KR20010113630A - 분자 유전학 방법에 의해 식물병원성 진균 및 박테리아에대한 경작물의 내성을 증가시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시키는 분자 유전학 방법에 의해 식물을 생산하는, 박테리아성 및 진균성 병원균에 대한 경작물의 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

분자 유전학 방법에 의해 식물병원성 진균 및 박테리아에 대한 경작물의 내성을 증가시키는 방법 {Method of Increasing the Resistance of Cultivated Plants to Phytopathogenic Fungi and Bacteria by Methods of Molecular Genetics}
본 발명은 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시키는 분자 유전학 방법에 의해 식물을 생산하는, 박테리아성 및 진균성 병원균에 대한 경작물의 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 방법은 추가로 분자 생물학 방법 (예를 들면, 안티센스 구조물, 동시 억제, 특정 항체의 발현 또는 특정 억제제의 발현)에 의해 식물의 전부 또는 일부에서 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 완전히 또는 일부, 영구적으로 또는 일시적으로 억제하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 분자 유전학 방법에 의해 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시킴으로써 박테리아성 및 진균성 병원균에 대해 내성이 증가된 식물에 관한 것이다.
스트레스 요인에 의해 여러가지 방식으로 경작물의 생산성이 감소될 수 있다. 언급될 수 있는 스트레스 요인에는 특히 바이러스성 질환, 박테리아성 및 진균성 병원균, 해충, 선충, 민달팽이 및 달팽이, 수엽 손상, 고온, 중저온 및 저온,수분 부족, 토양에서의 지나치게 높은 수분 함량, 토양 염류화, 지나치게 높은 방사선 강도, 지나치게 높은 오존 함량, 동반 식물상에 의한 빛, 물 및 영양분의 경쟁, 미숙하게 사용된 제초제, (특히 과수원에서) 적당하게 사용되지 않은 제초제, 감응성이 지나치게 낮은 제초제, 살충제, 살진균제, 생조절제 또는 엽면 비료의 처리, 빛이 강할 때 작물 보호제 또는 비료의 엽면 시용 등이 있다.
스트레스 요인에 의해 야기되는 이들 문제점 중 일부는 작물 보호제를 사용하거나, 내성이 있는 식물 원료를 사용하거나, 또는 적합한 경작 기술을 사용하여 최소화될 수 있다. 그러나, 그 가망성 정도는 제한된다. 특히, 세균병은 방제된다 하더라도 매우 어렵게 방제될 수 있을 뿐이다. 그렇게 하기 위해 (예를 들어, 사과 및 복숭아에 있어서 일조병 (fire blight)을 방제하고자 하는 경우), 스트렙토마이신 또는 테트라시클린과 같은 항생제를 사용하는데, 사람 병원균을 비롯해서 내성을 키울 위험이 있다. 더우기, 예를 들면 진균성 병원균은 종종 살진균제에 적응해서 살진균제의 효능을 감소시키는 것으로 나타난다. 유사한 적응이 통상적인 방법에 의해 생산되는 "내병원균 (pathogen-resistant)" 식물의 육종 제품에서도 존재한다.
1년생 작물 또는 원예 작물 뿐 아니라, 과일 및 덩굴 식물과 같은 가치 있는 다년생 작물에 있어서도 내병원균 식물이 요구된다.
본 발명의 목적은 특히 경작물에 있어서 박테리아성 및 진균성 병원균에 대한 내성을 영구적으로 개선시키는 간단하고 저비용의 방법을 찾는 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 아실시클로헥산디온 군의 생장 조절제에 관한 생리학적 연구를 기초로, 일련의 식물 병원성 박테리아 및 진균에 대한 내성이 있는 경작물을 생산할 수 있는 유전공학 방법에 의해 이러한 목적이 달성된다는 것을 알아내었다.
