KR20090028868A - 배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 비알디 1 유전자, 이를 이용한 형질전환체 및 상기 유전자를 발현시켜 해충 저항성을 증진시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 배추 유래의 해충저항성 디펜신을 코딩하는 유전자를 이용하여 해충저항성을 가진 광범위한 식물체를 생산할 수 있다.

배추, 디펜신, 해충저항성.

Description

배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 형질전환체{Gene coding the insect-resistant Defensin from Brassica rapa and transgenic plants using that}

본 발명은 배추(Brassica rapa)에서 유래한 해충저항성 디펜신(defensin) 단백질을 코딩하는 BrD1 유전자, 이 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용하여 제조된 형질전환체 및 식물체를 얻는 방법에 관한 것이다.

디펜신은 시스테인이 풍부한 항미생물 단백질군에 속하며 45~54개의 폴리펩티드로 이루어져 분자량이 작고 동물, 식물 및 곤충에서 발견된다(Thomma 등, Planta 216: 193-202, 2002). 식물 디펜신의 경우 4개의 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 안정된 구형의 구조를 포함하는 시스테인 특이 배열을 하고 있다(Meyer 등, Plant Physiology 112: 615-622, 1996).

식물 디펜신은 종자에서 최초로 분리되었으며 무의 경우 종자 껍질에서 추출되는 단백질의 30% 정도가 디펜신인 것으로 조사되었으며 이들 디펜신을 과발현시킨 형질전환 담배는 곰팡이 감염에 저항성을 나타내었다(Terras 등, Plant Cell 7:573-588, 1995). 디펜신이 병원균에 저항성을 보이는 기작은 원형질막에서 곰팡 이 특이성분과의 상호작용을 통하여 곰팡이 세포막에 천공을 일으키고 이러한 다중결합의 구멍들이 세포막 붕괴와 극성상실을 야기함으로써 곰팡이의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다.

곰팡이 저항성 이외에도 녹두에서 분리한 디펜신은 바구미에 저항성을 나타내었으며(Chen 등, J. Agri. Food Chem. 52: 2256-2261) 이러한 저항성은 알파 아밀라아제를 억제함으로써 기인하였다고 하였다. 또한 디펜신은 비생물적 스트레스인 인위적인 건조(Maitra, N and Cushman, J. C., Plant Physiology 118: 1536), 염해(Yamada 등, Plant Physiology 115: 314) 조건과 아연 (Marie Mirouze 등, The Plant Journal 47: 329-342) 등 중금속 처리에도 유도된다고 하였다.

이와 같이 디펜신은 곰팡이, 바이러스, 세균, 선충 및 해충 등의 생물적 스트레스와 건조, 염해 및 중금속 등의 비생물적 스트레스에 저항성인 형질전환 식물을 생산하는데 사용될 수 있다.

이에 본 발명자는 디펜신의 이러한 특성들, 즉, 식물체 안에서 발현되었을 때 곰팡이, 바이러스, 세균, 선충 및 해충 등의 생물적 스트레스와 건조, 염해 및 중금속 등의 비생물적 스트레스에 저항성인 형질전환 식물체를 제조하고자, 배추에서 유래한 BrD1 유전자를 벼에서 유래한 cytochrome c promoter의 조절하에 식물 형질전환용 운반체에 도입하여 벼에 형질전환하였으며, 형질전환된 벼가 벼멸구 및 어리쌀바구미에 대해 저항성을 나타내는 것을 확인하였다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 배추 유래의 디펜신을 코딩하는 cDNA 또는 게놈 DNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함하는 식물체 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환되어 전이식물체를 제조하는 목적으로 사용할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 상기 디펜신을 발현하여 해충 저항성을 가지는 전이식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 배추에서 유래한 BrD1 유전자를 식물체에 형질전환하고 이 유전자가 부여하는 해충저항성 특성을 유도함으로써 광범위의 식물 해충에 대해 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다

본 발명은 배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 서열번호 3의 유전자 BrD1의 게놈 DNA 염기서열 및 배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 서열번호 4의 유전자 BrD1의 cDNA 염기서열을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1에 의해 코딩되는 하기의 아미노산 서열을 제공한다.

바람직하게 본 발명은 상기 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1을 pSB11에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pMJC-GB-BrD1를 제공한다.

또한 바람직하게 본 발명은 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1을 포함하는 제4항의 재조합 벡터 pMJC-GB-BrD1을 아그로박테리움 투머파시엔에 도입시킨 것을 특징으로 하는 형질전환체를 제공한다.

또한 바람직하게 본 발명은 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1을 제5항의 형질전환체를 이용하여 도입시킨 형질전환 식물체를 제공한다.

