KR20140055501A

KR20140055501A - 국화 유래 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140055501A
Application number: KR1020120122499A
Authority: KR
Inventors: 박용진; 홍우주
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2014-05-09
Also published as: KR101441751B1

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 2개 이상의 핵산서열을 갖는 SSR 프라이머쌍에 관한 것으로, 바람직하게는 상기 프라이머쌍이 국화에서 유래된 것을 포함할 수 있다.

Description

국화 유래 ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도{SSR primer derived from Chrysanthemum and use of thereof}

본 발명은 SSR 프라이머 및 상기 SSR 프라이머를 사용하여 국화의 품종을 구분하는 방법에 관한 것이다.

육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나, 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한, 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 중합효소 연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 임의증폭 다형DNA(RAPD; randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, 유전자 증폭산물 길이 다형성 DNA(AFLP; amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, 단순반복 염기서열(SSR; simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 초위성체 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요 작물 및 소재배 작물에 대한 SSR 마커 개발이 필요한 실정이다.

따라서 본 발명은 SSR 프라이머쌍을 이용하여 국화의 유전적 다양성과 유연관계를 분석하였고, 국화의 품종에 대한 유전자형을 분석하여 품종 구분에 대한 가능성을 검토하고, 효율적인 품종 구분 방법을 제시하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 2 개의 핵산서열을 갖는 SSR 프리이머쌍을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 포함하는 국화 품종 구분용 키트를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용하여 국화 품종을 구분하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍은 국화의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 국화의 DNA 프로파일을 작성하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 국화의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써, 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.

도 1은 실험예에서 사용된 92개 재배국화 및 3개 야생종 국화에 대한 정보이다.
도 2는 8개 Bulk에 대해 선택된 SSR 마커 7개(KNUCRY1 내지 KNUCRY7)에 대한 결과이다.
도 3은 8개 Bulk에 대해 선택된 SSR 마커 7개(KNUCRY7 내지 KNUCRY14)에 대한 결과이다.
도 4는 집단구조 분석시 집단 수 결정에 사용된 결과이다.
도 5는 도 1의 95개 국화 자원의 필로그램(phylogram)이다.
도 6은 최소한의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 88점의 재배국화 품종을 구분한 결과이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 핵산서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.

상기 SSR 프리아머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 SSR 프라이머쌍은 국화로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 상기 국화는 국(菊)·구화라고도 한다. 국화는 관상용으로 널리 재배하며, 많은 원예 품종이 있다. 높이 1m 정도로 줄기 밑부분이 목질화하며, 잎은 어긋나고 깃꼴로 갈라진다. 꽃은 두상화로 줄기 끝에 피는데 가운데는 관상화, 주변부는 설상화이다. 꽃은 노란색·흰색·빨간색·보라색 등 품종에 따라 다양하고 크기나 모양도 품종에 따라 다르다. 꽃의 지름에 따라 18㎝ 이상인 것을 대륜, 9㎝ 이상인 것을 중륜, 그 이하인 것을 소륜이라 하며 꽃잎의 형태에 따라 품종을 분류하기도 한다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 포함하는 국화품종 구분용 키트를 제공할 수 있다.

상기 국화 품종 구분용 키트는 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은 국화로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제 1항 또는 제 2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계; 및

상기 증폭반응 산물을 검출하는 단계를 포함하는 국화 품종 구분 방법을 제공할 수 있다.

