CN114350814A - 基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及养殖长江刀鲚分子标记开发技术领域，具体是基于转录组的长江刀鲚多态性EST‑SSRs的快速识别方法。本发明基于养殖长江刀鲚雌、雄个体的脑转录组数据，从5675条养殖长江刀鲚雌雄转录组共有EST‑SSR序列中筛查到1082个多态性EST‑SSRs(19.07％)，并随机选取20个位点设计特异性PCR扩增引物进行有效性和多态性验证，结果显示，有19对能够扩增出稳定、清晰的条带，其中18对具有多态性(多态率约90％)，检出效率较高且能够有效地评估长江刀鲚不同年份养殖群体的种质资源现状。
Description
技术领域
本发明涉及养殖长江刀鲚分子标记开发技术领域，具体地说，是基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法。
背景技术
刀鲚(Coilia ectenes)，俗称刀鱼、毛刀鱼，在分类学上隶属于鲱形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鲚属(Coilia)，在我国各大水系均能发现其踪迹，其中以长江流域最负盛名，因其鱼体丰腴肥满，肉质细嫩鲜美，曾与鲥鱼、河豚并称为“长江三鲜”，深受消费者的青睐。历史上，我国刀鲚的种质资源极为丰富，然而，近年来，由于酷捕滥渔，水域环境的污染、水文条件的改变、生态环境的恶化及海岸工程建设等诸多因素，其自然种质资源急剧衰退，每年的产量波动很大，且呈现出逐年降低且个体日趋小型化的趋势，甚至不能形成优势种群，其自然种质资源岌岌可危。所幸的是，农业农村部通告要求自2019年2月1日起，将停止发放刀鲚(长江刀鱼)专项捕捞许可证，禁止其天然资源的生产性捕捞；次年又开始实施长江“十年禁渔”的政策；而刀鲚全人工繁育技术和苗种规模化生产技术亦获得了突破性进展，这些举措不仅促进了刀鲚产业化养殖的发展，而且有效地缓解了长江刀鲚野生种质资源锐减的局面。
基于长江刀鲚“十年禁捕”和良种匮乏的现状，开展长江刀鲚良种培育的研究势在必行。而开展刀鲚的遗传改良研究，不仅需要掌握其优良的表型性状，而且需要充分了解其繁育亲本的遗传背景，以保证繁育亲本具有优良生长性状的同时，又能保持丰富的遗传变异，并降低近交衰退发生的机率，促进良种的培育效果，因此开展刀鲚繁育亲本的种质资源评估显得尤为重要。
分子标记由于能够对动物整个基因组的遗传变异进行探究，且相对稳定，不易受到环境的影响而被广泛应用于水产动物的遗传育种研究，其中，微卫星标记(Microsatellite)备受关注。微卫星标记，又称为简单重复序列(Simple SequenceRepeats，SSR)，是指由1-6个核苷酸组成的简单串联重复序列，这些重复序列在重复单位和重复次数上的差异使其具有高度变异性和多态性，被广泛应用于水产动物种质资源评估和鉴定、遗传图谱的构建、QTL定位及分子标记辅助育种等遗传学研究，为水产动物遗传育种工作的开展提供极大的便利。一般而言，基于SSR来源差异，可分为基因组SSR(GenomicSSR，G-SSR)和表达序列标签SSR(Expressed Sequence Tag，EST-SSR)两种类型，前者主要利用磁珠富集法或FIASCO法富集微卫星、构建和筛选基因组文库等方法从基因组序列开发而来，多态性相对较高；后者则主要基于cDNA文库或转录组数据获得的转录序列开发获得，往往与功能基因直接相关，虽然多态性相对g-SSR低，但是保守性和通用性较高。海量的高通量测序数据为水产动物微卫星标记的开发提供了便利条件，同时一大批针对于高通量转录组数据挖掘EST-SSRs的软件(MIcroSAtellite identification tool，MISA)及多态性位点筛选的软件(Simple Sequence Repeat Molecular Marker Developer，SSRMMD)陆续被开发出来，极大的加快了用于水产动物种质资源评估分子标记的开发进程。
但是关于基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法目前还未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法，以解决现有长江刀鲚多态性分子标记匮乏的现状。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法，包括以下步骤：
A)利用Illumina转录组文库构建试剂盒分别构建长江刀鲚雌(n＝6尾)、雄(n＝6尾)群体脑组织的转录组cDNA测序文库，进行高通量转录组测序，测序数据经Trinity软件分别进行组装和去冗余后，获得长江刀鲚雌性转录组Unigenes数据(以下简称CEF.fa)和雄性转录组Unigenes数据(以下简称CEM.fa)；