더 바람직하게는 상기 형질전환 식물체의 대상이 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서는 (A) 배추에서 유래한 디펜신 단백질을 코딩하는 유전자인 BrD1을 분리하는 단계; (B) 상기 분리된 유전자 BrD1을 이용하여 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하고, 완성된 재조합 플라스미드를 아그로박테리움에 도입하는 단계; (C) 상기 식물 형질전환용 발현벡터를 가진 아그로박테리움을 이용, 벼에 형질전환 하는 단계; (D) 상기 형질전환된 벼 식물체에서 외래 유전자의 도입을 확인하는 단계; 및 (E) 상기 형질전환이 확인된 벼 식물체를 대상으로 벼멸 구(Nilaparvata lugens)와 어리쌀바구미(Sitophilus zeamais)에 대한 저항성을 검정하는 단계를 포함하는, 해충저항성 디펜신 단백질을 코딩하는 BrD1 유전자를 이용한 해충저항성 형질전환 식물체 작성에 관한 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 cDNA(유전자 BrD1)를 배추로부터 PCR 방법을 사용하여 분리하였다. 디펜신 유전자의 전체 구조는 인트론을 포함하여 336bp 염기서열(서열번호 3)로 구성되어 있으며 93bp의 인트론 부분을 제외한 cDNA의 크기는 243bp 염기서열(서열번호 4)이다. 이들의 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열(서열번호 5)은 80개로 구성되어 있다. BrD1 유전자의 발현은 배추 잎에서 상시 높은 것으로 나타났으며 살리실산(salicylic acid, SA)이나 자스몬산(jasmonic acid) 등 식물의 내병성 방어기작과 관련된 신호물질을 처리한 경우에는 발현량의 증가를 보이지 않았다. 이러한 결과는 BrD1 유전자가 내병성보다는 해충저항성 등을 포함한 다른 기능성과 관련이 있음을 나타내며 실제로 이 유전자가 형질전환된 벼 식물체는 흡즙성 해충인 벼멸구와 저작성 해충인 어리쌀바구미 등에 대해 저항성을 보였다. 따라서 BrD1 유전자는 기존에 밝혀지지 않은 배추 유래의 신규한 해충저항성 유전자로 판명되었으며, 이를 이용하여 흡즙성이나 저작성 해충 등의 광범위한 해충저항성 식물을 개발하는데 이용될 수 있다.

본 발명에 사용된 형질전환용 운반체, 즉 pMJ-GB-BrD1은 게이트웨이 시스템 (Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 방법으로 BrD1 유전자를 바이너리 벡터(binary vector)인 pSB11에 삽입하여 제작하였다. 본 발명의 형질전환용 운반체 제작에는 BrD1 유전자의 cDNA와 게놈 DNA 모두 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 유전자의 발현에 사용하는 프로모터는 식물세포에서 기능하는 모든 종류의 프로모터가 이용될 수 있으며, 과발현을 위한 프로모터, 상시발현을 위한 프로모터, 해충의 침입 때만 발현되는 유도성 프로모터, 목적 유전자를 식물생육 기간 중 일정 시기에 발현되도록 하는 프로모터, 식물조직의 특이 부분에만 발현하게 하는 프로모터 및 목적 유전자의 발현을 높이기 위해 ‘인핸서 서열(enhancer sequences)'이 결합한 하이브리드(hybrid) 프로모터 등이 포함된다.

본 발명에서는 벼에서 분리한 상시발현 OsCc1 프로모터(Jang et al., Plant Physiol. 129: 1473-1481, 2002)를 사용하였다.

상기 식물체 발현 벡터를 이용하여 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 형질전환시켜 해충저항성을 갖는 형질전환 식물체의 제조시 매개체로 사용될 수 있는 형질전환 미생물을 수득하였다. 목적유전자를 식물세포 내에 하나 또는 그 이상 도입하기 위해 사용되는 아그로박테리움은 디스암(disarmed)된 Ti 또는 Ri 플라스미드를 가지는 것으로 옥토핀-형(octopine-type) 계통인 LBA4404나 숙신아모핀-형(succinamopine-type) 계통인 EHA101 또는 EHA105 등 모든 아그로박테리움 계통이 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명에서 이용할 수 있는 형질전환용 식물의 보다 구체적인 예로는 벼, 콩, 보리, 옥수수, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수 등의 식량작물; 토마토, 고추, 딸 기, 파, 양파, 당근, 배추, 무, 수박, 오이, 양배추 및 호박 등의 채소작물; 인삼, 참깨, 들깨, 땅콩, 유채, 목화, 사탕수수, 사탕무 및 담배 등의 특용작물; 사과나무, 배나무, 대추나무, 포도, 감귤, 감, 살구, 바나나, 양다래, 장미, 국화, 백합, 거베라, 카네이션, 프리지아, 글라디올러스 및 튤립 등의 과수 및 화훼식물; 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐, 레드클러버 및 라이그라스 등의 사료작물; 및 아라비돕시스 등을 포함하는 식물을 들 수 있다.

본 발명에서는 식물 형질전환 운반체가 도입된 아그로박테리움을 이용, 벼 체세포 캘러스와 공동 배양하여 벼 체세포에 BrD1 유전자를 도입한 후, 식물 호르몬을 조절하여 벼 체세포 캘러스로부터 BrD1을 발현하는 형질전환 벼를 제조하였다. 상기 목적유전자가 도입된 식물체를 효과적으로 선발하기 위한 선발 인자로는 NPTⅡ(neomycin phosphotransferase), HPT(hygromycin phosphotransferase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase) 및 젠타마이신(gentamicin) 등의 항생제 내성 유전자; bar 유전자 등의 제초제 저항성 유전자; 및 GUS, GFP(green fluorescent protein) 및 LUX(luciferase) 등의 표지유전자가 사용될 수 있다.

