden Flavonoide Catechin und Cyanidin waren im behandelten Gewebe jedoch nicht nachweisbar oder traten nur in deutlich reduzierten Mengen auf (S. Rö melt et al, Vortrag 8th International Workshop on Fire Blight, Kusadasi, Türkei, 12.-15. Okto- ber 1998) .
Es kann als gesichert gelten, daß Prohexadion-Ca, Trinexapac- ethyl und andere Acylcyclohexadione 2-Oxoglutarsäure-abhängige Hydroxylasen inhibieren, die im Stoffwechsel phenolischer Sub- stanzen von Bedeutung sind. Dabei handelt es sich primär um Chal- consynthetase (CHS) und um Flavanon-3-hydroxylase (F3H) (W. Heller und G. Forkmann, Biosynthesis, in: The Flavonoids, Har- borne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York, 1988). Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß Acylcyclohexadione auch weitere, bislang unbekannte, 2-Oxoglutarsäure-abhängige Hydroxylasen hemmen. Es dürfte ferner naheliegend sein, daß ein Mangel an Catechin, Cyanidin oder anderen Endprodukten der Flavonoid- synthese von der Pflanze registriert wird und daß über einen Feedback-Mechanismus die Aktivität des Schlüsselenzyms Phenylala- ninammoniumlyase (PAL) erhöht wird. Durch die weiterhin existierende Hemmung von CHS und F3H können diese Flavonoid-Endprodukte jedoch nicht gebildet werden, und es kommt zu einer vermehrten Bildung von Luteoliflavan, Eriodyctiol und anderer Phenole (Abbildung 1) .
Durch die Reduktion der Enzymaktivität des Enzyms Flavanon-3-hy- droxylase (F3H) werden die Flavonoide Eriodictyol, Proanthocyani - dine, die am C-Atom 3 mit Wasserstoff substituiert sind, z.B. Lu- teoforol, Luteoliflavan, Apigeniflavan und Tricetiflavan, sowie homogene und heterogene Oligomere und Polymere aus den genannten und strukturell verwandten Substanzen vermehrt gebildet.
Erhöhte Konzentratonen der Phenole Hydroxyzimtsäure (p-Cumar- säure, Ferulasäure, Sinapinsäure) , Salicylsäure oder Umbellife- ron, einschließlich der aus ihnen gebildeten homogenen und heterogenen Oligomere und Polymere werden nach Reduktion der Enzym- aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase (F3H) in Pflanzen festgestellt. Ebenso erhöht sich die Konzentration der Chalcone, wie z.B. Phloretin, und der Stilbene, wie z.B. Resveratrol.
Durch Reduktion der Enzymaktivität des Enzyms Flavanon-3 -hydroxy- läse wird auch die Konzentration der Glykoside der Flavonoide, der phenolischen Verbindungen, der Chalcone und der Stilbene erhöht.
Ausgehend von diesen Befunden und Schlußfolgerungen wurden gen- technisch veränderte Kulturpflanzen erzeugt, in denen F3H durch Anti-Sense-Konstrukte ganz oder teilweise, dauerhaft oder vorübergehend, in der gesamten Pflanze oder in einzelnen Pflanzen- organen oder -geweben in ihren Aktivitäten reduziert war, mit der Folge, daß der Gehalt an phenolischen Verbindungen in der ganzen Pflanze reduziert ist. Experimentell konnte sodann gezeigt werden, daß diese Pflanzen in ihrer Widerstandsfähigkeit gegen bakterielle und/oder pilzliche Pathogene erhöht sind.
Alternativ zur Herstellung von Pflanzen, die mit Hilfe der Anti- sense Technologie in ihrer Flavonon-3 -hydroxylase Aktivität reduziert sind, lassen sich auch andere literaturbekannte molekulargenetische Methoden wie Co-Suppression oder die Expression von spezifischen Antikörpern verwenden, um diesen Effekt zu erreichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhöhung der Widerstandkraft gegen den Befall mit bakteriellen und pilzlichen Pathogenen durch Reduktion der Flavonon- 3 -hydroxylase Enzymaktivität kann erfolgreich bei folgenden Kulturpflanzen ausgeübt werden: Weizen, Ger- ste, Roggen, Hafer, Reis, Mais, Hirse, Zuckerrohr, Banane, Tomate, Tabak, Paprika, Kartoffel, Raps, Zuckerrübe, Soja, Baumwolle, Obstgehölze aus der Familie der Rosaceen, wie Apfel und Birne, Pflaume, Zwetschge, Pfirsich, Nektarine und Kirsche sowie Weinreben.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft gegen Venturia inaequalis in Apfel und Birne sowie gegen Botrytis cinerea bei Weinreben.
