-
Technisches Gebiet
-
Diese
Erfindung betrifft das Gebiet der Nukleinsäureherstellung und betrifft
Reagenzien und Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäureduplexen
(Nukleinsäureduplexen).
-
Technischer Hintergrund
-
Viele
Reinigungstechniken schließen
einen Erhitzungsschritt ein. Es ist schwierig, doppelsträngige DNA
mit diesen Techniken zu reinigen, weil Erhitzen zu Denaturierung
von doppelsträngigen
DNA (dsDNA)-Duplexen führt,
um einsträngige
DNA (ssDNA) zu bilden. Dies führt
zu Problemen bei jeglichen nachgeordneten DNA-Verarbeitungstechniken, die dsDNA erfordern.
-
Es
sind verschiedene Verfahren zum Stabilisieren von doppelsträngigen Nukleinsäuren bekannt.
Referenz 1 zeigt beispielsweise die sequenzspezifische Isolierung
und Reinigung von intakter dsDNA durch Oligonukleotid/PNA unterstütztem Affinitätseinfang.
Die Referenzen 2 und 3 erörtern
die Verwendung der PD-Schleife bei der Isolierung von dsDNA-Fragmenten
aus komplexen Mischungen. Referenz 4 offenbart die Verwendung von
Ionenpaar-Umkehrphasen-HPLC zur Reinigung von dsDNA. Andere Verfahren
werden in der Einführung
der Referenzen 5 und 6 diskutiert, und zu im Handel erhältlichen
Kits gehören
das WizardHM Genomic DNA Purification Kit
(Promega), FlexiPrepTM (Pharmacia Biotech)
und das Whatman BioSciences Genomic DNA Purification System ('WBPS'; Ref. 7).
-
Referenz
5 offenbart Verfahren und Reagenzien zum Stabilisieren von dsDNA.
Sie offenbart eine wässrige
Lösung
zur Behandlung eines Nukleinsäureduplex
mit einem pH-Wert von 3 bis 11 und umfasst (a) ein lösliches
Protein oder eine Mischung von Proteinen und (b) 0,1 mM bis 10 mM
zweiwertige Kationen. Die Art und Konzentration des löslichen
Proteins oder der Mischung von Proteinen wird so gewählt, dass
die Lösung
eine Hitzedenaturierung eines Nukleinsäureduplex hemmen kann.
-
Die
in Referenz 5 verwendeten bevorzugten Proteine stammen aus dem Blutserum
von Säugetieren. Serum
ist jedoch aufgrund seiner Natur eine komplexe Mischung. Es wäre vorteilhaft,
die gleichen Wirkungen, wie sie in Referenz 5 offenbart sind, mit
einfacheren und/oder besser definierten Reagenzien zu erreichen.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, verbesserte Reagenzien,
Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung zum Stabilisieren
von Nukleinsäureduplexen,
wie dsDNA, zur Verfügung
zu stellen. Referenz 20 beschreibt, Milchserum von Mastitis-Milch
auf Anwesenheit von Alpha-2-Makroglobulin zu testen.
-
Offenbarung der Erfindung
-
Es
wurde überraschenderweise
gefunden, dass Makroglobuline Nukleinsäureduplexe stabilisieren können. Die
Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Hemmen der Hitzedenaturierung
eines Nukleinsäureduplex,
umfassend den Schritt des Kontaktierens eines Nukleinsäureduplex
mit einer Zusammensetzung, die ein Makroglobulin aufweist, wobei
das Makroglobulin das Makroglobulin ein Alpha-2-Makroglobulin ist, welches Trypsinaktivität hemmen
kann.
-
Ein
Nukleinsäureduplex,
welcher mit einem Alpha-2-Makroglobulin in Kontakt gebracht wurde,
kann bei einer Hemmung der Denaturierung eines Duplex härteren Verarbeitungsbedingungen
unterworfen werden, als es sonst möglich wäre. Die Erfindung unterstützt das
Aufreinigen der doppelsträngigen
Nukleinsäuren
aus komplexen Mischungen und erlaubt zum Beispiel, dsDNA in ihrer
biologisch-aktiven Form zu erhalten (z. B. zur Untersuchung epigenetischer
Modifikationen in geprägten
Genen (imprinted-Genen)).
-
Die
Erfindung liefert auch die Verwendung einer Zusammensetzung, die
ein Makroglobulin aufweist, wobei das Makroglobulin ein Alpha-2-Makroglobulin
ist, welches Trypsinaktivität
hemmen kann, zur Hemmung der Denaturierung eines Nukleinsäureduplex.
