JP7479286B2 - タバコ植物を産生するための組成物および方法、ならびに変化したアルカロイドレベルを有する産物 - Google Patents

タバコ植物を産生するための組成物および方法、ならびに変化したアルカロイドレベルを有する産物 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１２日に出願された米国仮出願第６２／６１６，９５９号、２０１８年２月２日に出願された米国仮出願第６２／６２５，８７８号および２０１８年６月１５日に出願された米国仮出願第６２／６８５，８４４号に対する優先権を主張し、これらの全ての仮出願は参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の組込み
２，７８０，５２５バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）の２０１９年１月１１日に作成された「Ｐ３４７０９ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含有される配列表が本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
分野
本開示は、低アルカロイド関連染色体欠失領域（ＬＡ関連領域）、タバコＮｉｃ１ｂ遺伝子座、および該領域または該遺伝子座の中または辺りの遺伝子を提供する。変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルと商業的に許容される葉のグレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介するその開発、ならびにこれらのタバコ植物からのタバコ製品の産生もまた提供される。
背景
ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンの４つの主要なアルカロイドがタバコ中に見出される。ニコチンは最も多数を占めるアルカロイドであり、通常、商用のタバコ栽培品種において総アルカロイドの９０％より多くを占める。ニコチン生合成は主にタバコの根において起こる。タバコ植物は次にニコチンを維管束を通じて葉に輸送し、葉においてニコチンは次に液胞中に貯蔵される。
遺伝子型、環境、受精、および耕種学的実施を含む様々な要因がタバコアルカロイドレベルに影響する（例えば、ニコチン産生は、摘心、傷付け、および草食動物による損傷により刺激される）。キューバシガータバコ品種の株において最初に見出された低アルカロイド形質は、一連の戻し交雑を通じてシガレット品種に導入された。低アルカロイドのタバコ生殖質はその後に、栽培品種Ｂｕｒｌｅｙ ２１の遺伝的背景において登録された（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０：２１２（１９７０）（非特許文献１））。低アルカロイドＢｕｒｌｅｙ ２１（ＬＡ ＢＵ２１）株を使用した遺伝学的研究は、２つの関連しない遺伝子座がタバコ葉におけるニコチンレベルに寄与することを指し示した。これらの２つの遺伝子座はＮｉｃ１およびＮｉｃ２と称される。ＬＡ ＢＵ２１においてｎｉｃ１およびｎｉｃ２（それぞれニコチン１およびニコチン２と同じ）突然変異は半優性である。それらはニコチンレベルに対して用量依存的な効果を示し、ｎｉｃ１の効果はｎｉｃ２の効果より約２．４倍強い。Ｎｉｃ２遺伝子座の分子的特徴付けが報告されている。ｎｉｃ２突然変異は、エチレン応答性因子（ＥＲＦ）ファミリーからの転写因子遺伝子、例えば、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８のクラスターの欠失を含有することが示された（Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、（１０）：３３９０－４０９（２０１０）（非特許文献２））。
タバコ中の総アルカロイド含有量の低減は多くの利益を有し得る。それは、バイオマス資源としてのタバコの価値を増加させ得る。タバコ植物中のニコチンアルカロイドの増加は、昆虫および草食動物からの植物の保護において重要な役割を果たし得る。
昆虫からの防御におけるアルカロイドの役割に合致して、ＬＡ ＢＵ２１は昆虫による損傷に対して極めて感受性であることが報告された（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０：２１２（１９７０）（非特許文献１））。低い総アルカロイドパーセンテージ（約０．２０％）を有する熱風乾燥タバコの同質遺伝子株をそれらの「正常」な回帰性（ｒｅｃｕｒｒｉｎｇ）の親（総アルカロイド１．８５～２．７０％）と比較したさらなる研究は、低アルカロイド株における収率、グレード指数、総Ｎ、および還元糖含有量は正常な熱風乾燥栽培品種におけるより低いことを報告した（ＣｈａｐｌｉｎおよびＷｅｅｋｓ、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６（３）：４１６－１８（１９７６）（非特許文献３））。
Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０：２１２（１９７０） Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、（１０）：３３９０－４０９（２０１０） ＣｈａｐｌｉｎおよびＷｅｅｋｓ、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６（３）：４１６－１８（１９７６）
タバコニコチンレベルを調節する遺伝子を同定すること、ならびにタバコ葉の品質を（優れたものとしないにしても）維持しながら変化したニコチンレベル（例えば、低減したニコチン）を含有するタバコ植物および製品を開発することの必要性が存在する。
概要
一態様では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。
別の態様では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異およびＮｉｃ２遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いて当該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物またはその部分を提供する。
一態様では、本開示は、２．０％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む非トランスジェニックタバコ植物またはその部分であって、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニックタバコ植物またはその部分をさらに提供する。
別の態様では、本開示はまた、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、非トランスジェニック突然変異が、タバコ植物のニコチンレベルを類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの約２０％またはそれ未満まで低減し、タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、対照植物が、非トランスジェニック突然変異を除いて当該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物またはその部分を提供する。
一態様では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド（ｌａｂｄｅｎｏｉｄ）、センブラノイド（ｃｅｍｂｒｅｎｏｉｄ）、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたはそれ以上のタバコ芳香化合物を含む、タバコ植物またはその部分を提供する。
別の態様では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、突然変異がＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１には存在しない、タバコ植物またはその部分を提供する。一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１と比較してＮｉｃ１ｂ遺伝子座においてより短い染色体移入を含む。別の態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の完全な遺伝子または完全な遺伝子コーディング配列の欠失を含まない。
一態様では、本開示は、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、１５３、１５４、２０２、および２０３、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含むタバコ植物またはその部分を提供する。一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座から１つまたはそれ以上の遺伝子活性を低減または除去するＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座における１つまたはそれ以上の天然に存在しない突然変異体アレルを含む。一態様では、これらの突然変異体アレルは、より低いニコチンレベルを結果としてもたらす。
別の態様では、本開示は、配列番号：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、および２０５、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するコーディング配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含むタバコ植物またはその部分を提供する。
一態様では、本開示は、配列番号：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含むタバコ植物またはその部分を提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、１５３、１５４、２０２、および２０３、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ阻害配列を含む異種発現カセットを含むタバコ植物またはその部分であって、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、１５３、１５４、２０２、および２０３、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列の少なくとも２１ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物またはその部分を提供する。
別の態様では、本開示は、タバコ細胞中で機能的であり、かつ配列番号：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつ、ＲＮＡ分子がポリペプチドの発現を抑制する、組換えＤＮＡ構築物を提供する。
一態様では、本開示は、タバコ細胞中で機能的であり、かつ配列番号：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。
本開示は、開示されるタバコ植物、株、品種またはハイブリッドからの植物材料を含む、乾燥タバコ、タバコブレンド物、タバコ製品をさらに提供する。
本開示はまた、総アルカロイドまたはニコチンの望ましいレベル、例えば、低ニコチンまたはニコチン非含有を含むタバコ株、栽培品種、または品種を育種する方法を提供する。一態様では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生すること、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定することであって、多型マーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つにより隣接された、または配列番号１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群から選択される配列を有するいずれか２つの遺伝子座により隣接された染色体間隔にある、遺伝子型判定すること、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択することを含む、方法を提供する。
一態様では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生すること、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定することであって、多型マーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカー、または配列番号１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群から選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの２ｃＭ以内にある、遺伝子型判定すること、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択することを含む、方法を提供する。一態様では、多型マーカーは、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーである。
別の態様では、本開示は、低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する方法であって、（ａ）タバコ生殖質の集合物から核酸を単離すること、（ｂ）Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座に密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについて核酸をアッセイすること、および（ｃ）マーカーアッセイに基づいて低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択することを含む、方法を提供する。
[本発明1001]
Ｎｉｃ1ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、50またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分。
[本発明1002]
前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物である、本発明1001のタバコ植物またはその部分。
[本発明1003]
前記タバコ植物が、Ｎｉｃ2遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む、本発明1002のタバコ植物またはその部分。
[本発明1004]
前記タバコ植物が、ＥＲＦ189、ＥＲＦ115、ＥＲＦ221、ＥＲＦ104、ＥＲＦ179、ＥＲＦ17、およびＥＲＦ168からなる群から選択される2つもしくはそれ以上、3つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、5つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、または7つ全ての遺伝子中の1つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、本発明1002のタバコ植物またはその部分。
[本発明1005]
前記タバコ植物が、乾燥された場合に、70またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、本発明1002のタバコ植物またはその部分。
[本発明1006]
前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、本発明1002のタバコ植物またはその部分。
[本発明1007]
前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの40％未満のレベルのニコチンを含み、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、本発明1002のタバコ植物またはその部分。
[本発明1008]
前記タバコ植物が2．0％未満のニコチンレベルを含む、本発明1002のタバコ植物またはその部分。
[本発明1009]
Ｎｉｃ1ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、前記非トランスジェニック突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの60％未満まで低減し、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、前記対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、前記対照植物が、前記非トランスジェニック突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有し、前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、タバコ植物またはその部分。
[本発明1010]
本発明1001～1009のいずれかのタバコ植物の集団。
[本発明1011]
本発明1001～1009のいずれかのタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
[本発明1012]
熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥方法により産生された、本発明1011の乾燥タバコ材料。
[本発明1013]
本発明1011の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
[本発明1014]
本発明1011の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
[本発明1015]
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、本発明1014のタバコ製品。
[本発明1016]
無煙タバコ製品である、本発明1014のタバコ製品。
[本発明1017]
前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、本発明1016のタバコ製品。
[本発明1018]
Ｎｉｃ1ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、前記突然変異が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ 21、ＬＡＦＣ53、およびＬＮ ＫＹ171には存在しない、タバコ植物またはその部分。
[本発明1019]
前記タバコ植物が、Ｎｉｃ2遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む、本発明1018のタバコ植物またはその部分。
[本発明1020]
前記突然変異が、配列番号：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、および202～205、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の同一性を有する配列内に位置する、本発明1018のタバコ植物またはその部分。
[本発明1021]
前記突然変異が、配列番号：73、83、84、87、88、89、180、181、206、および207からなる群から選択される配列に対して少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、本発明1018のタバコ植物またはその部分。
[本発明1022]
前記タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオタバコ、およびオリエンタルタバコからなる群から選択される品種からのものである、本発明1018のタバコ植物またはその部分。
[本発明1023]
前記タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群から選択される品種からのものである、本発明1018のタバコ植物またはその部分。
[本発明1024]
本発明1018のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
[本発明1025]
前記タバコ植物が、0．2％～0．6％のレベルのニコチンを含む、本発明1024の乾燥タバコ材料。
[本発明1026]
前記タバコ植物が1．0％～3．0％のレベルのニコチンを含む、本発明1024の乾燥タバコ材料。
[本発明1027]
熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥方法により産生された、本発明1024の乾燥タバコ材料。
[本発明1028]
本発明1024の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
[本発明1029]
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、本発明1024のタバコ製品。
[本発明1030]
無煙タバコ製品である、本発明1024のタバコ製品。
[本発明1031]
配列番号：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、および202～205、およびその断片からなる群から選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ1ｂ＿ＥＲＦ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物またはその部分であって、前記阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、前記阻害配列が、配列番号：3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、および202～205、およびその断片からなる群から選択される配列の少なくとも21ヌクレオチドの断片に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、タバコ植物またはその部分。
[本発明1032]
前記Ｎｉｃ1ｂ阻害配列が、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、およびその組合せからなる群から選択される阻害性ポリヌクレオチドとして転写されることができる、本発明1031のタバコ植物またはその部分。
[本発明1033]
前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性プロモーターからなる群から選択される、本発明1031のタバコ植物またはその部分。
[本発明1034]
前記プロモーターが根特異的プロモーターである、本発明1031のタバコ植物またはその部分。
ｎｉｃ１およびｎｉｃ２欠失マーカーアレルを有するＦ５株を開発するための育種スキーム（＊（ｘ）は自家受精を指し示す）。 遺伝子座ｇ３１４３１および遺伝子座ｇ３１４３２の辺りの潜在的な選択的スプライシングバリアント。暗いボックスは検出された転写物を表す一方、明るいボックスはインシリコで生成されたＣＤＳモデルを表す。 ＥＲＦ１３０はそうではないが、ＥＲＦ１６、ＬＡ ＢＵ２１において欠失したＬＡ関連領域（すなわち、注釈付き遺伝子を含有しない、「Ｎｉｃ１ｂΔ」として参照される配列番号１；実施例２を参照）、またはｇ３２０８１（ベータ－グルコシダーゼ１８様遺伝子）の過剰発現は、ＬＡ ＢＵ２１においてニコチンおよび総アルカロイドの増加を結果としてもたらす。 人工マイクロＲＮＡを介する個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ（ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ２１０、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ２９、およびＥＲＦ９１Ｌ２）の抑制は、ニコチンレベルを対照植物の約５０％～９０％まで低減する。平均ニコチンレベルおよび標準誤差は表７からのデータに基づく。
配列の簡単な説明
配列番号：１は、ＴＮ９０×ＬＡ ＢＵ２１交雑から同定されたＬＡ関連領域の配列を示す。
配列番号：２はＮｉｃ１ｂ領域（ＬＡ関連領域を含む）の配列を示す。
配列番号：３～３７は、Ｎｉｃ１ｂ領域中の３５の注釈付き遺伝子（ＮＣＧ）のゲノムコーディング配列（典型的にはＡＴＧで開始して終止コドンで終了するが、一部の事例では非翻訳領域（ＵＴＲ）配列も含有するｇＤＮＡ）を示す。
配列番号：３８～７２は、Ｎｉｃ１ｂ領域中の３５の注釈付き遺伝子（ＮＣＧ）のｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号：７３～１０７は、Ｎｉｃ１ｂ領域中の３５の注釈付き遺伝子（ＮＣＧ）によりコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号：１０８～１１９は、選択されるＮＣＧ遺伝子を抑制するための例示的な成熟人工ｍｉＲＮＡ配列（センスまたはアンチセンス）を示す。
配列番号：１２０～１２４は、選択されるＮＣＧ遺伝子を編集するための例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
配列番号：１２５～１４５は、Ｎｉｃ１ｂ領域にわたるまたは該領域に隣接する２１のＳＮＰマーカー配列を示す。
配列番号：１４６～１４８は、遺伝子座ｇ３１４３２のゲノムコーディング、ｃＤＮＡ、およびアミノ酸配列をそれぞれ示す。
配列番号：１４９～１５１は、遺伝子座ｇ３１４４６のゲノムコーディング、ｃＤＮＡ、およびアミノ酸配列をそれぞれ示す。
配列番号：１５２～１５６は、Ｎｉｃ１ｂ領域からの複数のタンパク質コーディング遺伝子のゲノムコーディング配列および非非コーディングＲＮＡを示す。配列番号：１５７～１６１は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。配列番号：１６２～１８３は、対応するタンパク質または非コーディングＲＮＡ分子配列を示す。
配列番号：１８４～１８６は、正常アルカロイドタバコ株と低減アルカロイドタバコ株との間で差次的発現を呈する複数の転写因子遺伝子のゲノムコーディング配列を示す。配列番号：１８７～１８９は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。配列番号：１９０～１９２は、対応するタンパク質または非コーディングＲＮＡ分子配列を示す。
配列番号：１９３～２０１は、Ｎｉｃ１ｂ領域からの複数のＥＲＦ遺伝子のすぐ隣のまたは非コーディングＲＮＡをコードする遺伝子内のＳＮＰマーカー配列を示す。
配列番号：２０２および２０３は、Ｎｉｃ１ｂ領域と関連付けられる２つのＥＲＦ遺伝子のゲノムコーディング配列を示す。配列番号：２０４および２０５は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。配列番号：２０６および２０７は、対応するタンパク質配列を示す。
配列番号：２０８～２１４は、７つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子のゲノムコーディング配列を示す。配列番号：２１５～２２１は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。配列番号：２２２～２２８は、対応するタンパク質配列を示す。
様々な配列は、ヌクレオチド配列中の「Ｎ」またはアミノ酸配列中の「Ｘ」を含む。「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、または１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入であり得る。一部の事例（ｓｏｍｅ ｉｎｓｔａｎｔ）では、「Ｎ」の列が示される。「Ｎ」の数は、その位置における不定のヌクレオチドの実際の数と必ずしも一致しない。実際のヌクレオチド配列は、「Ｎ」の示されるセグメントより長いまたは短いものであり得る。同様に、「Ｘ」は、任意のアミノ酸残基または１つもしくはそれ以上のアミノ酸の欠失もしくは挿入であり得る。再度、「Ｘ」の数は、その位置における不定のアミノ酸の実際の数と必ずしも一致しない。実際のアミノ酸配列は、「Ｘ」の示されるセグメントより長いまたは短いものであり得る。
詳細な説明
他に定義されなければ、本明細書において使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。本開示の目的のために、以下の用語を以下において定義する。
例えば、全ての特許および刊行物を含む本明細書において参照される任意の参考文献は参照することにより全体が組み込まれる。
本明細書において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しなければ、複数への言及を含む。例えば、「化合物」（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含めて、複数の化合物を含んでもよい。
「約」という用語は、おおよそ、大まかに、その辺り、またはその領域中にあることを意味するために本明細書において使用される。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合、それは、示される数値の上および下に境界を広げることによりその範囲を修飾する。
本明細書において使用される場合、「Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座」は、Ｎｉｃ１ｂ領域内または該領域に密接に関連した任意の染色体位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎまたはｌｏｃａｔｉｏｎ）を指す。「Ｎｉｃ１ｂ領域」は、ＴＮ９０ゲノムからの配列番号２に対応し、かつ低アルカロイド形質と関連付けられるアレルを有する、約１５０万ｂｐの長さの染色体セグメントを指す。「ｎｉｃ１ｂ突然変異」はＮｉｃ１ｂ遺伝子座中の突然変異を指す。
本明細書において使用される場合、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ（または複数形Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ）は、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座におけるまたはその近くのＥＲＦ遺伝子または遺伝子座のいずれか１つを指し、例えば、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含む。表１１およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７、１７４：９９９－１０１１を参照。「ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異」はＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子中の突然変異を指す。本明細書において使用される場合、突然変異または突然変異体アレルは全て、小文字および斜体において示される。遺伝子、遺伝子座、またはタンパク質の名称は全て、大文字においてまたは大文字で開始して示され、斜体であるかまたは斜体でないことがある。
