CN109022597B

CN109022597B - 用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109022597B
Application number: CN201811062784.5A
Authority: CN
Inventors: 李晨虹; 陶紫玉; 程方圆
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2038-09-12
Also published as: CN109022597A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用。发明人前期筛选得到120个在短颌鲚和刀鲚之间具有显著性差异的SNP位点，21个湖鲚和刀鲚之间的差异位点。本发明针对120个位点中分化指数为1的位点，从中挑选20个用于引物设计；针对21个位点中分化指数较高的位点，挑选出10个设计引物。研究结果表明：短颌鲚与刀鲚可以使用以上19个SNP分子标记中的任何一个完全分开。而用于区分湖鲚与刀鲚的10个SNP分子标记中有8个在所测样本中可以扩增并用于物种鉴定。本发明提供了稳定、高效和低成本识别短颌鲚和刀鲚、湖鲚和刀鲚的方法，为今后刀鲚的物种鉴定和资源保护提供了有效的工具。

Description

用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用。

背景技术

在我国，刀鲚主要分为2个生态型，分别为江海洄游型和湖泊定居型。但对于定居型短颌鲚、湖鲚与洄游型刀鲚的分类一直备受争议。刀鲚是一种具有很高经济价值的鱼类，在巨大的利润推动下，许多商人利用短颌鲚和湖鲚冒充长江刀鲚。短颌鲚、湖鲚和刀鲚之间如何区分，一直是很多学者研究的热点。

早期分类学研究为判别刀鲚不同生态型提供了形态学的依据，依据形态学特征鉴定物种方便易行又简单直观,也是鲚属鱼类在分类问题的研究中最常使用的分类方法。但是通过形态学方法进行物种鉴定一直存在局限性。第一，表型可塑性会影响形态特征，并导致用物种鉴定的错误。第二，由于一些关键性的形态学特征只适用于特殊的生命阶段，很多个体无法被准确的识别。随着分子生物学的发展，运用同工酶位点、微卫星标记、细胞色素b，以及线粒体控制区序列来探究刀鲚种群结构的研究越来越多，但不同学者利用不同方法得到的实验数据及分析结果也存在较大差异。所以以上几种方法都不能够准确的提供分子标记用于区分短颌鲚和刀鲚、湖鲚和刀鲚。另一方面，近10年来，由于水体环境污染、洄游通道受阻以及捕捞过度等原因，刀鲚的资源产量急剧下滑，因此我们急需一种快速高效的方法来区分短颌鲚和刀鲚，湖鲚和刀鲚，从而更有针对性的保护资源。在没有准确的分子标记可用的情况下，使用耳石微量元素检测的方法确实可以判断每尾鱼的生活史，验证它为洄游型或定居型个体。但是基于耳石的方法成本高、过于耗时；而且，由于耳石的方法对鱼体的大小有一定的要求，不能够用于确定仔鱼和受精卵是否为洄游型刀鲚的后代。

因此，现在急需一种快速高效的方法来区分短颌鲚和刀鲚，湖鲚和刀鲚，从而更好的保护鲚属渔业资源。而分子标记的稳定性好，现被广泛地应用于鱼类种群识别、种群遗传结构、遗传作图等理论研究，以及鱼类保护生物学和鱼类遗传育种等实践领域。

中国专利文献CN106282334A公开了一种用于鉴别刀鲚和短颌鲚的分子标记及其应用，通过检测位于刀鲚和短颌鲚的线粒体COI基因上的标记来鉴别刀鲚和短颌鲚。中国专利文献CN106434642A公开了用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法。然而现有技术中，关于本发明用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用，目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记。

本发明的第二个目的是，提供用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记组合。

本发明的第三个目的是，提供一种用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP芯片。

本发明的第四个目的是，提供如上所述SNP分子标记和SNP分子标记组合的用途。

本发明的第五个目的是，提供一种鉴定短颌鲚和刀鲚的方法。

本发明的第六个目的是，提供一种鉴定湖鲚和刀鲚的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记，所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1-54任一所示。其中SEQ ID NO.1-38用于区分短颌鲚和刀鲚，SEQ IDNO.39-54用于区分湖鲚和刀鲚。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记组合，包括SEQ ID NO.1-5所示的分子标记中的任意两个或多个。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP芯片，所述SNP芯片包含SEQ ID NO.1-54所示的分子标记中的任意一个、两个或多个。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的分子标记在鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚中的应用。

如上所述的分子标记组合在鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚中的应用。

本发明进一步还提供检测如上所述SNP分子标记的试剂在制备鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的试剂盒或检测装置中的应用。

优选的，所述试剂包含下表中的核苷酸序列；

优选的，所述试剂为：用于直接测序法的试剂；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂；或用于以下任一种SNP分型方法的试剂：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象的方法或高分辨率溶解曲线分析技术。