-
Die
Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Aufreinigen eines Nukleinsäureduplex,
umfassend den Schritt des Kontaktierens des Nukleinsäureduplex
mit einer Zusammensetzung, die ein Makroglobulin aufweist, wobei
das Makroglobulin ein Alpha-2-Makroglobulin ist, welches Trypsinaktivität hemmen
kann. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Aufreinigen eines
Nukleinsäureduplex
aus einer Probe, umfassend den Schritt des Kontaktierens der Probe
mit einer Zusammensetzung, die ein Makroglobulin aufweist, wobei
das Makroglobulin ein Alpha-2-Makroglobulin ist, welches Trypsinaktivität hemmen
kann.
-
Die
Erfindung liefert auch ein Verfahren bei dem zwei Nukleinsäuren (z.
B. einsträngige)
unter hybridisierenden Bedingungen in Kontakt gebracht werden, um
ein Nukleinsäureduplex
zu bilden, wobei das Verfahren den anschließenden Schritt umfasst, den
Duplex mit einer Zusammensetzung in Kontakt zu bringen, welche ein
Makroglobulin aufweist, wobei das Makroglobulin ein Alpha-2-Makroglobulin
ist, welches Trypsinaktivität
hemmen kann.
-
Die
Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Extrahieren oder Aufreinigen
von doppelsträngiger
Nukleinsäure
aus einer biologischen Probe, die Zellen enthält, welches die Schritte umfasst:
(a) Lysieren von Zellen, welche Nukleinsäure enthalten, um ein Zell-Lysat
zu bilden; (b) in Kontakt zu bringen des Zell-Lysates mit einer
Zusammensetzung, welche ein Makroglobulin aufweist, wobei das Makroglobulin
ein Alpha-2-Makroglobulin ist, welches Trypsinaktivität hemmen
kann; und (c) Aufreinigen der Nukleinsäure aus dem Lysat, wahlweise
unter Erhitzen des Lysates. Der Lyseschritt kann auf einem Filter
stattfinden, der zweckmäßigerweise die
Behandlung der Probe und des Lysats (z. B. Zurückhalten von Zellen in einer
Probe, Waschschritte, usw.) auf einem einzigen Träger ermöglicht.
Die Filterzusammensetzung und -abmessungen werden vorzugsweise so
gewählt,
dass die Nukleinsäure
durch den Filter im Wesentlichen in Abwesenheit von ionischer Wechselwirkung
[z. B. Ref. 81] zurückgehalten
wird. Wenn bereits ein Zell-Lysat zur Verfügung steht, ist Schritt (a)
optional.
-
Die
Erfindung liefert auch ein Kit zur Isolierung von Nukleinsäure aus
einer Probe mit Zellen, die Nukleinsäure enthalten, das eine Zusammensetzung
umfasst, welche ein Makroglobulin aufweist, wobei das Makroglobulin
ein Alpha-2-Makroglobulin ist, welches Trypsinaktivität hemmen
kann und auf einem festen Träger immobilisiert
ist.
-
Die
Erfindung liefert auch einen Komplex aus einem Nukleinsäureduplex
und einem Alpha-2-Makroglobulin, das Trypsinaktivität hemmen
kann, wobei der Komplex durch Verbindung der DNA und des Alpha-2-Makroglobulin
in einer Lösung
gebildet wird, die 1% Alpha-2-Makroglobulin, KCl, MgCl2 und
Tris pH ~7 aufweist. Diese Komplexe liegen im Wesentlichen in reiner
Form vor (z. B. frei von Zelltrümmern).
-
Die
Erfindung liefert auch ein Erzeugnis für die Verwendung zur Affinitätsaufreinigung
von doppelsträngigen
Nukleinsäuren,
umfassend ein Alpha-2-Makroglobulin, das Trypsinaktivität hemmen
kann und auf einem festen Träger
immobilisiert ist.
-
Der Nukleinsäureduplex
-
Die
Erfindung kann mit jedem geeigneten Nukleinsäureduplex verwendet werden,
wird in der Regel jedoch mit DNA/DNA-Duplexen (d. h. mit dsDNA)
verwendet.
-
Andere
geeignete Duplexe können
aus einsträngigen
Molekülen
gebildet werden, die sowohl RNA als auch DNA umfassen. Hierzu gehören Analoga
wie jene, die modifizierte Grundgerüste enthalten (z. B. Phosphorthioate)
und Peptid-Nukleinsäuren (PNA)
sowie Hybridmoleküle
(z. B. DNA-RNA-Hybride). Duplexe zur erfindungsgemäßen Verwendung
schließen
daher ohne Einschränkung
ein: RNA/RNA-Duplexe; DNA/RNA-Duplexe; DANN/PNA-Duplexe, PNA/PNA-Duplexe,
PNA/RNA-Duplexe usw.
