CN107699633B - 与桃果实风味性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents

与桃果实风味性状相关的snp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与桃果实风味性状相关的SNP标记及其应用。本发明提供了2个与桃果实风味性状相关的SNP标记，并基于该SNP标记提供了鉴定桃果实风味性状的方法，可用于快速鉴定桃果实为酸表型还是非酸表型。本发明的检测方法的检测成本低、操作简单，预测的准确性在90％以上，在桃新品种的果实风味性状的预测上有重要的意义，能有效提升桃育种效率和准确性。

Description

与桃果实风味性状相关的SNP标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一组与桃果实风味性状相关的SNP标记、桃果实酸/非酸表型的检测方法及其应用。
背景技术
桃(Prunus persica)是世界四大果树之一。中国桃总产量占全世界的32.9％，出口量只占世界贸易量的0.3％，近十年来欧盟和美国的桃消费也没有明显增加，国内桃产量出现严重的过剩，桃品质的提升是解决桃产业这一现状的重要途径。对于桃的消费需求很大程度上取决于果实的感官品质,而酸度是肉质水果感官品质的重要组成部分，是影响桃品种经济价值的一个重要因素，同时也是杂交育种中一个关键的衡量标准。
在对桃基因组的研究中，与其紧密连锁的区域位于第5号染色体顶端，称为Dlocus，源于法语“Doux”，“甜”之意。科学家主要是利用SSR、RAPD、AFLP、RFLP等多种传统分子标记技术对D locus进行定位研究，其精度有限。随着二代测序成本的大幅降低，越来越多的SNP分子标记被发现，相比于其他分子标记，SNP(单核苷酸多态性)具有数量大、分布密集，易于自动化和计算机分析等优点，SNP作为新一代最高密度的分子标记，可与个体的表型进行关联分析，是研究农艺性状的遗传机制的重要数据依据。随着分子生物学的发展，分子标记技术也广泛应用到作物育种方面。目前对桃SNP分型的高通量方法主要有两种，高通量测序技术及基因芯片技术。之前桃的芯片有9K位点，相比较于桃群体SNP的多态性(1％以上)，这些位点的密度还是过低，本发明提供的SNP位点是基于现今最高密度的桃芯片(174K)，能够有针对性的快速对更多的SNP位点进行基因分型。
本发明提供了2个用于桃果实酸性/非酸性性状预测的SNP分子标记，在桃新品种的果实风味性状的预测上有重要的意义，精准育种，有效提高桃的育种效率。
发明内容
本发明的第一个目的是提供检测待测桃树基因组的g.643147位点或g.699037位点的基因型的物质的新用途。
本发明提供了检测待测桃树基因组的g.643147位点或g.699037位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型中的应用。
本发明还提供了检测待测桃树基因组的g.643147位点或g.699037位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型的产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型的方法为如下(a1)或(a2)：
所述(a1)包括如下步骤：检测待测桃树基因组的g.643147位点的基因型为AA、AG还是GG，
若所述待测桃树基因组的g.643147位点的基因型为AA，则该待测桃树的果实为或候选为酸性表型；
若所述待测桃树基因组的g.643147位点的基因型为AG或者GG，则该待测桃树的果实为或候选为非酸性表型；
所述(a2)包括如下步骤：检测待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT、TG还是GG，
若所述待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为或候选为酸性表型；
若所述待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TG或者GG，则该待测桃树的果实为或候选为非酸性表型。
上述方法中，采用Affymetrix 174K peach SNP芯片检测待测桃树基因组的g.643147位点的基因型为AA、AG还是GG；采用Affymetrix 174K peach SNP芯片检测待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT、TG还是GG。
本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型的产品。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型的产品为检测待测桃树基因组的g.643147位点或g.699037位点的基因型的物质。
本发明的第四个目的是提供上述方法或上述产品的新用途。
本发明提供了上述方法或上述产品在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型中的应用。
本发明还提供了上述方法或上述产品在选育果实为酸性表型的桃树或选育果实为非酸性表型的桃树中的应用。
本发明还提供了上述方法或上述产品在桃树育种中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种选育果实为酸性表型的桃树的方法。
本发明提供的选育果实为酸性表型的桃树的方法包括选择g.643147位点的基因型为AA或g.699037位点的基因型为TT的桃树进行育种的步骤。
本发明的第六个目的是提供一种选育果实为非酸性表型的桃树的方法。
本发明提供的选育果实为非酸性表型的桃树的方法包括选择g.643147位点的基因型为AG或者GG或g.699037位点的基因型为TG或者GG的桃树进行育种的步骤。
上述应用或产品或方法中，所述酸性表型的桃树果实是指pH≤4.2的桃树果实；所述非酸性表型的桃树果实为pH＞4.2的桃树果实。
上述应用或产品或方法中，所述g.643147位点为桃基因组5号染色体的第643147位，也即为序列1第151位；所述g.699037位点为桃基因组5号染色体的第699037位，也即为序列2第151位。本发明的桃参考基因组的版本号为Prunus_persica-genome.v1.0，下载地址为ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v1.0。
本发明提供了2个与桃果实风味性状相关的SNP标记，并基于该SNP标记提供了鉴定桃果实风味性状的方法，可用于快速鉴定桃果实为酸表型还是非酸表型。本发明的检测方法的检测成本低、操作简单，预测的准确性在90％以上，在桃新品种的果实风味性状的预测上有重要的意义，能有效提升桃育种效率和准确性。
附图说明
图1为本发明2个SNP分子标记在267份不同桃品种材料中对桃果实酸/非酸风味性状表型预测效果示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与桃果实风味性状相关的SNP标记及检测方法
一、与桃果实风味性状相关的SNP标记
本发明的与桃果实风味性状相关的SNP标记均位于桃参考基因组(版本号为Prunus_persica-genome.v1.0，下载的地址为ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v1.0)的5号染色体上，分别将其命名为SNP分子标记T1和SNP分子标记T2。其中，SNP分子标记T1位于桃参考基因组5号染色体的第643147位(g.643147)，等位变异碱基为A或G；SNP分子标记T2位于桃参考基因组5号染色体的第699037位(g.699037)，等位变异碱基为T或G(表1)。
对于SNP分子标记T1位点，将g.643147位点的核苷酸均为A的桃树的基因型命名为AA基因型，将g.643147位点的核苷酸均为G的桃树的基因型命名为GG基因型，将g.643147位点的核苷酸均为A和G的桃树的基因型命名为AG基因型。
对于SNP分子标记T2位点，将g.699037位点的核苷酸均为T的桃树的基因型命名为TT基因型，将g.699037位点的核苷酸均为G的桃树的基因型命名为GG基因型，将g.699037位点的核苷酸均为T和G的桃树的基因型命名为TG基因型。
表1、SNP分子标记信息
Figure BDA0001479390270000041
二、桃果实风味性状的检测方法
本发明提供的检测桃果实风味性状的方法为如下a1)或a2):
a1)检测待测桃树基因组的g.643147位点的基因型为AA、AG还是GG，
若所述待测桃树基因组的g.643147位点的基因型为AA，则该待测桃树的果实为或候选为酸性表型；