本明細書において使用される場合、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ（または複数形Ｎｉｃ２＿ＥＲＦｓ）は、Ｎｉｃ２遺伝子座におけるまたはその近くのＥＲＦ遺伝子または遺伝子座のいずれか１つを指し、例えば、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ１６８、ＥＲＦ１７、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１８９を含む。表１２；Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、（１０）：３３９０－４０９（２０１０）；およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７、１７４：９９９－１０１１を参照。
本明細書において使用される場合、突然変異は、遺伝子によりコードされる産物の発現または活性を変化させるために遺伝子に導入される遺伝性の遺伝子改変を指す。そのような改変は、遺伝子の任意の配列領域中、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、３’ＵＴＲ、またはターミネーター領域中にあり得る。一態様では、突然変異は、遺伝子産物の発現または活性を低減、阻害、または除去する。別の態様では、突然変異は、遺伝子産物の発現または活性を増加、上昇、強化、または増大させる。一態様では、突然変異は、特定のタバコ品種または栽培品種中に存在する天然の多型ではない。本明細書において使用される場合、「突然変異体アレル」は、遺伝子座からのアレルであって、アレルが突然変異を含むものを指す。本明細書において使用される場合、「突然変異誘発性」は、導入遺伝子を伴うことなくまたは突然変異関連の導入遺伝子が最終的な突然変異体中に残留することなく突然変異を生成することを指す。一態様では、突然変異誘発性はシスジェニックである。別の態様では、突然変異誘発性は遺伝子またはゲノム編集を介する。さらなる態様では、突然変異誘発性は、ランダム突然変異誘発、例えば、化学的（例えば、ＥＭＳ）または物理的（ｒ照射）突然変異誘発を介する。
本明細書において使用される場合、タバコ植物は、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属からの任意の植物であり得、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・アンプレキシカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ ２７１９８９、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）ＰＩ ５５５４７８、ニコチアナ・ビゲロビー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ）ＰＩ ５５５４８５、ニコチアナ・デブネイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｄｅｂｎｅｙｉ）、ニコチアナ・エクセルシオル（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）ＰＩ ２２４０６３、ニコチアナ・グルチノーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）ＰＩ ５５５５０７、ニコチアナ・グッドスピーデイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ）ＰＩ ２４１０１２、ニコチアナ・ゴセイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｓｓｅｉ）ＰＩ ２３０９５３、ニコチアナ・ヘスペリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｈｅｓｐｅｒｉｓ）ＰＩ ２７１９９１、ニコチアナ・ナイティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ）ＰＩ ５５５５２７、ニコチアナ・マリティマ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＰＩ ５５５５３５、ニコチアナ・メガロシフォン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）ＰＩ ５５５５３６、ニコチアナ・ヌディカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ ５５５５４０、ニコチアナ・パニクラータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）ＰＩ ５５５５４５、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）ＰＩ ５５５５４８、ニコチアナ・レパンダ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｅｐａｎｄａ）ＰＩ ５５５５５２、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・スアベオレンス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）ＰＩ ２３０９６０、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）ＰＩ ５５５５６９、ニコチアナ・トメントーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）ＰＩ ２６６３７９、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、およびニコチアナ・トリゴノフィラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ）ＰＩ ５５５５７２が挙げられるがそれに限定されない。一態様では、本明細書に記載のタバコ植物はニコチアナ・タバカム植物である。
一態様では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。一態様では、タバコ植物は、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。一態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、突然変異を除いて当該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、類似の条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、突然変異を除いて当該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。一態様では、タバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含み、対照植物は、突然変異を除いて当該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の態様では、タバコ植物は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択される総アルカロイドレベルを含む。別の態様では、タバコ植物は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む。
一態様では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いて当該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物またはその部分を提供する。一態様では、タバコ植物は、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。別の態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５０～９５、５５～９５、６０～９５、６５～９５、７０～９５、７５～９５、８０～９５、８５～９５、９０～９５、５５～９０、６０～８５、６５～８０、７０～７５、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、および９０～９５からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の態様では、タバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンまたは総アルカロイドを含む。別の態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む。
一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択される１つまたはそれ以上の配列を含む。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または９０００ヌクレオチド未満の配列または染色体セグメントを含む。別の態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または９０００ヌクレオチドの配列または染色体セグメントを含む。さらなる態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１００～１５００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、または１００～９０００ヌクレオチドの配列または染色体セグメントを含む。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、または８０００～９０００ヌクレオチドの配列または染色体セグメントを含む。
一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーの５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、または７００００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。別の態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーの１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１００～１５００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、または１００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。さらなる態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーの５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、または８０００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。
一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、およびその断片からなる群から選択される配列を含む。別の態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択される配列の５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、または７００００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。さらなる態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択される配列の１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１００～１５００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、または１００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択される配列の５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、または８０００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。
一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、およびその断片からなる群から選択される配列のいずれか２つにより隣接されておりかつ該２つの配列を含まない配列または染色体セグメントを含む。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つにより隣接されておりかつ該２つの配列を含まない配列または染色体セグメントを含む。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択される配列のいずれか２つにより隣接されておりかつ該２つの配列を含まない配列または染色体セグメントを含む。
一態様では、本開示はまた、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異、ｎｉｃ２突然変異、およびその組合せからなる群から選択される突然変異を含むタバコ品種、栽培品種、または株であって、タバコ品種、栽培品種、または株が、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ品種、栽培品種、または株の葉のグレードと同等の葉のグレードを有し、対照タバコ品種が、突然変異を除いて当該タバコ品種、栽培品種、または株と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ品種、栽培品種、または株を提供する。
一態様では、本開示は、非トランスジェニックタバコ植物またはその部分であって、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の値、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値ＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニックタバコ植物またはその部分をさらに提供する。別の態様では、そのような非トランスジェニックタバコ植物は、２．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる態様では、そのような非トランスジェニックタバコ植物は、１．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
一態様では、本開示はまた、非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、非トランスジェニック突然変異が、タバコ植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満まで低減し、タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、対照植物が、非トランスジェニック突然変異を除いて当該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物またはその部分を提供する。
一態様では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、突然変異がＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１には存在しない、タバコ植物またはその部分を提供する。一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１と比較してＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてより短い染色体移入を含む。別の態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の完全な遺伝子または完全な遺伝子コーディング配列の欠失を含まない。一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてホモ接合である。別の態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてヘテロ接合である。一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、点突然変異、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群から選択されるＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異を含む。一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異は、ランダム突然変異誘発および標的指向性突然変異誘発からなる群から選択されるアプローチにより導入される。別の態様では、本明細書において提供されるタバコ植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲからなる群から選択される標的指向性突然変異誘発アプローチにより導入される。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、配列番号：３、１３、１４、１７～１９、１５３、１５４、２０２、２０３、および２０８～２１４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一態様では、１つまたはそれ以上の突然変異は、配列番号：３、１３、１４、１７～１９、１５３、１５４、２０２、２０３、および２０８～２１４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、配列番号：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、２０５、および２１５～２２１、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコーディング配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一態様では、１つまたはそれ以上の突然変異は、配列番号：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、２０５、および２１５～２２１、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコーディング配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、配列番号：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一態様では、１つまたはそれ以上の突然変異は、配列番号：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一態様では、１つまたはそれ以上の突然変異は、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、配列番号：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコーディング配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一態様では、１つまたはそれ以上の突然変異は、配列番号：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコーディング配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、配列番号：８４、８７、８８、および８９、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一態様では、１つまたはそれ以上の突然変異は、配列番号：８４、８７、８８、および８９、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１（ＬＡ ＢＵ２１としても参照される）は、いくつかの戻し交雑を通じたキューバシガー品種からの低アルカロイド遺伝子のＢｕｒｌｅｙ ２１への組込みにより産生される低い総アルカロイドのタバコ株である（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．１９７０）。それは、その親であるＢｕｒｌｅｙ ２１の約３．５％（乾燥重量）と比較して約０．２％の総アルカロイド（乾燥重量）を有する。ＬＡ ＢＵ２１は、商業的に許容される基準よりかなり低い葉のグレードを有する。ＬＡ ＢＵ２１はまた、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質により特徴付けられる他の不都合な葉の表現型を呈する（ＣｈａｐｌｉｎおよびＷｅｅｋｓ、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．１６：４１６－４１８（１９７６）；Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｐ．Ｓｃｉ．１０：２１２（１９７０）；ＣｈａｐｌｉｎおよびＢｕｒｋ、Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．７５：１３３－１３６（１９８３））。ＬＡ ＢＵ２１の葉はさらに、葉の単位面積当たりのより高いポリアミン含有量、より高いクロロフィル含有量およびより多い葉肉細胞などの形質を呈する。
他に指定されなければ、タバコ植物、品種、栽培品種、または株についての本明細書に記載のアルカロイド、ポリアミン、もしくはニコチンレベル（もしくは別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）の測定値または葉のグレード指数値は、例えば、単一の代表的な植物の複数の葉の平均または単一の品種、栽培品種、もしくは株からのタバコ植物の代表的な集団からの平均測定値を含む、平均測定値を指す。他に指定されなければ、本明細書に記載のタバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、摘心後に葉番号３、４、および５から収集されたプールされた葉試料において摘心の２週後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、ニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミン（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）の最も高いレベルを有する葉において摘心後に測定される。一態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベルは、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０において摘心後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される連続する葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する葉において摘心後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群から選択される葉番号を有する３つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。
本明細書において使用される場合、葉の番号付けは、タバコの茎上の葉の位置に基づき、葉番号１は摘心後の最も若い葉（最上部）であり、最も高い葉番号は最も古い葉（最下部）に割り当てられる。
平均測定値（例えば、アルカロイドもしくはニコチンレベルまたは葉のグレード付け）を決定するためのタバコ植物の集団またはタバコ葉の集合物は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０といった任意のサイズであり得る。産業上承認される標準的なプロトコールに従って平均測定値またはグレード（ｇｒａｄ）指数値が決定される。
本明細書において使用される場合、「摘心」は、タバコ植物が栄養成熟に近く、かつ生殖生長の開始時期にある時の、ＳＡＭ、花、およびいくつかの隣接する葉までを含む、茎の頂部の除去を指す。典型的には、タバコ植物は、蕾のステージ（花が現れ始めた直後）において摘心される。例えば、温室または野外生育のタバコ植物は、５０％の植物が少なくとも１つの開いた花を有する時に摘心され得る。タバコ植物の摘心は、頂芽優勢の喪失を結果としてもたらし、かつアルカロイド産生の増加も誘導する。
典型的には、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、摘心の約２週後に測定される。他の時点もまた使用され得る。一態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、摘心の約１、２、３、４、または５週後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴付け）は、摘心の約３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９、または２１日後に測定される。
本明細書において使用される場合、「類似の生育条件」または「同等の生育条件」は、生育のためおよび２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間の意味のある比較を行うための類似の環境条件および／または耕種学的実施であって、環境条件および耕種学的実施のいずれも、２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間に観察される任意の差異に寄与せず、かつ該差異を説明しないようなものを指す。環境条件としては、例えば、光、温度、水（湿度）、ならびに栄養物（例えば、窒素およびリン）が挙げられる。耕種学的実施としては、例えば、種まき、切取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）、切落し（ｕｎｄｅｒｃｕｔｔｉｎｇ）、移植、摘心、および吸枝が挙げられる。Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９）、ｐｐ ７０－１０３のＣｈａｐｔｅｒ ４Ｂおよび４Ｃを参照。
「アルカロイド」は、植物中に天然に存在する複雑な窒素含有化合物であり、ヒトおよび動物において薬理学的効果を有する。「ニコチン」は、市販のシガレットタバコ中の主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカム中のアルカロイド含有量の約９０パーセントを占める。タバコ中の他の主要なアルカロイドとしては、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシンおよびアナタビンが挙げられる。微量のタバコアルカロイドとしては、ニコチン－ｎ－オキシド、Ｎ－メチルアナタビン、Ｎ－メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジルおよびその他が挙げられる。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異およびＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ特異的導入遺伝子のいずれも有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルの総アルカロイドまたは個々のアルカロイドを含む。別の態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ植物と比較して、より低いレベルの、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシンおよびアナタビンからなる群から選択される１種またはそれ以上のアルカロイドを含む。一態様では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。別の態様では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、１９％～２０％、２１％～２２％、２２％～２３％、２３％～２４％、２４％～２５％、２５％～２６％、２６％～２７％、２７％～２８％、２８％～２９％、または２９％～３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。さらなる態様では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。
アルカロイドレベルは、当該技術分野において公知の方法により、例えば、気体－液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイに基づく定量化により、アッセイされ得る。例えば、ニコチンアルカロイドレベルは、キャピラリーカラムおよびＦＩＤ検出器を備えた気体－液体クロマトグラフィーを使用する方法のためのＣＯＲＥＳＴＡ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ．７、１９８７およびＩＳＯ規格（ＩＳＯ ＴＣ １２６Ｎ ３９４ Ｅ．；Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １００：８２６－３５（１９９２）も参照）に基づくＧＣ－ＦＩＤ法により測定され得る。他に指定されなければ、本明細書に記載の全てのアルカロイドレベルは、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ ６２、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５による方法、ならびにＦｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．５５ Ｍａｒｃｈ ２３、１９９９において刊行（およびＶｏｌ．７４、Ｎｏ．４、Ｊａｎｕａｒｙ ７、２００９において補正）されたＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，Ｔｏｔａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｉｎ Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおいて定義される方法を使用して測定される。