-
Die
doppelsträngige
Nukleinsäure
kann in beliebiger Form vorliegen, z. B. A, B, C, Z, usw.
-
Die
Hemmung der Hitzedenaturierung kann durch den Fachmann leicht getestet
werden, indem das Verhalten eines Duplex, der (a) mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
oder (b) einer Standard-Waschlösung
(z. B. Wasser oder salzarmer Nukleinsäurekonservierungslösung, wie
AE oder dergleichen) kontaktiert wird, verglichen wird. Eine zweckmäßige Art
zum Vergleichen der Denaturierung ist das Vergleichen der Schmelztemperatur
(Tm) des Duplex in (a) und (b), z. B. unter
Verwendung eines Parameters wie OD260 (d.
h. Messen des hyperchromen Effekts) oder der Dichte. Denaturierung
kann in (a) und (b) auch verglichen werden, indem Reagenzien verwendet
werden, die für
doppel- oder einsträngige
Nukleinsäuren
spezifisch sind, z. B. kann die Menge an dsDNA in (a) und (b) unter
Verwendung von Anti-dsDNA Antikörpern
verglichen werden. Andere Verfahren, die verwendet werden können, umfassen
spektroskopische Verfahren und die unterschiedliche Affinität von dsDNA
und ssDNA zu Hydroxyapatit [siehe auch Ref. 9].
-
Die
Hitzedenaturierung des Duplex wird mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
gehemmt. Das Ausmaß der
Hemmung kann in Abhängigkeit
von verschiedenen Faktoren (z. B. pH-Wert, Ionenstärke, Art
und Konzentration der Kationen, Temperatur, Dauer des Erhitzens,
usw.) im Bereich von einem relativ kleinen Grad bis zu im Wesentlichen
vollständiger
Hemmung liegen, die Hemmung beträgt
vorzugsweise jedoch mindestens 50% (z. B. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,
98%, 99% oder sogar 100%), verglichen mit einer Kontrolle, in der
die erfindungsgemäße Zusammensetzung
nicht verwendet wird.
-
Die
Denaturierung kann z. B. durch die Temperatur, Salzkonzentration,
pH usw. erfolgen.
-
Bevorzugte
Zusammensetzungen hemmen die Denaturierung, so dass mehr als 50%
einer Nukleinsäureduplex-Probe
in Duplexform erhalten bleiben, wenn die Probe bis zu 30 Minuten
einer Temperatur von 90°C
ausgesetzt wird, noch bevorzugter 100°C bis zu einer Stunde.
-
In
einigen Ausführungsformen
der Erfindung werden die Komponenten der Zusammensetzung so gewählt, dass
die Hitzedenaturierung einiger Duplexe inhibiert wird, während die
Denaturierung anderer (schwächerer)
Duplexe zugelassen wird. Mit anderen Worten ist die Hemmung der
Denaturierung mindestens teilweise spezifisch.
-
Obwohl
die erfindungsgemäße Zusammensetzung
vorzugsweise mit dem Nukleinsäureduplex
in Kontakt gebracht wird, bevor der Duplex Denaturierungsbedingungen
ausgesetzt wird, ist es auch möglich,
dass der Nukleinsäureduplex
milden Denaturierungsbedingungen (z. B. einem Erhitzungsgrad) ausgesetzt
wird und anschließend
der Duplex mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
in Kontakt gebracht wird, wobei der Duplex danach schärferen Denaturierungsbedingungen
ausgesetzt wird.
-
Charakteristika der Zusammensetzung
-
Die
hier beschriebene Zusammensetzung liegt typischerweise in Form einer
wässrigen
Lösung
vor.
-
DNA
geht unterhalb eines pH-Werts von 3 mit Depurinierung und strukturellem
Abbau einher, und die Denaturierung wird oberhalb von pH 11 begünstigt.
Der pH-Wert der
Zusammensetzung liegt daher allgemein zwischen 3 und 11, vorzugsweise
zwischen 4 und 10, bevorzugter zwischen 5 und 9 und am meisten bevorzugt zwischen
6 und 8. Ein typischer pH-Wert ist neutral, d. h. um pH 7,0, obwohl
der optimale pH-Wert für
die dsDNA-Bindung für
jedes spezielle Alpha-2-Makroglobulin unterschiedlich ist.
