CN113789402B - 一种用于预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种用于预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的分子标记。本发明提供用于检测所述分子标记的引物，所述引物具有如SEQ ID No.1‑2所示的核苷酸序列。使用本发明提供的引物预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的方法，包括：提取新疆野生樱桃李叶片RNA并反转成cDNA；使用SEQ ID No.1‑2所示的引物进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。本发明在不接种南方根结线虫的情况下，进行抗性评估，可以筛选出抗性植株，为抗南方根结线虫优良砧木的鉴定与品种预选提供重要的科学指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子育种领域，具体涉及一种用于预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的分子标记。
背景技术
新疆野生樱桃李(Prunus sogdiana)是野生果树，具有耐瘠薄土壤、抗盐碱、耐湿、抗寒性强等特点。新疆野生樱桃李通过无性繁殖，硬枝、绿枝扦插成活率在80％以上。此外，新疆野生樱桃李与桃、李、杏等核果类果树具有良好的嫁接亲和性，是核果类果树砧木的优选材料。
DNA分子标记是一种能够检测和分析植物基因组中某一段特定的DNA片段的标记方法。它具有不受环境条件的影响、不受植物生育阶段的影响、不受取样时间和组织部位的限制、所需DNA模板量少等多个优点，是植物分子标记辅助育种的重要科学依据。InDel标记是指插入缺失标记，是一种基于基因组序列而开发的分子标记，是在等位基因位点上由于核苷酸插入或缺失而产生的长度多态性变异。InDel标记多态性可以通过多聚酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳等简单的步骤达到基因分型的目的，具有特异性高、稳定性好、检测方法简单等优点。
新疆野生樱桃李中具有对南方根结线虫可达免疫级别抗性的优良单株，是优良的核果类果树砧木材料。目前对抗南方根结线虫野生樱桃李的鉴定主要通过接种南方根结线虫后，计算其根结数量后进行评价。这种方法需要繁殖大量野生樱桃李植株，并且需时长，效率低，稳定性差等，大大影响了野生樱桃李抗南方根结线虫新品种的选育进程，目前尚未见到通过分子标记预测野生樱桃李抗南方根结线虫的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的方法。
为了弥补现有技术的不足，第一方面，本发明提供一种分子标记，检测所述分子标记的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。获得所述分子标记的步骤如下：
(1)培育野生樱桃李和抗南方根结线虫植株选育：以新疆天山野生樱桃李为原始资源，收集其种子，并通过播种，获得实生群体。通过对实生群体抗南方根结线虫的抗性进行多年鉴定。获得了抗南方根结线虫单株‘K-323’、‘K-325’、‘K-510’和感南方根结线虫单株‘G-319’、‘G-333’、‘G-348’。并对高抗单株嫁接亲和性试验表明，新疆野生樱桃李与桃、李、杏等核果类果树具有良好的嫁接亲和性。
(2)提取通过7年以上连续接种南方根结线虫后，能够对南方根结线虫达到高度抗病的野生樱桃李单株‘K-323’、‘K-325’、‘K-510’，和对南方根结线虫高度敏感的野生樱桃李单株‘G-319’、‘G-333’、‘G-348’的叶片，采用改良CTAB方法，分别提取野生樱桃李单株‘K-323’、‘K-325’、‘K-510’、‘G-319’、‘G-333’、‘G-348’的基因组RNA，并反转录为cDNA。
(3)使用上游引物PsoRPM-F和下游引物PsoRPM-R，以cDNA为模板进行PCR扩增，在对扩增产物进行回收测序后，分别得到抗性植株中的抗南方根结线虫植株和感性植株抗南方根结线虫基因PsoRPM的差异片段。
PsoRPM-F：GATGGAGATATTCAAAAAATACTCA(SEQ ID No.3)；
PsoRPM-R：TTTCAGAGTTGTCAATGATACCATG(SEQ ID No.4)。
(4)对(3)中得到的测序结果进行比对，获得在等位基因上由缺失而产生的长度多态性变异(InDel标记)；和在等位基因上高度保守的序列。
利用PsoRPM-F和PsoRPM-R引物在高抗和高感的植株中进行扩增，得到SEQ IDNo.5-SEQ ID No.16共12条序列(见序列表)，发现在感病植株的611bp-673bp区间存在有插入片段(图2)。根据抗病植株的第601-610位碱基和674-683位碱基的序列合成下游引物如SEQ ID No.2所示。以抗病和感病的第222-241位碱基的保守区域设计上游引物如SEQ IDNo.1所示(图1)。利用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2引物在抗病植株中可以扩增出398bp(SEQID No.17)的特异性条带。而在感病植株中，由于第601-610位碱基和674-683位碱基之间存在有不同长度的插入片段(图2中G319、G3333、G3348所示)，因此不能扩增出398bp(SEQ IDNo.17)的特异性条带。据此作为筛选抗病植株的分子标记。
第二方面，本发明提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。
所述引物对的设计过程如下：
以序列比对得到的高保守区(见图1)和长度多态性变异区(见图2)的序列作为依据，得到寡核苷酸引物，寡核苷酸引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：ATTCCTCGAGATTTGGGAGT；
SEQ ID No.2：TGAAGATGTAGCAGATGTAT。
