CN110157835B - 一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引物和应用 - Google Patents

一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引物和应用，属于分子标记技术领域。与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。用于扩增InDel分子标记的引物对，核苷酸序列如SEQ ID No.2～3所示。用于检测水稻抽穗扬花期耐热性的试剂盒，包括所述的引物对。所述InDel分子标记、引物对或试剂盒在预测、鉴定或辅助鉴定水稻抽穗扬花期耐热性表型或在选育水稻耐热品种中应用。同时本发明还提供了利用所述InDel分子标记鉴定水稻耐热性的方法，简便快捷，鉴定结果准确，具有良好的推广应用前景。

Description

一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引 物和应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引物和应用。
背景技术
水稻扬花授粉是结实形成产量的先决条件，如果不能正常扬花授粉，那就会影响当年水稻产量。外界环境条件对水稻授粉影响很大，例如水稻颖花虽然发育正常，但是由于外界不良条件妨碍授粉，便会产生空粒，影响产量。其中高温是妨碍水稻扬花授粉的不利因素之一。高温造成花器官发育不全，花粉发育不良，活力下降，水稻开花散粉和花粉管伸长受阻，导致不能受精而形成空粒。同时高温还能导致花粉管尖端大量破裂，使其失去受精能力；扬花授粉时遇到高温，伤害花粉粒，使之降低活力，温度超过40℃以上，颖花开后花柱会干枯，不能实现扬花授粉。
水稻品种抽穗扬花高温热害时有发生，但在相同年份的相同高温生态条件下，有的品种结实正常，有的品种结实下降特别突出，说明品种间对高温的耐热性具有差异性，存在耐热性强和耐热性弱的不同类型品种。目前，改良水稻抽穗扬花期耐热性的方法往往利用单片段置换系改良水稻抽穗扬花期耐热性，采用分子标记多次辅助筛选杂交后代，实现目标后代的快速获得。现有技术中关于水稻抽穗扬花期耐热性的分子标记种类较少，大大限制了遗传育种与品种改良的速度和进程。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引物和应用。
本发明提供的一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种用于扩增所述InDel分子标记的引物对，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
本发明提供了一种用于检测水稻抽穗扬花期耐热性的试剂盒，包括所述的引物对。
优选的，还包括10×PCRbuffer、dNTP和Taq DNA聚合酶。
本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定水稻抽穗扬花期耐热性表型中的应用。
本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物对或所述试剂盒在选育水稻耐热品种中的应用。
本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物对或所述试剂盒在预测水稻抽穗扬花期耐热性表型中的应用。
本发明提供了一种利用所述InDel分子标记鉴定水稻耐热性的方法，包括以下步骤：
1)以待鉴定水稻的基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
2)根据PCR产物的大小判断水稻在抽穗扬花期的耐热性情况：
当所述待鉴定水稻的PCR产物中缺失SEQ ID No.1所示片段时，则所述待鉴定水稻为热敏感水稻或候选热敏感水稻；
当所述待鉴定水稻的PCR产物中插入有SEQ ID No.1所示片段时，则所述待鉴定水稻为耐热水稻或候选耐热水稻；
当所述待鉴定水稻的PCR产物为两条条带，分别为缺失SEQ ID No.1所示片段的条带和插入有SEQ ID No.1所示片段的条带，则所述待鉴定水稻为杂合基因型。
优选的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
优选的，所述待鉴定水稻包括水稻种质资源、遗传群体或育种材料。
本发明提供的一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。基于PCR扩增所述InDel分子标记，可有效区分耐热等位基因型和热敏感等位基因型的序列差异，可用于水稻耐热性鉴定和分子育种。实验证明，利用所述InDel分子标记鉴定205份水稻种质资源的耐热性，有39份水稻材料的鉴定结果为热敏感基因型(200bp)，这39份水稻材料在高温下的平均结实率为55.2％，其中有26份水稻材料的结实率比整体平均值水平低，占66.7％；有166份水稻材料的鉴定结果为耐热基因型(214bp)，这166份水稻材料在高温下的平均结实率为65.6％，比39份热敏感基因型的平均值高10.4％，其中有102份水稻材料的结实率比整体平均值水平高，占61.4％；方差分析表明，热敏感基因型与耐热基因型在高温下的结实率呈极显著差异(P<0.001)。结果表明，本发明的InDel分子标记可以有效鉴别水稻在抽穗扬花期的耐热性，可以用于耐热水稻品种的预测和筛选。
附图说明
图1为水稻抽穗扬花期耐热性的全基因组关联分析结果，其中图1-A为基于MLM模型分析得到的Manhattan图，箭头所示为耐热关联的SNP位置；图1-B为用于反映观测值和预测值之间差异的Quantile-quantile plots；
图2为耐热品种与热敏感品种在耐热关联区域的部分序列比对结果，其中W1、W220和W229为耐热水稻品种，W82、W123和W297为热敏感水稻品种；