需要说明的是，在获知本发明公开的多个单核苷酸多态性位点后，本领域技术人员可用本领域已知的多种技术在DNA水平、RNA水平检测本发明所述的多个单核苷酸多态性位点。例如：可以采用直接测序的方法，通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异，具体可以是传统的使用商业测序试剂盒或自动测序仪对DNA直接进行测序，或是近年来发展的焦磷酸测序(Pyrosequencing)、微测序(SNaPshot)等。焦磷酸测序技术适于对已知的短序列的测序分析，其原理是引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。SnaPshot技术平台是Applied Biosystems，ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒，可对多个SNP位点同时进行基因分型，也被称为minisequencing，该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一次电泳胶内检测多个SNP位点。

也可以采用基于杂交的方法，具体包括Taqman探针法，DNA芯片法等。TaqMan SNP基因分型原理：利用核酸外切酶对5’特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号，反应体系包括：以基因组DNA或PCR产物为模板；一对PCR引物，以及分别用FAM和VIC标记的2条MGB探针检测SNP的两种类型；在PCR反应终点读取分型数据。DNA芯片技术：待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上，由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。

还可以采用基于引物延伸的方法，如基质辅助激光解析离子飞行时间质谱(MALDI-Tof-MS)。基质辅助激光解析离子飞行时间质谱检测原理：紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止，根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子量差异，从而实现SNP分型的目的。

还可以采用高分辨率溶解曲线分析技术(HRM)。该分析技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。

在具体实施时，本领域的技术人员可以根据实际情况选择上述的任一种技术体外检测本发明所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。也可以采用多种技术的组合来体外检测所述多个基因标签单核苷酸多态性位点。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种鉴定短颌鲚和刀鲚的方法，包括如下步骤：根据下表中任意一项或多项SNP编号及SNP分子标记，检测样本对应SNP位点基因型，分别计算短颌鲚和刀鲚的基因型频率乘积，将两个基因型频率乘积相加，计算短颌鲚和刀鲚各自所占总和的比例，作为判别概率；

。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：

一种鉴定湖鲚和刀鲚的方法，包括如下步骤：根据下表中任意一项或多项的SNP编号及如上任一所述的SNP分子标记组合，检测样本对应SNP位点基因型，分别计算湖鲚和刀鲚的基因型频率乘积，将两个基因型频率乘积相加，计算湖鲚和刀鲚各自所占总和的比例，作为判别概率，判别概率越大，其对应为湖鲚或刀鲚的概率越大；

。

本发明优点在于：

1、本发明提供了稳定、高效和低成本识别短颌鲚和刀鲚、湖鲚和刀鲚的方法，为今后刀鲚的物种鉴定和资源保护提供了有效的工具。

2、基于开发的两组SNP分子标记位点，我们可以快速高效且准确地区分湖鲚和刀鲚、短颌鲚和刀鲚。

3、解决了确定仔鱼和受精卵是否为洄游型刀鲚的后代的问题，可以区分刀鲚和短颌鲚的产卵场，更有利准确地调查刀鲚资源，针对性地保护洄游型刀鲚幼苗和产卵群体。

4、从市场安全上来讲，应用这些位点可以检测到用短颌鲚、湖鲚冒充刀鲚的行为，打击不法商贩的活动。

附图说明

图1是nyx基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图2是NOD1基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图3是psmd14基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图4是CREBZF基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图5是SETD2基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图6是med16基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图7是rpl8基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图8是mbpb基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图9是rars基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图10是rabif基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图11是sf3b1基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图12是si:ch211基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图13是PDPR基因SNP分子标记的核苷酸序列。

图14是H21orf59基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图15是SP3基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图16是ubr5基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图17是tmtc4基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图18是编号为Cb-Cn_no的SNP分子标记的核苷酸序列。

图19是znf236基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图20是abcb7基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图21是gcn1l1基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图22是spon2b基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图23是med23基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图24是mtf1基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图25是eif2b4基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图26是upf2基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图27是wtap基因的SNP分子标记的核苷酸序列。

图28是分子标记和累计验证准确率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例应用单核苷酸多态性标记鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚

1材料与方法

1.1实验选材和DNA提取

共采集了20尾短颌鲚样本，分别来自2个湖泊，鄱阳湖(PY，n＝10，来自三个采样点)和洞庭湖(DT，n＝10，来自三个采样点)。20尾湖鲚样本，分别来自2个湖泊，太湖(TH，n＝10，来自三个采样点)和巢湖(CH，n＝10，来自两个采样点)。12尾洄游型刀鲚样本，分别来自长江的主河道和重要支流(SH，n＝12)，如靖江，环崇明岛的长江分流和上海沿海的芦潮港(表1)。

