DE4330307C2 - Verwendung von Nukleinsäuregelelektrophorese zur Identifizierung von Organismenteilen und dergleichen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Verwendung von Nukleinsäure­ gelelektrophorese in Verbindung mit polymergekoppelten basenspezifischen Komplexbildnern, in der die Auftrennung von DNA-Restriktionsfragmenten in einer ersten Richtung nach der Fragmentlänge und in einer zweiten, in 90° zur ersten Richtung laufenden Richtung durch das Vermischen des Gels mit dem polymergekoppelten Komplexbildner nach Fragmentlänge und Basenzusammensetzung erfolgt.

Zur Identifizierung von Organismen(teilen), Viren, Viroiden, und Plasmiden (im folgenden: die "zu Identifizierenden") werden bereits nukleinsäureanalytische Verfahren eingesetzt:
Das Auftreten einzelner, für die zu Identifizierenden typischer Nukleinsäuresequenzen oder auch deren Verteilungsmuster in RNA (Ribonukleinsäure) oder DNA (Desoxyribonukleinsäure) kann in Hybridisierungsexperimenten ("Hybridisierung": Verklebung gesuchter Nukleinsäuresequenzen mit Testsequenzen, die ihnen möglichst genau komplementär sind und im Vorfeld im Labor isoliert bzw. hergestellt und zur Sichtbarmachung markiert werden) und in PCR-Tests ("polymerase chain reaction": Vervielfältigung und Sichtbarmachung von gesuchten Nukleinsäuresequenzen nach Hybridisierung mit kurzen, zuvor isolierten bzw. hergestellten komplementären Stücken an ihren Enden) nachgewiesen werden. (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.: Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1987, S. 9.31-9.62. Arnheim, N. und Ehrlich, H: Polymerase Chain Reaction Strategy; Annual Review of Biochemistry 61, 1992, S. 131-156).

In neueren Versuchen werden auch die Verteilungen zufällig ausgewählter Nukleinsäuresequenzen in Hybridisierungsexperimenten und PCR-Tests sichtbar gemacht (Tichy, HV.: Fingerabdrücke von Mikroorganismen; BIOforum 10, 1992, S. 352).

Hybridisierungsexperimente sind aufwendige Mehrschrittverfahren. Der korrekte Ablauf der einzelnen Schritte bis zur Hybridisierung und die darauffolgenden Schritte bis zum Nachweis einer stattgefundenen Hybridisierung sind in sensibler Weise von einer Vielzahl von Bedingungen abhängig, wie z. B. Verfügbarkeit, Einmaligkeit und möglichst geringe Kreuzhybridisierung einer typischen zur Hybridisierung verwendeten Sequenz, Temperatur, Zeit, Ionenstärke, Verunreinigungen, Effektivität der Bindung an Trägermaterialien, etc. Die Reproduzierbarkeit ist oft schwierig.

Die PCR ist ein ebenfalls kompliziertes und auch teures Mehrschrittverfahren, das als besonders kritische Schritte eine Folge mehrerer genau stattfindender Hybridisierungen mit den obengenannten kritischen Bedingungen (außer der Bindung an Trägermaterialien) umfaßt.

Grundbedingung für beide Verfahren zur Identifizierung ist, daß im Vorfeld der Untersuchung bereits eine für die zu Identifizierenden typische Nukleinsäuresequenz gefunden und vervielfältigt bzw. hergestellt worden (verfügbar) sein muß, die zu Identifizierenden also bereits genau untersucht sein müssen. Solche Sequenzen werden zur Zeit im wesentlichen durch Sequenzierung der ribosomalen DNA und datentechnischen Vergleich der Sequenzen mit entsprechenden Sequenzen anderer Organismen gefunden. Dies erfordert einen sehr hohen technischen Aufwand. Wegen der geringen Sequenzunterschiede in der ribosomalen DNA ist die Gefahr der Entstehung von Kreuzhybriden und falschpositiven Ergebnissen hoch. Die Verwendung repititiver nicht-ribosomaler DNA-Sequenzen zur Hybridisierung oder als Grundlage für PCR-Reaktionen bietet wegen der oft längeren typischen Basenfolge und des in der Regel hohen Repetitionsgrades auf DNA-Ebene Vorteile, insbesondere die verringerte Bildung von Kreuzhybriden und eine hohe Sensitivität des Nachweises. Typische repetitive DNA-Sequenzen sind dabei bislang nur schwierig zu isolieren und in genügender Reinheit darzustellen.