프로헥사디온-Ca 및 트리넥사팍-에틸 (이전에는 시멕타카브로 알려짐)과 같은 아실시클로헥산디온은 식물의 길이 생장을 억제하기 위한 생조절제로 사용된다. 이들은 길이 생장을 촉진하는 지베렐린의 생합성을 억제하기 때문에 생조절 작용을 하게된다. 이들은 2-옥소글루타르산과 구조적 상관관계가 있기 때문에, 공기질로서 2-옥소글루타르산을 필요로하는 특정 디옥시게나제를 억제한다 [Rademacher, W. 식물 생장 지연제의 생화학적 효과, Plant Biochemical Regulators, Gausman, HW(ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 169-200 (1991)]. 이러한 화합물들은 페놀 대사과정에도 관여함으로써 몇몇 식물종에서 안토시아닌 생성을 억제시킬 수 있다고 알려져 있다 [Rademacher, W 외, 아실시클로헥산디온의 작용 형태 - 새로운 종류의 생장 지연제, Progress in Plant Growth Regulation, Karssen, CM, van Loon, LC, Vreugdenhil, D (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1992)]. 페놀계 성분의 균형에 관한 이러한 영향이 일조병에 대한 프로헥사디온-Ca의 부작용을 일으키는 원인인 것으로 여겨진다 [Rademacher, W. 외, 프로헥사디온-Ca - 흥미로운 생화학적 특성을 갖는 사과에 대한 신규한 식물 생장 조절제, 시카고에서 1998년 7월 7-10일에 열린 the Plant Growth Regulation Society of America의 제25회 정기 모임에서의 포스터]. 룩스-엔드리히(Lux-Endrich)는 일조병에 대한 프로헥사디온-Ca의 작용 메카니즘에 관한 연구로 사과 세포 배양에서 프로헥사디온-Ca가 페놀계 물질 함량을 수배 증가시키며, 다른 식으로는 나타나지 않는 일련의 페놀류가 발견된다는 것을 알아내었다 [PHD Thesis, Technical University of Munich at Weihenstephan, 1998]. 이 연구에서, 프로헥사디온-Ca의 영향으로 사과 발아 조직에서 비교적 다량의 루테올리플라반 및 에리오딕티올을 만든다는 것도 알아내었다. 루테올리플라반은 보통 사과 조직에서는 생기지 않으며, 에리오딕티올은 플라보노이드 대사작용에서 중간체로 소량만이 존재한다. 그러나, 기대되었던 플라보노이드인 카테킨 및 시아니딘은 처리 조직에서 검출되지 않거나, 또는 상당히 소량만이 검출되었다 [S. Roemmelt 외, 1998년 10월 12-15일에 터어키 쿠사다시에서 열린 일조병에 대한 제8회 국제 워크삽에서 제출된 페이퍼].
프로헥사디온-Ca, 트리넥사팍-에틸 및 기타 아실시클로헥사디온이 페놀계 물질의 대사작용에 있어서 중요한 역할을 하는 2-옥소글루타르산 의존성 히드록실라제를 억제한다는 것이 관찰되었다. 이들은 주로 칼콘 합성효소 (CHS) 및 플라바논 3-히드록실라제 (F3H)이다 [W. Heller 및 G. Forkmann, Biosynthesis, The Flavonoids, Harborne, JB (ed.), Chapman and Hall, New York, 1988]. 그러나, 아실시클로헥산디온이 지금까지 알려지지 않은 기타 2-옥소글루타르산-의존성 히드록실라제를 억제한다는 것도 배제할 수는 없다. 카테킨, 시아니딘 및 기타 플라보노이드 합성 최종 생성물의 부족 현상이 또한 식물에 의해 나타나며, 피드백 작용을 통해 주요 효소인 페닐알라닌 암모늄-리아제 (PAL)의 활성이 증가된다는 것은 명백한 것처럼 보인다. 그러나, CHS 및 F3H가 여전히 억제되기 때문에 이들 플라보노이드 최종 생성물이 생성될 수 없으며, 이로 인해 루테올리플라반, 에리오딕티올 및 기타 페놀류의 생성이 증가된다 (도 1).