-
Der
pH-Wert der Zusammensetzung wird vorzugsweise unter Verwendung eines
Puffers kontrolliert, z. B. Tris, Phosphatpuffer, Histidinpuffer,
PIPES, HEPES, usw. Die Zusammensetzung ist außerdem vorzugsweise steril.
-
Die
Zusammensetzung umfasst allgemein zweiwertige Kationen. Diese sind
allgemein in einer Konzentration zwischen 0,1 mM und 10 mM, vorzugsweise
zwischen 0,5 mM und 8 mM, bevorzugter zwischen 1 mM und 5 mM und
am meisten bevorzugt zwischen 2 und 4 mM vorhanden. Eine typische
Konzentration der zweiwertigen Kationen ist etwa 3 mM, obwohl die
optimale Konzentration für
die dsDNA-Bindung für
jedes spezielle ubiquitinartige Protein oder Makroglobulin unterschiedlich
ist.
-
Bevorzugte
zweiwertige Kationen sind Mg2+-Ionen.
-
Es
ist bevorzugt, jedoch nicht wesentlich, dass eine Lösung zusätzlich einwertige
Kationen umfasst. Diese liegen im Allgemeinen in einer Konzentration
zwischen 0,1 mM und 100 mM vor, vorzugsweise zwischen 1 mM und 50
mM, bevorzugter zwischen 5 mM und 15 mM und am meisten bevorzugt
zwischen 7 und 10 mM. Eine typische Konzentration der einwertigen
Kationen ist etwa 8 mM, obwohl der optimale pH-Wert für die dsDNA-Bindung
für jedes
spezielle ubiquitinartige Protein oder Makroglobulin unterschiedlich
ist.
-
Bevorzugte
einwertige Kationen sind K+- oder Na+-Ionen.
-
Die
Komponenten der hier beschriebenen Zusammensetzung können in
beliebiger Reihenfolge gemischt werden. Proteine werden allgemein
jedoch am Ende des Mischens zugegeben, um eine Ausfällung zu vermeiden,
und jegliche einwertigen Kationen werden vorzugsweise nach zweiwertigen
Kationen zugefügt.
-
Die
Zusammensetzung kann eine geringe Konzentration eines antimikrobiellen
Mittels enthalten (z. B. Na2S2O5).
-
Die
Zusammensetzung ist vorzugsweise frei von Serum (z. B. frei von
FCS).
-
Die
hier beschriebene Zusammensetzung kann die Form einer trockenen
Zusammensetzung annehmen, die in einem wässrigen Medium gelöst werden
kann. Es ist davon auszugehen, dass die obigen Charakteristika der
Zusammensetzung sich unter diesen Bedingungen auf die resultierende
wässrige
Zusammensetzung beziehen.
-
Das
Alpha-2-Makroglobulin in der Zusammensetzung kann verschiedene Formen
annehmen, z. B. ein Fusionsprotein, ein Tandem-Repeat-Protein (Minisatellit),
ein Precursor, ein reifes Protein, glykosyliert, unglykosyliert,
methyliert, markiert (z. B. biotinyliert), mit oder ohne N-terminales
Methionin, usw., unter der Voraussetzung, dass die Duplex-Stabilisierungsaktivität erhalten
bleibt.
-
Das
ubiquitinartige Protein und/oder Makroglobulin ist in der Regel
in einer Konzentration zwischen 0,1 und 20 mg/ml, vorzugsweise zwischen
0,25 und 10 mg/ml, bevorzugter zwischen 0,5 und 5 mg/ml und am meisten
bevorzugt zwischen 1 und 3 mg/ml vorhanden.
-
Das Makroglobulin
-
Das
Makroglobulin zur erfindungsgemäßen Verwendung
ist vorzugsweise ein Alpha-2-Makroglobulin. Die
Alpha-2-Makroglobuline sind Protease-Inhibitoren, die aus vielen
Organismen isoliert worden sind (z. B. Säugern und Arthropoden). Ihre
inhibitorische Aktivität
ist nicht das Ergebnis von kompetitiver Hemmung von Proteasen, sondern
der Fähigkeit, "Käfige" um Proteaseenzyme herum zu bilden,
die den Zugang von Substraten mit hohem Molekulargewicht zu der
aktiven Stelle blockieren.
-
Die
Alpha-2-Makroglobuline sind neben ihrer Protease-hemmenden Aktivität in der
Lage, an einige Wachstumsfaktoren einschließlich TGF-β zu binden und diese zu neutralisieren.