Die neueren Versuche zur Identifizierung durch Sichtbarmachung der Verteilung zufällig ausgewählter Nukleinsäuresequenzen in Hybridisierungsexperimenten und PCR-Tests sind insbesondere wegen auftretender und extrem schwer reproduzierbarer Kreuzhybridisierungen kaum von einem Labor in das andere übertragbar.

Ein allgemeiner Nachteil der Hybridisierungsexperimente und PCR-Tests ist, daß die zu Identifizierenden generell nur anhand des Auftretens oder der Verteilung einer oder weniger Nukleinsäuresequenzen, die aufgrund meist aufwendiger Voruntersuchungen als für sie typisch betrachtet werden, identifiziert werden können. Es ist weder auszuschließen, daß diese Sequenzen doch auch in anderen Organismen auftreten, noch, daß sich die vermeintlich Identifizierten zwar im Vorhandensein oder in der Verteilung der zur Analyse verwendeten typischen Sequenz gleichen, in anderen Sequenzen aber wesentlich unterscheiden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, in Reinform vorliegende zu Identifizierende, von denen genügend reine DNA isolierbar ist, ohne die Notwendigkeit, vorher für sie typische Nukleinsäuresequenzen zu isolieren oder herzustellen, im Routineverfahren nukleinsäureanalytisch identifizieren zu können. Gleichzeitig sollen dabei zur Vereinfachung der Identifizierung der zu Identifizierenden in Gemischen oder Spuren einzelne Sequenzen, die für die zu Identifizierenden typisch sind, sichtbar, aufzureinigen und isolierbar werden, die dann mit hoher Trefferwahrscheinlichkeit in den herkömmlichen Hybridisierungsexperimenten oder PCR-Tests verwendet werden können. Insbesondere soll dies für die besonders erfolgversprechenden typischen repetitiven DNA-Sequenzen erleichtert bzw. ermöglicht werden.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die genannte Nukleinsäuregelelektrophorese zur Identifizierung und Charakterisierung von Organismen(teilen), Viren, Viroiden und Plasmiden (hier im weiteren: die "zu Identifizierenden") und/oder zur Identifizierung und Gewinnung von für diese typischen Nukleinsäuresequenzen durch Herstellung von zweidimensionalen DNA-Restriktionsfragment Mustern der zu Identifizierenden in der oben angegebenen Weise, Herstellung von DNA- Restrionsfragment-Mustern von Referenzorganismen(teilen), -viren, -viroid und -plasmiden (hier im weiteren: die "Referenzmuster") und Vergleich der Muster mit den Referenzmustern verwendet wird.

Besonders bevorzugt ist es dabei, daß die Nukleinsäuregelelektrophorese zur Herstellung der zweidimensionalen DNA-Restfunktionsfragment-Muster ohne die bisher beschriebene Temperierung und bei Spannungen bis zum Erreichen des Schmelzpunktes der Gele durchgeführt wird.

Der Vergleich der Muster der zu Identifizierenden mit den Referenzmustern erfolgt dabei bevorzugt optisch und/oder datentechnisch.

Wie bei der Identifizierung von Personen durch Vergleich von Fingerabdrücken mit Referenzmustern oder wie bei der Identifizierung von Proteinen nach Herstellung typischer ebenfalls zweidimensionaler Muster durch Auftrennung der Aminosäuren in einer ersten Richtung chromatographisch und in einer zweiten Richtung elektrophoretisch (M. Melvin, Electrophoresis, Analytical Chemistry by Open Learling, John Wiley & Sons 1987, S. 82-87) wird hier das Prinzip der Erkennung einer Einheit durch Herstellung und Auswertung eines für sie typischen zweidimensionalen Musters verwendet.