Transgene Pflanzen mit reduzierter Aktivität des Enzyms Flava- non- 3 -hydroxylase hergestellt nach der in den Beispielen beschriebenen Methode zeigen überraschenderweise eine erhöhte Widerstandskraft gegenüber dem Befall mit phytopathogenen Bakterien. Dies konnte am Beispiel des Befalls von transgenen Tomaten- pflanzen, deren Flavanon- 3 -hydroxylase Aktivität reduziert ist. mit Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) gezeigt werden, siehe Beispiel 3
Pflanzen, deren Flavanon- 3 -hydroxylase mit Hilfe von molekularge- netischen Methoden reduziert wurde, zeigten auch eine erhöhte Widerstandkraft gegen Befall mit Erwinia amylovora und anderen phytopathogenen Bakterien. Die wichtigsten phytopathogenen Bakterien können aus der Publikation "European Handbook of Plant Di - seases" , Eds. Smith, I.M., Dunez, J. , Lelliott, R.A. Phillips, D.H. and Archer, S.A. Blackwell Scientific Publications, 1988, entnommen werden.
Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft gegen folgende pflanzenpathogene Pilze:
Erysiphe graminis (echter Mehltau) an Getreide Erysiphe cichoracearum und Sphaerotheca fuliginea an Kürbisgewächsen Podosphaera leucotricha an Äpfeln, Uncinula necator an Reben, Puccinia-Arten an Getreide,
Rhizoctonia-Arten an Baumwolle, Reis und Rasen, Ustilago-Arten an Getreide und Zuckerrohr, Venturia -Arten (Schorf) an Äpfeln und Birnen Helminthosporium-Arten an Getreide, Septoria-Arten an Weizen
Botrytis cinerea (Grauschimmel) an Erdbeeren, Gemüse, Zierpflanzen und Reben, Cercospora arachidicola an Erdnüssen, Pseudocercosporella herpotrichoides an Weizen und Gerste, Pyricularia oryzae an Reis,
Phytophthora infestans an Kartoffeln und Tomaten, Plasmopara viticola an Reben, Pseudoperonospora-Arten in Hopfen und Gurken, Alternaria-Arten an Gemüse und Obst,
Mycosphaerella-Arten in Bananen und Erdnüssen sowie Fusarium- und Verticillium-Arten in Getreide, Gemüse und Zierpflanzen.
Beispiel 1
Klonierung des Gens einer Flavanone-3-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker.
Reife Tomatenfrüchte von Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker wurden gewaschen, getrocknet und mittels einer sterilen Klinge das Perikarp von Samen, mittlere Kolumnella und Holzteilen befreit. Das Perikarp (ca. 50 g) wurde in fluessigem Stickstoff eingefroren. Das Material wurde anschliessend in einem Mixer zerkleinert. Das zerkleinerte Material wurde in einem vorgekühlten Mörser mit 100 ml Homogenisierungs-Medium versetzt und gemischt. Die Suspension wurde dann in Zentrifugenbecher überführt, indem sie durch sterile Mulltücher gepreßt wurde. Anschließend wurde 1/10 Vol 10% SDS hinzugefügt und gut gemischt. Nach 10 Minuten auf Eis, wurde 1 Vol Phenol/Chloroform zugegeben, der Zentrifugenbecher verschlossen und gut gemischt. Nach 15 minütiger Zentrifugation bei 4000 rpm wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Es schlössen sich drei weitere Phenol/ Chloroform Extraktionen und eine Chloroform Extraktion an. Im folgenden wurde 1 Vol 3 M NaAC und 2.5 Vol Ethanol zugegeben. Die Fällung der Nukleinsäuren erfolgte über Nacht bei -20°C. Am näch- sten Morgen wurden die Nukleinsäuren für 15 Minuten bei 10000 rpm in der Kühlzentrifuge (4°C) pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 5-lo ml kaltem 3 M NaAc resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Das Pellet wurde mit 80%igem Ethanol gewaschen. Das vollständig getrocknet Pellet wurde in ca. 0,5 ml sterilem DEPC Wasser aufgenommen und die RNA- Konzentration photometrisch bestimmt.