B)在Linux操作系统下利用MISA软件分别扫描和检索CEF.fa和CEM.fa中的EST-SSRs，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别设置10、6、6、5、5和5；复合SSR两个位点间最大间隔碱基数设置为100；
C)在Linux操作系统下利用SSRMMD软件检索CEF.fa和CEM.fa中完美的EST-SSR位点和候选的多态性EST-SSRs，其中软件运行参数如下所示：perl SSRMMD.pl-f1 CEFM/CEF.fa-f2 CEFM/CEM.fa-p 1-me NW-st 0-t 2；
D)从筛选出来的多态性EST-SSRs中随机选取20条序列，结合长江刀鲚参考基因组序列特征和EST-SSRs两侧保守的侧翼序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性PCR扩增引物，进行标记有效性和多态性检测。
在本发明的具体实施方式中，其步骤如下：
步骤一：基于长江刀鲚雌/雄转录组测序数据，利用MISA软件从长江刀鲚雌/雄转录组测序数据中分别获得了112719条和102643条EST-SSR序列；步骤二：利用SSRMMD软件从这些序列中筛选获得了5675条共有EST-SSRs，并从中鉴定出1082个多态性EST-SSRs；步骤三：随机选取20条EST-SSR序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性PCR扩增引物，进行了引物有效性和多态性的验证，最终筛选出18对多态性EST-SSRs；步骤四：以长江刀鲚不同繁育年份(2018年、2019年和2020年)养殖群为研究对象，利用18对多态性较好EST-SSR引物评估长江刀鲚3个养殖群体的种质资源现状。
进一步的，对获得的多态性EST-SSRs进行有效性和多态性验证，包括以下步骤：
a)取自不同年份(2018年、2019年和2020年)长江刀鲚养殖群体的鳍条组织中，随机选取10个样本，每个样本剪取30mg左右鳍条组织，然后利用天根生化海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324-03)说明书的操作步骤，提取不同养殖长江刀鲚个体的基因组DNA；
b)将随机选取的10个养殖刀鲚的DNA样本，等量混合后，作为后续PCR扩增的模板，在Eppendorf MastercyclerX50s梯度PCR仪器上筛选各引物的最适退火温度；
c)PCR反应体系为10μl，其中包括：长江刀鲚模板DNA1μl，正、反引物(10μM)各0.25μl，2×Taq PCR MasterMix(天根生化，KT201)5μl，然后用ddH2O补足总体积至10μl；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火(48～68℃)30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸10min，4℃∞保存；
d)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶成像系统拍照、保存，确定各引物的最适退火温度和有效性；
e)获得各引物的最适退火温度后，分别从前期保存的2018年、2019年和2020年繁育的刀鲚样本中各随机选取24尾，共计72个样本，每个样本剪取30mg左右鳍条组织，然后利用天根生化海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324-03)说明书的操作步骤，分别提取DNA；
f)EST-SSRs多态性的初步验证：以72个样本DNA为模板，按照之前的PCR扩增体系和反应程序获得PCR产物，PCR产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，利用银染法显色定影，条带显色清晰后用数码相机拍照保存，用于后续的多态性分析；
g)数据处理：利用GenAlEx 6.0软件(Peakall,Smouse,2006)计算长江刀鲚不同年份养殖群体的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)及期望杂合度(He)等遗传多样性参数；利用PIC-Calc 0.6软件计算多态信息含量(Polymorphisminformation content，PIC)；利用MEGA 6.0软件计算不同群体间的UPGMA聚类分析树。
本发明基于长江刀鲚高通量测序获得长江刀鲚雌雄群体的转录组数据，利用MISA软件在长江刀鲚雌雄转录组中广泛通用的基因数据库(universal gene，Unigenes)中搜索EST-SSR位点信息，并利用SSRMMD软件检索数据库中完美的EST-SSR位点和候选的多态性EST-SSRs，最后随机选取20个多态性位点进行有效性和多态性验证，最终筛选获得了18对多态性较好、条带清晰的EST-SSR引物，用于评估长江刀鲚不同繁育年份(2018年、2019年和2020年)养殖群体的种质资源现状。