代替的に、タバコの総アルカロイドは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：７９－８１（１９６９）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。簡潔に述べれば、タバコの試料を乾燥し、粉砕し、抽出した後に総アルカロイドおよび還元糖の分析を行う。方法では次に、脱色のために酢酸／メタノール／水抽出および木炭が用いられる。総アルカロイドの決定は、有色複合体を形成するための芳香族アミンの存在下でのニコチンアルカロイドとの塩化シアノゲンの反応に基づき、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。他に指定されなければ、本明細書に示される総アルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）に基づく。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異およびＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ特異的導入遺伝子のいずれも有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む。一態様では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満の平均ニコチンレベルを指す。別の態様では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの約０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～６％、６％～７％、７％～８％、８％～９％、９％～１０％、１１％～１２％、１２％～１３％、１３％～１４％、１４％～１５％、１５％～１６％、１６％～１７％、１７％～１８％、１８％～１９％、１９％～２０％、２１％～２２％、２２％～２３％、２３％～２４％、２４％～２５％、２５％～２６％、２６％～２７％、２７％～２８％、２８％～２９％、または２９％～３０％の平均ニコチンレベルを指す。さらなる態様では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの約０．５％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％の平均ニコチンレベルを指す。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０５％、０．０５％～０．７５％、０．７５％～０．１％、０．１％～０．１５％、０．１５％～０．２％、０．２％～０．３％、０．３％～０．３５％、０．３５％～０．４％、０．４％～０．５％、０．５％～０．６％、０．６％～０．７％、０．７％～０．８％、０．８％～０．９％、０．９％～１％、１％～１．１％、１．１％～１．２％、１．２％～１．３％、１．３％～１．４％、１．４％～１．５％、１．５％～１．６％、１．６％～１．７％、１．７％～１．８％、１．８％～１．９％、１．９％～２％、２％～２．１％、２．１％～２．２％、２．２％～２．３％、２．３％～２．４％、２．４％～２．５％、２．５％～２．６％、２．６％～２．７％、２．７％～２．８％、２．８％～２．９％、２．９％～３％、３％～３．１％、３．１％～３．２％、３．２％～３．３％、３．３％～３．４％、３．４％～３．５％、および３．５％～３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、０．０２％～０．２％、０．０３％～０．３％、０．０４％～０．４％、０．０５％～０．５％、０．７５％～１％、０．１％～１．５％、０．１５％～２％、０．２％～３％、および０．３％～３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
本開示はまた、他のタバコ形質、例えば、葉のグレード指数値に対して負の影響力を有さずに変化したニコチンレベルを有するタバコ植物を提供する。一態様では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、商業的に許容されるグレードの乾燥タバコを提供する。タバコのグレードは、葉の茎上の位置、葉のサイズ、葉の色、葉の均一性および完全性、熟度、感触、弾性、光沢（葉の呈色の強度および深さの他に輝きに関する）、吸湿性（周囲の水分を吸収および保持するタバコ葉の能力）、ならびに緑色の特徴または色合いが挙げられるがそれに限定されない要因に基づいて評価される。葉のグレードは、例えば、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅにより刊行されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅ（７ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§５１１）を使用して決定され得る。例えば、１９９０年１１月５日（５５ Ｆ．Ｒ．４０６４５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ３１ ａｎｄ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９３）；１９８９年３月２７日（５４ Ｆ．Ｒ．７９２５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｅ－Ｃｕｒｅｄ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ １１，１２，１３，１４ ａｎｄ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９２）；１９６５年１月８日（２９ Ｆ．Ｒ．１６８５４）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｅｅｄｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ４１）；１９６３年１２月８日（２８ Ｆ．Ｒ．１１７１９および２８ Ｆ．Ｒ．１１９２６）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｏｈｉｏ Ｃｉｇａｒ－Ｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ４２，４３，ａｎｄ ４４）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ５４ ａｎｄ ５５）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ５４ ａｎｄ ５５）；１９７１年４月に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｏｒｇｉａ ａｎｄ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｓｈａｄｅ－Ｇｒｏｗｎ Ｃｉｇａｒ－Ｗｒａｐｐｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ６２）を参照。ＵＳＤＡグレード指数値は、産業上承認されたグレード指数にしたがって決定され得る。例えば、Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２：３９－４０（１９８８）；Ｌｅｇａｃｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｂａｔｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃５２３２６７８２６－５２３２６７８３３、Ｊｕｌｙ １、１９８８、Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｏｓｅｄ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ）；およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｉｎｔｅｒｎ．、１９２：５５－５７（全ての以上の参考文献は参照することにより全体が組み込まれる）を参照。他に指定されなければ、本明細書に記載の任意の植物のためのＵＳＤＡグレード指数は、受領された連邦政府のグレードの０～１００の数値表現であり、全ての茎上の位置の加重平均である。より高いグレード指数はより高い品質を指し示す。代替的に、葉のグレードは、ハイパースペクトルイメージングを介して決定され得る。例えば、ＷＯ２０１１／０２７３１５（公開日２０１１年３月１０日；参照することにより全体が組み込まれる）を参照。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたはそれ以上のタバコ芳香化合物を含む。別の態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたはそれ以上のタバコ芳香化合物のレベルに対して影響力を有しないｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異、ｎｉｃ２突然変異、またはその組合せを含む。
本明細書において使用される場合、タバコ芳香化合物は、タバコの煙の風味および芳香と関連付けられる化合物である。これらの化合物としては、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、センブラノイドおよびラブダノイドジテルペン、および糖エステルが挙げられるがそれに限定されない。タバコ芳香化合物の濃度は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、液体クロマトグラフィー連結質量分析が挙げられるがそれに限定されない当該技術分野における任意の公知の代謝物プロファイリング方法により測定され得る。Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、ＷｅｃｋｗｅｒｔｈおよびＫａｈｌ編、（Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）（Ｍａｙ ２８、２０１３）を参照。
本明細書において使用される場合、「還元糖」は、遊離のまたは潜在的に遊離のアルデヒド（ａｌｄｅｈｄｙｅ）またはケトン基を有する任意の糖（単糖または多糖）である。グルコースおよびフルクトースは、煙のｐＨを低減することおよび「遊離」の非プロトン化ニコチンの量を効果的に低減することによりシガレットの煙中のニコチン緩衝剤として作用する。還元糖は、例えば、ニコチンおよび他のタバコアルカロイドの知覚的影響力を修飾することにより、煙の風味の均衡を取る。糖含有量とアルカロイド含有量との逆の関係性が、タバコ品種にわたり、同じ品種内において、および栽培条件により引き起こされる同じ植物株内において報告されている。還元糖レベルは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｄａｖｉｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：１３９－１４４（１９７６）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。例えば、試料は、炭酸ナトリウム溶液に対して透析される。銅ネオクプロインが試料に添加され、溶液が加熱される。銅ネオクプロインキレートは糖の存在下で還元されて有色複合体を結果としてもたらし、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはＮｉｃ２遺伝子座から１つまたはそれ以上の遺伝子活性を低減または除去するＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはＮｉｃ２遺伝子座における１つまたはそれ以上の天然に存在しない突然変異体アレルを含む。一態様では、これらの突然変異体アレルは、より低いニコチンレベルを結果としてもたらす。突然変異体Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはＮｉｃ２アレルは、ランダムまたは標的指向性突然変異誘発アプローチを含む当該技術分野において公知の任意の方法により導入され得る。
そのような突然変異誘発方法としては、エチルメチルスルフェート（ＥＭＳ）（ＨｉｌｄｅｒｉｎｇおよびＶｅｒｋｅｒｋ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ ｐｒｅｓｓ、ｐｐ ３１７－３２０、１９６５）またはＵＶ照射、Ｘ線、および高速中性子照射（例えば、Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．１９：１９７－２０３、１９７１；およびＰｏｅｈｌｍａｎ、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ）、１９８７を参照）、トランスポゾンタグ付加（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９８４；米国特許第４，７３２，８５６号および米国特許第５，０１３，６５８号）を用いる種子の処理の他に、Ｔ－ＤＮＡ挿入方法論（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８３；米国特許第５，１４９，６４５号）が挙げられるがそれに限定されない。ＥＭＳ誘導突然変異誘発は、ゲノムの長さにわたりランダムな点突然変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子突然変異誘発は、種子を中性子衝撃に曝露することからなり、中性子衝撃は二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす。トランスポゾンタグ付加は、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して遺伝子の発現を低減または除去することを含む。タバコ遺伝子中に存在し得る突然変異の種類としては、例えば、点突然変異、欠失、挿入、重複、および逆位が挙げられる。そのような突然変異は、望ましくは、タバコ遺伝子のコーディング領域中に存在するが、タバコ遺伝子のプロモーター領域、およびイントロン、または非翻訳領域中の突然変異もまた望ましいことがある。
加えて、変性ＨＰＬＣまたは選択されるＰＣＲ産物の選択的なエンドヌクレアーゼ消化を使用する、化学的に誘導される突然変異のためのスクリーニングの迅速かつ自動化可能な方法、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）もまた本開示に応用可能である。ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５－４５７を参照。遺伝子発現に影響するまたは遺伝子の機能に干渉する突然変異は、当該技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。遺伝子エクソン中の挿入突然変異は、通常、ヌル突然変異体を結果としてもたらす。保存された残基中の突然変異は、タンパク質の機能の阻害において特に効果的であり得る。一態様では、タバコ植物は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子中のナンセンス（例えば、終止コドン）突然変異を含む。
一態様では、本開示はまた、商業的に許容される葉の品質を維持しながら変化したニコチンレベルを有するタバコ株を提供する。これらの株は、精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ－ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１システム、およびその組合せを介してＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはＮｉｃ２遺伝子座における１つまたはそれ以上の遺伝子中に突然変異を導入することにより産生され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号を参照）。例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１（７）：３９７－４０５（２０１３）を参照。
突然変異誘発されたタバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に公知の任意の方法論を通じて為され得る。スクリーニングおよび選択の方法論の例としては、サザン解析、ポリヌクレオチドの検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物の検出のためのＲＴ－ＰＣＲ増幅、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＰａｃＢｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性の検出のための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイが挙げられるがそれに限定されない。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技術もまた、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用され得る。参照される全ての技術を行うための方法は公知である。
一態様では、本明細書において提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１ヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼにより突然変異誘発または編集される。
本明細書において使用される場合、「編集」または「ゲノム編集」は、内因性の植物ゲノム核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０のヌクレオチドの標的指向性突然変異誘発、または内因性の植物ゲノム核酸配列の除去もしくは置換を指す。一態様では、提供される編集された核酸配列は、内因性核酸配列と少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。一態様では、提供される編集された核酸配列は、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２～２０５、および２０８～２２１、およびその断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。別の態様では、提供される編集された核酸配列は、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２～２０５、および２０８～２２１からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ゲノム配列の標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、それは次に、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスにより修復される。次に配列改変が切断された部位において起こり、それは、ＮＨＥＪの場合に遺伝子破壊を結果としてもたらす欠失もしくは挿入、またはＨＲによるドナー核酸配列の組込みを含み得る。一態様では、提供される方法は、提供されるヌクレアーゼを用いて植物ゲノムを編集して、ドナーポリヌクレオチドを用いるＨＲを介して植物ゲノム中の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または１０より多くのヌクレオチドを突然変異させることを含む。一態様では、提供される突然変異は、ヌクレアーゼを使用するゲノム編集により引き起こされる。別の態様では、提供される突然変異は、非相同末端結合または相同組換えにより引き起こされる。
一態様では、本明細書において提供される突然変異は、１つまたはそれ以上の酸化防止剤について、目的の遺伝子、例えば、生合成酵素、調節性転写因子、トランスポーター、異化酵素、またはその組合せからなる群から選択される遺伝子の発現または活性を活性化させる優性突然変異体を提供する。
一般的に微生物において同定されるメガヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの部位特異的な消化を結果としてもたらす高い活性および長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有する特有の酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作型は、典型的には、伸長されたＤＮＡ認識配列（例えば、１４～４０ｂｐ）を有する。メガヌクレアーゼの操作は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの操作より困難であり得、その理由は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識および切断機能は単一のドメイン中に織り込まれているからである。特有の配列を認識しかつ向上したヌクレアーゼ活性を有する新規のメガヌクレアーゼバリアントを作製するために突然変異誘発およびハイスループットスクリーニングの特別の方法が使用されている。
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合した操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの改変のために二本鎖ＤＮＡのほぼ任意の長さのストレッチを切断するように設計され得る。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列に結合するように操作されたジンクフィンガーアレイに融合したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的なＤＮＡ切断ドメインから構成される単量体から二量体を形成する。
ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～４個のジンクフィンガーアレイから構成される。標的ＤＮＡへの部位特異的な結合に寄与するジンクフィンガー∞－ヘリックスの開始に対して－１、＋２、＋３、および＋６の位置のアミノ酸を変更およびカスタマイズして、特定の標的配列に適合させることができる。他のアミノ酸はコンセンサス骨格を形成して、異なる配列特異性を有するＺＦＮを生成する。ＺＦＮ用の標的配列を選択するための規則は当該技術分野において公知である。
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するために二量体化を必要とし、したがって、Ｃ末端領域を有する２つのＺＦＮは切断部位の対向するＤＮＡ鎖（５～７ｂｐだけ分離されている）に結合することが必要とされる。２－ＺＦ－結合部位がパリンドロームの場合、ＺＦＮ単量体は標的部位を切断する（ｃｕｔｅ）ことができる。ＺＦＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＺＦＮからの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＺＦＮを含む。ＺＦＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働くように操作された一対のＺＦＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
いかなる科学理論によっても限定されないが、ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は様々な方法の１つを使用して原理的に再操作され得るので、カスタマイズされたＺＦＮは理論的に、ほぼ任意の遺伝子配列を標的化するように構築され得る。ジンクフィンガードメインを操作するための公開されている方法としては、Ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｐｏｏｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）、およびＭｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙが挙げられる。
ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合させることにより生成される人工的な制限酵素である。ＴＡＬＥＮペアの各メンバーが標的部位に隣接するＤＮＡ部位に結合する場合、ＦｏｋＩ単量体は二量体化して標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＴＡＬＥＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働く一対のＴＡＬＥＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際的に任意のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＴＡＬＥタンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の様々な植物細菌性病原体に由来するＤＮＡ結合ドメインである。キサントモナス病原体は、感染の間に宿主植物細胞中にＴＡＬＥを分泌する。ＴＡＬＥは核に移動し、そこで宿主ゲノム中の特定の遺伝子のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列を認識してそれに結合する。ＴＡＬＥは、３３～３４アミノ酸の１３～２８個のリピートモノマーから構成される中心のＤＮＡ結合ドメインを有する。各単量体のアミノ酸は、位置１２および１３における超可変アミノ酸残基を除いて高度に保存されている。２つの可変アミノ酸は反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸ペアＮＩ、ＮＧ、ＨＤ、およびＮＮはそれぞれ、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニン／アデニンを優先的に認識し、ＲＶＤのモジュレーションは、連続するＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識とのこの単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組合せを選択することによる特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能とした。
野生型ＦｏｋＩ切断ドメインの他に、突然変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントが、切断特異性および切断活性を向上させるために設計されている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向および空間的配置を有する標的ゲノム中の部位のための特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方は、高レベルの活性を達成するためのパラメーターである。
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との関係性は、設計可能なタンパク質を可能とする。ＤＮＡ Ｗｏｒｋｓなどのソフトウェアプログラムを使用してＴＡＬＥ構築物を設計することができる。ＴＡＬＥ構築物を設計する他の方法は当業者に公知である。Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：Ｗ１１７－１２２．；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）．３９：ｅ８２；およびｔａｌｅ－ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＦｏｋＩベースの方法のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの代替である。ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位におけるＤＮＡ配列を認識するために相補的塩基対形成を使用するＲＮＡガイド操作型ヌクレアーゼに基づく。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細菌および古細菌の適応免疫系の部分であり、配列依存的な方式で外来ＤＮＡを切断することによりウイルスなどの侵入性核酸からそれらを保護する。免疫は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端における２つの隣接リピートの間のスペーサーとして公知の侵入性ＤＮＡの短い断片の組込みにより獲得される。スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイは、侵入性ＤＮＡとのその後の遭遇の間に転写され、約４０ｎｔの長さの低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされ、ｃｒＲＮＡはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と合わさってＣａｓ９ヌクレアーゼを活性化およびガイドする。これは侵入性ＤＮＡ中のプロトスペーサーとして公知の相同的二本鎖ＤＮＡ配列を切断する。切断のための必要条件は、標的ＤＮＡの下流の保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在であり、これは通常、配列５－ＮＧＧ－３、より低い頻度でＮＡＧを有する。特異性は、ＰＡＭの約１２塩基上流のいわゆる「シード配列」により提供され、これはＲＮＡと標的ＤＮＡとの間でマッチしなければならない。Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はＣａｓ９と類似の方式で作用するが、Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。
さらに別の態様では、提供されるタバコ植物は、ニコチンデメチラーゼをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子座中の１つまたはそれ以上の突然変異を欠いた対照植物と比較して、低減した量のノルニコチンを付与するニコチンデメチラーゼをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子座中の１つまたはそれ以上の突然変異（例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、ＣＹＰ８２Ｅ１０）をさらに含む（米国特許第８，３１９，０１１号、同第８，１２４，８５１号、同第９，１８７，７５９号、同第９，２２８，１９４号、同第９，２２８，１９５号、同第９，２４７，７０６号を参照）。一態様では、記載される改変タバコ植物は、同等の条件下で生育および乾燥された場合の対照植物と比較して低減したニコチンデメチラーゼ活性をさらに含む。
本開示はまた、植物、特に、様々な商用の品種のタバコ植物を含むニコチアナ属の植物においてＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からの１つまたはそれ以上のポリペプチドの発現または機能を阻害するための組成物および方法を提供する。
一態様では、本開示は、タバコ植物またはその部分であって、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列を含む異種発現カセットを含み、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物またはその部分を提供する。別の態様では、本開示は、タバコ植物またはその部分であって、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列を含む異種発現カセットを含み、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、配列番号：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物またはその部分を提供する。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、およびその組合せからなる群から選択される阻害性ポリヌクレオチドとして転写されることができる。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、配列番号１０８～１１９からなる群から選択される配列を含む。