상기 국화로부터 게놈(genomic) DNA를 추출하는 단계는 국화 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 것을 포함하며, 상기 분리 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 세틸트리메틸암모늄브로마이드반응(cetyltrimethyl ammonium bromide reaction; CTAB reaction)을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일실시예에 따른 SSR 프라이머쌍을 마커로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지 될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머쌍은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 구분되는 국화의 품종은 국야국향, 가을아가씨, 강호황팔장, 겸육백국, 국화개운, 국화기운, 부산설, 옥피리, 이백, 자운전, 이팔홍, 홍어전, 천향매화, 신마, 하이마야, 정흥성, 수이신, 을녀, 정흥추, 용마, 정흥신년, ST09-173-01, 백광, 백선, 백마, 세이노나미, 유카, 정주, 세이코노일세, 장수황, 세이노이사미, ST06-03-01, ST09-148-04, ST09-50-01, ST09-40-02, ST09-149-01, ST09-136-01, ST09-99-02, ST09-173-11, 골드코스트, 그린데이, 모나리자, 샴록, 아나스타샤, 아틱퀸, 유로, 베수비오, 스텔리온, 예스투게더, 나이스, 로얄 아르딜로, 예스누리, 아르거스, 예스라이프, 페니레인, 퓨마, 롤리팝, 예스미소, 치로, 예스데이, 프로그, 리간 오렌지, 마블 오렌지, 무지개, 문라이트, 바이킹, 버피, 보라미, 비미니, 예스스완, 예스라인, 예스모닝, 우노아이보리, 예스스타, 휘파람, 그린밸리, 리마하니, 먼로, 피스엔젤, 피스옐로우, 피스핑크, 사스키아, 피코살토, 피스코퍼, 파쏘아레드, 금방울, 도화볼, 팝콘볼, 브라이트볼, G-20, G-28, 구절초, 울릉국화, 관동국화 및 G-31로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 품종일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1. SSR 농축 라이브러리

상기 국화에서 퀴아젠 DNA 추출 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 신선한 잎으로부터 DNA를 추출했다.

상기 국화에서 추출된 DNA로부터 수정된 바이오틴- 스트렙타비딘 포획(biotin-streptavidin capture) 방법으로 SSR 농축 라이브러리를 구성하였다. 상기 국화의 게놈 DNA를 7개의 제한 효소(EcoRV, DraI, SmaI, PvuI, AluI, HaeⅢ, 및 RsaI)로 절단한 후 혼합하였다. 상기 혼합된 시료를 1.4%의 아가로즈 겔(agarose gel)에서 크기별로 분리되었다. 300 ~ 1500bp 범위의 단편들은 겔로부터 추출하였고, gel extraction kit(Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 DNA 단편(1ug)은 double-stranded adaptor molecules(1ug)로 결합시켰다. 이후 어뎁터(AP11-5'-CTC TTG CTT AGA TCT GGA CTA-3' 및 AP-12-5'-TAG TCC AGA TCT AAG CAA GAG CAC A-3')와 라이게이션하였다. 어뎁터-라이이션된 DNA는 긴(40 ~ 45 개의 핵산) 바이오틴이 표지된 반복 프로브[(GA)_20, (CA)₂₀, (AT)₂₀, (GC)₂₀, (AGC)₁₅, (GGC)₁₅, (AAG)₁₅, (AAC)₁₅, (AGG)₁₅]의 혼합물과 혼성화 되었다. 혼성화된 DNA 단편을 마그네틱 비드로 덮인 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 획득하였다. 획득한 DNA 파편은 증류수로 세척한 후 50㎕의 증류수에 녹인 뒤, AP11 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T Easy Vector(Promega)로 클로닝 하였다.

이후 GX FLX 분석을 통해 18.83Mbp의 염기서열 결과를 얻었으며, read의 평균 길이는 280.06bp로 나타났다. GX FLX 분석 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

아이템	수(Number)
Raw Wells	126,347
Key Pass Wells	122,228
Passed Filter Wells	67,246
Total Bases	18,830,109
평균 길이	280.06
표준 편차	144.37
가장 긴 read 길이	741
가장 짧은 read 길이	40
중간 길이의 read 길이	290

실시예 2. SSR 마커 선발

상기 실시예 1에서 얻어진 염기서열 결과를 토대로 다양한 모티프를 갖는 100개의 프라이머를 제작하였고, 92개 국화 재배종 및 3개 야생종에 대한 유전적 다양성을 분석을 위해 다형성 마커를 선발하였다. 상기에서 사용된 국화의 목록은 하기 도면 1에 나타내었다.