플라바논 3-히드록실라제 (F3H)의 효소 활성이 감소되기 때문에, 3번 탄소 원자에서 수소로 치환된 플라보노이드 에리오딕티올인 프로안토시아니딘, 예컨대 루테오포롤, 루테올리플라반, 아피제니플라반 및 트리세티플라반, 및 이들의 균일 및 불균일 올리고머 및 중합체, 및 구조적으로 관련 있는 물질들이 보다 다량으로 생성된다.
플라바논 3-히드록실라제 (F3H) 효소의 활성이 감소되면, 식물에서 페놀 히드록시신남산 (p-쿠마르산, 페룰산, 시납산), 살리실산 또는 움벨리페론, 및 이들의 균일 및 불균일 올리고머 및 중합체의 농도가 증가된다는 것이 밝혀졌다. 칼콘 (예를 들면, 플로레틴) 및 스틸벤 (예를 들면, 레스버라트롤)의 농도도 상승된다.
플라바논 3-히드록실라제 효소 활성의 감소로 인해 플라보노이드의 글리코시드, 페놀계 화합물, 칼콘 및 스틸벤의 농도도 증가된다.
이러한 발견 및 결론을 기초로, 안티센스 구조물에 의해 식물 전체에서 또는 식물 각각의 기관 및 조직에서 완전히 또는 일부, 영구적으로 또는 일시적으로 F3H를 감소시키고, 그 결과 전체 식물에서 페놀계 화합물 함량이 감소된, 유전학적으로 변형된 경작물을 생산하였다. 결과적으로, 박테리아성 및(또는) 진균성 병원균에 대한 이들 식물의 내성이 증가된다는 것을 실험적으로 증명하는 것이 가능하였다.
플라바논 3-히드록실라제 활성을 안티센스 기술에 의해 감소시키는 식물 생산에 대한 별법으로, 이러한 효과를 달성하기 위해 동시 억제 또는 특정 항체의 발현과 같은 문헌에 공지되어 있는 다른 분자 유전학 방법을 사용하는 것도 가능하다.
플라바논 3-히드록실라제 효소 활성을 감소시킴으로써 박테리아성 및 진균성 병원균의 공격에 대한 내성을 증가시키기 위한 본 발명의 방법은 다음 경작물에 있어서 성공적으로 실시될 수 있다: 밀, 보리, 호밀, 귀리, 벼, 옥수수, 수수류, 사탕수수, 바나나, 토마토, 담배, 피망, 감자, 평지씨, 사탕무, 대두, 목화, 장미과 (Rosaceae)의 유실수 (예를 들면, 사과, 배, 자두, 서양자두, 복숭아, 승도 복숭아 및 벗나무) 및 포도나무.
본 발명에 따른 방법은 사과 및 배에 있는 검은별무늬병 (Venturia inaequalis) 및 포도나무에 있는 회색 곰팡이병균 (Botrytis cinerea)에 대한 내성을 증가시키는 데 특히 적합하다.
실시예에서 설명된 방법에 의해 생산되는, 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성이 감소된 트랜스제닉(transgenic) 식물은 놀랍게도 식물 병원성 박테리아에 의한 공격에 대해 증가된 내성을 나타낸다. 이는 플라바논 3-히드록실라제 활성이 감소된 트랜스제닉 토마토 식물에 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) (Cmm)를 공격시킨 것을 참고로 하여 증명되었다: 실시예 3 참조.