本发明的第二方面，提供一种采用如上所述的方法获得的长江刀鲚多态性EST-SSR引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.36所示。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的引物在长江刀鲚群体遗传分析、分子标记辅助育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明公开一种能够显著提高养殖长江刀鲚多态性EST-SSRs的检出效率的方法。本发明基于本课题组养殖长江刀鲚雌、雄个体的脑转录组数据，从5675条养殖长江刀鲚雌雄转录组共有EST-SSR序列中筛查到1082个多态性EST-SSRs(19.07％)，并随机选取20个位点设计特异性PCR扩增引物进行有效性和多态性验证，结果显示，有19对能够扩增出稳定、清晰的条带，其中18对具有多态性(多态率约90％)，检出效率较高且能够有效地评估长江刀鲚不同年份养殖群体的种质资源现状。
2、本发明基于养殖长江刀鲚可用于种质资源评估分子标记匮乏的现状，利用生物信息学软件从长江刀鲚转录组中数以万计的EST-SSRs中快速筛选出有多态性EST-SSR，有效地评估了长江刀鲚养殖群体的种质资源现状，结果显示长江刀鲚养殖群体伴随着繁育年份的增加，遗传多样性逐年降低，这就警示我们在后续的繁育过程中要增加有效群体数量。
3、此外，本发明的亦可用于长江刀鲚性别相关EST-SSRs的筛选、不同生长表型显著相关EST-SSRs的筛选等方面的研究，所开发的多态性EST-SSR对于长江刀鲚群体遗传分析、分子标记辅助育种亦具有重要的参考价值。本发明筛选到的引物准确度高、稳定性强，且操作简便，成本低廉、易于大范围推广应用。
附图说明
图1为部分EST-SSR引物PCR产物电泳图谱。
图2为基于EST-SSR标记的3个长江刀鲚养殖群体的UPGMA聚类分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
1.长江刀鲚转录组数据来源
转录组数据基于本课题组于2019年在奉贤科研基地以二龄长江刀鲚(雌、雄各六尾)为研究材料，分别剪取脑组织后，利用Illumina转录组文库构建试剂盒分别构建长江刀鲚雌分别进行转录组测序和组装，测序数据经Trinity软件分别组装和去冗余后，分别获得长江刀鲚雌性转录组Unigenes数据(以下简称CEF.fa)和雄性转录组Unigenes数据(以下简称CEM.fa)。
2.长江刀鲚转录组EST-SSR位点分布特征及多态性EST-SSRs数量特征
利用MISA软件分别从长江刀鲚CEF.fa和CEM.fa数据库中分别获得了112719条和102643条EST-SSR序列，其中，二核苷酸重复类型最多，分别占59.04％和57.57％；单核苷酸重复次之，分别占27.47％和28.67％；其余碱基重复类型的数量相对较少，且伴随着碱基重复类型次数的增加而减少，同时基于SSRMMD软件的搜索分析结果可看出，多态性EST-SSRs的数量亦伴随着碱基重复类型次数的增加而逐级减少；可见长江刀鲚转录组中EST-SSR的类型极为丰富，从单核苷酸到六核苷酸均有分布，但主要集中在单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸(见表1)。多态性EST-SSRs相对较少，一方面是由于试验样本取自多年繁育的养殖群体，遗传纯度较高；另一方面是由于SSRMMD软件设计的参数较为严格导致多态性位点检出率降低，但是引物质量较好。
表1.长江刀鲚雌/雄转录组及多态性EST-SSRs信息
3.长江刀鲚多态性EST-SSRs的有效性和多态性验证
从筛选出来的多态性EST-SSRs中随机选取20条序列，结合长江刀鲚参考基因组序列特征和多态性EST-SSRs两侧保守的侧翼序列，利用Primer Premier5.0软件设计特异性PCR扩增引物，进行标记有效性和多态性检测。