Die Verwendung der zweidimensionalen DNA-Restriktionsfragmentgelelektrophorese, die in der ersten Richtung nach der Länge und in der zweiten Richtung unter Verwendung polymergekoppelter Komplexbildner zusätzlich nach der Basenzusammensetzung auftrennt, zur Identifizierung von Organismen(teilen), Viren, Viroiden und Plasmiden ist hingegen ein grundsätzlich neuer Gedanke.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß nach Durchführung des Vergleichs einzelne Sequenzen ermittelt werden, die bei einem zu Identifizierenden, nicht aber in den Referenzmustern bzw. umgekehrt, auftreten.

Die erfindungsgemäße Verwendung schlägt weiterhin vor, daß die identifizierten Nukleinsäuresequenzen zu ihrer anschließenden Gewinnung gegebenenfalls mit dem sie unmittelbar umgebenden Gelbereich aus dem Gel ausgeschnitten/ausgestanzt werden.

Alternativ dazu können die identifizierten Nukleinsäuresequenzen zu ihrer anschließenden Gewinnung ggf. unmittelbar elektrophoretisch aus dem Gel eluiert werden.

Die Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung von erfindungsgemäß identifizierten Nukleinsäuresequenzen zum Nachweis von identischen und/oder ähnlichen Sequenzen durch Hybridisierung; zur Darstellung anhängender Sequenzen durch Hybridisierung; zum PCR- Nachweis identischer und/oder ähnlicher Sequenzen; zur Darstellung anhängender Sequenzen mittels PCR-Reaktion; oder zur Amplifikation von Nukleinsäuren.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das sich durch die obengenannten Merkmale von der bisherigen Verfahrensweise der Nukleinsäuregelelektrophorese unterscheidet, löst in überraschend einfacher und effektiver Art und Weise die Probleme, die bisher bei einer Umsetzung des Verfahrens in die Routinepraxis auftraten. Als Vorteile ergeben sich insbesondere die Möglichkeit, die Versuchszeit drastisch (bis zu 1/25 des bisher bekannten) zu reduzieren und Apparaturen bis herunter zum Format 2×2 cm einzusetzen.

Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht damit erstmals im Routineverfahren die Identifizierung von zu Identifizierenden und von deren typischen DNA-Sequenzen durch die Verwendung gelelektrophoretischer Methoden unter Anwendung polymer gekoppelter basenspezifischer Komplex­ bildner, wie sie im deutschen Patent DE 37 12 344 C2 beschrieben sind. Dabei wird das auf diesem Patent beruhende Verfahren der sogenannten zweidimensionalen Gelelektropho­ rese von DNA-Restriktionsfragmenten (Müller, W., Hattesohl, Y., Schuetz, H.-J., Meyer, G., Nucleic Acids Research 8, 1981, 95-119) konnte so vereinfacht werden, daß ein praktischer und routinefähiger Einsatz für die obengenannte Aufgabe erstmals ermöglicht wird.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung werden organismenspezifische Nukleinsäuresequenzen in Reinform zur Verfügung gestellt, deren Identifizierung, wenn überhaupt möglich, mit herkömmlichen Methoden einen monatelangen Versuchsaufwand erfordert hätte. Sie können direkt in Klonierungsexperimenten oder nach dem Versehen mit endständigen Linkern in PCR-Reaktionen vermehrt werden.