분자 유전학 방법에 의해 플라바논 3-히드록실라제 활성이 감소된 식물은 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및 기타 식물 병원성 박테리아에 의한 공격에 대해서도 증가된 내성을 나타냈다. 가장 중요한 식물 병원성 박테리아는 문헌 ["European Handbook of Plant Diseases", Eds. Smith, I.M., Dunez, J., Lelliott, R.A. Phillips, D.H. 및 Archer, S.A. Blackwell Scientific Publications, 1988]에서 찾아볼 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 하기 식물 병원성 진균에 대한 내성을 증가시키는 데 적합하다:
곡류에서의 흰가루병 (Erysiphe graminis) (powdery mildew),
조롱박에서의 흰가루병 (Erysiphe cichoracearum및Sp㏊erotheca fuliginea),
사과에서의 흰가루병 (Podosp㏊era leucotric㏊),
포도나무에서의 흰가루병 (Uncinula necator),
곡류에서의 녹병균류 (Puccinia species),
면화, 벼 및 잔디에서의 모잘록병균류 (Rhizoctonia species),
곡류 및 사탕수수에서의 깜부기병 (Ustilago species),
사과 및 배에서의 검은별무늬병 (Venturia species(scab)),
곡류에서의 무늬병류 (Helminthosporium species),
밀에서의 껍질마름병균 (Septoria species),
딸기, 야채류, 관상식물 및 포도나무에서의 회색 곰팡이병균 (Botrytis cinerea(gray mold)),
땅콩에서의 세르코스포라 아라키디콜라 (Cercospora arachidicola),
밀 및 보리에서의 슈도세르코스포렐라 헤르포트리코이데스(Pseudocercosporella herpotrichoides),
벼에서의 도열병균 (Pyricularia oryzae),
감자 및 토마토에서의 역병균 (Phytophthora infestans),
포도나무에서의 노병균 (Plasmopara viticola),
홉 및 오이에서의 슈도페로노스포라류 (Pseudoperonospora species),
야채류 및 과일에서의 검은무늬병균류 (Alternaria species),
바나나 및 땅콩에서의 미코스파에렐라류 (Mycosphaerella species) 및
곡류, 야채류 및 관상 식물에서의 썩음병균 (Fusarium) 및 무늬병균류 (Verticillium species).
<실시예 1>
토마토 재배종 머니메이커 (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker)로부터 플라바논 3-히드록실라제의 유전자 클로닝
익은 토마토 재배종 머니메이커 (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker)를 세척, 건조하고, 무균 블레이드로 종자, 중축 및 목질 부분에서 과피를 제거하였다. 이 과피 (약 50 g)을 액상 질소에서 동결시켰다. 이 물질을 후속적으로 혼합기에서 분쇄하였다. 미리 냉각시킨 모르타르에서, 분쇄된 물질을 100 ml의 균질화 매질로 처리하여 혼합하였다. 그후, 현탁액을 무균 가제로 짜내서 원심분리관으로 옮겼다. 그후, 1/10 부피의 10% SDS를 가하고, 배치를 철저히 혼합하였다. 얼음에서 10분 후, 페놀/클로로포름 1 부피를 가하고, 원심분리관을밀봉하고, 성분들을 철저히 혼합하였다. 4000 rpm에서 15분 동안 원심 분리한 후, 상등액을 깨끗한 반응기로 옮겼다. 페놀/클로로포름으로 3회 이상 추출하고, 클로로포름으로 1회 추출하였다. 그후, 3M NaAc 1 부피 및 에탄올 2.5 부피를 가하였다. -20 ℃에서 밤새 핵산을 침전시켰다. 다음날 아침, 핵산을 10,000 rpm에서 15 분 동안 냉동 원심분리기 (4 ℃)에서 펠렛화하였다. 상등액을 버리고, 펠렛을 차가운 3M NaAc 5 내지 10 ml 중에서 재현탁시켰다. 이 세척 단계를 2회 반복하였다. 펠렛을 80% 에탄올로 세척하였다. 완전히 건조되면, 펠렛을 약 0.5 ml의 무균 DEPC 물에 녹이고, 광도 측정법으로 RNA 농도를 측정하였다.
총 RNA 20 μg을 우선 3M 아세트산 나트륨 용액 3.3 μl 및 1M 황산 마그네슘 용액 2 μl로 처리하고, 이 혼합물을 DEPC 물로 보충하여 최종 부피 100 μl가 되게 하였다. RNase-무함유 DNase (Boehringer Mannheim) 1 μl를 가하고, 혼합물을 37 ℃에서 45분 동안 배양시켰다. 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜로 진탕하면서 추출하여 효소를 제거한 후, RNA를 에탄올로 침전시키고, 펠렛을 DEPC 물 100 μl에 녹였다. 이 용액으로부터 RNA 2.5 μg을 cDNA 키트 (Gibco BRL)를 사용하여 cDNA로 전사시켰다.