将取自不同年份(2018年、2019年和2020年)长江刀鲚养殖群体的鳍条样本，利用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324-03)提取基因组DNA，随机选取10个DNA样本等量混合后，作为后续PCR扩增的模板，在Eppendorf Mastercycler X50s梯度PCR仪器上筛选各引物的最适退火温度。PCR反应体系为10μl，其中包括：模板DNA 1μl，正、反引物(10μM)各0.25μl，2×Taq PCR MasterMix(天根生化，KT201)5μl，然后用ddH2O补足总体积至10μl；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火(48～68℃)30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸10min，4℃∞保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶成像系统拍照、保存，确定各引物的最适退火温度和有效性。同时每个群体随机选取4个DNA样本，分别对20对EST-SSR引物进行PCR扩增后，利用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染法显色定影，条带显色清晰后用数码相机拍照保存，用于后续的初步的多态性分析。
结果显示，20对EST-SSR引物中，除了1对没有扩增产物外，其余19对EST-SSR引物扩增得到预期大小的PCR产物，有效扩增率为95％；非变性聚丙烯凝胶电泳作为SSR标记检测的经典方法，结果显示有18对引物具有较好的多态性，占有效扩增引物的94.7％。
18对多态性EST-SSR引物信息，见下表2。
表2.18对多态性EST-SSR引物信息
4.长江刀鲚不同年份养殖群体的种质资源评估
长江刀鲚养殖群体种质资源评估样品分别取自本单位奉贤科研基地2018年、2019年和2020年长江刀鲚繁育群体，每个群体随机选取24尾，剪取尾鳍后置于95％酒精中保存，用于后续基因DNA的提取。
利用天根生化海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取长江刀鲚不同年份养殖刀鲚的基因组DNA；样品DNA利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测质量，利用NanoVue Plus分光光度计检测样本DNA的浓度和纯度，选取DNA无降解且A260/A280比值在1.8左右的DNA样品，稀释至50ng/μl后置于-20℃冰柜中保存备用。
长江刀鲚3个养殖群体总共72个样本对18对多态性EST-SSR引物在EppendorfMastercyclerX50s梯度PCR仪器上进行PCR扩增。PCR反应体系为10μl，其中包括：模板DNA 1μl，正、反引物(10μM)各0.25μl，2×Taq PCR MasterMix(天根生化，KT201)5μl，然后用ddH2O补足总体积至10μl；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，退火(表2中最适退火温度)30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸10min，4℃∞保存。利用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染法显色定影，条带显色清晰后用数码相机拍照保存，用于后续的初步的多态性分析。
数据处理：利用GenAlEx 6.0软件(Peakall，Smouse，2006)计算长江刀鲚不同年份养殖群体的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)及期望杂合度(He)等遗传多样性参数；利用PIC-Calc 0.6软件计算多态信息含量(Polymorphism informationcontent，PIC)；MEGA 6.0软件计算不同群体间的UPGMA聚类分析树。
长江刀鲚不同年份养殖群体的遗传多样性分析结果显示，长江刀鲚三个年份养殖群体的遗传多样性较好，但是伴随着繁育年份的增加，各遗传多样性参数呈现出逐年降低的趋势，特别是2020年的繁育群体遗传多样性降低的幅度较大(见表3)。
表3.长江刀鲚不同年份养殖群体的遗传多样性参数
长江刀鲚不同年份养殖群体的遗传距离和遗传相似系数的结果显示，长江刀鲚2018年养殖群体的遗传距离和2020年的遗传距离最大(0.1487)，遗传相似性最低(0.8618)；和2019年养殖群体的遗传距离最小(0.1047)，遗传相似性最高(0.9006)(见表4)；基于Nei’s遗传距离构建的长江刀鲚不同年份养殖群体的UPGMA聚类分析图亦显示，长江刀鲚2018年养殖群体先与长江刀鲚2019年养殖群体聚为一支，然后与长江刀鲚2020年养殖群体聚为一支(见图2)。
表4.长江刀鲚不同年份养殖群体的遗传相似系数(左下角)和遗传距离(右上角)
长江刀鲚不同年份养殖群体的遗传分化指数的结果显示，长江刀鲚不同年份养殖群体间存在不同程度的遗传分化，两两群体间均处于中等程度的遗传分化(0.05<FST<0.15)，遗传分化程度呈现出伴随着繁育年代的增加而加大的趋势(见表5)。
表5.长江刀鲚两两群体间的遗传分化指数(FST)
长江刀鲚不同年份养殖群体的AMOVA分子方差分析的结果显示，长江刀鲚不同年份养殖群体的大部分遗传变异来源于不同群体内个体间/内的遗传差异(～89.57％)，仅有10.43％的遗传变异来源于群体间的遗传差异(见表6)。