图3为部分水稻种质资源扩增分子标记HT9的电泳图，聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8％。
具体实施方式
本发明提供的一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。缺失SEQ ID No.1(GGCGGCTCAGAGAG)所示片段的水稻为热敏感水稻或候选热敏感水稻；插入SEQ ID No.1所示片段的水稻为耐热水稻或候选耐热水稻。所述耐热水稻为抽穗扬花期高温下结实率高的水稻，所述热敏感水稻为抽穗扬花期高温下结实率低的水稻。
本发明提供了一种用于扩增所述InDel分子标记的引物对，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示(5’-AGATAAAGAGAAAGCGACGAG-3’)；所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示(5’-CGTGTAATAACGGGAGCC-3’)。所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物对委托上海生工生物工程股份有限公司合成。所述引物对能特异性扩增包含InDel分子标记的DNA片段。所述DNA片段的长度为200bp或214bp。
本发明提供了一种用于检测水稻抽穗扬花期耐热性的试剂盒，包括所述的引物对。优选还包括10×PCRbuffer、dNTP和Taq DNA聚合酶。本发明对所述引物对的浓度没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物浓度即可。本发明对所述10×PCRbuffer、dNTP和Taq DNA聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的普通PCR扩增用试剂即可。
本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定水稻抽穗扬花期耐热性表型中的应用。本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物对或所述试剂盒在选育水稻耐热品种中的应用。本发明提供了所述InDel分子标记、所述引物对或所述试剂盒在预测水稻抽穗扬花期耐热性表型中的应用。
在本发明中，所述预测、鉴定或辅助鉴定水稻抽穗扬花期耐热性表型的方法见下面关于一种利用所述InDel分子标记鉴定水稻耐热性的方法中的操作步骤。所述选育水稻耐热品种的方法优选采用本领域所熟知的品种选育方法即可。
本发明提供了一种利用所述InDel分子标记鉴定水稻耐热性的方法，包括以下步骤：
1)以待鉴定水稻的基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
2)根据PCR产物的大小判断水稻在抽穗扬花期的耐热性情况：
当所述待鉴定水稻的PCR产物中缺失SEQ ID No.1所示片段时，则所述待鉴定水稻为热敏感水稻或候选热敏感水稻；
当所述待鉴定水稻的PCR产物中插入有SEQ ID No.1所示片段时，则所述待鉴定水稻为耐热水稻或候选耐热水稻；
当所述待鉴定水稻的PCR产物为两条条带，分别为缺失SEQ ID No.1所示片段的条带和插入有SEQ ID No.1所示片段的条带，则所述待鉴定水稻为杂合基因型。
在本发明中，所述待鉴定水稻优选包括水稻种质资源、遗传群体或育种材料。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选如下：模板DNA 10～100ng，5μM正向引物1μL，5μM反向引物1μL，10×PCRbuffer(含Mg2+)2.0μL，10mM dNTPMix 1μL，Taq DNA聚合酶1U，去离子水补齐至20μL；所述PCR扩增的反应程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
在本发明中，PCR产物优选用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，点样后在130V直流电压电泳2.5h，银染显色，在胶片灯上读取各样品的PCR带型。当所述待鉴定水稻的PCR产物中缺失SEQ ID No.1所示片段时，PCR产物的条带长度为200bp(AGATAAAGAGAAAGCGACGAGATCGGTGAGACGGGACCTCATCACAAATCATACAGCCCGTGAGGACGGACGGACGCGCGGTTGAGCGAATCAAAGCTCATCCGCAGCAGAGCGAGTGGCACTGTGGCATGTACAGGCCTACAGTGTACAGGAGAGAGAGAGGAGGTTGAGGCGATCTCTGCGGCTCCCGTTATTACACG，SEQ ID No.4)，则所述待鉴定水稻为热敏感水稻或候选热敏感水稻；当所述待鉴定水稻的PCR产物中插入有SEQ ID No.1所示片段时，PCR产物的条带长度为214bp(AGATAAAGAGAAAGCGACGAGATCGGTGAGGGCGGCTCAGAGAGACGGGACCTCATCACAAATCATACAGCCCGTGAGGACGGACGGACGCGCGGTTGAGCGAATCAAAGCTCATCCGCAGCAGAGCGAGTGGCACTGTGGCATGTACAGGCCTACAGTGTACAGGAGAGAGAGAGGCGGTTGAGGGGATCTCTGCGGCTCCCGTTATTACACG，SEQ ID No.5)，则所述待鉴定水稻为耐热水稻或候选耐热水稻；当所述待鉴定水稻的PCR产物为两条条带，分别为缺失SEQ IDNo.1所示片段的条带和插入有SEQ ID No.1所示片段的条带，PCR产物的条带一个长度为200bp，另一条为214bp，则所述待鉴定水稻为杂合基因型。