Bei Makrophagen induzieren Alpha-2-Makroglobuline die Synthese von
Stickoxidsynthease, bei vaskulären
glatten Muskelzellen induzieren Alpha-2-Makroglobuline die Expression des von
Thrombozyten stammenden Wachstumsfaktor-a-Rezeptors. Weitere Einzelheiten
finden sich in den Referenzen 18 und 19.
-
Das
Alpha-2-Makroglobulin sollte zur erfindungsgemäßen Verwendung seine Protease-hemmende Aktivität behalten,
da gefunden wurde, dass denaturiertes Alpha-2-Makroglobuline, das
Trypsin nicht hemmen kann, dsDNA nicht stabilisieren kann.
-
Das
Alpha-2-Makroglobulin liegt vorzugsweise in oligomerer Form vor
(z. B. ein Dimer, Trimer, Tetramer, usw.).
-
Die
hier beschriebenen Zusammensetzungen können Mischungen aus einem oder
mehreren Makroglobulinen umfassen.
-
Integration in Techniken zum
Umgang mit Nukleinsäuren
-
Die
Stabilisierung von Duplexen durch Anwendung der Erfindung kann in
jede passende Technik integriert werden, die doppelsträngige Nukleinsäuren verwendet.
Die Erfindung ist zur Stabilisierung von genomischer dsDNA besonders
geeignet, z. B. während
ihrer Aufreinigung. Ein stabilisierter Duplex kann beispielsweise
einer nachgeordneten Verarbeitung unterzogen werden, z. B. einem
oder mehreren Schritten der Aufreinigung, Analyse, Ligierung, enzymatischen
Behandlung (z. B. Verdauung mit Restriktionsenzym), Amplifizierung
(z. B. PCR), Denaturierung, Hybridisierung, Expression, Sequenzierung,
Trennung, usw.
-
Der
zu stabilisierende Duplex kann das Produkt einer Technik auf Basis
einer Hybridisierung sein, bei der eine markierte Sonde an eine
Nukleinsäureprobe
hybridisiert wird. Zu derartigen Techniken gehören Blotting (Southern, Northern,
Slot, Dot, usw.), Mikroarray-Hybridisierung, in situ Hybridisierung
(z. B. FISH), usw. Die Erfindung ermöglicht den Schutz von Hybridisierungsprodukten
vor Denaturierung während
nachgeordneten Verarbeitungsschritten in der Technik, d. h. sie
ermöglicht,
dass der Duplex schärferen
nachgeordneten Bedingungen ausgesetzt werden kann, als sonst möglich wäre. Der
Nukleinsäureduplex
kann beispielsweise schärferen
Waschbedingungen ausgesetzt werden (z. B. Waschen mit einer erhöhten Temperatur).
-
Die
Erfindung ermöglicht
das Aufreinigen von dsDNA direkt aus einer Amplifizierungsreaktion
oder aus einem Agarosegelabschnitt. Amplifizierungsprodukte können von
Verunreinigungen, wie Primern, getrennt werden.
-
Die
hier beschriebenen Zusammensetzungen können in Verfahren verwendet
werden, die unter den Handelsnamen FTA/FTA eluteTM,
GenspinTM und GenprepTM bekannt
sind.
-
Die
Erfindung ist besonders zur Verwendung mit Verfahren zum Extrahieren
oder Aufreinigen von dsDNA (z. B. genomischer DNA) aus Proben geeignet,
die Zellen einschließen
(z. B. aus Blutproben). Die Erfindung liefert ein Verfahren zum
Aufreinigen von doppelsträngiger
Nukleinsäure
[vergleiche Ref. 8], welches die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Filtern einer Probe mit Zellen, welche
Nukleinsäure
enthalten, wobei die Zellen als Retentat zurückgehalten und Verunreinigungen
entfernt werden;
- (b) Lysieren des Retentats aus Schritt (a), während das
Retentat durch den Filter zurückgehalten
wird, um ein Zell-Lysat zu bilden, welches die Nukleinsäure enthält;
- (c) Filtern des Zell-Lysats mit dem Filter, um die Nukleinsäure zurückzuhalten
und restliches Zell-Lysats zu entfernen;
- (d) wahlweises Waschen der durch das Filter zurückgehaltenen
Nukleinsäure;
und
- (e) Eluieren der Nukleinsäure,
wobei mindestens ein Schritt des Verfahrens in Anwesenheit eines
Alpha-2-Makroglobulins durchgeführt
wird.
-
Der
in Schritt (c) verwendete Filter hält vorzugsweise Nukleinsäure im Wesentlichen
in Abwesenheit von ionischen Wechselwirkungen zurück.