Das erfindungsgemäß verwendete Verfahren der zweidimen­ sionalen Gelelektrophorese von DNA-Restriktionsfragmenten soll im folgenden zunächst kurz erläutert werden:
In der zweidimensionalen DNA-Gelelektrophorese werden zunächst die Restriktionsfragmente in einem üblichen agaroseflachgelelektrophoretischen Verfahren nach ihrer Größe aufgetrennt. Nach dem Lauf wird der sie umgebende Gelstreifen aus dem Gel ausgeschnitten und in 90° zur ersten Laufrichtung in einer zweiten Flachgelapparatur in ein neues Gel eingebettet. Das neue Gel enthält einen der in der DE 37 12 344 beschriebenen polymergekoppelten Nuklein­ säurekomplexbildner. Die Komplexbildner lagern sich bevor­ zugt an bestimmte Basenfolgen der DNA an (Beispiel: 1- Methylphenylneutralrot lagert sich bevorzugt an benachbarte Guanosin/Cytosin-Basenpaare eines DNA-Moleküls an) und beladen somit die DNA-Restriktionsfragmente je nach Stärke des Auftretens der bevorzugten Basenfolgen mit Polymer­ ketten. Die Polymerketten erhöhen den Reibungskoeffizienten der beladenen DNA-Fragmente und verringern so deren Lauf­ geschwindigkeit und -strecke im Gel in Abhängigkeit des Gehalts an von den Komplexbildnern bevorzugten Basenfolgen. Die DNA-Fragmente liegen nach dem zweiten Lauf in einem zweidimensionalen Muster vor, in dem ihre Positionen ihrer Größe und ihrer Basenzusammensetzung entsprechen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr in für den Fachmann überraschend einfacher und wirkungsvoller Weise gelungen, dieses zweidimensionale DNA-Gelelektrophorese­ verfahren durch Vereinfachung der Durchführungsbedingungen für einen praktischen und routinefähigen Einsatz geeignet zu machen. Bisher wurde ein derartiges Verfahren ausschließlich für Forschungszwecke, insbesondere zum Zwecke des Studiums der organismeninternen DNA-Organisation und -Verteilung verwendet (siehe z. B. Meyer, G., Hildebrandt, A., Eur.J.Biochem. 157, 507-512), insbesondere deshalb, weil es für eine Routineanalytik zu hohen Versuchsaufwand erfordert (Müller, W. et al., aaO).

Zur Identifizierung von zu Identifizierenden, deren DNA in genügender Menge und Reinheit isolierbar ist, werden zwei­ dimensionale Verteilungsmuster ihrer restriktionsverdauten DNA als "Fingerprints" mit Referenzmustern verglichen. Hierbei geht es nicht um einzelne Sequenzen, sondern um die Spezifität des gesamten Verteilungsmusters der DNA-Restrik­ tionsfragmente. Durch den Vergleich werden aber gleichzeitig auch DNA-Fragmente zugänglich, die für die zu Identifi­ zierenden typisch sind. Deren Isolierung und Aufreinigung zur Verwendung in Hybridisierungsexperimenten und PCR-Tests werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit Hilfe der bekannten polymergekoppelten Komplexbildner erleichtert, so daß sich die Chancen erhöhen, zu Identifizierende auch in Gemischen vieler anderer ver­ mehrungsfähiger biologischer Materialien und in äußerst geringen Spuren nachzuweisen, für die bisher keine typischen Sequenzen bzw. Sequenzdaten vorliegen und deren Identifi­ zierungsbedarf nicht von solcher Tragweite ist, daß typische Sequenzen mit den heute zur Verfügung stehenden aufwendi­ geren Methoden identifiziert werden. Das erfindungsgemäße ist anhand eines beispielhaften Ablaufs im folgenden Schema noch einmal übersichtlicher dargestellt.

Schema

Im folgenden soll die Erfindung anhand von Ausführungs­ beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen näher erläutert werden. Dabei zeigt:

Fig. 1 einen Vergleich der unter Verwendung von Polyethylenglykol 6000 gekoppelten Komplexbildners Bisbenzimid hergestellten zweidimensional gelelektrophoretisch aufgetrennten DNA-Restriktionsfragmentmusters von 4 Hefestämmen;

Fig. 2 einen Vergleich der unter Verwendung des an Polyethylenglykol 6000 gekoppelten Komplex­ bildners Bisbenzimid hergestellten zwei­ dimensionalen gelelektrophoretisch aufgetrennten DNA-Restriktionsmuster von Rind, Schwein und Maus;

Fig. 3 einen Vergleich der unter Verwendung des an Polyethylenglykol 6000 gekoppelten Komplexbildners Bisbenzimid hergestellten zweidimensional gelelektrophoretisch aufgetrennten DNA-Restriktionsmuster zweier bakterieller Laborsicherheitsstämme von Escherichia coli;

Fig. 4 die Aufreinigung einer DNA-Sequenz, die entsprechend Fig. 1-3 in zweidimensionalen Gelelektrophoresen unter Verwendung des an Polyethylenglykol 6000 gebundenen Komplexbildners 1-Methylphenylneutralrot als für den Schleimpilz Physarum polycephalum typisch identifiziert wurde, in einem weiteren hier gezeigten Elektro­ phoreseschritt unter Verwendung des an Polyethylenglykol 6000 gebundenen Komplexbildners Bisbenzimid; und

Fig. 5 den Hybridisierungsnachweis der Anwesenheit der für Physarum polycephalum in Fig. 4 aufgereinigten typischen DNA-Sequenz in der DNA aus einem Organismus, dessen Identität festzustellen ist.