从每个湖泊中分别挑选多个采集点的样本测量矢耳石微量元素Sr/Ca比(每个湖泊4-5条)，另选1尾洄游型的样本作为参照比较。发现从湖泊中采集的鱼的矢耳石的中心、边缘和中间位置的Sr/Ca比值很稳定几乎没有数量级的波动，这表明它们是淡水定居型。而与此相反的是，洄游的刀鲚的矢耳石的三个位置的Sr/Ca比在中间和边缘处出现了明显的增加。因此，我们认为从湖泊采集的样本确实是淡水定居型。

取样本的胸鳍条和肌肉浸泡于95％的酒精储存在4℃冰箱中，使用组织DNA试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,USA)提取所有样本的DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取的结果，然后置于-20℃的冰箱中以备后续实验使用。

表1样本采集，20尾短颌鲚、20尾湖鲚和12尾刀鲚

1.2引物设计、PCR扩增和测序

使用的标记为前期靶基因富集研究中发现的SNP分子标记。在定居型的短颌鲚和洄游型的刀鲚之间我们共发现了120个分子标记位点，其中有68个Fst分化指数为1的位点。从68个标记位点中随机挑选20个用于引物设计(表2)。在湖鲚和刀鲚之间我们发现了21个分子标记位点，按照Fst分化指数的由高到低和P值显著性挑选了10个用于设计引物(表3)。PCR反应体系为25μl，包括2x Taq Master Mix 12.5μl(Taq酶，dNTP Mix和MgCl₂)、DNA样品1μl、左右引物各0.5μl，最后使用ddH₂O补充到25μl。反应程序为：94℃预变性5min，30～35个循环：94℃变性30s、退火温度为每对左右引物的平均数45s、72℃延伸60s，循环结束，72℃延伸7min。每个样品PCR产物使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况，将扩增出的PCR目标产物送至上海生物工程公司单向测序。

1.3数据分析

使用CondonCodeAligner6.0.2软件(http://www.codoncode.com/aligner/download.htm)对测序结果进行初步的处理，进行人工校正。根据软件显示的峰值图，将序列中含有杂峰的数据删除，保留下的数据将前后段10～20bp的序列删除，以确保数据的准确性。最后，将所有生工测序的数据与设计引物所用的数据合并，用MEGA7进行比对，验证所得数据的变异位点是否与最初设计引物的数据的变异位点相一致。

将测序验证后的序列用MEGA7软件分析基因序列的变异位点(SNP位点)，对比测序后的数据峰图，找到峰值图中对应MEGA7序列里观察到的变异位点，统计每个位点的基因型，最后计算每个位点的等位基因频率(％)。

对于刀鲚和湖鲚之间的10个分子标记，根据处理过的测序结果，我们统计了以下参数：SNP位点的名称、刀鲚和湖鲚在SNP位点处的基因型。由于该鱼为二倍体，纯合位点记为两个相同的碱基，杂合位点则记为两个不同的碱基，以此计算等位基因频率。

本实验随机测序了10尾预先了解来源信息的湖鲚和刀鲚的样本，使用基因频率的数据判断该10个样本是刀鲚还是湖鲚，用于验证这些分子标记是否可以用于实践中判别刀鲚或湖鲚的生态型。针对每个样本扩增8个(以下实验结果成功的标记位点)共有分子标记，当只使用1个分子标记时，例如，一个分子标记含有一个SNP位点，由于并不知道该序列样本是湖鲚还是刀鲚，所以根据等位基因频率，分别计算此样本是湖鲚或刀鲚的基因型频率，若湖鲚的基因型频率高则支持此样本为湖鲚。假如一个分子标记含有两SNP位点，那么分别独立的计算两次湖鲚和刀鲚的基因型频率，然后相乘得到一对综合数值进行比较判断。我们将10尾刀鲚和湖鲚的样本分别进行判断，验证准确率＝判断正确次数/判断总次数*100％。当使用2个分子标记时，先独立的计算第二个分子标记的基因型频率，将所得的数值乘以第一个分子标记的基因型频率，然后再判断要验证的10尾鱼，再次计算验证准确率(％)。由此推广到使用3个、4个…8个分子标记时的验证准确率。

另外，我们列出了10尾刀鲚和湖鲚样本的基因型(表6)，并计算当使用8个SNP分子标记时，每尾鱼是湖鲚或刀鲚的判别概率。

表2用于区分短颌鲚与刀鲚的20个SNP分子标记的引物

表3区分湖鲚和刀鲚的10个SNP分子标记的引物

2结果

2.1短颌鲚和刀鲚

将经过手工检查的测序结果与设计引物所用的序列合并，用MEGA7进行比对后，验证了所得数据的变异位点与最初设计引物的数据的变异位点是相一致的。用于测试区分短颌鲚和刀鲚的20对引物平均在13尾短颌鲚和11尾刀鲚样本中成功扩增。用于测试区分湖鲚和刀鲚的10对引物只有8对引物成功扩增，平均获得17尾湖鲚和11尾刀鲚的数据，另外2对引物扩增出的序列经2次测序都为杂峰。