其中，SEQ ID No.1为高保守区的一段序列(见图1中所示)，SEQ ID No.2为长度多态性变异区的两侧的序列(见图2中所示)。
本发明还请求保护上述引物对在制备检测新疆野生樱桃李对南方根结线虫抗性的试剂或试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供含有上述引物对的试剂或试剂盒。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述分子标记或上述引物对或上述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定新疆野生樱桃李对南方根结线虫抗性中的应用。
以及，上述分子标记或上述引物对或上述的试剂或试剂盒在新疆野生樱桃李种质资源选育中的应用。
以及上述分子标记或上述引物对或上述的试剂或试剂盒在抗南方根结线虫优良砧木的鉴定与品种预选中的应用。
第四方面，本发明提供一种预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的方法，包括：提取新疆野生樱桃李叶片RNA并反转成cDNA；以所述cDNA为模板，使用含有SEQ ID No.1-2所示核苷酸序列的引物对进行PCR扩增；
若PCR扩增产生条带，则待鉴定新疆野生樱桃李为南方根结线虫抗性植株；
若PCR扩增不产生条带，则待鉴定新疆野生樱桃李为南方根结线虫感性植株。
在本发明提供的方法中，所述PCR扩增的产物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
在本发明提供的方法中，所述PCR扩增的体系是2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCRMix 12.5μl，cDNA模板2.5μl，SEQ ID No.1 1.25μl，SEQ ID No.2 1.25μl，去离子水7.5μl。
在本发明提供的方法中，所述PCR扩增的程序是：95℃预变性10min；94℃变性25s，60℃退火25s，72℃延伸12s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
第五方面，本发明提供一种预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的试剂盒的制备方法，组装试剂盒的试剂中包括核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示的引物对。
在本发明提供的制备方法中，组装试剂盒所需的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种用于预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的分子标记，并提供检测所述分子标记的引物。本发明将基因组序列与抗南方根结线虫新疆野生樱桃李联系起来，能够在不接种南方根结线虫进行线虫抗性评估的情况下，建立和完善抗南方根结线虫新疆野生樱桃李分子标记辅助育种体系。
本发明建立了应用分子标记不受环境条件差异影响、不受植物某个生育阶段影响、不受取样时组织部位的限制，在早期预测抗南方根结线虫野生樱桃李的方法，为抗南方根结线虫优良砧木的鉴定与及品种选育具有重要的科学指导意义。
本发明提供的引物的序列为等位基因高度保守区和长度多态性变异区，在使用本发明提供的引物进行PCR扩增后，产生扩增条带的新疆野生樱桃李植株为具南方根结线虫抗性的植株，不产生条带的新疆野生樱桃李植株为具南方根结线虫感性植株。
附图说明
图1为本发明高度保守序列位置示意图。
图2为本发明等位基因上由缺失而产生的长度多态性变异位置示意图。
图3为本发明实施例2中新疆野生樱桃李具南方根结线虫抗性植株的电泳图。
图4为本发明实施例2中新疆野生樱桃李具南方根结线虫感性植株的电泳图。
图5为本发明实施例2中具南方根结线虫抗性或感性的新疆野生樱桃李植株抗性鉴定图；其中，K-323、K-325、K-510为具南方根结线虫抗性的植株，G-319、G-348、G-333为具有南方根结线虫感性的植株。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发实施例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本实施例中所用新疆野生樱桃李收集自新疆伊犁野果林，实生种植于中国农业大学上庄试验站中。
实施例1用于预测抗南方根结线虫新疆野生樱桃李的分子标记的制备
1、培育野生樱桃李和抗南方根结线虫植株选育。以新疆天山野生樱桃李为原始资源，收集其种子，并通过播种，获得实生群体。通过对实生群体抗南方根结线虫的抗性进行多年鉴定。获得了抗南方根结线虫单株‘K-323’、‘K-325’、‘K-510’和感南方根结线虫单株‘G-319’、‘G-333’、‘G-348’。高抗单株嫁接亲和性试验表明，高抗南方根结线虫的新疆野生樱桃李与桃、李、杏等核果类果树具有良好的嫁接亲和性。说明本申请提供的抗性砧木可以在桃、李、杏等核果类果树中广泛加以利用。
2、提取通过7年以上连续接种南方根结线虫后，能够对南方根结线虫达到高度抗病的野生樱桃李单株‘K-323’、‘K-325’、‘K-510’，和对南方根结线虫高度敏感的野生樱桃李单株‘G-319’、‘G-333’、‘G-348’的叶片，采用改良CTAB方法，分别提取野生樱桃李单株‘K-323’、‘K-325’、‘K-510’、‘G-319’、‘G-333’、‘G-348’的基因组RNA，并反转录为cDNA。具体方法如下：
(1)称2g取幼嫩叶片置于高温灭菌过的研钵中，使用液氮将样品研磨至粉末状，将研磨后的样品转移至无RNA酶的离心管中；
(2)CTAB试剂配制：称取10g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、16.38g氯化钠、10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，20ml 1mol/L Tris-Hcl(pH＝8)、8ml的1mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA，pH＝8)，使用去离子水定容至200ml，在高压灭菌锅中121℃高压灭菌20min，置于常温保存备用；