20 μg gesamt RNA wurden zunächst mit 3,3 μl 3M Natriumacetat-Lö- sung, 2 μl IM Magnesiumsulfat-Lösung versetzt und auf 100 μl End- volumen mit DEPC Wasser aufgefüllt. Dazu wurde ein Microliter
Rnase freie Dnase (Boehringer Mannheim) gegeben und 45 min bei 37° Grad inkubiert. Nach Entfernen des Enzyms durch ausschütteln mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol wurde die RNA mit Ethanol gefällt und das Pellet in 100 μl DEPC Wasser aufgenommen. 2,5 μg RNA aus dieser Lösung wurden mittels eines cDNA-Kits (Gibco BRL) in cDNA umgeschrieben.
Unter Verwendung von Aminosäuresequenzen die aus für Flava- none-3-Hydroxylase kodierenden cDNA Klonen abgeleitet wurden, konnten konservierte Bereiche in der Primärsequenz identifiziert werden (Britsch et al., Eur. J. Biochem. 217, 745 -754 (1993), die als Grundlage für das Design von degenerierten PCR Oligo- nukleotiden dienten. Das 5' Oligonukleotid wurde unter Verwendung der Peptidsequenz SRWPDK (Aminosäure 147-152 in der Sequenz FL3H PETHY aus Petunia hybrida) ermittelt und hatte folgende Sequenz :
5'-TCI (A/C) G (A/G) TGG CC (A/C/G) GA (C/T) AA (A/G) CC-3. Die Sequenz des unter Verwendung der Peptidsequenz DHQAW (Aminosäure 276281 in der Sequenz FL3H PETHY aus Petunia hybridaj abgeleiteten Oligonukleotides lautete wie folgt: 5'-CTT CAC ACA (C/ G/T) GC (C/T) TG (A/G) G (A/G)TC-3. 5
Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der tTth-Polymerase von Perkin-Elmer nach Herstellerangaben durchgeführt. Als Template wurden 1/8 der cDNA eingesetzt (entspricht 0,3 μg RNA). Das PCR- Programm lautete: 10
30 Zyklen
94 Grad 4 sec
40 Grad 30 sec
72 Grad 2 min
15 72 Grad 10 min
Das Fragment wurde nach Herstellerangaben in den Vektor pGEM-T von Promega kloniert.
20 Die Richtigkeit des Fragmentes wurde durch Sequenzierung überprüft. Das PCR Fragment wurde unter Verwendung der im Polylinker des Vektors pGEM-T vorhandenen Restriktionsschnittstellen Ncol und Pstl isoliert und die überstehenden Enden unter Verwendung der T4-Polymerase in glatte Enden überführt. Dieses Fragment
25 wurde in einen Smal (blunt) geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sei. 66: 221 -230 (1990)) kloniert (siehe Abbildung 2) . Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21: 285 - 294 (1980)) und das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al . ,
30 EMBO J. 3: 835 - 846 ( 1984)). Dieser Vector vermittelt in Pflanzen Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin. Die erhaltenen DNA Konstrukte enthielten das PCR Fragment in Sense und Antisense Orientierung. Das Antisensekonstrukt wurde zur Erzeugung transgener Pflanzen eingesetzt.
35
Abbildung 2: Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus) . Fragment B das Fragment des F3H Gens in Antisense-Orientierung. Fragment C (192 Bp) enthält das Terminationssignal des Octopin-Syn-
40 thase Gens.
Klonierung eines größeren cDNA Fragmentes der Flavanone-3-Hydroxylase aus Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker unter Verwendung des 5 'RACESystems . 5 Um auszuschließen, dass die Erzeugung von Pflanzen mit reduzierter mRNA Fließgleichgewichtsmenge der F3H aufgrund der geringen Größe des im Antisensekonstrukt verwendeten F3H PCR Fragmentes nicht erfolgreich ist, sollte ein zweites Antisense-Konstrukt unter Verwendung eines größeren F3H Fragmentes erzeugt werden.
Zum Zweck der Klonierung eines größeren Fragmentes der F3H wurde die 5'RACE Methode (System for Rapid amplification of cDNA ends) angewendet.