다형성 마커 선발은 분석시간 및 비용을 줄이기 위하여 제안된 BSM(Bulk selection method)을 적용하여 5개 국화 수집종의 DNA를 같은 양으로 혼합하여 하나의 Bulk를 만들었으며, 다형성 마커를 선발하는 실험에는 8개 Bulk, 즉 40개 품종에 대한 DNA 증폭 효율과 다형성 평가를 수행하였다. 상기 Bulk는 하기 표 2에 나타내었다.

40개 국화 품종에 대한 8개 Bulk에 대해 제작된 SSR 마커로 증폭한 결과, KNUCRY7 등은 단순한 band 형태를 보이면서 Bulk 간의 다형성을 보여 국화 육성종 유전분석에 활용하였다(도 2 및 도 3).

상기 과정을 통해 최종적으로 12개의 다양성 분석용 마커를 선발하였다. 선발된 SSR 마커는 하기 표 3에 나타내었다.

실험예 1. 유전적 다양성 분석

상기 실시예에서 선발된 SSR 마커 12쌍을 이용하여 92개 재배국화 및 3개 야생종 국화에 대해 유전자형 분석을 수행하였다. 상기 95개 국화의 품종은 하기 도면 1에 나타내었다.

상기 95개 국화의 신선한 잎에서 Qiagen DNA extraction kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 상대적인 순도나 농도를 확인하기 위해 NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA)을 사용하여 각 샘플의 농도를 50 ng/㎕로 제조하였다.

상기 12개의 프라이머쌍(표 3 참조)으로 94℃에서 30초간 변성(denaturation) 후 47 ~ 55℃로 45초 동안 어닐링(annealing)하고 72℃에서 1분 동안 증폭(extension)하는 과정을 30회 반복하였고, 5분 동안 최종 증폭(extension)을 수행하였다.

상기 12개 마커로 증폭된 95개 품종 DNA 단편은 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)를 이용하여 단편의 길이를 결정하였고, Power Marker 프로그램을 이용하여 대립유전자(alleles), rare alleles, specific alleles, genotype no., 이형접합성(heterozygosity; H), 주요 대립유전자 빈도(major allele frequency; MAF), 유전자 다양성(gene diversity; GD) 및 다형성 정보 함량(polymorphic information content; PIC)을 확인하였다. 상기 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

프라이머 이름	크기( bp )	NA ^a	MAF ^b	RA ^c	SA ^d	GD ^e	H ^f	PIC ^g
KNUCRY-10	160-410	4	0.874	2	1	0.229	0.187	0.218
KNUCRY-16	151-500	29	0.382	27	18	0.742	0.236	0.708
KNUCRY-35	160-435	14	0.315	8	5	0.818	0.865	0.797
KNUCRY-58	150-254	5	0.620	1	1	0.548	0.759	0.495
KNUCRY-59	134-500	27	0.437	23	11	0.779	0.517	0.767
KNUCRY-75	165-293	4	0.516	1	0	0.621	0.926	0.555
KNUCRY-76	150-286	8	0.817	6	5	0.315	0.367	0.290
KNUCRY-77	257-390	31	0.213	27	12	0.888	0.632	0.879
KNUCRY-84	152-500	35	0.332	30	18	0.843	0.348	0.832
KNUCRY-85	157-268	13	0.403	7	3	0.773	0.682	0.749
KNUCRY-94	160-197	7	0.617	4	1	0.566	0.713	0.524
KNUCRY-98	157-457	23	0.335	19	9	0.824	0.819	0.807
Mean	-	16.7	0.488	5	7	0.662	0.588	0.635
^a대립유전자 수, ^b주요 대립유전자 빈도, ^cRare allele, ^dSpecific allele, ^e유전자 다양성, ^f관찰된 이형접합성, ^g다형성 정보 함량