Beispiel 1 (Fig. 1) Vergleich der Nukleinsäuren von zu identifizierenden Hefestämmen

Die DNAs der miteinander zu vergleichenden Hefestämme wurden isoliert, mit dem Restriktionsenzym DraI verdaut und in der ersten Richtung in einem 1.5%igen Agarosegel (20×20 cm) nach der Fragmentlänge aufgetrennt (Puffer: 40 mM Tris-HCl, 20 mM Natriumacetat, 200 mM EDTA, pH 7,5, Spannungsdifferenz 2 V/cm, Laufzeit 10 Stunden, Temperatur im Gel 20°C). Die einzelnen Fragmente wurden aus dem Gel ausgeschnitten, in 90 Grad zur ersten Laufrichtung zum negativen Pol in eine Gelelektrophoreseapparatur gelegt und in ein neues Gel (1,8%iges Agarosegel, 20×20 cm) eingegossen, das den an Polyethylenglykol 6000 gekoppelten Komplexbildner Bisbenzimid (6,5×10^-7 M) enthält (Puffer: 25 mM EDTA, pH 5.9. Spannungsdifferenz 1,5 V/cm, Laufzeit 18 Stunden, Temperatur im Gel 20°C).

Fig. 1 stellt eine UV-Fluoreszenzphotographie nach dem Anfärben der Desoxyribonukleinsäure mit Ethidiumbromid dar, wobei mit 1 die erste Laufrichtung der DNA- Restriktionsfragmente (Auftrennung nach ihrer Länge; links: lange Fragmente; rechts: kurze Fragmente), mit 2 die zweite Laufrichtung der DNA-Restriktionsfragmente (Auftrennung nach ihrer Basenzusammensetzung), mit 3 ein für die zu Identifizierenden typisches zweidimensionales Verteilungsmuster von DNA-Restriktionsfragmenten und mit 4 für die zu Identifizierenden typische einzelne DNA- Restriktionsfragmente bezeichnet sind.

Beispiel 2 (Fig. 2) Vergleich der Nukleinsäuren verschiedener zu identifi­ zierender Fleischsorten

In der Darstellung von Fig. 2 haben die Bezugszeichen 1, 2 und 4 dieselbe Bedeutung wie in Fig. 1.

Die zweidimensionale DNA-Gelelektrophorese wird prinzipiell entsprechend dem Protokoll zu Beispiel 1 zum nukleinsäureanalytischen Vergleich der Fleischsorten Rind, Schwein, Maus verwendet, wobei in der ersten Richtung die Gelgröße 20×20 cm, die Spannungsdifferenz 8 V/cm, die Laufzeit 2,5 Stunden, die Temperatur im Gel ca. 42°C, in der zweiten Richtung die Gelgröße 20×20 cm, die Spannungsdifferenz 7,5 V/cm, die Laufzeit 3,5 Stunden und die Temperatur im Gel ca. 35°C betrugen. Die Verwendung der zweidimensional aufgetrennten Muster zum Vergleich der Nukleinsäuren ermöglicht die nukleinsäureanalytische Unterscheidung der Fleischsorten ohne vorherige Charakterisierung ihrer Nukleinsäuren, ohne Hybridisierungsexperimente und ohne PCR-Reaktion. Durch die Verwendung des Vergleichs der zweidimensionalen Muster der DNAs der fraglichen Fleischsorten sind diese eindeutig zu identifizieren. Gleichzeitig stellt sich durch die Verwendung des Vergleichs der zweidimensionalen Muster eine Vielzahl von DNA-Sequenzen als für die einzelnen Fleischsorten typisch heraus. Die Änderung der Laufspannung führte zur vier- bis fünffachen Verkürzung der Versuchszeit.

Beispiel 3 (Fig. 3) Vergleich der Nukleinsäuren verschiedener zu identifi­ zierender Sicherheitsbakterienstämme aus dem Labor

In der Darstellung von Fig. 4 haben die Bezugszeichen 1, 2 und 4 dieselbe Bedeutung wie in Fig. 2.