用于区分短颌鲚和刀鲚的20个分子标记中有一个没有观察到SNP位点，其它19个标记序列在进行人工校正和比对后发现，19个SNP分子标记可以将短颌鲚和刀鲚完全区分开，其中16个分子标记在短颌鲚和颌刀鲚中都是100％纯合的。部分基因存在2～3个SNP位点(表4)。

表4 20个SNP分子标记的基因频率

2.2湖鲚和刀鲚

用区分湖鲚和刀鲚的10对引物，成功扩增出了8个SNP分子标记，其中引物编号为Ct-Cn_eif2b4的分子标记含有2个SNP位点。湖鲚的等位基因频率范围在3％～95％，刀鲚的基因频率范围为0％～100％(表5)。其中引物编号Ct-Cn_wtap的分子标记在湖鲚和刀鲚之间的基因频率相差最大分别为5％和100％、95％和0，最有可能将湖鲚和刀鲚区分开。

表5 10个SNP分子标记的基因频率

为了检验用于区分湖鲚与刀鲚的8个分子标记的实际应用效果，随机验证10尾湖鲚或刀鲚的测试样本，使用表5的信息鉴定湖鲚与刀鲚物种，与实际的情况进行对比。例如，当使用Ct-Cn_abcb7这个分子标记时(表5)，我们随机测取的一尾鱼样本的基因型，假设测定的结果为AA，那么它是湖鲚和刀鲚的可能性分别为0.0289(＝0.17*0.17)和0.1444(＝0.38*0.38)等等。所以，我们分别使用总数为1、2、3…8个分子标记，检验10尾混合湖鲚与刀鲚样本的准确率。结果发现，验证准确率可以达到100％(图28)。当使用前5个分子标记Ct-Cn_abcb7、Ct-Cn_gcn1l1、Ct-Cn_spon2b、Ct-Cn_med23和Ct-Cn_mtf1时，准确率并没有上升；当加入分子标记Ct-Cn_eif2b4时，明显发现判断准确率提高至80％，证明分子标记Ct-Cn_eif2b4区分度性更高，当加入Ct-Cn_wtap时，混合样本的判断准确率高达100％(图28、表6)。

表6列出了10尾刀鲚和湖鲚待验证样本的基因型频率及判别概率(将湖鲚和刀鲚的基因型频率乘积相加为总和，计算湖鲚和刀鲚各自所占总和的比例，作为判别概率)。当使用8个SNP分子标记时，每个样本的基因频率乘积出现了明显的差别。若为湖鲚样本，刀鲚样本的基因型乘积都为0；若为刀鲚样本，湖鲚样本的基因型频率乘积远远的小于刀鲚。结果表明湖鲚和刀鲚样本的判别概率都可以达到或接近100％(表6)。

表6基于8个SNP分子标记测取的10个样本的判别概率(％)

3结论

本发明成功扩增出区分短颌鲚和刀鲚、湖鲚和刀鲚的分子标记。我们将此次扩增出的所有分子标记，与设计引物的分子标记数据使用MEGA进行重新比对，也成功的验证了我们扩增出的SNP位点与我们之前研究发现的位点相一致。区分短颌鲚和刀鲚的20对分子标记中19对可以直接用于实验鉴定，鉴定准确率为100％。区分湖鲚和刀鲚的8对分子标记，经过实验验证发现，当加入分子标记Ct-Cn_eif2b4和Ct-Cn_wtap分析时，验证准确率得到提升，可以达到100％。根据我们的测试样本结果，不建议使用Ct-Cn_abcb7、Ct-Cn_gcn1l1、Ct-Cn_spon2b、Ct-Cn_med23和Ct-Cn_mtf1分子标记，因为这几个分子标记的基因频率没有较大的偏差倾向。例如，引物编号为Ct-Cn_abcb7的分子标记，在湖鲚和刀鲚中，A的基因频率分别为17％和38％，所占的比例都偏小，G的基因频率分别为83％和62％，所占的比例都偏高，所以即使共同使用以上几个位点也不能够提高验证准确率。我们最后使用的10尾验证样本表明，若只使用Ct-Cn_eif2b4和Ct-Cn_wtap这2个基因频率相差大的位点共同判断，得到的判别准确率可以达到100％(图28和表6)。因此，我们推荐使用引物编号为Ct-Cn_eif2b4和Ct-Cn_wtap的分子标记。

基于开发的两组SNP分子标记位点，我们可以快速高效地区分湖鲚和刀鲚、短颌鲚和刀鲚。从市场安全上来讲，应用这些位点可以检测到用湖鲚冒充刀鲚的行为。从资源利用和保护上来说，鄱阳湖是刀鲚的一个重要的产卵场，通过标记位点的检测，我们可以区分刀鲚和短颌鲚的产卵场，更有利准确地调查刀鲚资源，针对性地保护洄游型刀鲚幼苗和产卵群体。此外，短颌鲚生活在长江中上游的一些淡水湖泊中，这些湖泊位于经济高度发达地区，受人类活动的影响较严重，而短颌鲚与刀鲚互为有效种，因此我们建议短颌鲚的保护问题也应该受到更多的关注，参照我们的研究成果，可以更好地指导鲚属鱼类资源的进一步恢复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海洋大学