상기 유전적 다양성 분석 결과, 95개 자원에서 총 200개의 대립유전자가 관찰되었다. 상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대립유전자 수는 4개(KNUCRY-10 and KNUCRY-75)에서 35개(KNUCRY-84)로 비교적 다양하게 나타났으며, 평균 대립유전자 수는 16.7개였다. 대립유전자 빈도의 분포는 빈도가 0.05 미만인 rare alleles는 전체 대립유전자 중 77.5%, 빈도(frequency)가 0.05 이상이고 0.5 미만인 intermediate는 19.5%, 빈도가 0.5 이상인 abundant 대립유전자는 3%를 관찰되었다. 또한, 마커별 품종 특이 대립유전자(Specific allele)는 0 ~ 18개를 보였고 rare allele는 1 ~ 30개가 확인되었는데, KNUCRY-84에서 specific allele와 rare allele가 최대로 보였다. 집단의 평균 관찰된 이형접합성(heterozygosity) 범위는 0.187 ~ 0.926으로 평균은 0.588로 나타났다. 유전자 다양성 범위는 0.229(KNUCRY-10)에서 0.888 (KNUCRY-77)으로 평균은 0.662였고, 다형성 정보 함량(PIC)의 범위는 0.218(KNUCRY-10) ~ 0.879 (KNUCRY-77)로 평균은 0.635로 확인되었다.

실험예 2. 집단 구조 분석

구조(Structure) 프로그램을 이용하여 95개 국화 자원(도 1 참조)의 집단구조 분석을 수행하였는데, 분석 시 집단 (K)를 2에서 9까지 분석하였으며, 각각의 K에 대하여 200,000 interaction과 100,000 burn-in을 실시한 후 각각의 K에 대한 log likelihood 값을 분석 후 최고 log likelihood 값을 나타내는 집단을 결정하고, 분석된 각각의 집단에 대한 log likelihood 값이 최고값을 나타내지 않고 집단이 증가할수록 log likelihood 값도 함께 증가할 경우 Evanno 등이 제안한 델타 K를 분석하여 정확한 집단을 결정하였는데 89.4%인 85점은 3개의 그룹으로 분류되었고 10.6%점인 10점은 유전적으로 혼입되었다고 확인되었다(도 4 참조). 모든 관상국(16점)과 스텐다드 국화 품종 중 17점은 1그룹에 포함되었고, 그 외의 스텐다드 국화(7점)은 그룹 2에 포함되었다. 스프레이 국화는 대부분 그룹 2(27점)에 포함되었고, 그 외 4점은 그룹 1에 포함되었다. 포트멈 (7점)과 화단국은 그룹 3(6점)에 포함되었다.

하기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 같은 그룹 내에서 평균 genetic distance는 그룹 1이 0.639로 가장 높았던 반면, 그룹 3은 0.549로 가장 낮았다. 3개의 그룹 중에서 그룹 2이 가장 높은 이형접합성(heterozygosity)를 보였고, 그룹 3은 가장 낮은 이형접합성을 보였다.

그룹명	샘플 수	대립유전자 수	유전자 다양성	이형접합성	다형성 정보 함량
전체	95	16.7	0.662	0.588	0.635
그룹 1	34	10.2	0.639	0.596	0.608
그룹 2	35	9.3	0.614	0.652	0.580
그룹 3	16	4.6	0.549	0.397	0.500

GD-based 분석은 95개 품종의 shared allele frequencies 측정하여 수행되었다. Unrooted phylogram(neighbor-joining tree)는 파워마커와 MEGA4 프로그램을 이용하였으며, unrooted phylogram의 덧칠해진 색은 model-based 분석에 기초하여 분류하였다(도 5 참조).

실험예 3. 최소한의 SSR 마커 세트를 이용한 품종판별

95개 다양성 분석 국화 자원(도 1 참조) 중 재배국화(1 ~ 88번)의 품종구분용 마커를 탐색하기 위해 다형성을　보이는　12개 마커 중에서 다형성 정도(PIC value)가 높은 4개 마커를 선택하여 품종판별력을 검정하였다. 상기에서 선택된 마커 4개는 하기 표 6에 나타내었다.

