CN113604468B

CN113604468B - 小麦单株穗数及耐热性性状相关snp位点及其应用

Info

Publication number: CN113604468B
Application number: CN202111026434.5A
Authority: CN
Inventors: 刘西岗; 张琦; 郭琳; 李永鹏; 景瑞莲
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2041-09-02
Also published as: CN113604468A

Abstract

本发明公开了一种小麦单株穗数及耐热性性状相关SNP位点及其应用，包括用于鉴定或辅助鉴定小麦单株穗数及耐热性性状的试剂盒、引物、相关的分子标记，以及上述元素在鉴定或辅助鉴定小麦单株穗数及耐热性性状中的用途。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种和研究中具有重要意义。

Description

小麦单株穗数及耐热性性状相关SNP位点及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种与小麦单株穗数及耐热性相关的SNP位点及其应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L)是是我国三大粮食作物之一。在耕地面积有限的条件下，提升小麦单产是满足未来粮食需求不断提高的重要方式，同时也是保证粮食安全的战略目标。单位面积穗数是影响小麦(Triticum aestivum)产量的三要素之一，直接受单株穗数(spike numberperplant,SNPP)影响，单株穗数是易受环境影响的复杂数量性状。因此，挖掘调控单株穗数的优异等位变异并开发功能标记在小麦高产育种中具有重要的应用价值。

随着测序技术和分子标记的丰富(Cui et al.,2017；Liu et al.,2018)，全基因组关联分析(Chen et al.,2017；Liu et al.,2017)和连锁分析(Xu et al.,2017)被广泛的应用到数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)的挖掘中。例如，利用高分蘖与矮秆突变体构建的双亲群体，在2D染色体上检测到1个控制单株穗数的数量性状基因位点(Xuet al.,2017)。3A染色体上检测到1个同时控制株高、穗粒数和单株穗数的QTL(Shah etal.,1999)。另外，利用2个双亲群体在3B、4A和6D染色体上也检测到单株穗数QTL(Kumar etal.,2007)。单株穗数形成在一定程度上依赖分蘖的多寡，水稻(Oryza sativa)中克隆了一些控制分蘖形成的基因，如MOC1(monoculm 1)、DLT(dwarfandlow-tillering)、TE(tillerenhancer)、THIS1(high tillering,reduced height,and infertile spikelets 1)、DWT1(dwarf tiller 1)、OsTB1(teosinte branched 1)和MOC3(monoculm 3)(Li et al.,2003；Tong etal.,2009；Lin et al.,2012；Liu et al.,2013；Wang et al.,2014；Lu et al.,2015；Wang etal.,2020)等。参与独角金内酯合成途径的基因TaD27(Dwarf27)影响小麦分蘖多少(Zhao et al.,2020)。位于1A染色体短臂的tin(tiller inhibition)基因(Spielmeryer et al.,2004)，以及来源于二倍体小麦(T.monococcum)定位于3Am染色体的tin3基因(Kuraparthy et al.,2007；2008)均使分蘖芽在营养生长向生殖生长过渡期停止生长使分蘖退化。

温度是调控小麦单株穗数的关键环境因素。一般认为，13℃-18℃是适合小麦分蘖的温度，温度过高或过低均停止分蘖，温度越高，小麦幼穗分化速率越快，幼穗分化的各个时期时间越短，反之结果相反。

尽管已经有调控单株穗数相关报道，但小麦单株穗数调控机制非常复杂，且非常容易受环境影响，所以目前发现和报导的基因很难应用于小麦遗传育种改良。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种小麦单株穗数及耐热性性状相关SNP位点及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种试剂盒，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性，所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第1875位碱基。

作为本发明的一种优选技术方案，所述SNP位点处的核苷酸为G或C；所述SNP位点处的核苷酸为G/G纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为C/C纯合时，相对应的基因型是乙。

作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID NO.2和SEQID NO.3组成的引物对1F和1R，和/或序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。

一种引物，用于检测小麦基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性，所述的SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第1875位碱基；所述SNP位点处的核苷酸为G或C；所述SNP位点处的核苷酸为G/G纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为C/C纯合时，相对应的基因型是乙。

作为本发明的一种优选技术方案，所述引物为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3组成的引物对1F和1R，和/或序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R。