Die zweidimensionale DNA-Gelelektrophorese wurde entsprechend dem Protokoll zu Beispiel 2 zum nukleinsäure­ analytischen Vergleich verschiedener Laborvarianten des Stammes Escherichia coli K12 verwendet, wobei die Gele in der ersten sowie der zweiten Richtung auf 8×8 cm verkleinert, die Laufzeit des ersten Gels auf eine Stunde um die des zweiten Gels auf 1,5 Stunden reduziert wurden. Die Verwendung der zweidimensional aufgetrennten Muster zum Vergleich der Nukleinsäuren ermöglicht die nukleinsäureanalytische Unterscheidung der Varianten ohne vorherige Charakterisierung ihrer Nukleinsäuren, ohne Hybridisierungsexperimente und ohne PCR-Reaktion, in ca. 1/10 der in Beispiel 1 benötigten Zeit. Durch die Verwendung des Vergleichs der zweidimensionalen Muster der DNAs der fraglichen Varianten sind diese eindeutig zu identifizieren. Die Unterscheidung der Muster in nur einem einzigen DNA-Fragment spiegelt dabei die nahe Verwandt­ schaft dieser untersuchten Organismen wider. Die Unterscheidung wäre mit herkömmlichen Hybridisierungs­ methoden oder PCR-Reaktionen nicht oder nur sehr schwer möglich. Das als unterschiedlich identifizierte Fragment kann in der Folge zur Charakterisierung der Laborvariante B auch in mikrobiellen Gemischen und in Spuren verwendet werden. Ein solches Fragment zu identifizieren und einer Isolierung zugänglich zu machen, hätte, wenn überhaupt möglich, mit herkömmlichen Methoden einen mehrmonatigen Versuchsaufwand erfordert.

Beispiel 4 (Fig. 4) Aufreinigung einer durch Vergleich der zweidimensional aufgetrennten Desoxyribonukleinsäuren als organismen­ typisch identifizierten Sequenz

In der Darstellung von Fig. 4 sind mit 5 die DNA- Restriktionsfragmente, die in einem zweidimensionalen Gel mit dem Komplexbildner 1-Methylphenylneutralrot an gleicher Stelle lagen, mit 6 die tatsächlich sequenzgleichen DNA-Restriktionsfragmente und mit 7 die durch Verwendung des Komplexbildners Bisbenzimid von DNA- Restriktionsfragmenten 6 in Fig. 4 abgetrennte, mit 6 nicht-homologe DNA-Restriktionsfragmente bezeichnet.

Die DNA-Sequenzen, die sich durch Verwendung des Vergleichs mit Referenzorganismen entsprechend den Beispielen 1-3, aber mit 1-Methylphenylneutralrot als an Polyethylenglykol 6000 gebundenen Komplexbildner in der zweiten Laufrichtung (1,2×10^-5 M, Puffer 40 mM Natriumphosphat, 2 mM EDTA, pH 6) als typisch für den Schleimpilz Physarum Polycephalum herausgestellt hatte, wurde mit den sie umgebenden Sequenzen möglichst genau aus dem zweidimensionalen Gel ausgestanzt. Die DNA wurde aus dem Gelstück isoliert und in ein weiteres Gel aufgetragen, das den an Polyethylen-glykol 6000 gekoppelten Komplexbildner Bisbenzimid enthielt (6,5×10^-7 M, Puffer: 25 mM EDTA, pH 5,9, Laufstrecke des Bromphenolblaus: 10 cm, Temperatur: Raumtemperatur). Gegenüber dem Komplexbildner 1-Methylphenylneutralrot (bevorzugte Anlagerung an benachbarte Guanosin-Cytosin-Basenpaare) verhalten sich die typische Sequenz und die sie umgebenden sehr ähnlich, sie lagen in dem zweidimensionalen Gel also an fast gleicher Stelle. Zur Aufreinigung in dem darauffolgenden Gel wird ausgenutzt, daß die Wahrscheinlichkeit, daß die umgebenden Sequenzen sich auf gegenüber einem Komplexbildner mit anderer Basenspezifität (Bisbenzimid: bevorzugte Anlagerung an benachbarte Adenosin-Thymin-Basenpaare) nahezu gleich verhalten, sehr gering ist. Die typische Sequenz und die, die sie in dem zweidimensionalen Gel umgaben, trennen sich deswegen in dem neuen Gel voneinander. Die typische Sequenz kann nun in sehr reiner Form aus dem Gel extrahiert und in der Folge zur Identifizierung durch Hybridisierungsexperimente benutzt werden (Beispiel 5) oder als Grundlage zur Herstellung von Oligonukleotiden für einen PCR-Nachweis dienen. Zu ihrer Vermehrung beispielsweise zum Zwecke der Verwendung in anschließenden Routineanalysen kann sie direkt in der hier dargestellten Form in Klonierungsexperimenten oder nach dem Versehen mit endständigen Linkern in der PCR-Reaktion vermehrt werden.