-
Die
Schritte (a) bis (e) werden vorzugsweise zwischen 0°C und 100°C durchgeführt. Das
Verfahren wird im Allgemeinen zwischen 20 und 50°C (z. B. zwischen 25 und 40°C, oder um
die 35°C)
durchgeführt,
obwohl einzelne Schritte in dem Gesamtverfahren Erwärmen oder
Abkühlen
außerhalb
dieses Bereichs beinhalten können.
-
Die
Extraktion von doppelsträngiger
Nukleinsäure
durch die erfindungsgemäßen Verfahren
ermöglicht,
dass eine benötigte
Probe, verglichen mit vorherigen Extraktionsverfahren, in einem
signifikant kürzeren Zeitraum
erhalten werden kann.
-
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 zeigt
ein Molekülmodell
von Wechselwirkungen zwischen einem DNA-Duplex und einem Ubiquitin-Dimer.
-
2 zeigt Modelle von Ladungsfeldern, die
verschiedene Ubiquitin-Domänenstrukturen
umgeben. Blau zeigt eine positive Ladung, rot zeigt eine negative
Ladung. DNA ist in gelb und grau dargestellt. Die gezeigten Proteine
sind: (2A) Ubiquitin; (2B)
RAD23A; (2C) SUMO-1; (2D)
NEDD8.
-
Verfahrensweisen zur Durchführung der
Erfindung
-
Die
Referenzen 5 und 6 offenbaren, dass FCS Nukleinsäureduplexe stabilisieren kann.
Die Aktivität von
FCS wurde mit Ubiquitin verglichen.
-
Der
Vergleich wurde unter Verwendung von 1 ml WBPS-Säulen nach dem Standard-Protokoll [7] durchgeführt. Kurz
gesagt wurden 0,5 ml Blut mit 0,5 ml "Lösung
1" (einer Lyselösung von
roten Blutkörperchen)
auf Säulen
gegeben und die Säule
mittels Vakuumpumpe eluiert. Danach wurde 1 ml weiterer "Lösung 1" zugegeben, gefolgt von Vakuumeluierung.
Bei diesem Schritt werden weiße
Blutkörperchen
in dem Filter festgehalten, und rote Blutkörperchen sind entfernt worden.
1 ml "Lösung 2" (eine Lyselösung von
weißen
Blutkörperchen)
wurde danach zugefügt,
um die eingefangenen Zellen zu lysieren, gefolgt von Vakuumeluierung. Der
Filter wurde dann mit 1 ml von entweder "Lösung
3" (1% FCS; KCl,
MgCl2, Tris; pH etwa 7) oder "Lösung 3, in der FCS durch Ubiquitin
(Sigma, Produktcode U6253) aus Rindererythrozyten ersetzt worden
war, gewaschen. Nach der Vakuumeluierung wurden 100 μl TE zugefügt und die
Säule wurde
für 10
Minuten auf 80°C erhitzt.
-
Nach
dem Erhitzen wurden 200 μl
TE zugefügt.
Die Eluierung ergibt dsDNA aus der Blutprobe.
-
Es
wurden verschiedene Konzentrationen von Ubiquitin getestet, und
die Ergebnisse waren wie folgt:
| Ubiquitin
Konzentration (mg/ml) | Konzentration
von dsDNA (ng/μl) ± Standardabweichung | dsDNA
Ausbeute (μg/ml
Blut) ± Standardabweichung |
| 0,00 | 2,85 ± 0,26 | 0,84 ± 0,08 |
| 0,10 | 3,11 ± 0,29 | 0,85 ± 0,10 |
| 0,25 | 4,52 ± 0,50 | 1,25 ± 0,18 |
| 0,50 | 12,70 ± 10,14 | 3,65 ± 3,14 |
| 1,00 | 13,59 ± 1,32 | 3,89 ± 0,51 |
| 2,00 | 22,37 ± 1,76 | 6,47 ± 0,63 |
| 2,50 | 20,96 ± 6,04 | 6,21 ± 1,70 |
-
Zum
Vergleich betrug die Konzentration der dsDNA, die unter denselben
Bedingungen mit FSC-haltiger "Lösung 3" erhalten wurde,
17,86 ± 3,41
ng/μl (d.
h. die Ausbeute war 5,37 ± 1,25 μg/ml Blut).
Die stabilisierende Wirkung von 1% FCS kann daher unter Verwendung
von zwischen 1 und 2 mg/ml Ubiquitin erreicht werden.