本明細書において使用される場合、「阻害する」、「阻害」、および「阻害すること」という用語は、目的の遺伝子産物（例えば、標的遺伝子産物）の発現または機能を減少させる当該技術分野において公知のまたは本明細書に記載の任意の方法として定義される。「阻害」は、２つの植物、例えば、遺伝学的に変化した植物と野生型植物との比較の文脈におけるものであり得る。代替的に、標的遺伝子産物の発現または機能の阻害は、同じ植物内の植物細胞、細胞小器官、器官、組織、もしくは植物部分の間または異なる植物の間の比較の文脈におけるものであり得、同じ植物もしくは植物部分内の発生的もしくは時間的ステージの間または植物もしくは植物部分の間の比較が挙げられる。「阻害」は、目的の遺伝子産物の機能または産生の完全な除去を含めて該完全な除去までの、その遺伝子産物の機能または産生の任意の相対的な減少を含む。「阻害」という用語は、標的遺伝子産物の翻訳および／もしくは転写または標的遺伝子産物の機能的活性を下方調節する任意の方法または組成物を包含する。一態様では、改変植物中のＮｉｃ１ｂ遺伝子座からの１つまたはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、突然変異体ではないまたはその遺伝子の発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物中の同じ遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満である。
「阻害配列」という用語は、植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からのニコチン生合成調節に関与する遺伝子の発現または機能を阻害することができる任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を包含し、例えば、全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、切断型ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のバリアント、センス方向のヌクレオチド配列、アンチセンス方向のヌクレオチド配列、センスまたはアンチセンス方向のヌクレオチド配列の相補体、ヌクレオチド配列の逆位領域、ヌクレオチド配列のヘアピン、二本鎖ヌクレオチド配列、一本鎖ヌクレオチド配列、およびその組合せなどである。「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾核酸、核酸アナログ、およびその組合せなどの配列を含む。
阻害配列は、標的遺伝子産物の名称により指定される。したがって、「Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列」は、例えば、転写および／もしくは翻訳のレベルにおいて、植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からのニコチン生合成調節に関与する遺伝子の発現を阻害することができる、または遺伝子産物の機能を阻害することができる阻害配列を指す。「阻害することができる」という語句がポリヌクレオチド阻害配列の文脈において使用される場合、それは、阻害配列自体が阻害効果を発揮すること；または、阻害配列が阻害性ヌクレオチド分子（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド）をコードし、もしくは阻害性ポリペプチド（例えば、標的遺伝子産物の発現もしくは機能を阻害するポリペプチド）をコードする場合、その転写（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする阻害配列の場合）もしくはその転写および翻訳（阻害性ポリペプチドをコードする阻害配列の場合）後に、それぞれ転写もしくは翻訳された産物が標的遺伝子産物に対する阻害効果を発揮する（例えば、標的遺伝子産物の発現もしくは機能を阻害する）ことを意味することが意図される。
開示されるＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、センス抑制／共抑制、アンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ干渉およびイントロン含有ヘアピンＲＮＡ干渉、アンプリコン媒介性干渉、リボザイム、小干渉性ＲＮＡ、人工または合成マイクロＲＮＡ、および人工トランス作用性ｓｉＲＮＡが挙げられるがそれに限定されない当該技術分野において公知の任意のサイレンシング経路または機構を介して遺伝子サイレンシングを誘発する配列であり得る。Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、所望のアウトカムに依存して、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約４００ヌクレオチドから本開示のタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチドまでの範囲内であってもよい。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、約５０～約４００ヌクレオチド、約７０～約３５０ヌクレオチド、約９０～約３２５ヌクレオチド、約９０～約３００ヌクレオチド、約９０～約２７５ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、約１００～約３５０ヌクレオチド、約１００～約３２５ヌクレオチド、約１００～約３００ヌクレオチド、約１２５～約３００ヌクレオチド、または約１２５～約２７５ヌクレオチドの長さの断片であり得る。一部の実施形態では、シトクロムＰ４５０ポリヌクレオチドの断片は、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約４００ヌクレオチドの長さ、および約７０～約４００ヌクレオチドの他のそのような値である。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドを含んでもよい。
「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、ＤＮＡを構成するポリヌクレオチドに本開示を限定することを意図しない。当業者は、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオシドとの組合せを含み得ることを認識する。そのようなデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオチドとしては、天然に存在する分子および合成アナログの両方が挙げられる。本開示のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、およびステム－アンド－ループ構造などが挙げられるがそれに限定されない全ての形態の配列を包含する。
一態様では、本開示は、タバコ細胞中で機能的であり、かつ配列番号：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８、およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつ、ＲＮＡ分子がポリペプチドの発現を抑制する、組換えＤＮＡ構築物を提供する。一態様では、ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびトランス作用性ｓｉＲＮＡからなる群から選択される。別の態様では、組換えＤＮＡ構築物は二本鎖ＲＮＡをコードする。これらの組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニックタバコ植物もしくはその部分、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品もまた提供される。一態様では、これらのトランスジェニック植物、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品は、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む。タバコ植物のニコチンレベルを低減する方法であって、これらの組換えＤＮＡ構築物のいずれかを用いてタバコ植物を形質転換することを含む、方法がさらに提供される。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の要素の間の機能的な連結を指す。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能とする機能的な連結である。作動可能に連結された要素は、連続または非連続であってもよい。
本明細書において使用され、かつ配列に関して使用される場合、「異種」は、外来種を起源とするか、または、同じ種からの場合、意図的なヒトの介入により組成物および／もしくはゲノム遺伝子座中でその天然の形態から実質的に改変されている配列を指す。該用語はまた、本明細書において「ポリヌクレオチド構築物」または「ヌクレオチド構築物」と称されることもある核酸構築物に適用可能である。この方式において、「異種」核酸構築物は、外来種を起源とするか、または、同じ種からの場合、意図的なヒトの介入により組成物および／もしくはゲノム遺伝子座中でその天然の形態から実質的に改変されている構築物を意味することが意図される。異種核酸構築物としては、例えば、形質転換方法または目的の別の植物を用いるトランスジェニック植物のその後の育種を介して、植物またはその植物部分に導入された組換えヌクレオチド構築物が挙げられるがそれに限定されない。一態様では、使用されるプロモーターは、プロモーターにより推進される配列にとって異種である。別の態様では、使用されるプロモーターは、タバコにとって異種である。さらなる態様では、使用されるプロモーターは、タバコにとって天然である。
一態様では、記載される改変タバコ植物はシスジェニック植物である。本明細書において使用される場合、「シスジェネシス」または「シスジェニック」は、全ての成分（例えば、プロモーター、ドナー核酸、選択遺伝子）が植物のみを起源とする（すなわち、非植物起源の成分は使用されない）植物、植物細胞、または植物ゲノムの遺伝子改変を指す。一態様では、提供される改変植物、植物細胞、または植物ゲノムはシスジェニックである。提供されるシスジェニック植物、植物細胞、および植物ゲノムは、使用準備済みのタバコ株に繋がり得る。別の態様では、提供される改変タバコ植物は、非タバコの遺伝材料および配列のいずれも含まない。
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」は、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む、遺伝子産物の生合成または産生を指す。
植物、特に、様々な商用の品種のタバコ植物を含むニコチアナ属の植物においてＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からの１つまたはそれ以上のポリペプチドを過剰発現させるための組成物および方法もまた本明細書において提供される。
一態様では、本開示は、タバコ細胞中で機能的であり、かつ配列番号：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８、およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。これらの組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニックタバコ植物もしくはその部分、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品もまた提供される。一態様では、これらのトランスジェニック植物、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品は、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較して増加したレベルのニコチンを含む。タバコ植物のニコチンレベルを増加させる方法であって、これらの組換えＤＮＡ構築物のいずれかを用いてタバコ植物を形質転換することを含む、方法がさらに提供される。
一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ関連の導入遺伝子または突然変異を有する各トランスジェニックまたは突然変異体株について、Ｎｉｃ２遺伝子座の１つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に特異的な突然変異または導入遺伝子事象とのそのようなトランスジェニックまたは突然変異体株の組合せもまた提供される。そのような１つまたはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子としては、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８が挙げられるがそれに限定されない（Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、（１０）：３３９０－４０９（２０１０））。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）、および、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制の組合せを有する植物は特に目的とされ、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制と、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制との組合せを有する植物はさらに特に目的とされ、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制の、ＥＲＦ１８９の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制との組合せを有する植物が本明細書においてさらに提供される。別の態様では、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制の、ＥＲＦ１１５の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制との組合せを有する植物が本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）、および、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制の組合せを有する植物は特に目的とされ、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制と、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制との組合せを有する植物はさらに特に目的とされ、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制の、ＥＲＦ１８９の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制との組合せを有する植物が本明細書においてさらに提供される。別の態様では、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制の、ＥＲＦ１１５の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制との組合せを有する植物が本明細書において提供される。
さらなる態様では、ＮＣＧ１２の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。別の態様では、ＮＣＧ１５の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。別の態様では、ＮＣＧ１６の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。別の態様では、ＮＣＧ１７の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。別の態様では、ＥＲＦ１０１の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。別の態様では、ＥＲＦ１１０の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。別の態様では、ＥＲＦ１６の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。別の態様では、ＥＲＦ１３０の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制、ならびに、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照動物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照動物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一態様では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。
一態様では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、以上の任意の植物は、同等の条件下のそのようなＮｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有しない対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、または６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有するタバコ植物が提供される。一態様では、以上の任意の植物は、同等の条件下のＮｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有しない対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下のそのようなＮｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有しない対照植物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、または６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現および１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有するタバコ植物が提供される。一態様では、そのような植物は、同等の条件下のＮｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有しない対照植物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の抑制を欠いた対照植物と比較してより低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異原性抑制は、全体的なＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子または全体的なＮｉｃ２＿ＥＲＦコーディング領域の欠失を含有しない。一態様では、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異原性抑制は、全体的なＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子または全体的なＮｉｃ２＿ＥＲＦコーディング領域の欠失を含有する。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異原性抑制は、全体的なＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子または全体的なＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦコーディング領域の欠失を含有しない。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異原性抑制は、全体的なＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子または全体的なＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦコーディング領域の欠失を含有する。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照植物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有し、かつ配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、２２２および２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を有し、かつ配列番号７３、８３、８４、および８７～８９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現をさらに有するタバコ植物が提供される。一態様では、この段落に記載の植物は、同等の条件下のそのような遺伝子導入または突然変異誘発原性の過剰発現を欠いた対照植物と比較してより高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一態様では、より低いニコチンまたは総アルカロイドレベルは、同等の条件下の対照植物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％低減していることを指す。
一態様では、より高いニコチンまたは総アルカロイドレベルは、同等の条件下の対照植物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、または８００％増加していることを指す。
一態様では、組換えＤＮＡ構築物または発現カセットはまた、トランスジェニック細胞の選択のための選択マーカー遺伝子を含み得る。選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子の他に、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４－ジクロロフェノキシアセテート（２，４－Ｄ）などの除草性化合物に対して抵抗性を付与する遺伝子が挙げられるがそれに限定されない。追加の選択マーカーとしては、β－ガラクトシダーゼなどの表現型マーカーおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質が挙げられる。
一態様では、組換えＤＮＡ構築物または発現カセットは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性プロモーター（例えば、葉特異的または根特異的プロモーター）からなる群から選択されるプロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターとしては、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよび米国特許第６，０７２，０５０号に開示される他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－８１２）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９－６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１－５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７２３－２７３０）；ならびにＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが挙げられる。例示的な化学物質誘導性プロモーターとしては、サリチル酸により活性化されるタバコＰＲ－１ａプロモーターが挙げられる。他の目的の化学物質誘導性プロモーターとしては、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１－１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７－２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照）ならびにテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９－２３７、および米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照）が挙げられる。使用され得る追加の例示的なプロモーターは、熱調節性遺伝子発現、光調節性遺伝子発現（例えば、エンドウマメｒｂｃＳ－３Ａ；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター；エンドウマメにおいて見出されるクロロフィルａｌｂ結合性タンパク質遺伝子；またはＡｒａｂｓｓｕプロモーター）、ホルモン調節性遺伝子発現（例えば、コムギのＥｍ遺伝子からのアブシジン酸（ＡＢＡ）応答性配列；オオムギおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＢＡ誘導性のＨＶＡ１およびＨＶＡ２２、およびｒｄ２９Ａプロモーター；ならびに創傷誘導性遺伝子発現（例えば、ｗｕｎｌ）、器官特異的遺伝子発現（例えば、塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子；により記載されるトウモロコシからの２３ｋＤａのゼイン遺伝子；またはインゲンマメ（β－ファセオリン遺伝子）、または病原体誘導性プロモーター（例えば、ＰＲ－１、ｐｒｐ－１、または（β－１，３グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性のｗｉｒｌａプロモーター、および線虫誘導性プロモーター、それぞれタバコ乾燥パセリのＴｏｂＲＢ７－５ＡおよびＨｍｇ－１）に関与するものである。
一態様では、提供されるタバコ植物は、ニコチン生合成または輸送に関与する遺伝子の活性の発現の増加または低減をさらに含む。ニコチン生合成に関与する遺伝子としては、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ－アデノシル－メチオニンシンセターゼ（ＳＡＭＳ）が挙げられるがそれに限定されない。ニコチン酸誘導体とメチルピロリニウム陽イオンとの縮合ステップを触媒するニコチンシンターゼは解明されていないが、２つの候補遺伝子（Ａ６２２およびＮＢＢ１）が提唱されている。ＵＳ２００７／０２４０７２８Ａ１およびＵＳ２００８／０１２０７３７Ａ１を参照。Ａ６２２はイソフラボンレダクターゼ様タンパク質をコードする。加えて、いくつかのトランスポーターがニコチンの移行に関与し得る。ＭＡＴＥと命名されたトランスポーター遺伝子がクローニングおよび特徴付けされている（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ １０６：２４４７－５２（２００９））。
一態様では、提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比較して、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の増加または低減したレベルのｍＲＮＡ、タンパク質、または両方をさらに含む。別の態様では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を直接的に抑制する導入遺伝子をさらに含む。別の態様では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む。別の態様では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子を過剰発現する導入遺伝子をさらに含む。
当該技術分野において公知の任意の好適な形質転換方法を使用する記載される組換え構築物または発現カセットを用いるタバコ植物の形質転換もまた開示される。ポリヌクレオチド配列をタバコ植物に導入する方法は当該技術分野において公知であり、安定な形質転換方法、一過性の形質転換方法、およびウイルス媒介性の方法が挙げられるがそれに限定されない。「安定な形質転換」は、植物に導入された目的のヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫に遺伝することができる形質転換を指す。「一過性の形質転換」は、配列が植物に導入されて一時的にのみ発現され、または一時的にのみ植物中に存在することを意味することが意図される。
ポリヌクレオチドを本開示の植物細胞に導入する好適な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３３４）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３１３－３３６；Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２－５６０６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性の形質転換（米国特許第５，１０４，３１０号、同第５，１４９，６４５号、同第５，１７７，０１０号、同第５，２３１，０１９号、同第５，４６３，１７４号、同第５，４６４，７６３号、同第５，４６９，９７６号、同第４，７６２，７８５号、同第５，００４，８６３号、同第５，１５９，１３５号、同第５，５６３，０５５号、および同第５，９８１，８４０号）、直接的な遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７－２７２２）、および弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）粒子加速（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１４１，１３１号、同第５，８８６，２４４号、同第５，８７９，９１８号、および同第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－９２６を参照）が挙げられる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１－４７７；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１－６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－９２６（ダイズ）；ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５－１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９－３２４（ダイズ）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）、Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．編（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎ．Ｙ．）、ｐｐ．１９７－２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５－４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０－５６６（ウィスカー媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５－１５０５（エレクトロポレーション）も参照。