본 발명에서 적용될 수 있는 식물 해충은 멸구류, 진딧물류, 노린재류, 매미충류, 응애류 등 흡즙성 해충; 나방류, 풍뎅이류, 바구미류 등 저작성 해충; 및 선충 등 식물을 가해하는 해충이 포함될 수 있다.

본 발명에서는 BrD1 유전자가 형질전환된 벼에서 유전자의 도입을 확인한 후, 형질전환 식물체를 대상으로 벼멸구와 어리쌀바구미를 접종하여 해충저항성을 조사하였다. 벼멸구의 경우 5령이 된 충을 무작위로 선별하여 형질전환 식물체에 접종하였으며 접종 5일이 지난 후 대조구 벼 식물체와 형질전환 벼 식물체 사이에는 뚜렷한 반응 차이가 나타났다. 대조구 식물체는 벼멸구 피해시에 전형적으로 나타나 식물체의 아래 부분의 잎부터 서서히 황색으로 변하고 결국 시들어 말라죽는 증상을 보였으나, 형질전환 식물체는 이러한 증상이 거의 나타나지 않았으며, 일부 형질전환 계통에서는 접종된 벼멸구의 밀도가 현저히 줄어들어 형질전환 식물체가 살충성 기능을 가지는 것으로 나타났다. 또한 어리쌀바구미는 누대 사육중인 곤충을 무작위로 선별하여 형질전환된 쌀에 접종하여 생물검정을 실시하였으며 그 결과 접종 105일 후 대조구 쌀과 형질전환된 쌀 사이에 뚜렷한 반응의 차이를 보였다. 대조구 쌀은 어리쌀바구미가 갉아먹어 가루로 변했으나 형질전환된 쌀은 대조구 쌀에 비해 피해 정도가 현저히 작은 것으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 BrD1 유전자를 목적하는 식물에 도입함으로써, 농작물을 비롯한 각종 식물의 해충저항성을 증가시킬 수 있음을 제시한 것이다.

본 발명은 흡즙성 해충인 벼멸구와 저장 중에 피해를 주는 저작성 해충인 어리쌀바구미에 대해 저항성을 보이는 식물체 및 종자를 제공하며, 이는 상기에서 살펴본 바와 같이, BrD1 유전자가 형질전환된 식물체 또는 종자는 해충에 효과적인 저항성을 보임으로써, 이 유전자를 활용하여 광범위의 해충저항성 식물을 개발할 수 있다. 그 결과로 농작물의 수량증대는 물론 해충 방제를 위해 사용하던 농약의 사용량 및 방제노력을 획기적으로 줄일 수 있고 수확 후 저장 과정에서의 수량감소, 품질저하 등의 피해를 줄일 수 있으며 농약사용에 의한 환경 및 인체의 위험성 을 최소화할 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 자세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 배추로부터 해충저항성 유전자 BrD1 의 분리 및 염기서열과 아미노산 서열 분석

본 발명에 사용된 BrD1 유전자의 분리를 위해 한여름, 장미, 흑진주, 스피드60일, 서울 등 5종의 배추 품종을 생육상에서 2주 동안 키웠으며 생장된 배추 잎으로부터 트리아졸 시약(Trizol regent; invitrogen, Cat. NO. 15596-018)를 이용하는 방법으로 RNA를 추출하였다. 상기 방법으로 추출한 각각의 RNA로부터 cDNA 합성 키트(cDNA synthesis kit; stratagen, Cat. NO. 600084)를 이용하여 cDNA를 각각 합성하였다. 또한 같은 시기의 배추 잎에서 게놈 DNA 추출 키트(Genomic DNA extraction kit; iNtRON, Cat. NO. 17271)를 이용하여 게놈 DNA(Genomic DNA)를 각각 분리하였다. 분리된 게놈 DNA와 합성한 cDNA를 BrD1의 cDNA를 근거로 디자인된 전진 프라이머(forward primer)인 5'-ATG GCT AAG GTT GCT TCC ATC ATC AC-3'(서열번호 1)와 역전사 프라이머(Reverse primer)인 5'-TTA ACA AGG GAA GTA GCA GAT ACA CC-3'(서열번호 2)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 MJ 리서치 (MJ research)사의 PTC-200기기로 수행하였다. PCR 반응 조건으로는 94℃ 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 60℃에서 30초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 35회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다 증폭된 산물을 EtBr이 첨가된 2% 아가로오스 겔에서 분리되고, UV트랜스 일루미네이터에서 확인하였다. 이렇게 각 품종에서 증폭된 PCR산물들을 클로닝 벡터인 티-이지 벡터(T-easy vector)에 클로닝을 하여, 각 품종의 cDNA와 게놈 DNA 염기서열을 분석하였다.