-
Ähnliche
Experimente wurden mit Blut unter Verwendung von höheren Ubiquitinkonzentrationen durchgeführt:
| Ubiquitin
Konzentration (mg/ml) | Konzentration
von dsDNA (ng/μl) ± Standardabweichung |
| 0,0 | 2,25 ± 0,58 |
| 2,5 | 27,06 ± 5,91 |
| 5,0 | 30,87 ± 4,93 |
-
Zum
Vergleich betrug die Konzentration der dsDNA, die unter denselben
Bedingungen mit WBPS-"Lösung 3" erhalten wurde,
15,49 ± 10,49
ng/μl.
-
NEDD8
ist mit Ubiquitin verwandt, und die dsDNA-stabilisierende Aktivität von NEDDS
wurde auch getestet. Die Lösungen
wurden auf dieselbe Weise wie die Ubiquitinlösungen hergestellt (d. h. WBPD-"Lösung 3", jedoch mit NEDD8 anstelle von FCS;
pH-Wert = 7 bis 8). Es wurden zwei Formen von NEDD8 verwendet (eine
native Sequenz und eine "Kontroll"-Form mit Gly76 → Ala-Mutation,
die nicht konjugieren kann), beide als GST-Fusionsproteine. Es wurden
auch SUMO-1 und Alpha-2-Makroglobulin getestet. Alle Proteine wurden mit
den Ergebnissen verglichen, die mit WBPS-"Lösung
3" erhalten worden
waren (und, als negative Kontrolle, gegen "Lösung
3", der ihre FCS-Komponente
fehlte).
-
Diese
Assays wurden mit WBPS-Reagenzien, jedoch im 96-Wells-Format durchgeführt, das
ein geringfügig
modifiziertes Protokoll verwendet. Kurz gesagt wurden 0,4 ml Blut
mit 0,4 ml "Lösung 1" gemischt. Nach Anlegen
eines Vakuums wurden dann weitere 0,8 ml "Lösung
1" zugefügt (Vakuum),
gefolgt von 0,3 ml "Lösung 2" (Inkubationsdauer
5 Minuten, danach Anlegen eines Vakuums). Die Wells wurden danach
5 Minuten mit 0,3 ml von entweder "Lösung
3" oder einer gleichartigen
Lösung
inkubiert, bei der FCS durch das zu untersuchende Protein ersetzt
wurde. Anlegen eines Vakuums wurden 25 μl TE zugefügt und die Säule 10 Minuten
auf 50°C
erhitzt. Nach dem Erwärmen
wurden 200 μl
TE hinzugegeben und das TE wurde danach herausgesaugt und gesammelt.
Das eluierte TE enthielt dsDNA aus der Blutprobe.
-
Die
Ergebnisse waren wie folgt:
| Zusammensetzung | Konzentration | dsDNA
Konzentration (ng/μl) |
| Ubiquitin | 1,16
mg/ml | 22,34 ± 9,99 |
| Ubiquitin | 0,49
mg/ml | 13,07 ± 7,37 |
| NEDD8 | 0,49
mg/ml | 68,64 ± 16,63 |
| NEDD8
(G76A) | 0,49
mg/ml | 50,33 ± 8,22 |
| SUMO-1
(G76A) | 1
mg/ml | 2,60 ± 0,35 |
| Alpha-2-Makroglobulin | 5
mg/ml | 10,79 ± 0,54 |
| "Lösung 3" (1% FCS) | 1%
FCS | 26,35 ± 7,26 |
| "Lösung 3" (0% FCS) | Kontrolle | 1,35 ± 0,13 |
-
Die
Daten in dieser Tabelle zeigen, dass beide Formen von NEDD aktiver
als Ubiquitin bei der Stabilisierung von dsDNA sind, und dass die
stabilisierende Aktivität
von der Fähigkeit
von NEDD zum Konjugieren an Zielproteine unabhängig ist.
-
NEDD8
wurde in Form von GST-Fusionsproteinen verwendet, bei denen NEDD8
nur 24% des Gewichts ausmacht. Ubiquitin und NEDDS haben beide ein
Molekulargewicht von ungefähr
8 kDa, so dass bei der gleichen Konzentration (0,49 mg/ml) NEDD8-GST
für etwa
4 × weniger
aktives Protein als Ubiquitin steht. Wenn dies berücksichtigt
wird, ist die spezifische Aktivität von NEED8 etwa 20 Mal größer als
diejenige von Ubiquitin.