別の態様では、組換え構築物または発現カセットは、植物をウイルスまたはウイルス核酸と接触させることにより植物に導入されてもよい。概しては、そのような方法は、本開示の発現カセットをウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に組み込むことを伴う。発現カセットにおいて使用するためのプロモーターはまた、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写のために利用されるプロモーターを包含することが認識される。ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を伴う、ポリヌクレオチドを植物に導入し、かつ、それにコードされるタンパク質を発現させる方法は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、同第５，８８９，１９０号、同第５，８６６，７８５号、同第５，５８９，３６７号、同第５，３１６，９３１号、およびＰｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２０９－２２１を参照。
器官発生によるものであれ胚発生によるものであれ、クローン法を使用してその後に繁殖され得る任意の植物組織は、組換え構築物または発現カセットを用いて形質転換されてもよい。「器官発生」により、新芽および根が成長点の中心から逐次的に発生するプロセスが意図される。「胚発生」により、新芽および根が、体細胞からであれ配偶子からであれ、協調した様式（逐次的ではない）において一緒に発生するプロセスが意図される。記載される様々な形質転換プロトコールのために好適な例示的な組織としては、カルス組織、既存の分裂性組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根端分裂組織）ならびに誘導性分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）、胚軸、子葉、葉盤、花粉、ならびに胚などが挙げられるがそれに限定されない。
一態様では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、ガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）タバコ、およびオリエンタル（Ｏｒｉｅｎｔａｌ）タバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。別の態様では、提供されるタバコ植物は、バーレイ（Ｂｕｒｌｅｙ）タバコ、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）タバコ、およびダークタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。
一態様では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコのバックグラウンドであり、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の熱風乾燥タバコの特徴を呈する。熱風乾燥タバコ（バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）またはブライトタバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ産生の約４０％の量を占める。熱風乾燥タバコは、乾燥の間に達するゴールデンイエローからディープオレンジの色のため、多くの場合に「ブライトタバコ」とも称される。熱風乾燥タバコは、軽い、鮮烈な芳香および味を有する。熱風乾燥タバコは、概しては、糖分が高くかつ油分が低い。主要な熱風乾燥タバコ生育国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニアおよび米国である。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、ＣＣ １３、ＣＣ ２７、ＣＣ ３３、ＣＣ ３７、ＣＣ ６５、ＣＣ ６７、ＣＣ ７００、ＧＦ ３１８、ＧＬ ３３８、ＧＬ ３６８、ＧＬ ９３９、Ｋ ３４６、Ｋ ３９９、Ｋ３２６、ＮＣ １０２、ＮＣ １９６、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ４７１、ＮＣ ５５、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ９２、ＰＶＨ １１１８、ＰＶＨ １４５２、ＰＶＨ ２１１０、ＳＰＥＩＧＨＴ １６８、ＳＰＥＩＧＨＴ ２２０、ＳＰＥＩＧＨＴ ２２５、ＳＰＥＩＧＨＴ ２２７、ＳＰＥＩＧＨＴ ２３６、および以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドである。別の態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｃｏｋｅｒ ４８、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３７１－Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３４７、ＧＬ ９３９、Ｋ １４９、Ｋ３２６、Ｋ ３４０、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＮＣ ２７ＮＦ、ＮＣ ３７ＮＦ、ＮＣ ５５、ＮＣ ６０、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８２、ＮＣ ９５、ＮＣ ２９７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７２９、ＮＣ ２３２６、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、Ｏｘ ２０７、Ｏｘ ４１４ ＮＦ、Ｒｅａｍｓ １２６、Ｒｅａｍｓ ７１３、Ｒｅａｍｓ ７４４、ＲＧ ８、ＲＧ １１、ＲＧ １３、ＲＧ １７、ＲＧ ２２、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ４、ＲＧ Ｈ５１、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－５８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－１０８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－ｌ１１、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－ｌ１７、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ－３、Ｖａ １１６、Ｖａ １８２、および以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドである。ＷＯ２００４／０４１００６Ａ１を参照。さらなる態様では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、Ｋ３２６、Ｋ３４６、およびＮＣ１９６からなる群から選択される任意の熱風乾燥のバックグラウンドである。
一態様では、提供されるタバコ植物は、空気乾燥タバコのバックグラウンドであり、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の空気乾燥タバコの特徴を呈する。空気乾燥タバコとしては、バーレイ、メリーランド、およびダークタバコが挙げられる。共通の因子は、乾燥が主に熱および湿度の人工的な供給源なしで為されることである。バーレイタバコは、ライトブラウンからダークブラウンの色であり、油分が高く、かつ糖分が低い。バーレイタバコは、納屋中で空気乾燥される。主要なバーレイ生育国は、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ、および米国である。メリーランドタバコは極めてふっくらしており、良好な燃焼特性、低いニコチンおよび中立的な芳香を有する。主要なメリーランド生育国としては、米国およびイタリアが挙げられる。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｃｌａｙ ４０２、Ｃｌａｙ ４０３、Ｃｌａｙ ５０２、Ｋｙ １４、Ｋｙ ９０７、Ｋｙ ９１０、Ｋｙ ８９５９、ＮＣ ２、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ２０００、ＴＮ ８６、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７１１、Ｒ ７１２、ＮＣＢＨ １２９、Ｂｕ ２１×Ｋｙ １０、ＨＢ０４Ｐ、Ｋｙ １４×Ｌ ８、Ｋｔ ２００、Ｎｅｗｔｏｎ ９８、Ｐｅｄｉｇｏ ５６１、Ｐｆ５６１およびＶａ ５０９からなる群から選択されるバーレイタバコのバックグラウンドである。さらなる態様では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、ＴＮ ９０、ＫＴ ２０９、ＫＴ ２０６、ＫＴ２１２、およびＨＢ ４４８８からなる群から選択される任意のバーレイのバックグラウンドである。別の態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｍｄ １０、Ｍｄ ４０、Ｍｄ ２０１、Ｍｄ ６０９、Ｍｄ ８７２およびＭｄ ３４１からなる群から選択されるメリーランドタバコのバックグラウンドである。
一態様では、提供されるタバコ植物は、暗色空気乾燥タバコのバックグラウンドであり、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の暗色空気乾燥タバコの特徴を呈する。暗色空気乾燥タバコは主に、暗色空気乾燥タバコにミディアムブラウンからダークブラウンの色および独特の芳香を与えるその乾燥プロセスにより他の種類から区別される。暗色空気乾燥タバコは主に、噛みタバコおよび嗅ぎタバコの産生において使用される。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｓｕｍａｔｒａ、Ｊａｔｉｍ、Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ Ｃｕｂａｎｏ、Ｂｅｓｕｋｉ、Ｏｎｅ ｓｕｃｋｅｒ、Ｇｒｅｅｎ Ｒｉｖｅｒ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ｓｕｎ－ｃｕｒｅｄ、およびＰａｒａｇｕａｎ Ｐａｓｓａｄｏからなる群から選択される暗色空気乾燥タバコのバックグラウンドである。
一態様では、提供されるタバコ植物は、暗色火力乾燥タバコのバックグラウンドであり、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の暗色火力乾燥タバコの特徴を呈する。暗色火力乾燥タバコは、慨しては、閉じた乾燥納屋の床上で低燃木の火を用いて乾燥される。それらの葉は、低い糖含有量であるが高いニコチン含有量を有する。暗色火力乾燥タバコは、パイプブレンド物、シガレット、噛みタバコ、嗅ぎタバコおよび強い味のシガーを作製するために使用される。暗色火力乾燥タバコの主要な生育領域は、米国のテネシー、ケンタッキー、およびバージニアである。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍａｄｏｌｅ、Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ Ｍａｄｏｌｅ、Ｎｅｗｔｏｎ’ｓ ＶＨ Ｍａｄｏｌｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、Ｇｒｅｅｎ Ｗｏｏｄ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｗｏｏｄ、Ｓｍａｌｌ Ｓｔａｌｋ Ｂｌａｃｋ Ｍａｍｍｏｔｈ、ＤＴ ５０８、ＤＴ ５１８、ＤＴ ５９２、ＫＹ １７１、ＤＦ ９１１、ＤＦ ４８５、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＶＡ ３０９、およびＶＡ ３５９からなる群から選択される暗色火力乾燥タバコのバックグラウンドである。
一態様では、提供されるタバコ植物は、オリエンタルタバコのバックグラウンドであり、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上のオリエンタルタバコの特徴を呈する。オリエンタルタバコは、トルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリア、およびルーマニアなどの東地中海地域において典型的に生育されるという事実に起因してギリシャ、アロマおよびトルコタバコとも称される。今日のオリエンタル品種に特徴的な小さい植物および葉のサイズの他に、その特有の芳香特性は、過去何世紀にもわたりそれが発生した乏しい土壌および苛酷な気候条件への植物の適合の結果である。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｉｚｍｉｒ、Ｋａｔｅｒｉｎｉ、Ｓａｍｓｕｎ、ＢａｓｍａおよびＫｒｕｍｏｖｇｒａｄ、Ｔｒａｂｚｏｎ、Ｔｈｅｓａｌｉａｎ、Ｔａｓｏｖａ、Ｓｉｎｏｐ、Ｉｚｍｉｔ、Ｈｅｎｄｅｋ、Ｅｄｉｒｎｅ、Ｓｅｍｄｉｎｌｉ、Ａｄｉｙａｎｍａｎ、Ｙａｙｌａｄａｇ、Ｉｓｋｅｎｄｅｒｕｎ、Ｄｕｚｃｅ、Ｍａｃｅｄｏｎｉａｎ、Ｍａｖｒａ、Ｐｒｉｌｅｐ、Ｂａｆｒａ、Ｂｕｒｓａ、Ｂｕｃａｋ、Ｂｉｔｌｉｓ、Ｂａｌｉｋｅｓｉｒ、および以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるオリエンタルタバコのバックグラウンドである。
一態様では、本明細書に記載のタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株（低アルカロイド、低ニコチン、高アルカロイド、または高ニコチンであり得る）は、ＢＵ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ４８、ＣＵ ２６３、ＤＦ９１１、ガルパオタバコ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ １０、ＫＹ １４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、「Ｐｅｒｉｑｕｅ」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－６、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ ３０９、またはＶＡ３５９、Ｍａｒｙｌａｎｄ ６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、ＳｈｉｒｅｙＬＣ、または当該技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の商用のタバコ品種に本質的に由来し、またはその遺伝的背景である。
暗色空気乾燥、バーレイ、メリーランド、暗色火力乾燥、またはオリエンタル種の全ての上記の特定の品種は、例示的な目的のためにのみ列記されている。任意の追加の暗色空気乾燥、バーレイ、メリーランド、暗色火力乾燥、オリエンタル品種もまた本出願において想定される。
記載されるタバコ植物の集団もまた提供される。一態様では、タバコ植物の集団は、１エーカー当たり約５，０００～約８０００、約５，０００～約７，６００、約５，０００～約７，２００、約５，０００～約６，８００、約５，０００～約６，４００、約５，０００～約６，０００、約５，０００～約５，６００、約５，０００～約５，２００、約５，２００～約８，０００、約５，６００～約８，０００、約６，０００～約８，０００、約６，４００～約８，０００、約６，８００～約８，０００、約７，２００～約８，０００、または約７，６００～約８，０００の植物の栽植密度を有する。別の態様では、タバコ植物の集団は、低い～中等度の肥沃度を有する土壌種中にある。
記載されるタバコ植物からの種子の容器もまた提供される。本開示のタバコ種子の容器は、任意の数、重量、または体積の種子を含有してもよい。例えば、容器は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００もしくはそれ以上、または約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００もしくはそれ以上より多い種子を含有し得る。代替的に、容器は、少なくとも約１オンス、５オンス、１０オンス、１ポンド、２ポンド、３ポンド、４ポンド、５ポンドもしくはそれ以上、または約１オンス、５オンス、１０オンス、１ポンド、２ポンド、３ポンド、４ポンド、５ポンドもしくはそれ以上より多い種子を含有し得る。タバコ種子の容器は、当該技術分野において利用可能な任意の容器であってもよい。非限定的な例として、容器は、箱、バッグ、小包、ポーチ、テープロール、チューブ、またはボトルであってもよい。
記載される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料もまた提供される。より高いレベルの総アルカロイドまたはニコチンを有する記載されるタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料がさらに提供される。
「乾燥」（ｃｕｒｉｎｇ）は、水分を低減し、かつ、タバコ葉に黄金色を与えかつそれによりデンプンが糖に変換されるクロロフィルの分解をもたらす熟成プロセスである。乾燥タバコは、したがって、収穫された緑色の葉と比較してより高い還元糖含有量およびより低いデンプン含有量を有する。一態様では、提供される緑色の葉のタバコは、従来の手段、例えば、熱風乾燥、納屋乾燥、火力乾燥、空気乾燥または太陽乾燥を使用して乾燥され得る。例えば、異なる種類の乾燥方法の説明のためにＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥タバコは、通常、１０％～約２５％の範囲内の水分含有量において数年（例えば、２～５年）にわたり圧縮条件において木製ドラム（例えば、大だる）または段ボール箱中で熟成される。米国特許第４，５１６，５９０号および同第５，３７２，１４９号を参照。乾燥および熟成されたタバコは次にさらに加工され得る。さらなる加工としては、様々な温度での蒸気の導入ありまたはなしでの真空下でのタバコのコンディショニング、低温殺菌、および発酵が挙げられる。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、同第５，３７２，１４９号；米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号；およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、熟成、および発酵されたタバコはさらに加工（例えば、切断、細断、膨化、またはブレンド）され得る。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、および同第４，９８７，９０７号を参照。一態様では、本開示の乾燥タバコ材料は太陽乾燥されている。別の態様では、本開示の乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、空気乾燥、または火力乾燥されている。
本開示のタバコ株、品種またはハイブリッドから得られるタバコ材料は、タバコ製品を作製するために使用され得る。本明細書において使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトでの使用または消費が意図されるタバコから作製または派生された任意の製品として定義される。
提供されるタバコ製品としては、シガレット製品（例えば、シガレットおよびビディシガレット）、シガー製品（例えば、葉巻タバコ（ｃｉｇａｒ ｗｒａｐｐｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ）およびシガリロ）、パイプタバコ製品、タバコに由来する製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、湿潤嗅ぎタバコ、乾燥嗅ぎタバコ、および噛みタバコ）、フィルム、チュワブル、タブ、成形部分、ゲル、消費可能単位、不溶性マトリックス、中空形状、再構成タバコ、ならびに膨化タバコなどが挙げられるがそれに限定されない。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０１９１５４８号を参照。
本明細書において使用される場合、「シガレット」は、「ロッド」および「フィラー」を有するタバコ製品を指す。シガレット「ロッド」は、シガレットペーパー、フィルター、プラグラップ（フィルター材料を含有するために使用される）、シガレットペーパー（フィラーを含む）をフィルターに保持するティッピングペーパー（ｔｉｐｐｉｎｇ ｐａｐｅｒ）、およびこれらの成分を一緒に保持する全ての接着剤を含む。「フィラー」としては、（１）再構成タバコおよび膨化タバコが挙げられるがそれに限定されない全てのタバコ、（２）非タバコ代用品（シガレットペーパー内に巻かれたタバコを伴ってもよいハーブ、非タバコ植物材料および他のスパイスが挙げられるがそれに限定されない）、（３）ケーシング、（４）風味物質、ならびに（５）全ての他の添加物（タバコおよび代用品に混合され、シガレット中に巻かれる）が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「再構成タバコ」は、シート形態に加工され、かつタバコに似せるように細片に切断された、タバコ塵および他のタバコ屑材料から作製されたタバコフィラーの部分を指す。コストの節約に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との反応を使用する風味発生の加工からシガレットの味に対するその寄与のために非常に重要である。
本明細書において使用される場合、「膨化タバコ」は、タバコが「膨らむ」ように好適な気体の膨張を通じて加工されて、低減された密度およびより大きい充填能力を結果としてもたらすタバコフィラーの部分を指す。それは、シガレットにおいて使用されるタバコの重量を低減する。
本開示の植物に由来するタバコ製品としてはまた、シガレットおよび他の喫煙物品、特に、フィルター要素を含むそれらの喫煙物品であって、喫煙可能材料のロッドがタバコブレンド物内に乾燥タバコを含むものが挙げられる。一態様では、本開示のタバコ製品は、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット（ｎｏｎ－ｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｓｓ ｆｉｌｔｅｒ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ）、通気式リセスフィルターシガレット（ｖｅｎｔｅｄ ｒｅｃｅｓｓ ｆｉｌｔｅｒ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ）、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される。別の態様では、本開示のタバコ製品は無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は燃焼されず、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、スヌース、および乾燥嗅ぎタバコが挙げられるがそれに限定されない。噛みタバコは、典型的には大きいパウチ様パッケージ中に包装されてプラグまたはツイストにおいて使用される粗く分割されたタバコ葉である。湿潤無煙タバコは、ルース（ｌｏｏｓｅ）形態またはパウチ形態において提供される湿潤の、より微細に分割されたタバコであり、典型的には、丸缶中に包装され、成人タバコ消費者の頬と歯肉との間に置かれるピンチとしてまたはパウチ中で使用される。スヌースは、熱処理される無煙タバコである。乾燥嗅ぎタバコは、口の中に置かれるまたは経鼻的に使用される微細に粉砕されたタバコである。さらなる態様では、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される。さらに別の態様では、本開示のタバコ製品は、電子加熱シガレット、ｅ－シガレット、電子的気化デバイスからなる群から選択される。
一態様では、本開示のタバコ製品はブレンドタバコ製品であり得る。別の態様では、本開示のタバコ製品は低ニコチンタバコ製品であり得る。さらなる態様では、本開示のタバコ製品は、約３ｍｇ／ｇ未満のレベルのノルニコチンを含んでもよい。例えば、そのような製品中のノルニコチン含有量は、３．０ｍｇ／ｇ、２．５ｍｇ／ｇ、２．０ｍｇ／ｇ、１．５ｍｇ／ｇ、１．０ｍｇ／ｇ、７５０μｇ／ｇ、５００ｐｇ／ｇ、２５０ｐｇ／ｇ、１００ｐｇ／ｇ、７５ｐｇ／ｇ、５０ｐｇ／ｇ、２５ｐｇ／ｇ、１０ｐｇ／ｇ、７．０ｐｇ／ｇ、５．０ｐｇ／ｇ、４．０ｐｇ／ｇ、２．０ｐｇ／ｇ、１．０ｐｇ／ｇ、０．５ｐｇ／ｇ、０．４ｐｇ／ｇ、０．２ｐｇ／ｇ、０．１ｐｇ／ｇ、０．０５ｐｇ／ｇ、０．０１ｐｇ／ｇ、または検出不可能であり得る。
一態様では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の態様では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０５％、０．０５％～０．７５％、０．７５％～０．１％、０．１％～０．１５％、０．１５％～０．２％、０．２％～０．３％、０．３％～０．３５％、０．３５％～０．４％、０．４％～０．５％、０．５％～０．６％、０．６％～０．７％、０．７％～０．８％、０．８％～０．９％、０．９％～１％、１％～１．１％、１．１％～１．２％、１．２％～１．３％、１．３％～１．４％、１．４％～１．５％、１．５％～１．６％、１．６％～１．７％、１．７％～１．８％、１．８％～１．９％、１．９％～２％、２％～２．１％、２．１％～２．２％、２．２％～２．３％、２．３％～２．４％、２．４％～２．５％、２．５％～２．６％、２．６％～２．７％、２．７％～２．８％、２．８％～２．９％、２．９％～３％、３％～３．１％、３．１％～３．２％、３．２％～３．３％、３．３％～３．４％、３．４％～３．５％、および３．５％～３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる態様では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、０．０２％～０．２％、０．０３％～０．３％、０．０４％～０．４％、０．０５％～０．５％、０．７５％～１％、０．１％～１．５％、０．１５％～２％、０．２％～３％、および０．３％～３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
本開示はまた、望ましいレベルの総アルカロイドまたはニコチン、例えば、低ニコチンまたはニコチン非含有を含むタバコ株、栽培品種、または品種を育種する方法を提供する。育種は、任意の公知の手順を介して実行され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰマッピング、ハプロタイプマッピングまたは類似の技術は、望ましい形質またはアレルをタバコ植物に移入または育種するためにマーカー補助選択（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用されてもよい。例えば、育種家は、Ｆ１ハイブリッド植物を使用してまたはＦ１ハイブリッド植物を耕種学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交雑してＦ２または戻し交雑世代において分離集団を作製することができる。Ｆ２または戻し交雑世代における植物は、当該技術分野において公知のまたは本明細書において列記される技術の１つを使用して所望の耕種学的形質または望ましい化学的プロファイルについてスクリーニングされ得る。期待される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に依存して、所望の個々の植物の同定を補助するために戻し交雑の各サイクルの前に選択された植物の自家受粉が行われ得る。戻し交雑または他の育種手順は、回帰性親の所望の表現型が回収されるまで反復され得る。本開示における回帰性親は、熱風乾燥品種、バーレイ品種、暗色空気乾燥品種、暗色火力乾燥品種、またはオリエンタル品種であり得る。他の育種技術は、例えば、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
記載されるタバコ植物を使用する植物育種プログラムの結果としては、本開示の有用な株、栽培品種、品種、子孫、自殖品種、およびハイブリッドが挙げられる。本明細書において使用される場合、「品種」という用語は、同じ種の他の植物からそれらを分離する一定の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、常にではないが多くの場合に、商業的に販売される。１つまたはそれ以上の確固とした形質を有するが、品種は、その品種内の個体間の非常に小さい全体的なバリエーションによりさらに特徴付けられる。「純粋株」品種は、組織または細胞培養技術を使用して単一の親からの自家受粉および選択、または栄養繁殖のいくつかの世代により作製されてもよい。品種は、別の株または品種に本質的に由来し得る。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ（１９６１年１２月２日；１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日、および１９９１年３月１９日にＧｅｎｅｖａにおいて改訂）により定義されるように、品種は、ａ）主に初期品種、または初期品種の遺伝子型もしくは遺伝子型の組合せの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現を保持しながら主に初期品種に由来する品種に由来し、ｂ）初期品種から明確に区別可能であり、かつｃ）誘導化の行為の結果としてもたらされる差異を除いて、初期品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現において初期品種と合致する場合に、初期品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種は、例えば、天然のもしくは誘導された突然変異体、ソマクローナルバリアント、初期品種の植物からのバリアント個体の選択、戻し交雑、または形質転換により得られ得る。第１のタバコ品種および第１の品種が本質的に由来する第２のタバコ品種は、本質的に同一の遺伝的背景を有すると考えられる。品種から区別されるような「株」は、最も多くの場合に、非商業的に、例えば植物研究において使用される植物の群を表す。株は、典型的には、１つまたはそれ以上の目的の形質について個体間の全体的なバリエーションをほとんど示さないが、他の形質について個体間で何らかのバリエーションがあってもよい。