그 결과 도 1b, 도 1d에 나타낸 바와 같이 본 발명의 해충저항성 유전자 BrD1의 게놈 DNA는 전체 336bp의 염기서열(서열번호 3)로 구성되어 있었으며, 상기 도 1b의 염기서열에서 인트론 93bp를 제외한 cDNA의 크기는 243bp(서열번호 4, 도 1a 참조)이었으며 이를 아미노산 서열을 연역한 결과 도 1c에 나타낸 바와 같이 80개의 아미노산으로 구성되어 있었다(서열번호 5). 또한 상기 염기서열(서열번호 4) 및 연역 아미노산 서열(서열번호 5)을 미국 생물정보센터(NCBI)의 Blast 검색 프로그램을 사용하여 데이터베이스를 검색한 결과, 애기장대를 포함한 십자화과 식물에서 분리된 내병성 관련 디펜신 유전자(antifungal protein)와는 86%~98%의 높은 상동성을 보였으나 해충저항성과 관련이 있는 것으로 보고된 유전자는 없는 것으로 조사되었다. 따라서 상기 유전자 BrD1은 배추 유래의 해충저항성에 관련된 새로운 기능을 가진 유전자인 것으로 판명되었다.

[ 실시예 2] 형질전환을 위한 운반체의 제작 및 아그로박테리움에의 도입

본 발명을 위해 사용된 BrD1 유전자를 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pSB11 벡터(Komari et al., Plant J. 10: 165-174, 1996)에 도입하였다. 유전자의 도입이 확인된 형질전환용 운반체를 pMJC-GB-BrD1로 명명하였다. BrD1 유전자의 발현을 위해서 벼에서 분리한 상시발현 OsCc1 프로모터(Jang et al., Plant Physiol. 129: 1473-1481, 2002)를 사용하였다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 bar(Bialaphos resistance) 유전자를 이용하였으며 양쪽 보더(border) 안쪽으로 MAR(Matrix attachment region)를 추가하여 유전자의 안정적인 발현을 유도하였다. 상기 재조합된 플라스미드 pMJC-GB-BrD1의 주요 유전자 배열은 도 2a에 나타내었다. 도 2a에서 각 부호의 약어는 다음과 같다: LB(left border), RB(Right border), PCytC(OsCc1 promoter), TPinll(Pin-Ⅱ terminator), P35S(CaMV 35S promoter), TNos(Nos terminator), bar(bar coding region), MAR(Matrix attachment region).

제작된 형질전환용 바이너리 벡터 DNA 즉, pMJC-GB-BrD1를 3계 교잡법(tri-parental mating)에 의해 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입하였으며, 재조합된 플라스미드가 포함된 아그로박테리움의 선발을 위해서 2종의 항생제인 스펙티노마이신(spectinomycin)과 테트라사이클린(tetracycline)을 사용하였다. 아그로박테리움 내로의 형질전환 여부는 콜로니 PCR 방법으로 확인하였다.

PCR 반응은 1X f-Taq 완충액(Solgent, Daejeon, Korea), 각 dNTP 50 μM, 1X 밴드 닥터(Solgent, Daejeon, Korea), f-Taq DNA 폴리머라아제 1.5 유닛(Solgent, Daejeon, Korea) 및 각 프라이머 25 pM을 첨가하고 멸균수로 최종 부피를 25μl로 맞춘 PCR 반응액에 각각의 운반체가 형질전환된 콜로니의 일부를 팁으로 찍어 첨가 하였다. PCR 반응은 MJ 리서치(MJ Research)사의 PTC-200 기기로 수행하였으며, 조건으로는 94℃에서 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 55℃에서 30 초간 중합, 72℃에서 60초간 신장 반응을 30회 반복 후 72℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다. 증폭된 산물은 EtBr이 첨가된 0.8% 아가로오스 겔(agarose gel)에서 분리되고, UV 트랜스일루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.

도 2b는 본 발명에 사용된 형질전환용 운반체 pMJC-GB-BrD1를 3계 교잡방법으로 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 선발된 4개의 콜로니는 사용한 프라이머의 기대 크기인 243bp 위치에서 밴드를 나타내어 BrD1 유전자가 아그로박테리움에 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었다. 위의 방법으로 형질전환이 확인된 아그로박테리움 콜로니를 증식시킨 후 형질전환에 이용하였다. 상기 BrD1 유전자가 도입된 아그로박테리움을 2007년 8월 20일자로 농어생명공학연구원에 기탁번호 KACC 95064P으로 기탁하였다.

[ 실시예 3] BrD1 유전자가 발현되는 형질전환 벼의 제조

3-1. 캘러스 유도 및 선발

공시품종은 일미벼를 사용하였다. 먼저, 종자 껍질을 제거한 현미를 70% 에탄올에 5분간 세척한 다음 50% 락스 용액으로 상온에서 15분씩 2회 정도 소독한 후 멸균수로 10회 이상 세척하여 멸균처리하였다. 멸균된 종자는 2,4-D 2mg/L가 포함된 2N6배지 (표 1 참조)에 약 15-20개(90×20㎝ petridish)를 배 부분이 위로 향하게 치상한 다음 27℃ 암실에서 3-4주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 유도된 캘 러스 중에서 1-2㎜의 일정한 둥근 모양의 갈변화가 안된 양호한 상태의 캘러스를 선발하여 2N6 배지에서 3일간 증식시킨 다음 형질전환에 사용하였다.