下面结合实施例对本发明提供的一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
水稻抽穗扬花期耐热性的全基因组关联分析(GWAS)
1)水稻抽穗扬花期的耐热性鉴定
从湖南省种质资源库选取来源广泛、遗传多样性丰富的338份水稻资源，2018年根据各材料的生育期进行播期调整，于4月～6月分4期播种于湖南省长沙县北山镇。30d后移栽至大田，田间管理和病虫害防治按照当地水稻栽培技术进行。采用温湿度记录仪(HOBE)记载水稻冠层的温度变化，温度探头分布于大田的不同位置，每间隔30min记录一次。记录所有材料的始穗期，在日最高气温高于37℃时(7月16日～8月10日)，利用不同颜色的标签对开花的稻穗进行标记，始穗30天后收种标记穗，同时对开花期未遇上高温的稻穗收种作为对照。考种结实率，3次生物学重复。
2)基因型分析及耐热性GWAS分析
在分蘖期取水稻叶片提取DNA，利用简化基因组测序技术对338份材料进行全基因组测序。根据完整度50％以上且次要基因型频率高于5％的标准过滤，共获得3,765,790个SNP标记。为了避免正常结实率差异对耐热性鉴定的影响，仅选取正常条件下结实率高于85％的材料用于耐热性的GWAS分析；以高温胁迫下的结实率作为考核指标，基于混合线性模型(MLM)进行关联分析，在第9号染色体上获得2个与耐热性显著关联的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)标记(图1)。其中SNP标记(ID14365299)与耐热性的关联度最高(–log10(P)＝6.54，P<0.001)。根据荧光定量PCR和生物信息学等技术手段，进一步在该SNP两翼100Kb的范围内预测了耐热候选基因(基因编号为：Os09g0434200)。
3)耐热分子标记HT9的开发
耐热基因的序列差异可能是造成不同品种间耐热性差异的主要原因。因此对耐热候选基因的编码区和启动子区进行测序，扩增编码区的引物序列为：正向引物(CAGGCTACATCTCCATCCCT，SEQ ID No.6)，反向引物(CAGCGTCATCCGTTATCTCA，SEQ IDNo.7)；扩增启动子区的引物序列为：正向引物(GTCACACGATTTGGCGTT，SEQ ID No.8)，反向引物(GGACTTTGCCGTTTACTGC，SEQ ID No.9)。
利用DNAMAN软件对序列进行比对，发现耐热品种与热敏感品种之间存在一些序列差异，在起始密码子上游1977bp的位置，热敏感品种相比耐热品种有一段14bp的序列缺失(图2)。利用Primer 5.0在该区域两翼设计引物，产物大小控制在100～300bp，以便于更好区分基因型之间的差异。设计的引物序列为：
正向引物：AGATAAAGAGAAAGCGACGAG(SEQ ID No.2)
反向引物：CGTGTAATAACGGGAGCC(SEQ ID No.3)。
实施例2
水稻耐热分子标记HT9的鉴定方法
1)PCR扩增：使用CTAB法提取水稻植株的基因组DNA，以DNA为模板，将设计的HT9正向引物和反向引物加入到PCR反应体系中，PCR反应体系如下：模板DNA 10～100ng，5μM正向引物1μL，5μM反向引物1μL，10×PCRbuffer(含Mg2+)2.0μL，10mM dNTPMix 1μL，Taq DNA聚合酶1U，去离子水补齐至20μL；PCR程序参考《分子克隆实验指南》第三版，并按照湖南省水稻研究所的条件和要求进行适当修改。具体PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
2)根据PCR产物大小鉴定水稻的耐热性：扩增产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离，点样后在130V直流电压电泳2.5h，银染显色，在胶片灯上读取各样品的PCR带型。如果扩增产物是200bp的DNA片段，则待鉴定水稻为热敏感水稻或候选热敏感水稻；如果扩增产物为214bp的DNA片段，则所述待鉴定水稻为耐热水稻或候选耐热水稻；如果扩增产物为两条条带，片段大小分别为200bp和214bp，则所述待鉴定水稻为杂合基因型(图3)。
实施例3
利用分子标记HT9鉴定水稻种质资源的耐热性
以整体平均值作为区分水稻耐热性强弱的标准，利用本发明的分子标记HT9鉴定205份水稻种质资源的等位基因型。
在大田条件下通过分期播种方式鉴定水稻在抽穗扬花期的耐热性。选取抽穗扬花期遇高温的205份水稻种质资源，以高温下的结实率作为耐热性的考察指标。从表1中的205份水稻材料中提取基因组DNA，利用耐热分子标记HT9，按照实施例2中的方法进行基因型的鉴定。
表1 205份水稻种质资源的HT9基因型及高温下的结实率
Figure BDA0002123349810000081
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Figure BDA0002123349810000091
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Figure BDA0002123349810000151
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Figure BDA0002123349810000161
表1结果表明，有39份水稻材料的鉴定结果为热敏感基因型(200bp)，这39份水稻材料在高温下的平均结实率为55.2％，其中有26份水稻材料的结实率比整体平均值水平低，占66.7％；有166份水稻材料的鉴定结果为耐热基因型(214bp)，这166份水稻材料在高温下的平均结实率为65.6％，比39份热敏感基因型的平均值高10.4％，其中有102份水稻材料的结实率比整体平均值水平高，占61.4％；方差分析表明，热敏感基因型与耐热基因型在高温下的结实率呈极显著差异(P<0.001)。这些结果表明，本发明的分子标记HT9可以有效鉴别水稻在抽穗扬花期的耐热性，可以用于耐热水稻品种的预测和筛选。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南省水稻研究所