플라바논 3-히드록실라제를 암호화하는 cDNA 클론으로부터 유도된 아미노산 서열을 사용하여 제1 서열에서의 불변 영역을 확인하였고 [Britsch 외, Eur. J. Biochem. 217, 745-754 (1993)], 이들은 변형된 PCR 올리고뉴클레오티드의 설계에 대한 기초를 형성한다. 5'-올리고뉴클레오티드는 펩티드 서열 SRWPDK (페츄니아 (Petunia Hybrida) 서열 FL3H PETHY에서의 아미노산 147-152)를 사용하여 결정되었고, 서열 5'-TCI (A/C) G (A/G) TGG CC(A/C/G) GA (C/T) AA (A/G) CC-3을 가졌다.
펩티드 서열 DHQAVV (페츄니아 서열 FL3H PETHY에서의 아미노산 276281)을 사용하여 유도된 올리고뉴클레오티드의 서열은 5'-CTT CAC ACA (C/G/T) GC (C/T) TG (A/G) TG (A/G) TC-3이었다.
제조자 지시에 따라 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) tT번째 중합효소를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 템플레이트로 (RNA 0.3 μg에 해당하는) cDNA 1/8을 사용하였다. PCR 프로그램은 다음과 같았다:
30 사이클
90도 4초
40도 30초
72도 2분
72도 10분
제조자의 지시에 따라 단편을 프로메가(Promega)에 의한 벡터 pGEM-T로 클로닝하였다.
서열화에 의해 단편의 정확함을 확인하였다. 벡터 pGEM-T의 폴리링커에 존재하는 제한 분열 자리 Nco1 및 Pst1을 사용하여 PCR 단편을 단리하였고, T4 중합 효소를 사용하여 돌출부를 평활 말단으로 만들었다. 이 단편을 SmaI (평활) 말단 벡터 pBinAR로 클로닝하였다 [Hoefgen 및 Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230 (1990)] (도 2 참조). 이 벡터는 CaMV (꽃양배추 모자이크 바이러스) 35S 프로모터 [Franck 외, Cell 21: 285-294 (1980)] 및 옥토파인 합성 효소 유전자 종결 시그날 [Gielen 외, EMBO J. 3: 835-846 (1984)]를 함유한다. 식물에서, 이 벡터는 카나마이신 항생제에 대한 내성을 중재한다. 얻어진 DNA 구조물은 센스 및 안티센스 배향에 PCR 단편을 함유하였다. 이 안티센스 구조물을 트랜스제닉 식물을 생산하는 데 사용하였다.
도 2: 단편 A (529 bp)는 CaMV 35S 프로모터 (꽃양배추 모자이크 바이러스의 뉴클레오티드 6909 내지 7437)를 함유한다. 단편 B는 안티센스 배향에 F3H 유전자 단편을 함유한다. 단편 C (192 bp)는 옥토파인 합성 효소 유전자의 종결 시그날을 함유한다.
<5'-RACE 시스템을 사용하여 토마토 재배종 머니메이커 (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker) 플라바논 3-히드록실라제의 보다 큰 cDNA 단편의 클로닝>
안티센스 구조물에 사용되는 작은 크기의 F3H PCR 단편으로 인해 F3H의 mRNA 유동 평형 양이 감소된 식물을 생산하는 것을 실패하지 않도록 보다 큰 F3H 단편을 사용하여 제2 안티센스 구조물을 생산해야 했다.
보다 큰 F3H 단편을 클로닝하기 위해, 5' RACE 방법 (cDNA 말단의 신속한 확장을 위한 시스템)을 사용하였다.
<cDNA 말단의 신속한 확장을 위한 5' RACE 시스템 (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies:상표)에 의한 버젼 2-0)을 사용하는 5'RACE 방법에 의한 F3H PCR 단편의 확장>
익은 토마토 재배종 머니메이커 (Lycopersicon esculentum Mill. cv.Moneymaker)로부터 총 RNA를 단리하였다 (상기 참조).