Beispiel 5 (Fig. 5) Verwendung einer durch Vergleich zweidimensional aufgetrennter DNA-Restriktionsfragmente als organismentypisch identifizierten, in der Folge aufgereinigten und isolierten DNA-Sequenz zur Identifizierung eines fraglichen Organismus

Mit 8 sind in dieser Darstellung die den DNA-Fragment 6 in Fig. 4 homologen DNA-Sequenzen im Genom eines fraglichen Organismus bezeichnet.

Zur Feststellung der Identität eines fraglichen Organismus wurden die Restriktionsfragmente (Restriktionsenzym: MboI) seiner DNA gelelektrophoretisch nach ihrer Länge aufgetrennt, auf Nitrocellulosefilter geblottet (Southern­ blot) und mit der in Beispiel 4 aufgereinigten, für Physarum polycephalum typischen, hier radioaktiv markierten Sequenz (Bezugslinie 6) hybridisiert. Fig. 5 zeigt das Autoradiogramm der Hybridisierung. Die typische Sequenz hybridisiert mit der fraglichen DNA. Bei dem zu identifizierenden Organismus handelt es sich also um Physarum polycephalum.

Claims (7)

1. Verwendung von Nukleinsäuregelelektrophorese in Verbindung mit polymergekoppelten basenspezifischen Komplexbildnern, in der die Auftrennung von DNA-Restriktionsfragmenten in einer ersten Richtung nach der Fragmentlänge und in einer zweiten, in 90° zur ersten Richtung laufenden Richtung durch das Vermischen des Gels mit einem polymergekoppelten Komplexbildner nach Fragmentlänge und Basenzusammensetzung erfolgt, zur Identifizierung und Charakterisierung von Organismen(teilen), Viren, Viroiden und Plasmiden (hier im weiteren: die "zu Identifizierenden") und/oder zur Identifizierung und Gewinnung von für diese typischen Nukleinsäuresequenzen durch Herstellung von zweidimensionalen DNA- Restritionsfragment-Mustern der zu Identifizierenden in der oben angegebenen Weise, Herstellung von DNA-Restriktionsfragment-Mustern von Referenzorganismen(teilen), -viren, -viroiden und -plasmiden (hier im weiteren: die "Referenzmuster") und Vergleich der Muster mit den Referenzmustern.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach Durchführung des Vergleichs einzelne Sequenzen ermittelt werden, die bei einem zu Identifizierenden, nicht aber in den Referenzmustern bzw. umgekehrt, auftreten.

3. Verwendung von nach einem der Ansprüche 1 oder 2 identifizierten Nukleinsäuresequenzen zum Nachweis von identischen und/oder ähnlichen Sequenzen durch Hybridisierung.

4. Verwendung von nach einem der Ansprüche 1 oder 2 identifizierten Nukleinsäuresequenzen zur Darstellung anhängender Sequenzen durch Hybridisierung.

5. Verwendung von nach einem der Ansprüche 1 oder 2 identifizierten Nukleinsäuresequenzen zum PCR-Nachweis identischer und/oder ähnlicher Sequenzen.

6. Verwendung von nach einem der Ansprüche 1 oder 2 identifizierten Nukleinsäuresequenzen zur Darstellung anhängender Sequenzen mittels PCR-Reaktion.

7. Verwendung von nach einem der Ansprüche 1 oder 2 identifizierten Nukleinsäuresequenzen zur Amplilikation von Nukleinsäuren.