(3)65℃预热CTAB，2mL管，1mLCTAB液+30×B一巯基基乙醇(混合总预热)；
(4)取100mg叶片液氮中研磨，之后放入预热的CTAB中，涡旋振荡，65℃水浴10min，中间颠倒3-5次；
(5)加入1ml的CI：异戊醇＝24:1，冰浴10min，颠倒混匀3-5min；
(6)4℃，11000g离心；
(7)取上清至新的离心管中，加入等体积CL，轻轻混匀，冰浴10min；
(8)4℃，12000g离心10min；
(9)取上清至新的离心管中，加2倍体积异丙醇，置于-20℃1h；
(10)4℃，12000g离心20min，去上清；
(11)加入1mL 75％乙醇清洗1次；
(12)4℃，10000g离心3-5mim，去上清，风干；
(13)加入10×DNaseI buffer 5μL，DNase I 2μL，RNA酶抑制剂0.5μl加DEPC水至50μL，37℃消化25min；
(14)加入500ul DEPC和等体积CI，冰溶10min，4℃13000g离心10min；
(15)取上清液，加入2倍体积无水乙醇置于-20℃1h，4℃，10000g，离心20min，去上清；
(16)使用1mL 75％乙醇清洗2次，4℃，10000g离心3-5min，去上清；
(17)静置风干残留乙醇，50uL DEPC水溶解样品10min；
(18)使用NovoScript plus All-in-one 1st strand cDNA SynthesisSuperMixLgDNA Purge反转录试剂盒，将单链RNA反转为双链cDNA，反转录后的样品置于4℃保存备用。
3、合成克隆抗病基因全长克隆引物：通过使用前期在高抗单株‘K-510’中成功同源克隆到的抗南方根结线虫基因PsoRPM序列，设计上游引物PsoRPM-F(SEQ ID No.3：GATGGAGATATTCAAAAAATACTCA)和下游引物PsoRPM-R(SEQ ID No.4：TTTCAGAGTTGTCAATGATACCATG)。
4、PCR多聚酶链式反应扩增：
(1)PCR多聚酶链式反应体系：2×PCR buffer for KOD TX 25μl，dNTPs 10μl，引物PsoRPM-F 1.5μl，引物PsoRPM-R 1.5μl，cDNA模板1μl，KOD FX 1μl，去离子水10μl；
(2)PCR多聚酶链式反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火25s，68℃延伸60s，40个循环；4℃保存备用。
5、琼脂糖凝胶电泳：使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，通过凝胶成像系统拍摄电泳照片；
6、PCR扩增产物回收：参照中科瑞泰(北京)生物科技有限公司提供的凝胶回收试剂盒进行PCR产物回收；
7、测序：回收的PCR产物送至生工生物股份有限公司(北京)进行测序，通过比对测序结果，获得在等位基因上得到由缺失而产生的长度多态性变异；和在等位基因上高度保守的序列。
根据测序结果，以序列比对得到的高保守区(见图1)和长度多态性变异区(见图2)作为依据，设计寡核苷酸引物，寡核苷酸引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：ATTCCTCGAGATTTGGGAGT；
SEQ ID No.2：TGAAGATGTAGCAGATGTAT。
实施例2使用分子标记预测南方根结线虫新疆野生樱桃李的方法
本实施例提供抗南方根结线虫新疆野生樱桃李的分子标记的应用方法。本实施例中所用新疆野生樱桃李为‘K-325’、‘K-510’和感南方根结线虫单株‘G-319’、‘G-333’、‘G-348’‘G-402’。
1、采用与实施例1的步骤2中相同的方法，进行新疆野生樱桃李基因组cDNA的提取。
2、采用实施例1设计得到的寡核苷酸引物SEQ ID No.1-2作为PCR扩增引物。
3、PCR多聚酶链式反应扩增和琼脂糖凝胶电泳检测：
(1)PCR反应体系：2×M5HiPer plus Taq HiFi PCR Mix 12.5μl；cDNA模板2.5μl；SEQ ID No.1 1.25μl；SEQ ID No.2 1.25μl；去离子水7.5μl；
(2)PCR反应条件：95℃预变性10min；94℃变性25s，60℃退火25s，72℃延伸12s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；凝胶成像系统拍摄电泳照片，对南方根结线虫具有抗性的野生樱桃李单株基因组cDNA可扩增出如SEQ IDNo.17所示的398bp的特异性条带(见图3)，对南方根结线虫易感的野生樱桃李单株无特异性条带(图4)。
电泳检测结果与接种南方根结线虫后的结果一致(图5)，在抗性植株的根系中，未观察到南方根结线虫的侵染，在感性植株的根系中，观察到大量南方根结虫侵染造成的根结。
实施例3分子标记预测新疆樱桃李抗南方根结线虫及嫁接亲和性的准确度
实施例使用实施例1设计的引物(SEQ ID No.1-2)对30株新疆樱桃李的南方根结虫抗性及嫁接亲和性进行预测，结果见表1。
表1 使用SEQ ID No.1-2进行预测的结果
从表1的结果可知，使用SEQ ID No.1-2所示引物对，针对30株新疆野生樱桃李进行南方根结虫抗性预测，预测准确率达到100％；证实本发明所提供的分子标记与南方根结虫抗性显著相关，本发明提供的引物对不仅可以用于预测新疆野生樱桃李的南方根结虫抗性，也可以用于预测新疆樱桃李常规品种的南方根结虫抗性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的分子标记
<130> KHP211119017.3