GSP-1 (유전자-특이성 프라이머) 5'-TTCACCACTGCCTGGTGGTCC-3'를 사용하여 제조자의 지시에 따라 cDNA 제1 스트랜드 합성을 수행하였다. RNase 분해 후, 라이프 테크놀로지스사 제품인 GlassMAX 스핀 시스템을 사용하여 제조자의 지시에 따라 cDNA를 정제하였다.
제조자의 지시에 따라, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이 효소를 사용하여 정제된 단일-스트랜드의 F3H cDNA의 3' 말단에 시토신 단독중합체를 부가하였다. GSP-1 인식 서열의 3' 영역 상류에 결합하는 제2 유전자-특이성 프라이머 (GSP-2)를 사용하여 5'-확장된 F3H cDNA를 확장함으로써 "내포된" PCR을 얻게 하였다. 사용된 5' 프라이머는 제조자에 의해 제공되며 cDNA의 단독중합체 dC 테일에 상보적인 "5' RACE 단축된 앵커 프라이머"였다.
이런 방법으로 확장된 F3H확장이라고 칭해지는 cDNA 단편을 제조자의 지시에 따라 프로메가의 pGEM-T 벡터로 클로닝하였다.
cDNA는 서열화에 의해 확인하였다.
pGEM-T 벡터의 폴리링커에 존재하는 제한 분열 부위 Nco1 및 Pst1을 사용하여 F3H확장cDNA 단편을 단리하였고, 돌출부는 T4-중합 효소를 사용하여 평활 말단으로 만들었다. 이러한 단편을 SmaI (평활) 벡터 pBinAR로 클로닝하였다 [Hoefgen 및 Willmitzer, 1990] (도 3 참조). 이 벡터는 CaMV (꽃양배추 모자이크 바이러스) 35S 프로모터 [Franck 외, 1980] 및 옥토파인 합성 효소 유전자 종결 시그날[Gielen 외, 1984]을 함유한다. 식물에서, 이 벡터는 카나마이신 항생제에 대한 내성을 중재한다. 얻어진 DNA 구조물은 센스 및 안티센스 배향에 PCR 단편을 함유하였다. 안티센스 구조물을 트랜스제닉 식물을 생산하는 데 사용하였다.
도 3: 단편 A (529 bp)는 CaMV 35S 프로모터 (꽃양배추 모자이크 바이러스의 뉴클레오티드 6909 내지 7437)을 함유한다. 단편 B는 안티센스 배향에 F3H 유전자의 단편을 함유한다. 단편 C (192 bp)는 옥토파인 합성 효소 유전자 종결 시그날을 함유한다.
<실시예 2>
안티센스 배향에서 플라바논 3-히드록실라제 아단편을 발현하는 트랜스제닉 토마토 재배종 머니메이커 (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker)의 생산
문헌 [Ling 외, Plant Cell Report 17, 843-847 (1998)]에 따른 방법을 사용하였다. 빛에서 16 시간 / 어둠에서 8 시간 두는 방식으로 약 22 ℃에서 경작을 하였다.
토마토 재배종 머니메이커 (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Moneymaker) 종자를 4% 하이포아염소산 나트륨 용액 중에서 10분 동안 배양하여 멸균시키고, 후속적으로 무균 증류수로 3 내지 4회 세척해서 발아되도록 3% 수크로스 (pH 6.1)가 보강된 MS 배양액에 두었다. 7 내지 10일의 발아 시간 후, 변형에 사용하기 위해 떡잎을 준비하였다.
1일: "MSBN" 배양액을 함유하는 페트리 디쉬를 약 10일된 담배 현탁 배양액1.5 ml로 덮었다. 이 플레이트를 필름으로 싸서 실온에서 다음날까지 배양하였다.
2일: 무균 여과지를 이러한 방식으로 공기 방울이 없는 담배 현탁 배양액으로 덮혀진 플레이트에 두었다. 십자형으로 절개한 떡잎을 이 여과지 상부에 두었다. 이 페트리 디쉬를 배양실에서 3일 동안 배양하였다.