<120> 用于鉴定短颌鲚、湖鲚和刀鲚的SNP分子标记及其应用

<130> /

<160> 54

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 67

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 1

cttcgggacg ctgccctcgc tgcggtccct ctcgctagac cacaacaaca ttctccttca 60

tcacgcc 67

<210> 2

<211> 67

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 2

cttcgggacg ctgccctcgc tgcggtccct ctcgctagac cacaacaaca ttttccttca 60

tcacgcc 67

<210> 3

<211> 250

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 3

aagtccatca tgctgcagaa gctccagaac ctgtggtcaa agagggagct ggacaccaga 60

gcaaagttct tcttcaagtt ccggtgccgg atgttcagcg ccttcaagga gacagacgag 120

atctccctca aagacctcat cttcaagcac aactgctacc ctgacatgga cccagacaac 180

gaggtgttca gctacatcct gaggttccct gagactgtca tattcacgtt tgatggctac 240

gatgagatcc 250

<210> 4

<211> 250

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 4

aagtccatca tgctgcagaa gctccagaac ctgtggtcaa agagggagct ggacaccaga 60

gcaaagttct tcttcaagtt ccggtgccgg atgttcagcg ccttcaagga gacagacgag 120

atctccctca aagacctcat cttcaagcac aactgctacc cagacatgga cccagacaac 180

gaggtgttca gctacatcct gaggttccct gagactgtca tattcacgtt tgatggctac 240

gatgagatcc 250

<210> 5

<211> 251

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 5

gttctctatc ggaggtccaa gtcgctatat ggcccatcac ccagtcataa ccaatggagc 60

ttacaacagc cttttgagca acacttctcc acaagcttac cctgccgccg gttacccata 120

cacgcagcag tatggccacg cgtaccaagg agcggctttt taccagttct cgtcggcgca 180

agctggactg gtccccggca aagcccaagt ttacctctgc aacagggcgt tatggctaaa 240

gtttcacaga c 251

<210> 6

<211> 251

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 6

gttctctatc ggaggtccaa gtcgctatat ggcccatcac ccagtcataa ccaatggagc 60

ttacaacagc cttttaagca acacttctcc acaagcttac cctgccgccg gttacccata 120

cacgcagcag tatggccacg cgtaccaagg agcggctttt taccagttct cgtcggcgca 180

agctggactg gtccccggca aagcccaagt ttacctctgc aacagggcgt tatggctaaa 240

gtttcacaga c 251

<210> 7

<211> 158

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 7

ctaggtatct gagagctgtt ttggccaacg acagcatgtt gggacaacta ttatctagat 60

tgagcgatgt gaacggcatg aaattttcta cttcactttt ccagggttca gagaagaacg 120

accacgatta tgccataccc aaaaagaggg taaaggtg 158

<210> 8

<211> 158

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 8

ctaggtatct gagagctgtt ttggccaacg acagcatgtt gggacaactg ttatctagat 60

tgagcgatgt gaacggcatg aaattttcta cttcactttt ccagggttca gagaagaacg 120

accacgatta tgccataccc aaaaagaggg taaaggtg 158

<210> 9

<211> 170

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 9

aggattgcgc tatgaccagg cgccatccca agcgcttctg tcagagctgc aaccgtccgc 60

tgccgccgtc cagcaggcag tggtgccccc ctctgtgggc ctgcccatgc acatcgcccc 120

tcagatggag ctgcaggcct ccgccaccac tgcccccccg cagttcgtcc 170

<210> 10

<211> 170

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 10

aggattgcgc tatgaccagg cgccatccca agcgcttctg tcagagctgc aaccgtccgc 60

tgccgccgtc cagcaggcag tggtgccccc ctctgtaggc ctgcccatgc acatcgcccc 120

tcagatggag ctgcaggcct ccgccaccac tgcccccccg cagttcgtcc 170

<210> 11

<211> 108

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 11

tggtgaacga gaagtgccgc atcgacacgg aactcctgcc gtcgctcttc atgcgctaca 60

ccaccgatcc cgtgcgccga gacaagtacc cgtccgtcac acacctca 108

<210> 12

<211> 108

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 12

tggtgaacga gaagtgccgc atcgacacgg aactcctgcc gtcgctcttc atgcgctaca 60

ccaccgaccc cgtgcgccga gacaagtacc cgtccgtcac acacctca 108

<210> 13

<211> 110

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 13

ttggcagccc tccactatca ggagggacgc ccccgctgga cgcaaggtcg gtctcatcgc 60

tgcccgtcgt actggcagac tgcgtggaac aaagaccgtc caggacaaga 110

<210> 14

<211> 110

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 14