Verlängerung des F3H PCR Fragmentes durch die 5' RACE-Methode unter Verwendung des 5 'RACE System for rapid amplification of cDNA ends, Version 2-0 von Life Tecgnologies™.
Aus reifen Tomatenfrüchten von Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneymaker wurde gesamt RNA isoliert (siehe oben) .
Die cDNA Erststrang-Synthese wurde nach Herstellerangaben unter Verwendung des GSP-1 (Gen spezifischer Primer) 5'-TTCAC- CACTGCCTGGTGGTCC-3 ' durchgeführt. Im Anschluß an einen Rnase Verdau, wurde die cDNA unter Anwendung des GlassMAX spin Systems von Life Tecgnologies™ gemäß den Herstellerangaben aufgereinigt .
An das 3 'Ende der gereinigten einzelsträngigen F3H cDNA wurde unter Verwendung der terminalen deoxynukleotydil-Transferase gemäß den Herstellerangaben ein Cytosin Homopolymer addiert.
Die Amplifikation der 5' verlängerten F3H cDNA erfolgte unter Verwendung eines zweiten Gen spezifischen Primers (GSP-2) der im Bereich 3' vor der GSP-1 Erkennungsequenz bindet und somit eine ,,nested" PCR ermöglichte. Als 5 ' Primer wurde der vom Hersteller gelieferte "5'RACE abrided anchor primer" verwendet, der komplementär zum homopolymeren dC-Schwanz der cDNA ist.
Das so amplifizierte und als FSHextended bezeichnete cDNA Fragment wurde nach Herstellerangaben in den Vektor pGEM-T von Promega kloniert.
Die Identität der cDNA wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Das F3Heχendec- cDNA Fragment wurde unter Verwendung der im Polylinker des Vektors pGEM-T vorhandenen Restriktionsschnittstellen Ncol und Pstl isoliert und die überstehenden Enden unter Verwendung der T4-Polymerase und glatter Enden überführt. Dieses Fragment wurde in einen Smal (blunt) geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990) kloniert (siehe Abbildung 3) . Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al . , 1980) und das Terminationssignal des Octopin-Syn- thase Gens (Gielen et al . , 1984). Dieser Vektor vermittelt in Pflanzen Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin. Die erhaltenen DNA Konstrukte enthielten das PCR Fragment in Sense und Antisense Orientierung. Das Antisensekonstrukt wurde zur Erzeugung transgener Pflanzen eingesetzt.
Abbildung 3: Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus) . Frag- ment B das Fragment des F3H Gens in Antisense-Orientierung. Fragment C (192 Bp) enthält das Terminationssignal des Octopin-Syn- thase Gens.
Beispiel 2
Herstellung transgener Lycopersicon esculentum Mill.cv. Moneyma- ker die ein Teilfragment der Flavanone-3-Hydroxylase in Antisense Orientierung exprimieren.
Es wurde die Methode nach Ling et al., Plant Cell Report 17, 843 - 847 ( 1998 ) genutzt. Die Kultivierung erfolgt bei ca. 22°C unter einem 16 h - Licht / 8 h - Dunkel - Regime.
Tomatensamen (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker) wur- den durch 10 minütige Inkubation in 4%iger Natriumhypochlorit- lösung inkubiert, anschließend 3 - 4 mal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und auf MS Medium mit 3 % Saccharose, pH 6,1 zur Keimung ausgelegt. Nach einer Keimdauer von 7 - 10 d konnten die Kotyledonen für die Transformation eingesetzt werden.
Tag 1: Petrischalen mit dem Medium "MSBN" wurden mit 1,5 ml einer ca. 10 d alten Tabaksuspensionskultur überschichtet. Die Platten wurden mit Folie abgedeckt und bis zum nächsten Tag bei Raumtemperatur inkubiert.
Tag 2: Auf die mit der Tabaksuspensionskultur beschichteten Platten wurde steriles Filterpapier luftblasenfrei aufgelegt. Darauf wurden die quer geschnittenen Keimblätter mit der Oberseite nach unten aufgelegt. Die Petrischalen wurden für 3 Tage im Kulturen- räum inkubiert.