一种分子标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1中5’末端1772-1899位序列，和/或其核苷酸序列为SEQ ID NO.1中5’末端1674-2001位序列。

本发明还包含上述试剂盒、引物、分子标记在鉴定或辅助鉴定小麦单株穗数及耐热性性状中的应用。

本发明还包含上述试剂盒、引物、分子标记在小麦育种中的应用。

一种鉴定或辅助鉴定小麦单株穗数及耐热性性状的方法，该方法包括如下步骤：

A、对待测小麦基因组DNA中任意一段包含如下SNP位点的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定；所述SNP位点对应于SEQ ID NO.1所示序列自5’末端第1875位碱基；

B、确定待测小麦的基因型，所述SNP位点处的核苷酸为G/G纯合时，相对应的基因型是甲；所述SNP位点处的核苷酸为C/C纯合时，相对应的基因型是乙；

C、根据待测小麦基因型按照如下标准确定待测小麦的单株穗数及耐热性性状：C-1，单株穗数为：基因型甲纯合的小麦小于/候选小于基因型乙纯合的小麦；C-2，耐热性为：基因型甲纯合的小麦强于/候选强于基因型乙纯合的小麦。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中：所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ IDNO.1中5’末端1772-1899bp；所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R；所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到PCR产物；将此PCR产物稀释100倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到PCR产物；用限制性内切酶SacI酶切PCR产物；步骤B中：若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为G/G，基因型为甲；若PCR产物可以被切开，则该核苷酸多态性位点为C/C，基因型为乙。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明实验证明，通过检测所述SNP，即可找到单株穗数及耐热性相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种和研究中具有重要意义。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素的存在或添加。

还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。

另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网，网址：http://icgr.caas.net.cn。

实施例1与小麦单株穗数相关的SNP及其PCR-酶切多态性检测

1、扩增含小麦该SNP的基因组片段的特异引物及序列分析

在小麦基因组上的基因HSF编码区发现1个SNP，对应于序列表中SEQ ID NO：1自5’末端的第1875位、；该位点在小麦自然变异群体中存在两种基因型：

基因型甲：G

基因型乙：C

根据小麦不同基因组的序列差异，设计特异性引物PCR扩增分别包含该SNP位点在内的DNA片段：

F1：CCAGACAGATGGGAGTTCG(SEQ ID NO：2)；

R1：GGTTCTGTATTGCTCTTGCCAGG(SEQ ID NO：3)；

F2：ATCACAGCAGCAGGCTCTTGG(SEQ ID NO：4)；

R2：GCTGCTCCTGCCTCAGTTTCACGA(SEQ ID NO：5)。

以F1和R1为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列1所示的1674-2001位序列；以F2和R2为引物对PCR扩增的靶序列如序列表的序列1所示的1772-1899位序列。酶切分析显示，该多态性可分别被SacI识别。

2、PCR-酶切多态性检测及基因分型方法的建立

1)提取待测小麦的基因组DNA；

2)以步骤1)的基因组DNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH₂OμL、10×PCRBuffer 1μL、引物F1(5μmol/L)和引物R1(5μmol/L)各0.3μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。

PCR扩增条件为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，32次循环；72℃10min，16℃保存。

3)将步骤2)的PCR产物稀释100倍，以其为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR扩增的体系(10μL)为：ddH₂OμL、10×PCR Buffer 1μL、引物F2(5μmol/L)和引物R2(5μmol/L)各0.3μL、dNTP(2.5μmol/L)0.6μL，Taq酶0.1μL、模板(20ng/μL)0.5μL。

PCR扩增条件为94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃10s，32次循环；72℃10min，16℃保存。

4)将步骤3)得到的PCR产物用SacI酶切，获得酶切产物，进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，记录PCR产物是否被切为两个片段，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述位点的情况：

若所述酶切产物为一个片段，则待测小麦在所述位点为G纯合(表示为G/G)的小麦；

若所述酶切产物为两个片段，则待测小麦在所述位点为C纯合(表示为C/C)的小麦。

5)根据步骤4)的结果，将小麦分为在所述位点的情况为如下I、II两种类型：

I：G/G(即基因型甲纯合)；

II：C/C(即基因型乙纯合)；

所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。

3、利用dCAPs标记对自然群体进行分型并与单株穗数性状进行关联分析

以323份六倍体小麦组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦，按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物进行测序验证，结果如表1所示。