ttggcagccc tccaccatca ggagggacgc cccagctgga cgcaaggtcg gtctcatcgc 60

tgcccgtcgt actggcagac tgcgtggaac aaagaccgtc caggacaaga 110

<210> 15

<211> 96

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 15

atgccccggg ccgcgaggac aacaccttca aagaccgacc ttcggagtcc gacgagctac 60

agaccatcca ggagcacagc ggagctggta cggaga 96

<210> 16

<211> 96

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 16

atgccccggg ccgcgaggac aacaccttca aagaccgacc ttcggagtcc gatgagctac 60

agaccatcca ggagcacagc ggagctggta cggaga 96

<210> 17

<211> 152

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 17

accacgagaa ggagtggaag ctgggcaagg ccatcctgcg cttccccgaa atcctgcaga 60

agatcctgga cgacctgctc ctgcacacgc tctgcgacta cctgtacgag ctcgccacca 120

ccttcaccga gttctacgac agctgttact gc 152

<210> 18

<211> 152

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 18

accacgagaa ggagtggaag ctgggcaagg ccatcctgcg cttccccgag atcctgcaga 60

agatcctgga cgacctgctc ctgcacacgc tctgcgacta cctgtacgag ctcgccacca 120

ccttcaccga gttctacgac agctgttact gc 152

<210> 19

<211> 143

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 19

cactgacggc ccactggcta gtgtacgaca tgttcgactt tgagaatgtg ggcttcacca 60

aggatgtggg gaaaataaag tacctcatat gtgcagattg tgaaattgga cccattggtt 120

ggcactgttt agacgacaag aaa 143

<210> 20

<211> 143

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 20

cactgacggc ccactggcta gtgtacgaca tgttcgactt tgagaacgtg ggcttcacca 60

aggatgtggg gaaaataaag tacctcatat gtgcagattg tgaaattgga cccattggtt 120

ggcactgttt agacgacaag aaa 143

<210> 21

<211> 147

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 21

tctctcgtat cgtggacgac ctgaaggacg aggcggagca gtacaggaag atggtgatgg 60

agaccattga gaagatcatg ggcaacctgg gtgccgcaga catcgaccac aagctggagg 120

agcagcttat cgacggcatc ctctaca 147

<210> 22

<211> 147

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 22

tctctcgtat cgtggacgac ctgaaggacg aggcggagca gtacaggaag atggtgatgg 60

agaccatcga gaagatcatg ggcaacctgg gtgccgcaga catcgaccac aagctggagg 120

agcagctcat cgacggcatc ctctaca 147

<210> 23

<211> 93

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 23

cctggaccag ttcatgcaca tcgtcaaggg ctcgctggag aacgtgcggg tcatgctggt 60

gcccagtcca cgctacctgg gcctgcagaa tga 93

<210> 24

<211> 93

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 24

cctggaccag ttcatgcaca tcgtcaaggg ctcgctggag aatgtgcggg tcatgctggt 60

gcccagtcca cgctacctgg gcctgcagaa tga 93

<210> 25

<211> 117

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 25

gcggctacta cgccctgcgc agcctgcgca tcgagaagtt cttcgcattc tggggccagg 60

acctcgactc cttcaccacg ccgctggagt gcggccggga gttcagggtc aaatttg 117

<210> 26

<211> 117

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 26

gcggctacta cgccctgcgc agcctgcgca tcgagaagtt cttcgcgttc tggggccagg 60

acctcgactc cttcaccacg ccgctggagt gcggccggga gttcagggtc aaatttg 117

<210> 27

<211> 88

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 27

tgatgaccag atagtagatc tgaaacttca tgatgaatgg gaggataagt gcatacccag 60

tggtggtgct gaatttaaga aggatgaa 88

<210> 28

<211> 88

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 28

tgatgaccag atagtagatc taaaacttca tgatgaatgg gaggataagt gcatacccag 60

tggtggtgct gaatttaaga aggatgaa 88

<210> 29

<211> 301

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 29

cgacgggcag ctgggcttct ccgcctccac gttggacgcg tcggcgctgg gccaggacgg 60

cgccgggcag atccagatcc tgcccgacgg cagccaggcc atcagcgtgt cgtcggccag 120

cgacctcctc agcaaccacc agaacctcat atcacagact ggccacgtcc agcagatcca 180

gggagtgtct ctgggcagct ctgcctttgg cagccaaggt caggttgtca ctaatgtgcc 240

tgtgggcttg cccgggaaca tcaccttcgt ccccatcaac agcgtggacc tggactcgtt 300

a 301

<210> 30

<211> 301