表6.长江刀鲚不同群体间AMOVA分子方差分析
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海市水产研究所（上海市水产技术推广站）
<120> 基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 34
aacttaaagg taactccact g 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 35
aaagaaaaga atgggaaaa 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 36
ctgagcagct actgtggag 19
Claims (4)
1.基于转录组的长江刀鲚多态性EST-SSRs的快速识别方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)利用Illumina转录组文库构建试剂盒分别构建长江刀鲚雌、雄群体脑组织的转录组cDNA测序文库，进行高通量转录组测序，测序数据经Trinity软件分别进行组装和去冗余后，获得长江刀鲚雌性转录组Unigenes数据，以下简称CEF.fa，和雄性转录组Unigenes数据，以下简称CEM.fa；
B)在Linux操作系统下利用MISA软件分别扫描和检索CEF.fa和CEM.fa中的EST-SSRs，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别设置10、6、6、5、5和5；复合SSR两个位点间最大间隔碱基数设置为100；
C)在Linux操作系统下利用SSRMMD软件检索CEF.fa和CEM.fa中完美的EST-SSR位点和候选的多态性EST-SSRs，其中软件运行参数如下所示：perl SSRMMD.pl-f1 CEFM/CEF.fa-f2 CEFM/CEM.fa-p 1-me NW-st 0-t 2；
D)从筛选出来的多态性EST-SSRs中随机选取20条序列，结合长江刀鲚参考基因组序列特征和EST-SSRs两侧保守的侧翼序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性PCR扩增引物，进行标记有效性和多态性检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有效性和多态性检测，包括以下步骤：
a)取自不同年份长江刀鲚养殖群体的鳍条组织中，随机选取10个样本，每个样本剪取30mg左右鳍条组织，然后提取不同养殖长江刀鲚个体的基因组DNA；
b)将随机选取的10个养殖刀鲚的DNA样本，等量混合后，作为后续PCR扩增的模板，在Eppendorf MastercyclerX50s梯度PCR仪器上筛选各引物的最适退火温度；
c)PCR反应体系为10μl，其中包括：长江刀鲚模板DNA 1μl，10μM正、反引物各0.25μl，2×Taq PCR MasterMix 5μl，然后用ddH2O补足总体积至10μl；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸10min，4℃∞保存；
d)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶成像系统拍照、保存，确定各引物的最适退火温度和有效性；
e)获得各引物的最适退火温度后，分别从前期保存的2018年、2019年和2020年繁育的刀鲚样本中各随机选取24尾，共计72个样本，每个样本剪取30mg左右鳍条组织，然后分别提取DNA；
f)EST-SSRs多态性的初步验证：以72个样本DNA为模板，按照之前的PCR扩增体系和反应程序获得PCR产物，PCR产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，利用银染法显色定影，条带显色清晰后用数码相机拍照保存，用于后续的多态性分析；
g)数据处理：利用GenAlEx 6.0软件计算长江刀鲚不同年份养殖群体的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)及期望杂合度(He)等遗传多样性参数；利用PIC-Calc 0.6软件计算多态信息含量；利用MEGA 6.0软件计算不同群体间的UPGMA聚类分析树。
3.一种采用如权利要求1或2所述的方法获得的长江刀鲚多态性EST-SSR引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.36所示。
4.一种如权利要求3所述的引物在长江刀鲚群体遗传分析、分子标记辅助育种中的应用。
Priority Applications (1)