Tag 5: Die Agrobakterienkultur (LBA4404) wurde durch Zentri- fugation bei ca. 3000g für 10 min sedimentiert und in MS-Medium resuspendiert, so daß die OD 0,3 beträgt. In diese Suspension wurden die Keimblattstückchen gegeben, die unter leichtem Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Anschließend wurden die Keimblattstückchen auf sterilem Filterpa- pier etwas abgetrocknet und wieder zurück auf ihre Ausgangsplatten für die Fortsetzung der Cocultivierung für 3 Tage im Kulturenraum gelegt.
Tag 8: Die cocultivierten Keimblattstückchen wurden auf MSZ2K50+ß gelegt und für die nächsten 4 Wochen im Kulturenraum inkubiert. Danach erfolgte die Subkultivierung.
Sich bildende Sprosse wurden auf Wurzelinduktionsmedium gebracht.
Nach erfolgreicher Bewurzelung konnten die Pflanzen getestet und ins Gewächshaus überführt werden.
Beispiel 3
Transgene Tomatenpflanzen mit reduzierter Flavanon-3-hydroxylase Aktivität wurden mit Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) infiziert.
Cmm wurde auf Hefe-Dextrose-Ca Agar (YDC) bei 28°C 2 Tage kultiviert. Die Bakterien wurden mit sterilem Wasser abgeschwemmt und ihre Zelldichte bestimmt. Zur Inokulation wurde die Zelldichte mit sterilem Wasser auf 106 Zellen / ml eingestellt. Die Injektionen wurden mit Injektionsnadeln (Nr. 20), die mit der Bakterien- Suspension gefüllt waren, durchgeführt. Sie erfolgten in die
Blattachsel des obersten voll entwickelten Blattes junger Pflanzen, die insgesamt 3-4 Blätter besaßen. Die Evaluierung der Infektion erfolgte durch Beurteilung des sich entwickelnden Phäno- typs.
Während in Wildtyp-Pflanzen mehr als 75 % der Blätter verwelkt waren, war demgegenüber in den transgenen Tomatenpflanzen ein signifikant geringerer Verwelkungsgrad zu verzeichnen.
Beispiel 4
Test auf Erhöhung der Widerstandskraft gegen den Befall mit Phytophthora infestans in Tomaten mit Flavanon-3 -hydroxylase in Antisens -Orientierung.
Die Blätter von nicht gentechnisch modifizierten bzw. erfindungs- gemäß gentechnisch modifizierten Tomatenpflanzen der Sorte "Mo- neymaker" wurden eine Woche nach dem 4 -Blattstadium mit einer wäßrigen Zoosporenaufschwemmung von Phytophthora infestans infi- ziert. Anschließend wurden die Pflanzen in einer wasserdampf - gesättigten Kammer bei Temperaturen zwischen 16 und 18°C aufgestellt. Nach 6 Tagen hatte sich die Krautfäule auf den gentech- nisch nicht modifizierten Kontrollpflanzen stark entwickelt. Tomatenpflanzen, die ein Antisens-Konstrukt der Flavanon-3 -hydroxylase exprimierten zeigten einen deutlich geringeren Befall mit Phytophthora infestans als die Kontrolle.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraf von Kulturpflan- zen gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß mit molekulargenetischen Methoden eine Pflanze hergestellt wird, in der die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Flavanon-3-hydroxylase durch molekularbiologische Verfahren (z.B. Anti-Sense-Konstrukt, Co-Suppression, der Expression spezifischer Antikörper oder der Expression spezifischer Inhibitoren) ganz oder teilweise, andauernd oder vor- übergehend, in der gesamten Pflanze oder in Teilen der Pflanze in seiner Aktivität gehemmt wird.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Kulturpflanzen um Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Mais, Hirse, Zuckerrohr, Banane, Tomate, Tabak, Paprika, Kartoffel, Raps, Zuckerrübe, Soja, Baumwolle, Obstgehölze aus der Familie der Rosaceen, wie Apfel und Birne, Pflaume, Zwetschge, Pfirsich, Nektarine und Kirsche sowie um Weinreben handelt.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen Venturia inaequalis in Apfel und Birne erhöht wird.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstandskraft gegen Botrytis cinerea bei Weinrebe erhöht wird.
6. Pflanze mit erhöhter Widerstandskraft gegen bakterielle und pilzliche Pathogene, dadurch gekennzeichnet, daß durch molekulargenetische Methoden die Aktivität des Enzyms Flavanon-3-hydroxylase reduziert ist.
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