-
Computermodelle
(unter Verwendung von Deep View 3.7b2 und ProModll v.3.5) legen
nahe, dass ein Dimer von Ubiquitin eine Furche bilden kann, die
sich an dsDNA anschmiegen kann (1 und 2A).
Das Ladungsfeld, welches das Dimer in diesem Modell umgibt, ist
mäßig positiv,
wodurch es möglich
wird, das negative DNA-Grundgerüst
aufrechtzuerhalten. Ein ähnliches
Feld zeigt sich in NEDD8 (2D) und
auch in RAD23 (2B). Die SUMO1 umgebende Ladung
ist jedoch anders (2C). Die mit SUMO1 gewonnenen experimentellen
Daten stützen
die Ansicht, dass das Ladungsfeld eines ubiquitinartigen Proteins
wichtig ist, um die dsDNA stabilisierende Aktivität zu bestimmen.
-
Die
mit Alpha-2-Makroglobulin erhaltenen Ergebnisse wurden weiter untersucht.
Es wurden zwei Formen von Alpha-2-Makroglobulin getestet, eine Form,
die Trypsin nicht inhibierte (Sigma Code M7151) und eine Form, die
Trypsin inhibierte (Sigma Code M6159). Die M6159-Präparation
war in der Lage, dsDNA zu stabilisieren, während die M7151-Form dazu nicht
in der Lage war:
| Zusammensetzung | Konzentration | dsDNA
Konzentration (ng/μl) |
| Alpha-2-Makroglobulin
(M6159) | 5
mg/ml | 10,79 ± 0,54 |
| Alpha-2-Makroglobulin
(M7151) | 0,1
mg/ml | 2,36 ± 0,25 |
| Alpha-2-Makroglobulin
(M7151) | 0,5
mg/ml | 1,86 ± 0,13 |
| Alpha-2-Makroglobulin
(M7151) | 2,5
mg/ml | 1,43 ± 0,19 |
| Alpha-2-Makroglobulin
(M7151) | 5,0
mg/ml | 1,16 ± 0,07 |
| WBPS
(0% FCS) | Kontrolle | 2,25 ± 0.58 |
-
Die
Daten in dieser Tabelle zeigen, dass Alpha-2-Makroglobulin, welches
die Trypsinaktivität
nicht hemmen konnte (d. h. in gewisser Weise denaturiert war), nicht
in der Lage ist, dsDNA zu stabilisieren, wohingegen Alpha-2-Makroglobulin,
das Trypsinaktivität
hemmen kann, in der Lage ist, dsDNA zu stabilisieren.
-
Referenzen
-
- 1 – Demidov
et al. (2000) Curr Issues Mol Biol. 2(1): 31–35.
- 2 – Bukanov
et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(10) 5516–5520.
- 3 – US Patent 6,265,166 .
- 4 – Wong
et al. (2000) Biotechniques 28(4): 776–783.
- 5 – Internationale
Patentanmeldung PCT/GB01/02564.
- 6 – Britische
Patentanmeldung 0014324.8 ( GB-A-2363381 ).
- 7 – Baker
et al. (2003) Biotechniques 31(1): 142–145.
- 8 – Internationale
Patentanmeldung PCT/GB99/03357 ( WO
00/21973 ).
- 9 – Internationale
Patentanmeldung PCT/US99/30751 ( WO
00/37686 ).
- 10 – Hofmann
et al. (1999) Nucleic Acids Research 27(1): 215–219.
- 11 – Bucher & Bairoch (1994)
Proc. Int. Conf. Intell. Syst. Mol Biol. 2: 53–61 [ISMB-94; Proceedings 2nd
International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology,
(Herausgeber Altman et al.), AAAlPress, Menlo Park].
- 12 – Silverstein
et al. (2001) Nucleic Acids Research 29(1): 49–51.
- 13 – Shoop
et al. (2001) Bioinformatics 17(3): 262–271.
- 14 – Silverstein
et al. (2001) Bioinformatics 17(3): 249–261.
- 15 – Apweiler
et al. (2000) Bioinformatics 16(12): 1145–1150.
- 16 – Apweiler
et al. (2000) Nucleic Acids Research 29(1) 37–40.
- 17 – Lo
Conte et al. (2000) Nucleic Acids Research 28(1): 257–259.
- 18 – Armstrong & Quigley (1999)
Dev Corp Immunol 23(4–5):
375–390.
- 19 – Feige
et al. (1996) Horm Res 45(3–5):
227–232.
- 20 – Rantamäki & Müller (1992)
J. Dairy Res. 59: 273–285
- 21 – Cheng
et al. (1983) Nucleic Acids Research 11(3): 659–669