5일: 아그로박테리아 배양액 (LBA4404)을 약 3000 g에서 10분 동안 원심분리에 의해 침전시키고, OD가 0.3이 되도록 MS 배양액에 재현탁시켰다. 떡잎 부분을 이 현탁액에 놓고, 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 그후, 떡잎 부분을 무균 여과지에서 약간 건조시키고, 출발 플레이트로 다시 보내서 배양실에서 3일 동안 계속해서 공생 배양시켰다.
8일: 공생 배양된 떡잎 부분을 MSZ2K50+β에 두고, 배양실에서 다음 4주 동안 배양시켰다. 그후, 이들을 2차 배양시켰다.
형성된 가지를 뿌리 유도 배양액으로 옮겼다.
뿌리내림이 성공되면, 식물을 시험할 준비를 하고 온실로 옮겼다.
<실시예 3>　
클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) (Cmm)로 감염시킨 플라바논 3-히드록실라제 활성이 감소된 트랜스제닉 토마토 식물.
Cmm을 이스트-덱스트로스-Ca 아가 (YDC)에서 28 ℃에서 2일 동안 성장시켰다. 이 박테리아를 무균수로 세척하고, 그들의 세포 밀도를 측정하였다. 접종을위해, 무균수를 사용하여 세포 밀도를 106세포수/ml로 되게 하였다. 박테리아 현탁액을 채운 20-게이지 피하 주사용 바늘을 사용하여 주입하였다. 총 3 내지 4개의 잎을 갖는 어린 식물의 가장 위에 있는 완전히 성장한 잎의 옆액에 이를 제공하였다. 나타난 표현형을 평가하여 감염 정도를 측정하였다.
야생형 식물에서는 잎의 75%가 넘게 시들어버리는 한편, 트랜스제닉 토마토 식물에서는 시드는 정도가 상당히 적었다.
<실시예 4>
안티센스 배향에 플라바논 3-히드록실라제를 갖는 토마토에서 역병균 (Phytophthora infestans)의 공격에 대한 내성을 증가시키는 시험
유전자 변형되지 않은, 또는 본 발명에 따라 유전자 변형된 재배종 머니메이커 토마토 식물의 잎을 역병균 (Phytophthora infestans)의 유주자 수현탁액으로 감염시키고, 1일 주 후 이들은 4-잎 단계가 되었다. 그후, 이 식물을 16 내지 18 ℃ 온도에서 대기 습도가 100%인 챔버 안에 두었다. 6일 후, 유전자 변형되지 않은 대조 식물에서 갈색 썩음이 심하게 나타났다. 플라바논 3-히드록실라제의 안티센스 구조물을 발현시킨 토마토 식물에서는 대조 식물에 비해 역병균 (Phytophthora infestans) 감염 정도가 상당히 적은 것으로 나타났다.

Claims (6)

  1. 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시키는 분자 유전학 방법에 의해 식물을 생산하는, 박테리아성 및 진균성 병원균에 대한 경작물의 내성을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분자 생물학 방법 (예를 들면, 안티센스 구조물, 동시 억제, 특정 항체의 발현 또는 특정 억제제의 발현)에 의해 식물의 전부 또는 일부에서 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 완전히 또는 일부, 영구적으로 또는 일시적으로 억제하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 경작물이 밀, 보리, 호밀, 귀리, 벼, 옥수수, 수수류, 사탕수수, 바나나, 토마토, 담배, 피망, 감자, 평지씨, 사탕무, 대두, 목화, 장미과 (Rosaceae)의 유실수 (예를 들면, 사과, 배, 자두, 서양자두, 복숭아, 승도 복숭아 및 벗나무) 및 포도나무인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사과 및 배에 있는 검은별무늬병 (Venturia inaequalis)에 대한 내성을 증가시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포도나무에 있는 회색 곰팡이병균 (Botrytis cinerea)에 대한 내성을 증가시키는 방법.
  6. 분자 유전학 방법에 의해 플라바논 3-히드록실라제 효소의 활성을 감소시킴으로써 박테리아성 및 진균성 병원균에 대해 내성이 증가된 식물.
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