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 30

cgacgggcag ctgggcttct ccgcctccac gctggacgcg tcggcgctgg gccaggacgg 60

cgccgggcag atccagatcc tgcccgacgg cagccaggcc atcagcgtgt cgtcggccag 120

cgacctcctc agcaaccacc agaacctcat atcacagact ggccacgtcc agcagatcca 180

gggagtgtct ctgggcagct ctgcctttgg cagccaaggt caggttgtca ctaatgtgcc 240

tgtgggcttg cccgggaaca tcaccttcgt ccccatcaac agcgtggacc tggactcgtt 300

a 301

<210> 31

<211> 144

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 31

ctacgcgctg tccctgatgc gctcgcacaa cgacgagcac tcggacgtgc tgcctgtgct 60

ggacgtgtgc tcgctcaagc acgtggccta cgtcttccag gcgctcatct actggatcaa 120

ggccatgaac cagcagacca cgct 144

<210> 32

<211> 144

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 32

ctacgcgctg tccctgatgc gctcgcacaa cgacgagcac tcggacgtgc tgcccgtgct 60

ggacgtgtgc tcgctcaagc acgtggccta cgtcttccag gcgctcatct actggatcaa 120

ggccatgaac cagcagacca cgct 144

<210> 33

<211> 92

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 33

gcttccacgt gctcaacatc ggcctgcaca gcgtcatatc ggcgctaatg atggacgtgt 60

ttgcaatatt aatcggcggc ttggcctacg ac 92

<210> 34

<211> 92

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 34

gcttccacgt gctcaacatc ggcctgcaca gcgtcatatc ggcgctaatg atggacgtgt 60

ttgcaatatt aatcggcggc ctggcctacg ac 92

<210> 35

<211> 132

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 35

cttctggatt gccctggcaa gcagatgact agatgttgca gtgtggacaa tggtctcaat 60

gttcagaact ccccattcac ctcccacctt agcacttacg caaacagcaa ggggctctcc 120

agtactctta ga 132

<210> 36

<211> 132

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 36

cttctggatt gccctgacaa gcagatgact agatgttgca gtgtggacaa tggtctcaat 60

gttcagaact ccccattcac ctcccacctt agcacttacg caaacagcaa ggggctctcc 120

agtactctta ga 132

<210> 37

<211> 125

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 37

tggagtcacc tgacactgca caagtccacc cacaccatct cagaccccgt ctgtcctatg 60

tgcctcaaga agttctccag ggtggccagc ctcaaggccc acattatgct ccacgagaaa 120

gaaga 125

<210> 38

<211> 125

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 38

tggagtcacc tgacactgca caagtccacc cacaccacct cagaccccgt ctgtcccatg 60

tgcctcaaga agttctccag ggtggccagc cttaaggccc acattatgct ccacgagaaa 120

gaaga 125

<210> 39

<211> 203

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 39

taaggtggca gagcgaggga accactcaac cctgctggcc acccccggca gcctgtacgc 60

ggacctgtgg aacacgcaga acaaccgcgt cctgaacggg gcagcagggg gcgctgtggg 120

cggagaggtg gagacggagc agctgtccaa gaaggaggag gagcgcaaga agctccagga 180

ggagatcctg aacagcgtca agg 203

<210> 40

<211> 203

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 40

taaggtggca gagcgaggga accactcaac cctgctggcc acccccggca gcctgtacgc 60

ggacctgtgg aacacgcaga acaaccgcgt cctgagcggg gcagcagggg gcgctgtggg 120

cggagaggtg gagacggagc agctgtccaa gaaggaggag gagcgcaaga agctccagga 180

ggagatcctg aacagcgtca agg 203

<210> 41

<211> 219

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 41

atcactccca tcctgttgga cgccctgact gacccctctc acaagactca gcactgcctg 60

cagacgctgc tggagaccaa gtttgtgcac ttcatcgacg cgccctccct cgccctcatc 120

atgcccatcg tccagcgcgc cttccaggac cgctccactg acacccgcaa gatggccgcc 180

cagatcatag gcaacatgta ctctctcacc gaccagaag 219

<210> 42

<211> 219

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 42

atcactccca tcctgttgga cgccctgact gacccctctc acaagactca gcactgcctg 60

cagacgctgc tggagaccaa gtttgtgcac ttcatcgatg cgccctccct cgccctcatc 120

atgcccatcg tccagcgcgc cttccaggac cgctccactg acacccgcaa gatggccgcc 180

cagatcatag gcaacatgta ctctctcacc gaccagaag 219

<210> 43

<211> 213

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 43

actcacagtt cggactacca catctggcaa agtgatgagt atgccagcaa cggggtgagg 60