3-2. 아그로박테리움의 배양 및 현탁액 준비

초저온냉장고(-70℃)에서 글리세롤 스탁으로 저장되어 있는 재조합 플라스미드가 형질전환된 아그로박테리움을 꺼내 AB-ST배지(표 1 참조)에 조밀하게 스트리킹하여 28℃ 암조건에서 4-5일간을 배양하였다. 배양이 끝난 아그로박테리움을 페트리 접시(petri dish) 당 15-20㎖ AAM 배지(표 1 참조)를 분주한 후 멸균된 루프를 이용하여 긁어내고 팰콘 튜브(falcon tube)로 옮겨 담았다. 그 다음 아그로박테리움이 잘 현탁될 수 있도록 수초 동안 볼텍싱(vortaxing)하였으며, 최종 접종 농도는 OD650㎚에서 2.0-2.5가 되도록 하였다.

[표 1]형질전환 단계별 배지 종류 및 조성

형질전환 단계	배 지	조 성
캘러스 유도 및 증식	2N6	N6 매크로(macro), 미세 염(micro salt), N6 비타민. 카사미노산(casamino acid) 300mg/L, 프롤린 500mg/L, 수크로오스 30g/L, 글루타민 500mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
아그로박테리움 배양	AB-ST	AB 완충액, 염, 글루코오스 5g/L, 박토-아가(Bacto-agar) 15g/L, 스펙티노마이신(spectinomycin) 50mg/L, 테트라사이클린(tetracycline) 10mg/L, pH 7.0
아그로박테리움 현탁 및 접종	AAM	AA 매크로, 미세 염, 아미노산 스탁(stock), MS 비타민, 철 스탁(stock), 카사미노산 500mg/L, 수크로오스 68.5g/L, 글루코오스 36g/L, 아세토시린곤(acetosyringone) 100uM/L, pH 5.8
공동배양	1/2-2N6- AS-New	1/2-2N6 배지, 아세토시린곤 100uM/L, 글루코오스 10g/L, 티오황산나트륨 1mM, 디티오트레이톨 1mM, 질산은 5mg/L, 젤라이트 3.0g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.2
형질전환 캘러스 선발	2N6-CP	2N6 배지, 세포탁심(cefotaxime) 250mg/L, L-포스피노트리신(L-phosphinotricine) 6mg/L, 젤라이트 2.5g/L, 2.4-D 2mg/L, pH 5.8
재분화	MSR-CP	MS 매크로, 미세 염, MS 비타민, 세포탁심 250mg/L, NAA 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L, 말토오스 20g/L, L-포스피노트리신 3mg/L, 젤라이트 4g/L, pH 5.8
뿌리 유도	MS0	MS 매크로 및 미세 염, MS 비타민, 수크로오스 30g/L, 젤라이트 2.5g/L, pH 5.8

3-3. 아그로박테리움 접종 및 공동배양

3-5일간 증식된 캘러스를 빈 페트리 접시에 옮긴 후 15-20ml의 아그로박테리움 현탁액을 부어 약 20-30분간 접종하였다. 접종 후에 멸균된 여과지가 들어있는 페트리 접시에 캘러스를 옮겨 남아 있는 아그로박테리움 현탁액을 제거한 다음 공동배양 배지(표 1 참조)에서 7일 동안 치상하였다.

3-4. 형질전환된 캘러스의 선발

공동배양 과정이 끝난 캘러스는 아그로박테리움을 제거하기 위해 세포탁심(cefotaxim) 250mg/L이 포함된 용액으로 약 10회 이상 세척하였으며, 세척이 끝난 캘러스는 멸균된 여과지가 들어 있는 페트리 접시로 옮겨 담아 남아 있는 용액 을 완전히 제거하였다. 이 과정을 마친 캘러스는 PPT(6mg/L)가 포함된 2N6-CP 배지(표 1 참조)에 옮겨 27℃ 암조건에서 3주 동안 형질전환된 캘러스를 1차로 선발하였으며 선발된 캘러스는 동일 배지에 동일 조건으로 2주 동안 배양하는 과정으로 2차 선발하였다.

3-5. 형질전환된 캘러스로부터 재분화 식물체 유도

선발된 캘러스는 PPT 3mg/L, 세포탁심 250mg/L, NAA(Naphthalene Acetic Acid) 1mg/L, 키네틴(Kinetine) 5mg/L, 소르비톨 30g/L 및 말토오스 20g/L이 포함된 MSR-CP 배지(표 1 참조)에 치상한 다음 25℃ 명조건에서 배양하여 형질전환식물체를 유도하였다.