表1小麦自然群体中所述多态性位点的情况

实施例2

2015年，在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义)的旱地，2016年在中国农业科学院作物科学研究所实验农场(北京顺义和昌平)的旱地和水地种植上述自然群体小麦，调查各小麦品种的单株穗数，用Tassel2.1软件对单株穗数和所述多态性位点的情况进行关联分析，选择混合线性模型+群体结构(MLM+(Q+K))方法进行分析，以P<0.05为显著性水平，结果如表2所示。

表2自然群体中WFZP-A基因多态性位点的情况与单株穗数的关联分析结果

表2的关联分析结果表明，表1所示的323份六倍体小麦组成的自然群体形成的两种类型的单株穗数差异均达到显著水平(P<0.05)。其中，类型II的小麦单株穗数高于类型I的小麦单株穗数。几个环境中，类型II的小麦材料的单株穗数分别较I的小麦高0.83、0.74、0.71、1.92，类型II是提高小麦单株穗数的优异基因型。

实施例3

在实施例2中对关联分析的结果分析发现，调查的10个环境中有4个热环境，其中有3个热环境的单株穗数差异达到极显著(P<0.05)，所以认为HSF-A基因与热这一环境因素有较高关联度，所以，针对以上关联分析结果，将4个环境划分为热和正常，统计两个基因型的单株穗数，结果如表3所示。

表3四个关联环境中HSF-A基因两种单倍型单株穗数的数量差异结果

表3的结果表明在正常情况下类型I比类型II减少19.06％，而在热环境下，类型I比类型II减少10.15％，综上类型I为低单株穗数、高耐热基因型，类型II为高单株穗数、低耐热基因型。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

综上实施例可见，本发明通过对小麦自然变异群体中HSF基因编码区的遗传变异分析，发现有一个SNP，对应于序列表序列1自5’末端第1875位，该SNP存在两种基因型：基因型甲(G)、基因型乙(C)。通过关联分析证明，这两种单倍型的纯合类型中，单株穗数大小为：基因型甲纯合的小麦﹤基因型乙纯合的小麦，耐热性强弱为基因型甲纯合的小麦>基因型乙纯合的小麦。实验证明，通过检测所述SNP，即可找到单株穗数相对较高，耐热性较强的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种和研究中具有重要意义。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河北师范大学

<120> 小麦单株穗数及耐热性性状相关SNP位点及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2558

<212> DNA

<213> 普通小麦(Triticum aestivum L)