gagtttacgg agaaggggga agcgtggaca ctaataaacg aagtggaggc ggcgggggaa 120

aagatccaaa gtgtctacgg cttattctct gcacctgctg tgctggacgg gactggccag 180

acaaactcag agttcgaggt ctttgcgaga cac 213

<210> 44

<211> 213

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 44

actcacagtt cggactacca catctggcaa agtgatgagt atgccagcaa cggggtgagg 60

gagtttacgg agaaggggga agcgtggaca ctaataaatg aagtggaggc ggcgggggaa 120

aagatccaaa gtgtctacgg cttattctct gcacctgctg tgctggacgg gactggccag 180

acaaactcag agttcgaggt ctttgcgaga cac 213

<210> 45

<211> 192

<212> DNA

<213> 鲚属（coilia）

<400> 45

agaacaacgt tcctcaggag agccgcttca acctgaagaa gaacgtggag gaggagtaca 60

ggaagtggaa gtccatgacc aacgagaacg acatcatcac ccacttctcc atgcagggct 120

cccctccgct cttcctgtgt ctgctgtgga agatgctgct ggagaccgac cacatcaacc 180

aaatcggatt ca 192

<210> 46

<211> 192

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 46

agaacaacgt tcctcaggag agccgcttca acctgaagaa gaacgtggag gaggagtaca 60

ggaagtggaa gtccatgacc aacgagaacg acatcatcac ccacttctcc atgcagggct 120

ccccgccgct cttcctgtgt ctgctgtgga agatgctgct ggagaccgac cacatcaacc 180

aaatcggatt ca 192

<210> 47

<211> 192

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 47

gaggaggaag gggatggcgc gctggtgttc atgggcgacc cagagggcat ggcgcagggc 60

tacgtgcacc acaccatctc gcccgaccag atccagttca ccatcaaccc aggctccacg 120

cccatgccgc ggaacatcga gggggccaca ctcacactgc actcagagtg cccagagacc 180

aagcagagag ag 192

<210> 48

<211> 192

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 48

gaggaggaag gggatggcgc gctggtgttc atgggcgacc cagagggcat ggcgcacggc 60

tacgtgcacc acaccatctc gcccgaccag atccagttca ccatcaaccc aggctccacg 120

cccatgccgc ggaacatcga gggggccaca ctcacactgc actcagagtg cccagagacc 180

aagcagagag ag 192

<210> 49

<211> 85

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 49

tccagatcgc cctggttgcc aaggcctaca atgtgccagt gctggtgtgc tgtgagacgt 60

acaagttctg tgaacgagtg caaaa 85

<210> 50

<211> 85

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 50

tccagatcgc cctggttgcc aaggcctaca acgtgccagt gctggtgtgc tgtgagacgt 60

acaagttctg tgaacgagtg caaaa 85

<210> 51

<211> 136

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 51

aggatcctgc actccaaggg ggagttgagt gaggaccggc ataagcagta tgaggagttt 60

gccacctcct atcagaagct gctggccaac acccagactc tggcagacct gctggatgag 120

aatatgcctg aactga 136

<210> 52

<211> 136

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 52

aggatcctgc actccaaggg ggagttgagt gaggaccggc ataagcagta tgaggagttt 60

gccacctcct accagaagct gctggccaac acccagactc tggcagacct gctggatgag 120

aatatgcctg aactga 136

<210> 53

<211> 180

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 53

aatgatgtga cgggactgaa ggagtcggag gagaagttga agcagcaaca gcaggagtct 60

gcgcggcggg agaacattct ggtgatgcgg ctggccacca aggagcagga atctgcgcgg 120

cgggagaaca ttctggtgat gcggctggcc accaaggagc aggagatgca ggagtgcaca 180

<210> 54

<211> 180

<212> DNA

<213> 鲚属（Coilia）

<400> 54

aatgatgtga cgggactgaa ggagtcggag gagaagttga agcagcaaca gcaggagtct 60

gcgcggcggg agaacattct ggtgatgcgg ctggccacca aggagcagga atctgcacgg 120

cgggagaaca ttctggtgat gcggctggcc accaaggagc aggagatgca ggagtgcaca 180

Claims

1.用于鉴定湖鲚和刀鲚的SNP分子标记组合，其特征在于，所述的SNP分子标记组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP分子标记组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示的SNP分子标记组合。

3.一种用于鉴定湖鲚和刀鲚的SNP芯片，其特征在于，所述SNP芯片包含核苷酸序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的SNP分子标记。

4.权利要求1或2所述的SNP分子标记组合在鉴定湖鲚和刀鲚中的应用。

5.检测权利要求1所述SNP分子标记组合的试剂在制备鉴定湖鲚和刀鲚的试剂盒或检测装置中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂包含下表中所示的引物；

。

7.一种鉴定湖鲚和刀鲚的方法，其特征在于，包括如下步骤：根据下表及权利要求1或2中SNP分子标记组合，检测样本对应SNP位点基因型，分别计算湖鲚和刀鲚的基因型频率或基因型频率乘积，将湖鲚和刀鲚的基因型频率或基因型频率乘积相加，计算湖鲚和刀鲚各自所占总和的比例，作为判别概率，判别概率越大，其对应为湖鲚或刀鲚的概率越大；

。