프라이머 이름	서 열번 호	Forward sequence	서 열번 호	Reverse sequence
KNUCRY-35	5	CCTCGCACTACTTCCAAATGA	6	GGAGATTGTTTGTTCGTATCCTT
KNUCRY-77	15	CCCGGTTATCATGTGTATGC	16	CGTATTTAAAGGTTTTCCTTTCG
KNUCRY-84	17	CTAGGCTCCTTCAGCCCTCT	18	TCTGGACTAGCCGTCAGTTG
KNUCRY-98	23	TCACATCACACATCACTGCAA	24	TGTGTGTGAGGGACACATGA

하기 표 7에서 확인할 수 있듯, 상기 4개의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 ８８점의　재배국화에　대하여　유전적　다양성을　분석한　결과，총　98개의　대립유전자가 관찰되었다．대립유전자 수는 KNU-84에서　36개,　KNU-98에서　20개,　KNU-77에서　31개,　KNU-35에서　11개로　비교적　다양하게　나타났으며,　평균　대립유전자 수는　24.5개　였다.　분석에　사용한　마커에　대한　유전적　다양성을　나타내는　유전자 다양성 및　다형성 정보 함량(PIC)은　KNU-77에서　0.8938과　0.8858로　가장　높게　나타났다.

프라이머 이름	주요 대립유전자 빈도	대립유전자 수	유전자 다양성	이형접합성	다양성 정보 함량
KNU-84	0.3352	36	0.8474	0.3750	0.8373
KNU-98	0.3295	20	0.8220	0.8182	0.8040
KNU-77	0.2188	31	0.8938	0.6625	0.8858
KNU-35	0.3232	11	0.8155	0.8780	0.7941
평균	0.3017	24.5	0.8447	0.6834	0.8303

상기 SSR 프라이머쌍을　이용하여　재배　국화의　판별을　위하여　대립유전자 수,　유전자 다양성　및　다양성 정보 함량(PIC) 값이　가장　높은　KNU-84 마커를　이용하여　phylogenetic tree를　작성 후　분석하였다. 총　４단계로　분석을 　수행하였으며　단계별로　KNU-98,　KNU-77,　KNU-35 마커　순으로　추가하여　단계별　tree를　작성하여　분석하였다.

KNU-84 마커를 이용하여 1단계 판별을 수행한 결과 총 88점의 국화 자원 중 25점이 판별되었다. 2단계에서 KNU-98 마커를 추가하여 분석한 결과 1단계에서 판별되지 않았던 34점이 판별되었다. KNU-77 마커를 이용한 3단계에서는 17점, KNU-35 마커를 이용한 4단계에서는 12점이 판별되었다. 결과적으로 4개의 다형성 SSR 마커를 이용하여 88점의 국화를 모두 판별할 수 있었다(도 6).

상기 실시예 및 실험예를 통해서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍(마커)은 국화의 DNA 다형성을 효과적으로 검출할 수 있으며, 국화의 DNA 프로파일을 작성하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 통해 국화의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써, 신규 유전자원 도입시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있다.

<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> SSR primer derived from Chrysanthemum and use of thereof <130> 1039189 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 1 gtgtcttcat cccaccacca 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 2 tgtgagagag tgagtgtagt gtgag 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 3 tgttcaccca ttcacagctc 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 4 cacatgtatg actaggtgag gtga 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 5 cctcgcacta cttccaaatg a 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 6 ggagattgtt tgttcgtatc ctt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 7 ggtggaattg ctccttgttg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 8 ccatcatcaa cacaagcttc a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 9 cggtcctctc agccttattg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 10 ggtgtgtgtg tgaaggtgct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 11 gtggttgagc catttgaggt 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 12 ttggctattg tgatttctac gc 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 13 ttgaggttgt ggaaatgcag 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 14 cgcgttaact ttggtgtttt t 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 15 cccggttatc atgtgtatgc 20 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 16 cgtatttaaa ggttttcctt tcg 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 17 ctaggctcct tcagccctct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 18 tctggactag ccgtcagttg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 19 gaccaacaaa acggaatgct 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 20 gttgtcgtcc gttggctagt 20 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 21 cattcaggac agtcatacaa gtg 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 22 caacacacac acacacagga at 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 23 tcacatcaca catcactgca a 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Chrysanthemum <400> 24 tgtgtgtgag ggacacatga 20