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attcctcgag atttgggagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaagatgta gcagatgtat 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatggagata ttcaaaaaat actca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> DNA
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ttttgaaaag tctggtgatt ttcttagctc agaggaataa ctgagattaa ggattttcaa 300
attctgatgc aacttgcaat ccttccaaac tattttgagt tcgctacgcc gcatgtctaa 360
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cctgtaagag ccatgtagag caactccttc aattttttta gttccagatt catcactcaa 600
tacatctgct acatcttcac gtttccacaa tctactaaat ttttctggat gaccatgggc 660
attttcataa acgatctctc ttcccatgtc tcgaagcaaa tcatgcatcc tcagcttgtt 720
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agatatatca aggaatatct ttctcgttgt atcatcaggt agcctgtcaa agcttattct 900
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<211> 924
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ctttagcatt ttgcagcgtt caagatttac caaagaaagc cttccaagat ccccgatgga 180
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ttccagattc atcactcaat acatctgcta catcttca 398
Claims (7)
1.引物对在制备检测新疆野生樱桃李对南方根结线虫抗性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。
2.引物对在鉴定或辅助鉴定新疆野生樱桃李对南方根结线虫抗性中的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。
3.引物对在新疆野生樱桃李种质资源选育中的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。
4.引物对在抗南方根结线虫的优良樱桃李砧木的鉴定与品种预选中的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示。
5.一种预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的方法，其特征在于，包括：提取新疆野生樱桃李叶片RNA并反转成cDNA；以所述cDNA为模板，使用含有SEQ ID No.1-2所示核苷酸序列的引物对进行PCR扩增；
若PCR扩增产生条带，则待鉴定新疆野生樱桃李为南方根结线虫抗性植株；
若PCR扩增不产生条带，则待鉴定新疆野生樱桃李为南方根结线虫感性植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系是2×M5 HiPer plus TaqHiFi PCR Mix 12.5 μl，cDNA模板 2.5 μl，SEQ ID No.1 1.25μl，SEQ ID No.2 1.25μl，去离子水 7.5μl；PCR扩增程序是：95℃预变性10 min；94℃变性25s，60℃退火 25s，72℃延伸12s，35个循环；72°C延伸5min；4℃保存。
7.一种预测新疆野生樱桃李抗南方根结线虫的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括，核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示引物对。
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN108866233A (zh) * | 2018-08-23 | 2018-11-23 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的标记位点、引物对、试剂盒及应用 |
| CN111961752A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-11-20 | 四川农业大学 | 一种鉴定中国樱桃种质的ssr标记、应用及鉴定方法 |
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2021
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| 南方根结线虫诱发新疆野生樱桃李形成的根结形态和发育;刘青;乔峰;朱翔;卢崇烈;李天忠;胡建芳;;中国农业大学学报(第01期);第101-107页 * |
| 转新疆野生樱桃李psoRPM1基因烟草抵抗南方根结线虫;李芳;朱翔;乔峰;;中国园艺文摘(第01期);第235-236页 * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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