3-6. 뿌리 유도 및 순화

재분화 식물체는 생장호르몬이 포함되지 않은 MS0 배지(표 1 참조)에 옮겨 뿌리를 유도하였다. 뿌리가 유도된 식물체는 1000배 하이포닉스 수용액에 약 7-10일간 침지하여 순화시켰으며 순화된 식물체는 화분에 이식하고 온실에서 관리하였다.

[ 실시예 4]

형질전환 T2세대 벼 식물체를 대상으로 세대진전에 따른 BrD1 유전자의 유전여부를 확인하기 위해 PCR 및 서든 블랏 분석(southern blot analysis)을 수행하였 다. 도 3a는 실시예 2의 조건으로 PCR을 수행 후 그 결과를 나타낸 것으로 T2세대 벼 식물체는 모두 프라이머의 기대 크기인 243bp 위치에서 특이 밴드를 나타내어 BrD1 유전자가 후대로 안정적으로 유전되는 것이 확인되었다. 유전된 BrD1 유전자의 벼 식물체내의 삽입 수는 서든 블랏 분석을 통해 확인하였다. 서든 블랏은 BrD1 유전자를 프로브(probe)로 하여 DIG DNA Labeling 키트(Roche, Cat. NO. 11 585 614 910)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다. 먼저, 형질전환 식물체로부터 실시예 1의 방법으로 DNA를 추출하여 정량한 다음 제한효소 Xba1을 이용하여 절단하였다. 절단된 DNA를 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 나일론 막에 블롯팅하였다. 블롯팅된 막을 UV 크로스-링킹(cross-linking)한 후, 42℃에서 30분간 예비혼성화(pre-hybridization)를 수행하고, 42℃에서 16시간 동안 프로브를 포함하는 혼성화 완충용액(hybridization buffer)으로 혼성화를 실시하였다. 도 3b는 그 결과를 나타낸 것으로 형질전환 식물체는 모두 한 개의 유전자가 벼 게놈에 삽입되어 성공적으로 다음 세대에 유전되는 것으로 확인되었다.

[ 실시예 5] 형질전환 벼에 대한 벼멸구 생물검정 및 저항성 확인

다음과 같은 방법을 사용하여 벼 형질전환체의 벼멸구에 대한 저항성을 조사하였다.

벼멸구 생물검정 방법으로는 유리시험관 생물검정 방법을 사용하였다. 검정에 사용될 벼 식물체의 육성을 위해 먼저 발아된 벼 종자를 수도용 상토에 파종하였으며 잘 자란 3엽기의 유묘를 생물검정에 이용하였다. 생물검정을 위해 균일하게 자란 유묘를 상토에서 뽑고 뿌리의 흙을 잘 씻어 제거한 다음, 뿌리 부분을 솜(가로*세로=4*25cm)으로 말아 유리시험관(직경:3cm, 높이:20cm)에 집어넣었다(도 4 참조). 유묘가 세팅된 유리시험관에 갓 5령이 된 벼멸구 약충을 흡충관을 이용하여 무작위로 5마리씩 접종하였다. 매일 벼멸구의 생존율과 벼의 상태를 기록하고 감수성인 모품종인 일미벼가 모두 고사하는 시점에서, 살아남은 형질전환 벼를 시험관에서 꺼내 토양에 이식하였다. 저항성 평가 시점은 감수성 벼가 모두 고사한 때를 기준으로 하였으며, 저항성 정도는 약, 중, 강 등 3등급으로 분류하여 조사하였다. ‘약’은 벼가 시들어 고사하거나, 2엽이 고사한 시점에서 벼멸구 80% 이상 생존한 경우, ‘중’은 벼 1, 2, 3엽 모두 상태가 양호하거나 또는 1엽만 연한 황색으로 변하고 벼멸구가 40 ~ 60% 생존하였을 경우, ‘강’은 벼 1, 2, 3엽 모두 상태가 양호하거나 또는 1엽만 연한 황색으로 변하고 벼멸구가 80% 이상 사망하였을 경우를 표시하였다. 대조구로는 형질전환에 사용된 모품종인 일미벼와 저항성 유전자 Bph1을 가지고 있는 청청벼를 사용하였으며, 검정에 사용된 벼 형질전환체와 저항성 정도를 비교하였다. 생물검정은 모두 3 반복 이상으로 실시하였다.

표 2는 벼멸구 생물검정 결과를 나타낸 것으로 형질전환에 사용된 모품종인 일미벼의 경우 접종 5일이 경과하였을 때 식물체 전체가 시들어 말라죽는 전형적인 벼멸구 피해 증상을 보였다(도 4 참조). 그러나 BrD1 유전자가 형질전환된 벼 T2세대인 TG-18-4-1-1, TG-18-4-1-2, TG-18-4-1-3, TG-26-4-1-1, TG-26-4-1-2 등 5계통은 증상이 없거나 1엽에만 약한 갈반 증상을 보여 벼멸구에 저항성 품종인 청청벼와 비슷한 저항성을 보였다. 이러한 결과는 BrD1 유전자가 벼멸구 등의 흡즙성 해 충에 대해 매우 효과적인 저항성을 부여하고 있음을 나타낸다.