<400> 1

ctgcgttggg cgccactgtg ctgagcaatt ctttctttgg ttctttggat tcttccgtgt 60

gcgacaggag atcgctggtt gtttgcttgc tcggccgcga ggagggatgg accgggtgct 120

gctgccggtg agggtgaagg aggagtggcc gccgccgccg ccggaggagg aggaggagtt 180

ggagcatcgg ggcctggcgc cgcggccgat ggaggggctg cacgagacgg gcccgccgcc 240

gttcctgacc aagacgttcg acctggtggc cgacccggcc accgacggcg tcgtctcctg 300

gggccgcgcc ggggacagct tcgtcgtctg ggacccccac ctcttcgccg ccgtgctgct 360

cccgcgcttc ttcaagcaca gcaacttctc cagcttcgtc cgccagctca acacctacgt 420

gagtctcccc tctcctgctt gccttgctca accattactt gttcagttaa cctgcacttg 480

ctagtcgctt gcttgtgttg ctgcaatccc agtcttgcat ttgtagaacc aagattttag 540

ctgagttgct tgagcaagag atgaacgaca aatgacatga tggaatgcca aagcaacatt 600

tcgtgcttgt cttacaatac aactgtggtg actatggtgg tctggtcacc atgattattg 660

gtatgcatct gattctggaa tgacataaat cacacaaaaa caaaaatata agatggttca 720

gtttggtaac tgggtacaaa ttgtgaaaga agagtaacat ttatagctgc tcttagcatc 780

tagcggtaag cggttctata tggcagtgaa ctttgctagt tgccgtgtgt tggtgttggc 840

tgtgtgcatc cagaggccgg gtgtgtgctc attgtgtttt gtatcctctt gatgcttcat 900

tttgagctaa taaaatccac ccttcgtcga aaaaaaatat ggcagtgaac tatgttactg 960

tgattctctt ccctttgtgt aaatcttgta tatctacaat taatcagcaa agaagctgca 1020

aattagaatt ctttgttttt tgcctctggt ttgaagggtg aacatagctt gaactcttca 1080

acagactaca atagctatga tactagtact cctactagga tagataggat tcttgaatat 1140

ctctgccact atctgcttac gtaaagtcag ggaaaatcat tgaatttgac ggaaaaatga 1200

ggttggggcc aatcctttgg cagaggcatg tgcataaaac cttatttcct gaattcttct 1260

tgatacttca gaacaaggag atatgctggg aggctgaata gcctgcatct ccttgacgaa 1320

catatttaat tctgacatgc tttttcttca acttcttact gtgtagctag atggatcaag 1380

acaccggctg aagctacaag aacctgctta tttgttctag aagactcctt tcatcaccat 1440

caagcaatat agtataccac tacctattct tccacttctt ataaatttgg gcataacact 1500

gtgtgaaacc taccatttta tattgtgtga agtatgccat gttagttgag ctttgctgct 1560

tgtggcttgt gaacttgagc taactgcagt tgttcttcta ctctttgtgt ttctcgaaac 1620

taaaataaat atgtgactta ttctgcaatt tgcagggttt tagaaagatt gatccagaca 1680

gatgggagtt cgcgaacgag ggtttcatta ggggccagag acagcttctg aagatgataa 1740

agagaaggag accaatgtct tatctccctt catcacagca gcaggctctt ggctcctgcc 1800

tcgaggtcgg ccagttcgga ttcgacgaag aaatcgaagt gctaaagcgc gacaagaacg 1860

ccttactcgc agaggtggtg aaactgaggc aggagcagca gagcagcaga gctgacatgc 1920

gagccatgga agagaggtta caccacgtcg agcagaagca gctccagatg atgggtttcc 1980

tggcaagagc aatacagaac cctgacttct ttctccagct gatccagcaa caaaataaac 2040

tgaaggacct cgaggacggt tacccgacga agaggaggag gcccatcgac gtaatgccgt 2100

tccttggccc tgaggggacc agtcagagtg agccactcga gtccacattc atttttgagg 2160

acagggaatt ttcagagctg gagaatttag ccatgaacat tcagggcatc aggaagggca 2220

tggaggatga cagaggtggt cggaatcagg gctgtggtga ggccgagctg actgacgact 2280

tctgggagga gctgctgagt gaaggaatga gggatgaagc tgagatgcta gagctggaga 2340

ggaggagatc tagatgtttc gacgcgtagc gcaaaatatg ggtcatctaa gtaacaacga 2400

tccaaactct accagaattc ataaccattt aatctatata cagttgtata gatagctgta 2460

ttgcatattg tagtgctaat tcatagtcaa agactgattg tattgcggtt ccacaccgat 2520

tatgtggtat atatctagtg gtataaatac tgtccctg 2558

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagacagat gggagttcg 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttctgtat tgctcttgcc agg 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcacagcag caggctcttg g 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgctcctg cctcagtttc acga 24

Claims

1.引物对的用途，所述引物对为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，和序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对2F和2R，其特征在于：所述用途为在小麦的分子标记辅助选择育种中用于鉴定或辅助鉴定小麦单株穗数。

2.一种鉴定或辅助鉴定小麦单株穗数性状的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

C、根据待测小麦基因型按照如下标准确定待测小麦的单株穗数性状：基因型甲纯合的小麦小于基因型乙纯合的小麦；

步骤A中：

所述的PCR扩增的DNA片段为SEQ ID NO.1中5’末端1772-1899bp；所述的PCR扩增的特异性引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3组成的引物对1F和1R，SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5组成的引物对2F和2R；

所述的酶切包括以下步骤：以小麦基因组DNA为模板，以引物1F和1R为引物对扩增得到第一PCR产物；将此PCR产物稀释100倍，以其作为模板，以引物2F和2R为引物对扩增得到第二PCR产物；用限制性内切酶SacI酶切第二PCR产物；

步骤B中：

若PCR产物不能被切开，则该核苷酸多态性位点为G/G，基因型为甲；若PCR产物可以被切开，则该核苷酸多态性位点为C/C，基因型为乙。