若所述待测桃树基因组的g.643147位点的基因型为AG或者GG，则该待测桃树的果实为或候选为非酸性表型；
a2)检测待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT、TG还是GG，
若所述待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为或候选为酸性表型；
若所述待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TG或者GG，则该待测桃树的果实为或候选为非酸性表型。
实施例2、SNP标记在鉴定桃果实风味性状中的应用
一、试验材料
本发明的试验材料为267份不同的桃品种，均来源于国家果树种质北京桃圃资源群体。每个品种的桃果实采摘标准如下：果面绿色已减退，果实开始表现出品种特性，如橙黄色、乳白色、白色等，果面充分着色，果肉丰满，果实按压后有一定弹性，有芳香，已经基本表现出品种特有风味。
二、果实酸/非酸风味表型鉴定
在果实成熟期，对267份不同的桃品种果实的风味进行评价。
取成熟期果实样品，每个品种取10个果实，采用四分法进行取样，打浆磨碎，脱脂棉过滤出果实汁液，测定pH值。pH≤4.2的果实为酸性表型；pH＞4.2的果实为非酸性表型。
267份桃品种的果实酸/非酸风味表型信息如表2所示。
表2、试验材料的果实酸/非酸风味表型
Figure BDA0001479390270000051
Figure BDA0001479390270000061
Figure BDA0001479390270000071
三、基因型检测
1、基因组DNA的提取
采用CATB法提取试验材料的基因组总DNA，用紫外分光光度计方法检测其浓度和质量。CATB的具体方法步骤如下：
1)新鲜叶片于2ml EP管中液氮研磨；
2)水浴65℃预热DNA提取液；
3)每管加入600μl提取液，10μlβ-巯基乙醇，2μl蛋白酶K，混匀；
4)65℃水浴加热，期间每10min温和混匀一次，40min后取出，室温冷却10min；
5)加入600μl酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡混匀，静置2-3min；
6)12000rpm，离心10min，上清液移入新管中；
7)重复5)，6)步骤；
8)加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20℃放置大于30min；
9)4℃12000rpm，离心20min；
10)加200μl TE重溶，加2μl RNase A，37℃水浴30min；
11)加200μl氯仿：异戊醇(24：1)混匀，12000rpm，离心10min；
12)上清移入新管中，加100μl 7.5M乙酸铵，混匀，加400μl无水乙醇，混匀，-20℃放置大于30min；
13)4℃12000rpm，离心20min；
14)70％乙醇洗涤3次，晾干；
15)加50μl TE重溶。
500ml提取液配方10g CTAB，50ml 1M Tris.HCl(pH8.0)，20ml 0.5M EDTA，140ml5M NaCl和290ml H2O组成。
2、SNP位点的基因分型
将上述步骤1提取的基因组总DNA在Affymetrix公司生产的Affymetrix 174Kpeach SNP芯片进行基因分型，芯片信号的分析采用Affymetrix的SNPolisher package及Genotyping ConsoleTM Software(GTC)软件包聚类进行基因分型，根据聚类的效果筛选多态性的位点。267份材料的在SNP分子标记T1和SNP分子标记T2两个位点的基因型鉴定结果信息如表3所示。
表3、2个SNP分子标记的基因型信息
Figure BDA0001479390270000081
Figure BDA0001479390270000091
注：表3中样本序号对应表2中的序号。
四、SNP分子标记的基因型与桃果实酸/非酸风味表型的相关性分析
1、用2个SNP分子标记分别对桃果实风味性状的进行预测，最终得到基于每个SNP分子标记对每个品种的预测表型。
(1)按照实施例1步骤二中的a1)所述的方法预测桃果实酸/非酸风味表型：若待测桃树基因组的5号染色体的g.643147位点的基因型为AA，则该待测桃树的果实为或候选为酸性表型；如果基因型为AG或者GG，则该待测桃树的果实为或候选为非酸性表型；
(2)按照实施例1步骤二中的a2)所述的方法预测桃果实酸/非酸风味表型：若待测桃树基因组的5号染色体的g.699037位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为或候选为酸性表型；如果基因型为TG或者GG，则该待测桃树的果实为或候选为非酸性表型；
2、将每个品种的预测表型分别与步骤二中的实际表型进行统计分析，得到每个分子标记对应的预测准确率。预测准确率＝预测准确的材料/(预测准确的材料+预测错误的材料)。
统计分析的结果如表4和图1所示。可以看出：用SNP分子标记T1进行桃果实酸/非酸风味性状预测时，实际表型为酸桃的108份材料中基因型与表型数据的一致性为87.29％，实际表型为非酸桃的165份材料中因型与表型数据的一致性为99.39％，总共283份材料中基因型与表型数据的一致性为93.45％；用SNP分子标记T2进行桃果实酸/非酸风味性状预测时，实际表型为酸桃的108份材料中基因型与表型数据的一致性为88.98％，实际表型为非酸桃的165份材料中因型与表型数据的一致性为95.15％，总共283份材料中基因型与表型数据的一致性为92.58％。
由以上结果可知，可以根据5号染色体的2个SNP分子标记位点的基因型鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型。
表4、SNP分子标记对桃果实甜酸风味性状的鉴定效果
Figure BDA0001479390270000101
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但是在本发明的基础上，可以对之作一些修改或者改进，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的这些修改或者改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京农林科学院
<120>与桃果实风味性状相关的SNP标记及其应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>301
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>misc_feature
<222>(151)..(151)
<213>n=a或g
<400>1
gatcaaatcc gaggagagat tttgcagatg gagccaaaac tcgaactgga ggccgaatat 60
gcacatatta aaagagagag taatcgacag ggaaccatgt ctgaagctgg tgtaacctcc 120
gaagccacgg ccttggctac tgcgagggcc naacaatctc ggccgaacaa ttatagtgtc 180
gaccctactc gtaaccggcc tccaatgaag tgtaccaaat gtggtttaga taaccacaca 240
attaagggct gttatgagat cattggttat ccagaaggat gggtccataa agggcaaaaa 300
a 301
<210>2
<211>301
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>misc_feature
<222>(151)..(151)
<213>n=t或g
<400>2
ggggtatttt cacacaattt catggggatc gaaccgcata ccaatcgcca gcatgcaaac 60
agctctacca ctgagctaag gccccatctg cagtattggg tcattgttta cttgacctag 120
ttttttctac attagacatc aagcaaaagc naatttgttt agatagaata tgcgacaaac 180
gtctcttgtc agctggctcc aatgcttaac gaaattgtta ggacattacc actttgttcc 240
taatcctatg tggttgggga catcattgcc acgtttcaca actggccacc acctccagac 300
a 301