Claims

서열번호 1 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 2개 이상의 핵산서열을 포함하는 SSR 프라이머쌍.
제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 SSR 프라이머쌍.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 국화로부터 유래된 것을 특징으로 하는 SSR 프라이머쌍.
제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 국화 품종 구분용 키트.
제 4항에 있어서, 상기 국화 품종 구분용 키트에 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 군에서 선택된 1종 이상의 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 국화 품종 구분용 키트.
제 4항에 있어서, 상기 국화 품종이 국야국향, 가을아가씨, 강호황팔장, 겸육백국, 국화개운, 국화기운, 부산설, 옥피리, 이백, 자운전, 이팔홍, 홍어전, 천향매화, 신마, 하이마야, 정흥성, 수이신, 을녀, 정흥추, 용마, 정흥신년, ST09-173-01, 백광, 백선, 백마, 세이노나미, 유카, 정주, 세이코노일세, 장수황, 세이노이사미, ST06-03-01, ST09-148-04, ST09-50-01, ST09-40-02, ST09-149-01, ST09-136-01, ST09-99-02, ST09-173-11, 골드코스트, 그린데이, 모나리자, 샴록, 아나스타샤, 아틱퀸, 유로, 베수비오, 스텔리온, 예스투게더, 나이스, 로얄 아르딜로, 예스누리, 아르거스, 예스라이프, 페니레인, 퓨마, 롤리팝, 예스미소, 치로, 예스데이, 프로그, 리간 오렌지, 마블 오렌지, 무지개, 문라이트, 바이킹, 버피, 보라미, 비미니, 예스스완, 예스라인, 예스모닝, 우노아이보리, 예스스타, 휘파람, 그린밸리, 리마하니, 먼로, 피스엔젤, 피스옐로우, 피스핑크, 사스키아, 피코살토, 피스코퍼, 파쏘아레드, 금방울, 도화볼, 팝콘볼, 브라이트볼, G-20, G-28, 구절초, 울릉국화, 관동국화 및 G-31로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 품종인 것을 특징으로 하는 국화 품종 구분용 키트.
국화로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제 1항 또는 제 2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계; 및
상기 증폭반응 산물을 검출하는 단계를 포함하는 국화 품종 구분 방법.
제 7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 국화 품종 구분 방법.
제 7항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 국화 품종이 국야국향, 가을아가씨, 강호황팔장, 겸육백국, 국화개운, 국화기운, 부산설, 옥피리, 이백, 자운전, 이팔홍, 홍어전, 천향매화, 신마, 하이마야, 정흥성, 수이신, 을녀, 정흥추, 용마, 정흥신년, ST09-173-01, 백광, 백선, 백마, 세이노나미, 유카, 정주, 세이코노일세, 장수황, 세이노이사미, ST06-03-01, ST09-148-04, ST09-50-01, ST09-40-02, ST09-149-01, ST09-136-01, ST09-99-02, ST09-173-11, 골드코스트, 그린데이, 모나리자, 샴록, 아나스타샤, 아틱퀸, 유로, 베수비오, 스텔리온, 예스투게더, 나이스, 로얄 아르딜로, 예스누리, 아르거스, 예스라이프, 페니레인, 퓨마, 롤리팝, 예스미소, 치로, 예스데이, 프로그, 리간 오렌지, 마블 오렌지, 무지개, 문라이트, 바이킹, 버피, 보라미, 비미니, 예스스완, 예스라인, 예스모닝, 우노아이보리, 예스스타, 휘파람, 그린밸리, 리마하니, 먼로, 피스엔젤, 피스옐로우, 피스핑크, 사스키아, 피코살토, 피스코퍼, 파쏘아레드, 금방울, 도화볼, 팝콘볼, 브라이트볼, G-20, G-28, 구절초, 울릉국화, 관동국화 및 G-31로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 품종인 것을 특징으로 하는 국화 품종 구분 방법.