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107190097A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-09-22 | 贵州大学 | 利用转录组测序的ssr分子标记鉴定火龙果种质的方法 |
| CN107517897A (zh) * | 2017-09-30 | 2017-12-29 | 上海市水产研究所 | 长江刀鲚室内苗种培育早期清除晶囊轮虫的方法 |
| CN108315442A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-07-24 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种黄唇鱼微卫星dna标记及其筛选方法 |
| CN111455088A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-07-28 | 中国水稻研究所 | 层出镰刀菌ssr分子标记及其应用 |
| CN113151545A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-07-23 | 北京市农林科学院 | 基于彩色组马蹄莲多个转录组序列所开发的ssr引物组及获取方法和应用 |
-
2021
- 2021-12-27 CN CN202111610324.3A patent/CN114350814A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107190097A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-09-22 | 贵州大学 | 利用转录组测序的ssr分子标记鉴定火龙果种质的方法 |
| CN107517897A (zh) * | 2017-09-30 | 2017-12-29 | 上海市水产研究所 | 长江刀鲚室内苗种培育早期清除晶囊轮虫的方法 |
| CN108315442A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-07-24 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种黄唇鱼微卫星dna标记及其筛选方法 |
| CN111455088A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-07-28 | 中国水稻研究所 | 层出镰刀菌ssr分子标记及其应用 |
| CN113151545A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-07-23 | 北京市农林科学院 | 基于彩色组马蹄莲多个转录组序列所开发的ssr引物组及获取方法和应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| D.-A. FANG等: "Screening potential SSR markers of the anadromous fish Coilia nasus by de novo transcriptome analysis using Illumina sequencing", GMR, vol. 14, no. 4, pages 14184 * |
| XIANGJIAN GOU 等: "SSRMMD: A Rapid and Accurate Algorithm for Mining SSR Feature Loci and Candidate Polymorphic SSRs Based on Assembled Sequences", FRONTIERS IN GENETICS, vol. 11 * |
| 于爱清 等: "长江刀鲚选育群体转录组 EST-SSR的分布特征分析", 渔业科学进展, vol. 40, no. 5, pages 102 - 103 * |
| 王解香;于凌云;白俊杰;樊佳佳;全迎春;: "草鱼EST-SSR标记及5个不同地域群体的遗传结构分析", 动物学杂志, no. 05, pages 24 - 32 * |
| 鲁翠云;全迎春;李大宇;孙效文;梁利群;: "用鲤鱼EST-SSRs分子标记分析长江黑龙江鲤种群结构", 农业生物技术学报, no. 06, pages 948 * |
| 龚诗琦;王志勇;肖世俊;林爱强;谢仰杰;: "黄姑鱼转录组SSR的开发与验证", 集美大学学报(自然科学版), no. 04, pages 241 - 246 * |
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