一態様では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生すること、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定することであって、多型マーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つにより隣接された染色体間隔にある、遺伝子型判定すること、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択することを含む、方法を提供する。別の態様では、これらの方法は、選択された子孫タバコ植物を第２のタバコ品種と戻し交雑することをさらに含む。さらなる態様では、これらの方法は、（ｄ）選択された子孫植物をそれ自体とまたは第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上のさらなる子孫タバコ植物を産生すること、および（ｅ）低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択することをさらに含む。一態様では、選択するステップ（ｅ）はマーカー補助選択を含む。一態様では、これらの方法は、低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一態様では、これらの方法は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ移入を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一態様では、第２のタバコ品種はエリート（ｅｌｉｔｅ）品種である。別の態様では、これらの方法の遺伝子型判定するステップは１またはそれ以上の分子マーカーアッセイを伴う。別の態様では、この方法で使用される多型マーカーは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単一配列反復（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群から選択される多型を含む。別の態様では、選択された子孫タバコ植物は、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１と比較してＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてより短い染色体移入を含む。
別の態様では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生すること、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定することであって、多型マーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカー、または配列番号１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群から選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の以内にある、遺伝子型判定すること、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択することを含む、方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座と関連付けられるまたは密接に関連した１つまたはそれ以上の分子マーカーの他に、Ｎｉｃ２遺伝子座と関連付けられるまたは密接に関連した１つまたはそれ以上の分子マーカーについて同時にまたは並行して選択することを含む。
一態様では、本開示は、低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する方法であって、（ａ）タバコ生殖質の集合物から核酸を単離すること、（ｂ）Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座に密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについて核酸をアッセイすること、および（ｃ）マーカーアッセイに基づいて低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択することを含む、方法を提供する。一態様では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座に密接に関連したアッセイされる１つまたはそれ以上のマーカーは、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカー、または配列番号３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群から選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の以内にある。別の態様では、この方法は、Ｎｉｃ２遺伝子座に密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについてアッセイすることをさらに含む。一態様では、Ｎｉｃ２遺伝子座に密接に関連したアッセイされる１つまたはそれ以上のマーカーは、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８の１つにおいて位置する多型遺伝子座のいずれか１つの約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の以内にある。一態様では、この方法は、前記選択された植物のニコチンレベルを決定して低ニコチン形質を確認することをさらに含む。
低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生すること、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定することであって、多型マーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つにより隣接された染色体間隔にある、遺伝子型判定すること、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択することを含む、方法もまた開示される。一態様では、これらの方法は、低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一態様では、これらの方法は、Ｎｉｃ２移入を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一態様では、第２のタバコ品種はエリート品種である。別の態様では、これらの方法の遺伝子型判定するステップは１またはそれ以上の分子マーカーアッセイを伴う。別の態様では、この方法で使用される多型マーカーは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単一配列反復（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群から選択される多型を含む。別の態様では、選択された子孫タバコ植物は、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１と比較してＮｉｃ２遺伝子座においてより短い染色体欠失を含む。
本明細書において使用される場合、「遺伝子座」（ｌｏｃｕｓ）は、多型核酸、形質決定因子、遺伝子、またはマーカーが位置する染色体領域である。本開示の遺伝子座は集団中に１つまたはそれ以上の多型を含み、例えば、代替的なアレルが一部の個体中に存在する。本明細書において使用される場合、「アレル」は、特定の遺伝子座における代替的な核酸配列を指す。アレルの長さは、１ヌクレオチド塩基もの短さであり得るが、典型的にはより長い。例えば、ヘテロ接合個体の異なる染色体について、または集団中の異なるホモ接合もしくはヘテロ接合個体の間で起こるように、例えば、第１のアレルが１つの染色体上で起こり得ると共に、第２のアレルが第２の相同染色体上で起こる。本明細書において使用される場合、「染色体間隔」という用語は、単一の染色体上にあるゲノムＤＮＡの連続する線形スパンを示す。
本明細書において使用される場合、センチモルガン（「ｃＭ」）は、組換え頻度の尺度の単位である。１ｃＭは、１つの遺伝子座におけるマーカーが、単一世代における乗換えに起因して第２の遺伝子座においてマーカーから分離している可能性が１％に等しいことである。本明細書において参照される遺伝子距離は、コーサンビー（Ｋｏｓａｍｂｉ）関数を使用して組換え値から算出され得る（Ｋｏｓａｍｂｉ、Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｐ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｅｕｇｅｎｉｃｓ、１２：１７２－７５（１９４４））。
本明細書において使用される場合、「密接に関連した」または「関連付けられる」は、マーカーまたは遺伝子座が、別のマーカーまたは遺伝子座の約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の以内にあることを意味する。例えば、２０ｃＭは、約２０％に等しいまたは約２０％未満の頻度でのマーカーと遺伝子座との組換えを意味する。
本明細書において使用される場合、「移入」または「移入する」は、１つの遺伝的背景から別の遺伝的背景への遺伝子座の所望のアレルの伝達を指す。
本明細書において使用される場合、「交雑される」または「交雑」は、受精（例えば、細胞、種子または植物）を介して子孫を産生することを意味し、植物の間の交雑（有性）および自家受精（ｓｅｌｆ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎまたはｓｅｌｆｉｎｇ）を含む。
本明細書において使用される場合、「戻し交雑」および「戻し交雑する」は、子孫植物がその親の１つに戻して反復的に交雑される方法を指す。戻し交雑スキームにおいて、「ドナー」親は、移入される所望の遺伝子または遺伝子座を有する親植物を指す。「レシピエント」親（１回もしくは複数回使用される）または「回帰性」（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）親（２回もしくはそれ以上の回数使用される）は、遺伝子または遺伝子座が移入されている親植物を指す。初期交雑はＦ１世代を生じさせる。「ＢＣ１」という用語は回帰性親の２回目の使用を指し、「ＢＣ２」は回帰性親の３回目の使用を指す、などである。一態様では、戻し交雑は反復的に行われ、各連続する戻し交雑世代の子孫個体は、それ自体が同じ親遺伝子型に対して戻し交雑される。
本明細書において使用される場合、「単一遺伝子変換される」または「単一遺伝子変換」は、戻し交雑として公知の植物育種技術を使用して、または遺伝子操作を介して開発される植物であって、戻し交雑技術を介してまたは遺伝子操作を介して品種に移入される単一遺伝子に加えて、品種の所望の形態学的および生理学的特徴の本質的に全てが元通りとされるものを指す。
本明細書において使用される場合、「エリート品種」は、優れた耕種学的性能のための育種および選択の結果としてもたらされた任意の品種を意味する。
本明細書において使用される場合、マーカー補助選択または育種の文脈における「選択する」または「選択」は、ある特定の予め決定された基準に基づく、通常は集団からの、所望の個体の採集または選出の行為を指す。
本明細書において使用される場合、「形質」という用語は、遺伝子型により影響され得る細胞または生物の１つまたはそれ以上の検出可能な特徴を指す。表現型は、肉眼で、または当該技術分野において公知の評価の任意の他の手段により観察可能であり得、該手段は、例えば、顕微鏡法、生化学的分析、ゲノム解析、特定の耐病性についてのアッセイなどである。一部の場合には、表現型は、単一の遺伝子または遺伝子座、例えば、「単一の遺伝子形質」により直接的に制御される。他の場合には、表現型はいくつかの遺伝子の結果である。
本明細書において使用される場合、「マーカーアッセイ」は、特定の方法、例えば、少なくとも１つの表現型（例えば、種子の色、花の色、または他の視覚的に検出可能な形質）の測定、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、単一塩基伸長、電気泳動、配列アライメント、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、マイクロアレイベースの技術、および核酸シークエンシング技術などを使用して特定の遺伝子座における多型を検出する方法を意味する。
本明細書において使用される場合、「マーカー補助選択」（ＭＡＳ）は、表現型がマーカー遺伝子型に基づいて選択される方法である。「マーカー補助選択育種」は、所望の形質に関連した１つまたはそれ以上の核酸を植物から検出した後、それらの１つまたはそれ以上の核酸を有する植物または生殖質を選択することにより１つまたはそれ以上の植物中の所望の１つまたはそれ以上の形質を選択する方法を指す。
本明細書において使用される場合、「多型」は、集団中の１つまたはそれ以上のバリエーションの存在を意味する。多型は、核酸のヌクレオチド配列におけるバリエーションとしてまたはタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションとして現れてもよい。多型としては、１つまたはそれ以上の個体の集団における１つまたはそれ以上の遺伝子座における核酸配列または核酸の特徴の１つまたはそれ以上のバリエーションの存在が挙げられる。バリエーションは、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの塩基の変化、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入または１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含んでもよいがそれに限定されない。多型は、核酸複製におけるランダムなプロセスから、突然変異誘発を通じて、可動性ゲノム要素の結果として、コピー数多型から、ならびに、減数分裂、例えば、不均等交差、ゲノム重複および染色体の切断および融合のプロセスの間に生じてもよい。バリエーションは、共通して見出され得るか、または集団内に低い頻度で存在してもよく、前者は一般に植物育種においてより大きな有用性を有し、後者は、希少であるが重要な表現型バリエーションと関連付けられることがある。有用な多型としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単一配列反復（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰを挙げることができる。遺伝子マーカー、遺伝子、ＤＮＡ由来配列、ＲＮＡ由来配列、プロモーター、遺伝子の５’非翻訳領域、遺伝子の３’非翻訳領域、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、寛容性遺伝子座、サテライトマーカー、導入遺伝子、ｍＲＮＡ、ｄｓ ｍＲＮＡ、転写プロファイル、およびメチル化パターンもまた、多型を含んでもよい。加えて、前述のものの存在、非存在、またはコピー数におけるバリエーションは、多型を含んでもよい。
本明細書において使用される場合、「ＳＮＰ」または「単一ヌクレオチド多型」は、ゲノム配列中の単一のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）が変更されるまたは可変である場合に起こる配列バリエーションを意味する。「ＳＮＰマーカー」は、ＳＮＰがゲノム上の部位にマッピングされる場合に存在する。
本明細書において使用される場合、「マーカー」または「分子マーカー」または「マーカー遺伝子座」は、ゲノム上の特定の遺伝子座を特徴付けるために充分に特有の核酸またはアミノ酸配列を表すために使用される用語である。差次的に遺伝しかつ目的の表現型形質と連鎖不平衡を呈する限り、任意の検出可能な多型形質がマーカーとして使用され得る。各マーカーは、したがって、特有のヌクレオチド配列を有する、ＤＮＡの特定のセグメントの指標である。マップ位置は、互いに対する特定のマーカーの相対位置の尺度を提供する。形質が所与のマーカーに関連していると記載される場合、その配列が形質に影響する実際のＤＮＡセグメントは一般にマーカーと共分離することが理解されるであろう。形質のより精密かつ明確な局在性は、マーカーが形質の両側において同定される場合に得られ得る。交雑の子孫におけるマーカーの出現を測定することにより、形質の存在は、形質自体の出現を実際に評価することなく比較的単純な分子試験により検出することができ、形質の実際の評価は、形質が発現され得るステージまでおよび／または環境条件下で植物を生育することを必要とするので困難かつ時間を消費するものであり得る。一態様では、使用されるマーカーは、Ｑｇｅｎｅのバージョン２．２３（１９９６）およびデフォルトのパラメーターなどの当該技術分野において公知の方法を使用して測定して、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子座と２もしくはそれ以上、３もしくはそれ以上、４もしくはそれ以上、５もしくはそれ以上、６もしくはそれ以上、７もしくはそれ以上、８もしくはそれ以上、または９もしくはそれ以上のＬＯＤスコアを呈する。
本開示の任意のタバコ植物は、例えば、当該技術分野において公知の技術を使用する遺伝子構築物または導入遺伝子を用いる形質転換により、追加の耕種学的に望ましい形質をさらに含み得ることが理解される。非限定的に、所望の形質の例は、除草剤抵抗性、有害生物抵抗性、耐病性；高い収率；高いグレード指数値；治癒可能性；乾燥品質；機械的収穫可能性；保持能力；葉の品質；高さ、植物成熟度（例えば、早期の成熟、早期から中等度の成熟、中等度の成熟、中等度から後期の成熟、もしくは後期の成熟）；茎サイズ（例えば、小さい、中等度、もしくは大きい茎）；または植物当たりの葉数（例えば、少ない（例えば、５～１０枚の葉）、中等度（例えば、１１～１５枚の葉）、または多数（例えば、１６～２１）の葉）、または任意の組合せである。一態様では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物または種子は、１つまたはそれ以上の殺虫タンパク質、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶タンパク質またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）からの栄養殺虫タンパク質、例えば、ＶＩＰ３などを発現する１つまたはそれ以上の導入遺伝子を含む（例えば、Ｅｓｔｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３７を参照）。別の態様では、タバコ植物は、落葉病への抵抗性（米国特許第５，６８９，０３５号）またはシスト線虫への抵抗性（米国特許第５，４９１，０８１号）を付与する移入された形質をさらに含む。
本開示はまた、変化したニコチンまたは総アルカロイドレベルを含むがそのようなニコチンレベルの変化を有しない対応する初期タバコ植物の収率と同等の収率を有するタバコ植物を提供する。一態様では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、約１２００～３５００、１３００～３４００、１４００～３３００、１５００～３２００、１６００～３１００、１７００～３０００、１８００～２９００、１９００～２８００、２０００～２７００、２１００～２６００、２２００～２５００、および２３００～２４００ｌｂ／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。別の態様では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、約１２００～３５００、１３００～３５００、１４００～３５００、１５００～３５００、１６００～３５００、１７００～３５００、１８００～３５００、１９００～３５００、２０００～３５００、２１００～３５００、２２００～３５００、２３００～３５００、２４００～３５００、２５００～３５００、２６００～３５００、２７００～３５００、２８００～３５００、２９００～３５００、３０００～３５００、および３１００～３５００ｌｂ／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。さらなる態様では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物は、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異、ｎｉｃ２突然変異、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ導入遺伝子、Ｎｉｃ２導入遺伝子、またはその組合せを除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％の収率を提供する。さらなる態様では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物は、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異、ｎｉｃ２突然変異、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ導入遺伝子、Ｎｉｃ２導入遺伝子、またはその組合せを除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％の収率を提供する。
一態様では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、葉の単位面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈しない。一態様では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、葉の単位面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈しない。一態様では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、葉の単位面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の３つまたはそれ以上を呈しない。一態様では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、葉の単位面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。一態様では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、葉の単位面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈する。一態様では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、葉の単位面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。
一態様では、開示される改変タバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、葉の単位面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される形質に実質的に影響することなく所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含む。
一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物と実質的に同等の形質をさらに含み、該形質は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、葉の単位面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される。
一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い収率をさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％の収率をさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％の収率をさらに含む。
一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％の摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％の摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。
一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高いクロロフィルレベルをさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％のクロロフィルレベルをさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％のクロロフィルレベルをさらに含む。
一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の葉の単位面積当たりの葉肉細胞数と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い葉の単位面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の葉の単位面積当たりの葉肉細胞数と比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％の葉の単位面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。一態様では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の葉の単位面積当たりの葉肉細胞数と比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％の葉の単位面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。
一態様では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械収穫のために適合されている。別の態様では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械的に収穫される。
一態様では、提供されるタバコ植物はハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第１の品種の雌性親植物（例えば、種子親）の自家受粉を予防して、第２の品種の雄性親植物からの花粉が雌性親植物に授精することを可能とし、Ｆ１ハイブリッド種子が雌性植物において形成されることを可能とすることにより産生され得る。雌性植物の自家受粉は、花の発生の早期ステージにおいて花を除雄することにより予防され得る。代替的に、花粉形成は、雄性不稔性の形態を使用して雌性親植物において予防され得る。例えば、雄性不稔性は、導入遺伝子が小胞子形成および／もしくは花粉形成を阻害する雄性不稔性（ＭＳ）、もしくはトランスジェニック雄性不稔性、または自家不和合性により生じ得る。ＭＳを含有する雌性親植物は特に有用である。雌性親植物がＭＳである態様では、花粉が雄性稔性植物から収穫され、ＭＳ雌性親植物の柱頭に手動で適用されてもよく、結果として生じたＦ１種子が収穫される。
植物は、単交雑タバコＦ１ハイブリッドを形成するために使用され得る。雄性親植物からの花粉は、Ｆ１種子を形成するために、除雄された雌性親植物または雄性不稔性の雌性親植物に手動で移動される。代替的に、単交雑Ｆ１ハイブリッドが雌性親として使用されて異なる雄性親と交雑される三系交雑が実行され得る。別の代替として、２つの異なる単交雑のＦ１子孫がそれら自体で交雑される二重交雑ハイブリッドが作製され得る。二重交雑ハイブリッドを形成する場合の雌性親の自家受粉を予防するための特定の利点のために自家不和合性が使用され得る。
一態様では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は雄性不稔性である。別の態様では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は細胞質雄性不稔性である。雄性不稔性のタバコ植物は、当該技術分野において公知の任意の方法により産生されてもよい。雄性不稔性のタバコを産生する方法は、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．７６１ ｐｐに記載されている。
さらなる態様では、提供されるタバコ部分としては、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、新芽、細胞、およびプロトプラストが挙げられるがそれに限定されない。一態様では、提供されるタバコ部分は種子を含まない。一態様では、本開示は、生殖材料ではなく、かつ植物の天然の生殖を媒介しないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の態様では、本開示はまた、生殖材料であり、かつ植物の天然の生殖を媒介するタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の態様では、本開示は、光合成を介して維持され得ないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の態様では、本開示は、体細胞性タバコ植物細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞系列細胞とは異なり、植物生殖を媒介しない。
提供される細胞、組織および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、内乳、根、新芽、茎、さや、花、花序（ｉｎｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ）、茎、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、がく、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部、管束組織からのものであってもよい。別の態様では、本開示は、タバコ植物葉緑体を提供する。さらなる態様では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、葉毛もしくは根毛、貯蔵根、または塊茎を提供する。別の態様では、本開示は、タバコプロトプラストを提供する。
タバコ植物は、無性生殖または栄養繁殖を介してではなく、種子を介して天然に生殖することを当業者は理解する。一態様では、本開示は、タバコ内乳を提供する。別の態様では、本開示は、タバコ内乳細胞を提供する。さらなる態様では、本開示は、ヒトの介入なしでは生殖できない雄性または雌性不稔性タバコ植物を提供する。