Claims (10)

1.g.699037位点的多态性在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型中的应用；
所述g.699037位点为桃树基因组5号染色体的第699037位，该位点的多态性为T/G。
2.g.699037位点的多态性在制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型的产品中的应用；
所述g.699037位点为桃树基因组5号染色体的第699037位，该位点的多态性为T/G。
3.一种鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型的方法，包括如下步骤：检测待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT、TG还是GG，
若所述待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为或候选为酸性表型；
若所述待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TG或者GG ，则该待测桃树的果实为或候选为非酸性表型；
所述g.699037位点为桃树基因组5号染色体的第699037位。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：采用Affymetrix 174K peach SNP芯片检测待测桃树基因组的g.699037位点的基因型为TT、TG还是GG。
5.权利要求3或4所述的方法在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为酸性表型还是非酸性表型中的应用。
6.权利要求3或4所述的方法在选育果实为酸性表型的桃树中的应用。
7.权利要求3或4所述的方法在选育果实为非酸性表型的桃树中的应用。
8.权利要求3或4所述的方法在桃树育种中的应用。
9.一种选育果实为酸性表型的桃树的方法，包括选择g.699037位点的基因型为TT的桃树进行育种的步骤；
所述g.699037位点为桃树基因组5号染色体的第699037位。
10.一种选育果实为非酸性表型的桃树的方法，包括选择g.699037位点的基因型为TG或者GG的桃树进行育种的步骤；
所述g.699037位点为桃树基因组5号染色体的第699037位。
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