[표 2]벼멸구 접종 후 일별 생존 수 및 벼 상태

계통	벼멸구 접종 후 일별 생존수(마리)								접종 후 벼상태	저항성 강도
	0	1	2	3	4	5	6	7
일미벼-1	5	5	5	5	5	5	-	-	식물체 전체가 말라 죽음	약
일미벼-2	5	5	5	5	5	5	-	-	식물체 전체가 말라 죽음	약
청청벼-1	5	3	0	0	0	0	0	0	1엽에 갈반증상	강
청청벼-2	5	3	2	0	0	0	0	0	1엽 끝에 마름증상	강
청청벼-3	5	2	1	0	0	0	0	0	1엽 중앙부 갈반증상	강
TG-18-4-1-1	5	4	1	1	1	1	1	1	증상 없음	강
TG-18-4-1-2	5	2	1	0	0	0	0	0	1엽 끝에 갈반증상	강
TG-18-4-1-3	5	3	1	0	0	0	0	0	1엽 끝에 갈반증상	강
TG-26-4-1-1	5	3	3	1	1	1	1	1	증상 없음	강
TG-26-4-1-2	5	4	3	2	2	2	0	0	증상 없음	강
TG-26-4-1-3	5	5	4	4	4	4	4	4	1, 2엽에 황화 증상, 이식 후 고사	약
TG-26-4-1-4	5	5	5	4	4	4	3	3	1엽 고사, 3엽 끝에 황화 증상	중

[ 실시예 6] 형질전환 벼에 대한 어리쌀바구미 생물검정 및 저항성 확인

다음과 같은 방법을 사용하여 벼 형질전환체의 어리쌀바구미에 대한 저항성을 조사하였다.

벼멸구 생물검정 방법으로는 페트리 접시 접종 방법을 사용하였다. 검정에 사용될 벼 형질전환체 종자껍질을 제거한 다음 페트리 접시 당 약 60개의 종자를 집어넣고 누대 사육중인 어리쌀바구미 30마리를 무작위로 각 접시별로 접종하였다. 곤충 접종 후 15, 30, 105일에 각각 생존 곤충 수와 쌀의 피해 수를 조사하여 저항성 정도를 평가하였다. 그 결과 접종 105일 후의 대조구 쌀과 형질전환된 쌀 사이에는 뚜렷한 차이를 보였다. 대조구 쌀은 어리쌀바구미가 갉아먹어 가루로 변했으 나 형질전환된 쌀에서는 일부 피해를 받은 쌀이 있었으나 대조구 쌀에 비해 현저히 피해정도가 미미한 것으로 나타났다(도 5 참조). 이러한 결과는 BrD1 유전자가 저장 중에 피해를 주는 어리쌀바구미 등의 해충에 대해 매우 효과적인 저항성을 부여하고 있음을 나타낸다.

[ 실시예 7]

벼멸구 생물검정 후 생존 개체를 대상으로 BrD1 유전자의 발현량을 조사하였다. 형질전환 벼 식물체의 잎으로부터 트리졸 시약(Trizol reagent: invitrogen, Cat. NO. 15596-018)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로부터 cDNA 합성 키트(cDNA synthesis kit; stratagen, Cat. NO. 600084)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 기질로 사용하여 BrD1의 유전자 특이 프라이머(gene specific primer)인 전진 프라이머(Forward primer)인 5'-ATG GCT AAG GTT GCT TCC ATC ATC AC-3'와 역전사 프라이머(Reverse primer)인 5'-TTA ACA AGG GAA GTA GCA GAT ACA CC-3'로 RT-PCR을 수행하였다. 벼의 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 액틴(actin)을 내부 통제(internal control)로 사용하였다. 액틴 프라이머(actin primer)는 전진 프라이머(forward primer)인 5'-GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG-3'(서열번호 1)와 역전사 프라이머(reverse primer)인 5'-TCC ATC TTG GCA TCT CTC AG-3'(서열번호 2)를 이용하였다. PCR 반응은 MJ 리서치 (MJ research)사의 PTC-200기기로 수행하였다. PCR 반응 조건으로는 94℃ 4분간 변성 반응시킨 후 94℃에서 15초간 변성, 60℃에서 30초간 중합, 72℃에서 30초간 신장 반응을 30회 반복 후 72 ℃에서 7분간 신장 반응하도록 프로그램하였다. 증폭된 산물을 EtBr이 첨가된 2% 아가로오스 겔에서 분리하고, UV트랜스 일루미네이터에서 확인하였다.

도 7은 그 결과를 나타낸 것으로 벼멸구 생물검정에서 생존한 벼 식물체는 안정적인 BrD1 유전자의 발현을 보였으며 이러한 결과는 형질전환된 BrD1 유전자가 벼 세포내에서 정상적으로 발현되고 있음을 나타낸다. 따라서 형질전환 벼에서의 벼멸구 저항성은 BrD1 유전자의 발현과 밀접한 관련이 있는 것으로 증명되었다.