一態様では、本開示は、配列番号：１～７２、１４７、１５０、１５７～１６１、１８７～１８９、および２０２～２０５およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む核酸分子を提供する。一態様では、本開示は、配列番号：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列類似性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の生物学的に活性のバリアントを提供する。本開示のタンパク質の生物学的に活性のバリアントは、わずか１～１５アミノ酸残基、わずか１０、わずか９、わずか８、わずか７、わずか６、わずか５、わずか４、わずか３、わずか２、またはわずか１アミノ酸残基だけそのタンパク質から異なるものであってもよい。Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からの遺伝子またはタンパク質のオルソログ遺伝子またはタンパク質もまた提供される。「オルソログ」は、共通の祖先遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種において見出される遺伝子である。オルソログは、ヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列のレベルにおいて少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性または類似性を共有してもよい。オルソログの機能は、多くの場合に種間で高度に保存されている。
本明細書において使用される場合、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定される比較ウインドウにわたる最大の一致のためにアライメントされた場合に同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は多くの場合に保存的アミノ酸置換により異なり、その場合、アミノ酸残基は類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方に調整されてもよい。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するとみなされる。
提供される核酸分子、ポリペプチド、またはタンパク質は、単離または実質的に精製され得る。「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、またはその生物学的に活性の部分は、その天然に存在する環境において見出されるようなそのポリヌクレオチドまたはタンパク質と通常一緒にあるまたは相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。例えば、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により産生される場合に他の細胞材料、もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学合成される場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
本開示は、開示されるタバコ植物からのタバコ材料を含むタバコ製品を産生する方法をさらに提供する。一態様では、方法は、タバコ植物から作られた熟成されたタバコ材料をコンディショニングして約１２．５％～約１３．５％から約２１％までその水分含有量を増加させ、コンディショニングされたタバコ材料をブレンドして望ましいブレンド物を産生することを含む。一態様では、タバコ製品を産生する方法は、ブレンド物をケーシングまたは風味付けすることをさらに含む。概しては、ケーシングプロセスの間に、ケーシングまたはソース材料をブレンド物に加えて、化学組成の均衡を取ることによりそれらの品質を増進し、かつある特定の所望の風味の特徴を発生させる。ケーシング加工についてのさらなる詳細は、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌ．ＤａｖｉｓおよびＭ．Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９において見出され得る。
提供されるタバコ材料はまた、熱処理（例えば、煮焼き（ｃｏｏｋｉｎｇ）、トースティング）、風味付け、酵素処理、膨張および／または乾燥が挙げられるがそれに限定されない方法を使用して加工され得る。発酵タバコおよび非発酵タバコの両方がこれらの技術を使用して加工され得る。好適な加工タバコの例としては、暗色空気乾燥、暗色火力乾燥、バーレイ、熱風乾燥、およびシガーフィラーまたはラッパーの他に、葉全体から茎を取り除く操作（ｗｈｏｌｅ ｌｅａｆ ｓｔｅｍｍｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）からの製品が挙げられる。一態様では、タバコ繊維は、新鮮重を基準にして最大７０％のダークタバコを含む。例えば、タバコは、米国特許出願公開第２００４／０１１８４２２号または同第２００５／０１７８３９８号に記載されるような加熱、蒸しおよび／または低温殺菌ステップによりコンディショニングされ得る。
提供されるタバコ材料は、発酵に供され得る。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、および同第５，３７２，１４９号を参照。葉の芳香の改良に加えて、発酵は、葉の色および感触のいずれかまたは両方を変化させ得る。また、発酵プロセスの間に、発生ガスが産生され得、酸素が取り込まれ得、ｐＨが変更され得、かつ保持される水の量が変更され得る。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、または乾燥および発酵タバコは、口腔製品への組込みの前にさらに加工（例えば、切断、膨化、ブレンド、ミーリング加工または粉砕）され得る。タバコは、一部の場合には、コポリマーとの混合ならびに任意選択的に香料および他の添加物の前に４８～５０重量パーセントのオーブン揮発分含有量（ｏｖｅｎ ｖｏｌａｔｉｌｅｓ ｃｏｎｔｅｎｔ）を有するロングカットの発酵乾燥湿潤タバコである。
一態様では、提供されるタバコ材料は、所望のサイズに加工され得る。一態様では、タバコ繊維は、２００マイクロメートル未満の平均繊維サイズを有するように加工され得る。一態様では、タバコ繊維は７５～１２５マイクロメートルである。別の態様では、タバコ繊維は、７５マイクロメートルまたはそれ未満のサイズを有するように加工される。一態様では、タバコ繊維は、ロングカットのタバコを含み、該タバコは、約１０カット／インチから約１１０カット／インチまでの幅および約０．１インチから約１インチまでの長さにカットまたは細断され得る。ダブルカットタバコ繊維は、ダブルカットタバコ繊維の約７０％が－２０メッシュおよび８０メッシュのメッシュサイズの間を落ちるような粒子サイズの範囲を有し得る。
提供されるタバコ材料は、約１０重量％もしくはそれ以上、約２０重量％もしくはそれ以上、約４０重量％もしくはそれ以上、約１５重量％～約２５重量％、約２０重量％～約３０重量％、約３０重量％～約５０重量％、約４５重量％～約６５重量％、または約５０重量％～約６０重量％の総オーブン揮発分含有量を有するように加工され得る。「湿潤」タバコは、典型的には、約４０重量％～約６０重量％（例えば、約４５重量％～約５５重量％、または約５０重量％）のオーブン揮発分含有量を有するタバコを指すことを当業者は理解する。本明細書において使用される場合、「オーブン揮発分」は、１１０℃に予め温めた強制送風オーブン中で３．２５時間にわたり試料を乾燥した後の試料の重量損失のパーセンテージを算出することにより決定される。口腔製品は、口腔製品を作製するために使用されるタバコ繊維のオーブン揮発分含有量とは異なる全体的なオーブン揮発分含有量を有し得る。記載される加工ステップは、オーブン揮発分含有量を低減または増加させ得る。
以下のリストは、例示的な実施形態の第１のセットを提供する。
１．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中の突然変異を含み、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
３．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
７．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含み、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９．前記タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１０．前記タバコ植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、実施形態１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１１．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中の突然変異を含み、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む、実施形態１１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、実施形態１１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１４．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、実施形態１１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１５．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、実施形態１１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１６．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、前記対照植物のグレーディング指数の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、実施形態１１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１７．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、実施形態１１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１８．前記タバコ植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、実施形態１１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１９．ｎｉｃ１ｂ突然変異を含むタバコ品種の植物またはタバコ遺伝子型であって、前記タバコ品種が、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ品種の葉のグレーディング指数と同等の葉のグレーディング指数を有し、前記対照タバコ品種が、前記突然変異を除いて前記タバコ品種と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、植物またはタバコ遺伝子型。
２０．前記タバコ品種が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む、実施形態１９の植物またはタバコ遺伝子型。
２１．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、実施形態１９の植物またはタバコ遺伝子型。
２２．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、実施形態１９の植物またはタバコ遺伝子型。
２３．非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含み、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の値、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２４．前記非トランスジェニックタバコ植物が、２．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、実施形態２３の非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２５．前記非トランスジェニックタバコ植物が、１．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニック実施形態２３のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２６．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中の非トランスジェニック突然変異を含み、前記非トランスジェニック突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満まで低減し、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、前記対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、前記対照植物が、前記非トランスジェニック突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２７．実施形態１～２６のいずれか１つのタバコ植物の集団。
２８．実施形態１～２６のいずれか１つのタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
２９．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥方法により産生された、実施形態２８の乾燥タバコ材料。
３０．実施形態２８の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
３１．前記乾燥タバコ材料が、重量により前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、実施形態３０のタバコブレンド物。
３２．前記乾燥タバコ材料が、体積により前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、実施形態３０のタバコブレンド物。
３３．実施形態２８の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
３４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、実施形態３３のタバコ製品。
３５．無煙タバコ製品である、実施形態３３のタバコ製品。
３６．前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、実施形態３５のタバコ製品。
３７．実施形態２８の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
３８．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中の突然変異を含み、前記突然変異がＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１品種には存在しない、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
３９．前記タバコ植物が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１品種と比較してＮｉｃ１ｂ遺伝子座においてより短い染色体移入を含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４０．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記突然変異を有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４１．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記突然変異を有しない対照タバコ植物中のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４２．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記突然変異を有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルの総アルカロイドを含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４３．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記突然変異を有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルの、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンからなる群から選択される１種またはそれ以上のアルカロイドを含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４４．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたはそれ以上の化合物を含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４５．前記突然変異がホモ接合である、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４６．前記突然変異がヘテロ接合である、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４７．前記突然変異が、点突然変異、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群から選択される、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４８．前記突然変異が、ランダム突然変異誘発および標的指向性突然変異誘発からなる群から選択されるアプローチにより導入される、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４９．前記標的指向性突然変異誘発が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲにより媒介される、実施形態４８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５０．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５１．前記突然変異が、配列番号：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５２．前記突然変異が、前記遺伝子の発現または活性を低減する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５３．前記突然変異が、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５４．前記突然変異が、配列番号：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５５．前記突然変異が、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、２０２～２０５、５４、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５６．前記突然変異が、配列番号：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５７．前記突然変異が、配列番号：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するコーディング配列を含む遺伝子内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５８．前記突然変異が、配列番号：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５９．前記突然変異が、配列番号：８４、８７、８８、および８９、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６０．前記植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記突然変異を有しないタバコ植物と比較して、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、およびＡ６２２からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の低減したレベルのｍＲＮＡ、タンパク質、または両方をさらに含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６１．前記植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６２．前記タバコ植物がハイブリッドである、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６３．前記部分が、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、新芽、細胞、およびプロトプラストからなる群から選択される、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６４．前記タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオタバコ、およびオリエンタルタバコからなる群から選択される品種からのものである、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６５．前記タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群から選択される品種からのものである、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６６．実施形態３８のタバコ植物の集団。
６７．実施形態３８のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
６８．前記突然変異を有しない対照タバコ植物からの乾燥タバコ材料と比較してより低いレベルのニコチンを含む、実施形態６７の乾燥タバコ材料。
６９．前記タバコ植物が０．２％～０．６％のレベルのニコチンを含む、実施形態６７の乾燥タバコ材料。
７０．前記タバコ植物が１．０％～３．０％のレベルのニコチンを含む、実施形態６７の乾燥タバコ材料。
７１．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥方法により産生された、実施形態６７の乾燥タバコ材料。
７２．実施形態６７の乾燥タバコ材料を含むタバコブレンド物。
７３．実施形態６７の乾燥タバコ材料を含むタバコ製品。
７４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、実施形態７３のタバコ製品。
７５．無煙タバコ製品である、実施形態７３のタバコ製品。
７６．前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、実施形態７５のタバコ製品。
７７．実施形態６７の乾燥タバコ材料を含む再構成タバコ。
７８．タバコ細胞中で機能的であり、かつ配列番号：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２、およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物。
７９．実施形態７８の組換えＤＮＡ構築物を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８０．前記タバコ植物が、前記組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較してより高いレベルのニコチンを含む、実施形態７９のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８１．実施形態７９のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
８２．実施形態８１の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
８３．タバコ植物のニコチンレベルを増加させる方法であって、実施形態７８の組換えＤＮＡ構築物を用いてタバコ植物を形質転換することを含む、方法。
８４．タバコ細胞中で機能的であり、かつ配列番号：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２、およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、かつ、前記ＲＮＡ分子が前記ポリペプチドの発現を抑制する、組換えＤＮＡ構築物。
８５．実施形態８４の組換えＤＮＡ構築物を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８６．前記ＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびトランス作用性ｓｉＲＮＡからなる群から選択される、実施形態８５のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８７．前記ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡをコードする、実施形態８５のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８８．前記タバコ植物が、前記組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む、実施形態８５のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８９．実施形態８５のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
９０．実施形態８９の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
９１．タバコ植物のニコチンレベルを低減する方法であって、実施形態８４の組換えＤＮＡ構築物を用いてタバコ植物を形質転換することを含む、方法。
９２．配列番号：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、およびその断片からなる群から選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、前記阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、前記阻害配列が、配列番号：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、およびその断片からなる群から選択される配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の同一性を有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９３．前記Ｎｉｃ１ｂ阻害配列が、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、およびその組合せからなる群から選択される阻害性ポリヌクレオチドとして転写されることができる、実施形態９２のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９４．前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性プロモーターからなる群から選択される、実施形態９２のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９５．前記プロモーターが根特異的プロモーターである、実施形態９２のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９６．配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、前記阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、前記阻害配列が、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９７．低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、
ａ．低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を前記低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生すること、
ｂ．前記低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて前記１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定することであって、前記多型マーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つにより隣接された染色体間隔にある、前記遺伝子型判定すること、ならびに
ｃ．前記低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択すること
を含む、方法。
９８．前記選択された子孫タバコ植物を前記第２のタバコ品種と戻し交雑することをさらに含む、実施形態９７の方法。
９９．ｄ．前記選択された子孫植物をそれ自体とまたは前記第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上のさらなる子孫タバコ植物を産生すること、および
ｅ．前記低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択すること
をさらに含む、実施形態９７の方法。
１００．選択する前記ステップ（ｅ）がマーカー補助選択を含む、実施形態９９の方法。
１０１．前記低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を生じさせる、実施形態９７の方法。
１０２．前記第２のタバコ品種がエリート品種である、実施形態９７の方法。
１０３．前記遺伝子型判定することが１またはそれ以上の分子マーカーアッセイを伴う、実施形態９７の方法。
１０４．前記多型マーカーが、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単一配列反復（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群から選択される多型を含む、実施形態９７の方法。