<120> 一种与水稻抽穗扬花期耐热性相关的InDel分子标记及其引物和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcggctcag agag 14
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agataaagag aaagcgacga g 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtgtaataa cgggagcc 18
<210> 4
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agataaagag aaagcgacga gatcggtgag acgggacctc atcacaaatc atacagcccg 60
tgaggacgga cggacgcgcg gttgagcgaa tcaaagctca tccgcagcag agcgagtggc 120
actgtggcat gtacaggcct acagtgtaca ggagagagag aggaggttga ggcgatctct 180
gcggctcccg ttattacacg 200
<210> 5
<211> 214
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agataaagag aaagcgacga gatcggtgag ggcggctcag agagacggga cctcatcaca 60
aatcatacag cccgtgagga cggacggacg cgcggttgag cgaatcaaag ctcatccgca 120
gcagagcgag tggcactgtg gcatgtacag gcctacagtg tacaggagag agagaggcgg 180
ttgaggggat ctctgcggct cccgttatta cacg 214
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggctacat ctccatccct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagcgtcatc cgttatctca 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcacacgat ttggcgtt 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggactttgcc gtttactgc 19

Claims (7)

1.一种用于扩增InDel分子标记的引物对或试剂盒在鉴定或辅助鉴定水稻抽穗扬花期耐热性表型中的应用，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；
所述InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述试剂盒包括所述的引物对。
2.一种用于扩增InDel分子标记的引物对或试剂盒在选育水稻耐热品种中的应用，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；
所述InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述试剂盒包括所述的引物对。
3.一种用于扩增InDel分子标记的引物对或试剂盒在预测水稻抽穗扬花期耐热性表型中的应用，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQID No.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；
所述InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述试剂盒包括所述的引物对。
4.根据权利要求1~3任意一项所述应用，其特征在于，所述试剂盒还包括10×PCRbuffer、dNTP和Taq DNA聚合酶。
5.一种利用InDel分子标记鉴定水稻耐热性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以待鉴定水稻的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示；所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；
2)根据PCR产物的大小判断水稻在抽穗扬花期的耐热性情况：
当所述待鉴定水稻的PCR产物中缺失SEQ ID No.1所示片段时，则所述待鉴定水稻为热敏感水稻或候选热敏感水稻；
当所述待鉴定水稻的PCR产物中插入有SEQ ID No.1所示片段时，则所述待鉴定水稻为耐热水稻或候选耐热水稻；
当所述待鉴定水稻的PCR产物为两条条带，分别为缺失SEQ ID No.1所示片段的条带和插入有SEQ ID No.1所示片段的条带，则所述待鉴定水稻为杂合基因型；
所述InDel分子标记，位于水稻第9号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述待鉴定水稻包括水稻种质资源、遗传群体或育种材料。
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