도 1a는 본 발명에 사용된 배추 유래의 해충저항성 디펜신 단백질을 코딩하는 유전자 BrD1의 cDNA 염기서열을 나타낸 것이다.

도 1b는 본 발명에 사용된 BrD1 유전자의 게놈 DNA 염기서열을 나타낸 것이다.

도 1c는 발명에 사용된 배추 유래의 해충저항성 디펜신 단백질을 코딩하는 유전자 BrD1의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 1d는 BrD1 유전자 전체 구조를 나타낸 것이다.

도 1e는 배추 5개 품종으로부터 BrD1 유전자의 cDNA 및 게놈 DNA를 대상으로 RT-PCR 및 PCR을 수행한 다음 그 결과를 보여주는 사진이다.

도 2a는 본 발명에 사용된 BrD1이 도입된 식물 형질전환용 운반체의 지도이다.

도 2b는 도 2a의 형질전환 운반체를 아그로박테리움에 형질전환하고 콜로니 PCR을 수행하여 그 결과를 보여주는 사진이다.

도 3a는 형질전환 벼 (T2 세대)를 대상으로 PCR 방법으로 BrD1 유전자 도입 여부를 확인한 것이고, 도 3b는 서든 블랏(southern blot)을 통해 형질전환 벼의 BrD1 유전자 도입 수를 확인한 것이다.

도 4는 형질전환 벼 (T2 세대)의 벼멸구에 대한 저항성을 보여주는 그림이다. 도 4의 WT는 형질전환 운반체가 도입되지 않은 벼 식물체를, 도 4의 TG는 형질전환 운반체가 도입된 형질전환 벼 식물체를 보여주는 사진이며, 도 4의 청청벼는 벼멸구 저항성 유전자 Bph1을 가지고 있는 저항성 품종으로 형질전환 벼 식물체와 저항성 정도를 비교하기 위해 나타내었다.

도 5는 형질전환 운반체가 도입된 형질전환 벼 쌀의 어리쌀바구미에 대한 저항성을 보여주는 그림이다. 도 5의 WT는 형질전환 운반체가 도입되지 않은 벼 쌀을, 도 5의 A와 B는 형질전환 운반체가 도입된 벼 형질전환 쌀을 보여주는 사진이며 A는 피해가 없는 쌀을, B는 피해를 받은 쌀을 나타낸 것이다.

도 6은 벼멸구 접종 후 포트에서 정상적으로 생육하고 있는 형질전환 벼 식물체를 보여주는 사진이다.

도 7은 벼멸구 생물검정 후 생존 개체를 대상으로 BrD1 유전자의 발현량을 조사한 결과이다.

<110> Korea <120> Gene coding the insect-resistant Defensin from Brassica rapa and transgenic plants using that <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 atggctaagg ttgcttccat catcac 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 2 ttaacaaggg aagtagcaga tacacc 26 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 3 atggctaagg ttgcttccat catcaccctt ctcttcgctg ctctcgttct ctttgctgct 60 tttggtgagt agtgatctta tcataagcat gacgaaatga tttttaaata tttattcttc 120 agattatttg atttaaccat gataaatatg tatacagaag caccaacaat ggtgaaagcg 180 cagaagttgt gcgagaggtc tagtgggaca tggtcaggag tatgtggaaa taacaatgct 240 tgcaagaacc agtgcatcaa ccttgaggga gcacgacatg gatcttgcaa ctatgttttc 300 ccatatcaca ggtgtatctg ctacttccct tgttaa 336 <210> 4 <211> 243 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 4 atggctaagg ttgcttccat catcaccctt ctcttcgctg ctctcgttct ctttgctgct 60 tttgaagcac caacaatggt gaaagcgcag aagttgtgcg agaggtctag tgggacatgg 120 tcaggagtat gtggaaataa caatgcttgc aagaaccagt gcatcaacct tgagggagca 180 cgacatggat cttgcaacta tgttttccca tatcacaggt gtatctgcta cttcccttgt 240 taa 243 <210> 5 <211> 80 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 5 Met Ala Lys Val Ala Ser Ile Ile Thr Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Lys Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Ser Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Gly Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Tyr His Arg Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80

Claims (7)

1. 배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 하기의 유전자 BrD1의 게놈 DNA 염기서열.

   
2. 배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 하기의 유전자 BrD1의 cDNA 염기서열.

   
3. 제1항 또는 제2항의 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1에 의해 코딩되는 하기의 아미노산 서열.

   
4. 제1항 또는 제2항의 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1을 pSB11에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pMJC-GB-BrD1 .
5. 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1을 포함하는 제4항의 재조합 벡터 pMJC-GB-BrD1을 아그로박테리움 투머파시엔(Agrobacterium tumefaciens)에 도입시킨 것을 특징으로 하는 형질전환체(KACC 95064P).
6. 배추 유래의 해충 저항성 디펜신 유전자 BrD1을 제5항의 형질전환체를 이용하여 도입시킨 형질전환 식물체.
7. 제6항에 있어서,

   상기 형질전환 식물체의 대상이 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.

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