１０５．前記遺伝子型判定することが、配列番号：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態９７の方法。
１０６．前記遺伝子型判定することが、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態９７の方法。
１０７．前記遺伝子型判定することが、配列番号：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態９７の方法。
１０８．前記第１のタバコ品種が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１からなる群から選択される、実施形態９７の方法。
１０９．前記選択された子孫タバコ植物が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１と比較してＮｉｃ１ｂ遺伝子座においてより短い染色体移入を含む、実施形態９７の方法。
１１０．低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、
ａ．低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を前記低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生すること、
ｂ．前記低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて前記１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定することであって、前記多型マーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカー、または配列番号１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群から選択される配列を有するいずれかの遺伝子座のいずれか１つの２０ｃＭ以内にある、前記遺伝子型判定すること、ならびに
ｃ．前記低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択すること
を含む、方法。
１１１．前記遺伝子型判定することが、配列番号：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態１１０の方法。
１１２．前記遺伝子型判定することが、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態１１０の方法。
１１３．前記遺伝子型判定することが、配列番号：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態１１０の方法。
１１４．低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する方法であって、
ａ．タバコ生殖質の集合物から核酸を単離すること、
ｂ．Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座に密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについて前記核酸をアッセイすること、および
ｃ．前記マーカーアッセイに基づいて低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択すること
を含む、方法。
１１５．前記１つまたはそれ以上のマーカーが、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカー、または配列番号１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群から選択される配列を有するいずれかの遺伝子座のいずれか１つの約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の以内にある、実施形態１１４の方法。
１１６．前記アッセイすることが、配列番号：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態１１４の方法。
１１７．前記アッセイすることが、配列番号：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態１１４の方法。
１１８．前記アッセイすることが、配列番号：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイすることを含む、実施形態１１４の方法。
１１９．前記選択された植物のニコチンレベルを決定して前記低ニコチン形質を確認することをさらに含む、実施形態１１４の方法。
１２０．タバコ生殖質の前記集合物が半数体育種集団である、実施形態１１４の方法。
１２１．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１のいずれか１つから得られ得る染色体移入を含み、前記染色体移入が、配列番号１２５～１４５および１９３～２０１からなる群から選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つにより隣接されておりかつこれらを含まず、または配列番号１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群から選択される配列を有するいずれか２つの遺伝子座により隣接されており、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の、５５もしくはそれ以上、６０もしくはそれ以上、６５もしくはそれ以上、７０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、８０もしくはそれ以上、８５もしくはそれ以上、９０もしくはそれ以上、または９５もしくはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２２．前記タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む、実施形態１２１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２３．前記染色体移入が、配列番号１２６～１３５からなる群から選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つにより隣接されておりかつこれらを含まない、実施形態１２１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２４．前記染色体移入が、ＳＮＰマーカー配列番号１２９～１３２により隣接されておりかつこれらを含まない、実施形態１２１のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２５．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１のいずれか１つから得られ得る第１の染色体移入を含み、前記第１の染色体移入が、Ｎｉｃ１ｂマーカー番号１～２０７のいずれか２つにより隣接されておりかつこれらを含まず、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２６．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の前記対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、実施形態１２５のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２７．実施形態１２１～１２６および１３６～１４１のいずれか１つのタバコ植物の集団。
１２８．実施形態１２１～１２６のいずれか１つのタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
１２９．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥方法により産生された、実施形態１２８の乾燥タバコ材料。
１３０．実施形態１２８の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
１３１．前記乾燥タバコ材料が、重量により前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、実施形態１３０のタバコブレンド物。
１３２．前記乾燥タバコ材料が、体積により前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、実施形態１３０のタバコブレンド物。
１３３．実施形態１２８の乾燥タバコ材料を含むタバコ製品。
１３４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、実施形態１３３のタバコ製品。
１３５．ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、実施形態１３３のタバコ製品。
１３６．前記突然変異が、配列番号：３、１３、１４、１４６、１５３、１５４、１７、１８、１９、２０２、および２０３、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３７．前記突然変異が、配列番号：３、１３、１４、１５３、１５４、１７、１８、１９、２０２、および２０３、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３８．前記突然変異が、配列番号：３、１３、１４、１５３、１５４、１７、１８、１９、および２０３、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３９．前記突然変異が、配列番号：３、１３、１７、１８、および１９、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１４０．前記突然変異が、配列番号：３、１８、および１９、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、実施形態３８のタバコ植物またはその部分。
１４１．前記突然変異が、配列番号：７３、８３、８４、８７、８８、８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、実施形態３８のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
これまで本開示を全般的に記載したが、本開示は以下の実施例を参照してより容易に理解され、実施例は、実例として提供され、指定されない限り、本開示の限定であることは意図されない。
実施例１：低アルカロイド形質を有するＴＮ９０株ならびにｎｉｃ１およびｎｉｃ２欠失マーカーアレルを有する高中間アルカロイド形質を有する植物の開発
ＬＡ ＢＵ２１（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２突然変異を有するＬｏｗ Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ドナー親）とエリート栽培品種ＴＮ９０（レシピエント親）との交雑から育種集団を開発する。目標は、劣った葉の特徴を有する親ＬＡ ＢＵ２１株と比較した場合に向上した葉の品質も有する低アルカロイド植物を得ることである。所望の特徴（低アルカロイドレベル、向上した葉の品質）を有するＦ２植物をさらに自家受粉してＦ３世代、およびその後にＦ５世代を得る。図１は、低アルカロイド形質を有する自家受粉ＴＮ９０株の開発のためにたどられる育種方法を示す。
図１に示すように、ＴＮ９０タバコゲノム配列データベースに関して、異なるタバコ種（熱風、ダーク、オリエンタルおよびバーレイ）に属するいくつかの再シークエンシングされた株において観察される約１７０，０００の多型のＳＮＰに基づいて開発されたＡｘｉｏｍｅ（登録商標）アレイにおいて２２のＦ３植物をスクリーニングする。植物２２－６は、約４０．６％のレシピエント親ゲノムの復元を示し、さらなる開発のためにこれを選択する。Ｆ３世代はまた、低アルカロイドレベルを呈し、これはＬＡ ＢＵ２１において観察されるものと合致する。Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２ ＫＡＳＰアッセイを使用してＦ４世代をスクリーニングする（それぞれＮｉｃ１ＫＡＳＰおよびＮｉｃ２ＫＡＳＰマーカーに対応する、ＵＳ２０１６／０３７４３８７の配列番号：１３５および１３７を参照）。１９２のスクリーニングされたＦ４植物の全ては２つの欠失を有し、３つの植物（ｄｓ１０５９－１３８、ｄｓ１０５９－１４３およびｄｓ１０５９－１９２）をさらなる開発のために選択する。これらの３つの植物からの自家受粉した種子をさらに集め、Ｆ５世代を評価する。２２０全てのＦ５植物はｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルの両方についてホモ接合である。摘心の２週後に植物の頂部から３つ目、４つ目、および５つ目の葉から収集されたプールされた葉試料を測定することによりＦ５植物におけるアルカロイドレベルを決定する。全ての植物が低アルカロイド形質を呈するわけではなく、葉の表現型における際立った差異もまた観察され、いくつかの株は、商用のバーレイタバコにおいて観察されるものと合致する良好な葉の品質を呈する（表１）。
（表１）選択されたＦ５植物および対照植物のアルカロイドレベルおよび葉の表現型。全てのＦ５植物はｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルの両方についてホモ接合である。
Figure 0007479286000001
実施例２：低アルカロイド形質と関連付けられるさらなるゲノム領域の同定
ホモ接合のｎｉｃ１ＫＡＳＰおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルを有するにもかかわらず高いアルカロイドレベルを有する実施例１のＦ５植物は、ｎｉｃ１ＫＡＳＰおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失マーカーは低アルカロイド形質と１００％の関連を呈しないことを示唆する。この知見について調べるために、ＬＡＦＣ５３（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有する熱風乾燥型）、ＬＮ ＫＹ１７１（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有するダーク型）、およびＫＹ１７１（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有しないダーク品種）の他に、ｎｉｃ１ＫＡＳＰおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルについてホモ接合であるが高いアルカロイドレベルを呈する２つのＦ５株（Ｇ６１－３６およびＧ６１－３９）、ならびにｎｉｃ１ＫＡＳＰおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルについてホモ接合でありかつ低アルカロイドレベルを呈する２つのＦ５株（Ｇ６１－３１およびＧ６１－３７）についてさらなる再シークエンシングを実行する。以前に再シークエンシングされた株であるＢＵ２１、ＨＩ ＢＵ２１、ＬＩ ＢＵ２１およびＬＡ ＢＵ２１に加えてこれらの７つの株を、ＴＮ９０ゲノムデータベースを使用してマッピングした。
マッピングしたリードのカバレージ解析は、ＵＳ２０１６／０３７４３８７において以前に記載されたｎｉｃ１欠失セグメントＮＴ１．０－Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００２５０４の約２００万ｂｐ下流の２０００～３０００ｂｐの領域（配列番号１、以下「ＬＡ関連領域」）の同定に繋がる。ＬＡ関連領域は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＩ ＢＵ２１、ＬＮ ＫＹ１７１、ＬＡＦＣ５３の他に、低アルカロイドのホモ接合ｎｉｃ１ＫＡＳＰ ｎｉｃ２ＫＡＳＰ Ｆ５株Ｇ６１－３１およびＧ６１－３７において欠失している。対照的に、ＬＡ関連領域は、野生型（例えば、ＴＮ９０、ＢＵ２１、Ｋ３２６、ＮＬＭ、Ｋａｔｅｒｉｎｉ）の他に、高アルカロイドのホモ接合ｎｉｃ１ＫＡＳＰ ｎｉｃ２ＫＡＳＰ Ｆ５株Ｇ６１－３６およびＧ６１－３９において欠失していない（すなわち、存在する）。ＬＡ関連領域は既知の遺伝子を有しない。セリンスレオニンプロテインホスファターゼ遺伝子がこの領域の４８７７ｂｐ上流において見出され、ＥＲＦ（ＥＲＦ１８９のホモログ）がこの領域の５９，９４５ｂｐ下流において見出される。
さらに、Ｆ３植物（２２－６）のＳＮＰ遺伝子型判定は、ｎｉｃ１欠失セグメントＮＴ１．０－Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００２５０４の１，２５６，０６３ｂｐ下流から始まり２，７６６，１１８ｂｐ下流において終了するゲノム領域（約１，５１０，０５５ｂｐの長さ、配列番号２、本明細書において「Ｎｉｃ１ｂ領域」と称される）はＦ３植物（ＬＡ関連領域を含む）においてヘテロ接合であることを明らかにする。これは、Ｎｉｃ１ｂ領域の低アルカロイドアレルはシガーを起源としている可能性があり（ＬＡ ＢＵ２１はＢＵ２１と低アルカロイドキューバシガー品種との交雑から開発された）、結果として生じるＦ４および後の世代において分離することを示唆する。
また、約１７０，０００のＳＮＰを含有するＡｘｉｏｍｅアレイを使用して４７のＦ４植物および４８のＦ５植物を遺伝子型判定して、アルカロイドレベルとＬＡ関連領域の他にＮｉｃ１ｂ領域との相関をさらに検証する。３つの前駆Ｆ４世代植物（ｄｓ１０５９－１３８、ｄｓ１０５９－１４３およびｄｓ１０５９－１９２）の解析は、ヘテロ接合であるとしてまたはＬＡ ＢＵ２１様（Ｂ）アレルを有するとしてＬＡ関連領域およびＮｉｃ１ｂ領域を示す。同様に、４８のＦ５世代植物はＬＡ関連領域およびＮｉｃ１ｂ領域において分離を示し、Ｂアレル（ＬＡ ＢＵ２１様）を有する個体は低アルカロイドレベル（０．１３７％～０．４１７％、乾燥重量）を呈し、ヘテロ接合状態（Ｈ）または野生型アレル（Ａ）を有する個体は中等度から高いアルカロイドレベル（１．７９３％～５．４１９％、乾燥重量）を呈する。
実施例３：Ｎｉｃ１ｂ領域中の遺伝子およびマーカーの同定
Ｎｉｃ１ｂ領域の配列解析は、該領域からの少なくとも３５の注釈付き遺伝子を明らかにする（表２）。これらの遺伝子をＮｉｃ１ｂ Ｃｉｇａｒ Ｇｅｎｅ（「ＮＣＧ」）１～３５と称する。これらのＮＣＧ遺伝子の中で、６つのエチレン応答性転写因子様（ＥＲＦ様）遺伝子が同定される。ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、１０のＮＣＧは、摘心の７２時間後に収集された根試料から、ＢＵ２１に関してＬＡ ＢＵ２１植物において低減した発現を呈することを示す。ＢＵ２１と比較してＬＡ ＢＵ２１において６つのＥＲＦ様遺伝子のうちの４つを含む７つのＮＣＧは下方調節される一方、他の３つのＮＣＧは上方調節される。
ＬＡ ＢＵ２１、ＴＮ９０、および選択されたＦ５植物における３５のＮＣＧのそれぞれを再シークエンシングして、ＬＡ ＢＵ２１中に存在して遺伝子機能の喪失を引き起こし得る特定の天然の突然変異を同定する。遺伝子発現の調節異常を引き起こし得る非コーディング配列（例えば、プロモーター）における突然変異を同定するために追加の再シークエンシング解析も行う。
加えて、ＳＮＰマーカーを開発するためにＮｉｃ１ｂ領域内およびＮｉｃ１ｂ領域に隣接する多型もまた同定する。Ｎｉｃ１ｂ領域の遺伝子型判定のために２１のＳＮＰマーカーを開発する（表３）。さらなるＳＮＰマーカーを表４において提供する。これらのマーカーはＮｉｃ１ｂ領域内かつ様々なＥＲＦ遺伝子のすぐ隣にある。それらは、正常アルカロイド株を低アルカロイド株から区別するために使用され得るアレルを有する。
（表２）Ｎｉｃ１ｂ領域の注釈付き遺伝子。ａ ｇ３１４３１およびｇ３１４３２は選択的スプライシングを示すと思われる（図２を参照）。ｂ ｇ３１４４６は別の選択的スプライシングを示し得る。
Figure 0007479286000002
Figure 0007479286000003
Figure 0007479286000004
Figure 0007479286000005
Figure 0007479286000006
（表３）Ｎｉｃ１ｂ領域中およびその辺りのマーカー。（＊）ゲノム位置はＴＮ９０ゲノムに基づき、ＴＮ９０ゲノムはＮＣＧ遺伝子位置を表すためにも使用される。
Figure 0007479286000007
Figure 0007479286000008
（表４）Ｎｉｃ１ｂ領域からの複数のＥＲＦ遺伝子に密接に近接したＳＮＰマーカー。（＊）ゲノム位置は参照ＴＮ９０ゲノムに基づく。
Figure 0007479286000009
Figure 0007479286000010
実施例４：望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発するためのトランスジェニックアプローチ
過剰発現および抑制の両方のアプローチを採用して、ＮＣＧの機能を調べかつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２セットのトランスジェニック植物を生成し、１つは全長コーディング配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間の差次的発現を呈する全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて、３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）を試験する。過剰発現研究の一部をｎｉｃ１ ｎｉｃ２二重突然変異体バックグラウンド（例えば、ＬＡ ＢＵ２１）において実行して、突然変異体ｎｉｃ１アレルからの低アルカロイド突然変異体表現型を補完またはレスキューする同定された遺伝子（個々にまたは組合せで）の能力を試験する。
全長コーディング配列または人工マイクロＲＮＡ配列の発現のために、ＣｓＶＭＶプロモーターおよびＮＯＳターミネーターの他に、アクチン２プロモーターの指示の下でのカナマイシン選択マーカー（ＮＰＴ ＩＩ）を有しかつＮＯＳターミネーターを有するカセットを有するように発現ベクターを構築する。例示的な人工マイクロＲＮＡ配列は、表２において見出され得る。他の標的配列が、抑制性構築物の構築または遺伝子サイレンシングのための他のトランスジェニックアプローチ（例えば、ＲＮＡｉ、トランス作用性ｓｉＲＮＡなど）において使用され得ることを当業者は理解する。
ＤＮＡ衝撃または微粒子銃アプローチを使用して、目的の導入遺伝子を有する核酸構築物をタバコ葉ディスクに導入する。例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７：４８３－５１０；ならびにＯｋｕｚａｋｉおよびＴａｂｅｉ、２０１２、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９：３０７－３１０を参照。簡潔に述べれば、形質転換カセットを含有するプラスミドＤＮＡを以下のように１μｍの金粒子（ＤＮＡ／金）上にコーティングする。１μｍの金粒子を１８０℃で１２時間焼き、ストック溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を調製する。１０ショット用の混合物を作製するために、１００μｌのストック溶液を１．５ｍｌチューブ中の４０μｌの発現ベクターＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、１００μｌの２．５ＭのＣａＣｌ２、および４０μｌの０．１Ｍのスペルミジンと混合する。混合物を１３，０００×ｇで３０秒間遠心分離し、５００μｌの１００％のエタノールを用いてペレットを洗浄する。ＤＮＡ／金混合物を１００μｌの水に懸濁し、１０μｌをマクロキャリアーに適用し、乾燥させた後、砲撃（ｂｏｍｂａｒｄ）する。ＰＤＳ－１０００／Ｈｅシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）において部分真空（７１１ｍｍＨｇ）下での１，１００プサイ破砕ディスクを使用してプレート当たり２ショットを砲撃する。Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ（ＮＬＭ）およびＴｅｎｎｅｓｓｅｅ ９０（ＴＮ９０）タバコ葉ディスクを、ＲＮＡｉ構築物を用いる、および全長遺伝子構築物を用いる形質転換のために使用する。タバコ葉全体（約４５×３０ｍｍの長さ）をＭＳ培地上終夜置き、２日目に葉ディスクを構築物を用いて砲撃する。葉を次に小片（約５×５ｍｍ）に切断し、ＴＯＭ培地（２０ｇのスクロース／Ｌ；１ｍｇ／ＬのＩＡＡおよび２．５ｍｇ／ＬのＢＡＰを含むＭＳ培地）に戻して２７℃で３～５日間生育した後、３００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＴＯＭ培地（ＴＯＭ－Ｋａｎ）に移して生育する。組織を４～６週にわたり２～３週毎に新たなＴＯＭ－Ｋａｎプレートに移す（２７℃、１６ｈの光）。カナマイシン抵抗性初代新芽は衝撃の４～６週後に再生される。新芽をＭＳ－カナマイシンプレートに移して根を生育する。Ｔ１植物（およびその後の世代）からの葉および／または根を次に評価して１種またはそれ以上のアルカロイドの量を決定する。
実施例５：低アルカロイド形質を付与するＮｉｃ１ｂ領域中またはその辺りの新規の突然変異を開発するためのランダム突然変異誘発
メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）突然変異誘発または高速中性子衝撃を使用してタバコ植物のランダム突然変異誘発を行う。ＥＭＳ突然変異誘発は、ゲノムの長さにわたりランダムな点突然変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子突然変異誘発は、二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きい欠失を引き起こす中性子衝撃に種子を曝露することからなる。
ＥＭＳ突然変異誘発のために、１グラム（約１０，０００の種子）のＴｅｎｎｅｓｓｅｅ ９０タバコ（ＴＮ９０）種子を０．１％のＴｗｅｅｎ中で１５分間洗浄した後、３０ｍｌのｄｄＨ２Ｏ中に２時間浸す。１５０μｌの０．５％のＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ－０８８０）を次に種子／ｄｄＨ２Ｏ溶液に混合し、フード下において室温（ＲＴ；約２０℃）で８～１２時間（３０ｒｐｍにおいて回転）インキュベートする。液体を次に種子から除去し、夾雑物除去および廃棄のために１ＭのＮａＯＨに終夜混合する。種子を次に１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏを用いて２回、２～４時間洗浄する。洗浄した種子を次に０．１％の寒天溶液に懸濁した。
寒天溶液中のＥＭＳ処理した種子を、平箱中の水に浸したＣａｒｏｌｉｎａ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｍｉｘ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｏｉｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｋｉｎｓｔｏｎ、ＮＣ）に約２０００種子／平箱で均等に広げる。平箱を次にプラスチックラップを用いて覆い、生育室中に置く。実生が土壌から現れたら、プラスチックラップを穿刺して湿度を徐々に低下させる。プラスチックラップを２週後に完全に除去する。平箱を温室に移動し、ＮＰＫ肥料を施す。実生をフロートトレイに詰め、移植サイズまで生育する。植物をその後に畑に移植する。生育の間に、植物は自家受粉してＭ１種子を形成する。成熟ステージにおいて、５つの鞘を各植物から収穫し、個々の呼称を各植物からの種子のセットに与える。これはＭ１集団を形成する。各Ｍ０植物からのＭ１種子の複合物を生育し、Ｍ１植物からの葉をＤＮＡ抽出のために収集する。Ｎｉｃ１ｂ領域内、その辺り、またはそれに隣接する標的遺伝子を突然変異の同定のために増幅およびシークエンシングする。ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間の差次的発現を呈する全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて、３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）において突然変異を同定する。
実施例６：低アルカロイド形質を付与するＮｉｃ１ｂ領域中またはその辺りの新規の突然変異を開発するための標的指向性突然変異誘発
精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９システム、Ｃｐｆ１システム、またはＣｓｍ１システム）を介してＮｉｃ１ｂ遺伝子座（例えば、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０、およびＮＣＧ）中およびその辺りに突然変異を導入することにより、高い葉の品質を維持しながら低いニコチンを有するタバコ株を産生する。ＴＮ９０、Ｋ３２６およびＮａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅなどの商用のタバコ品種においてゲノム改変を行う。ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間の差次的発現を呈する全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて、３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）を編集する。
例えば、ＮＣＧ遺伝子からの特定の標的配列を認識するようにＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを設計および合成する。例示的なガイドＲＮＡ配列を表２において提供する。ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣｓｍ１タンパク質をコードする随伴する核酸（ＤＮＡプラスミド形態またはｍＲＮＡ形態のいずれかとして）を次に使用してタバコプロトプラストを形質転換する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１／Ｃｓｍ１リボ核タンパク質複合体は特定のＮＣＧ標的配列を認識して二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。内因性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復システムはＤＳＢを治し、それは、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を導入して潜在的な機能欠失型突然変異を結果としてもたらし得る。代替的に、所望の配列を有するドナー核酸分子を、鋳型分子として働くようにプロトプラスト形質転換において含めて、ＣＲＩＳＰＲ標的部位においてまたはその辺りに所望の配列を導入する。
生育室中のマゼンタボックスにおいて生育しているＴＮ９０タバコ葉からタバコプロトプラストを単離する。３～４週齢の植物からの良好に広がった葉（５ｃｍ）を葉の中央部分から０．５～１ｍｍの葉細片に切断する。葉細片の両側を漬けることにより、調製された酵素溶液（１％のセルラーゼＲ１０、０．２５％のマセロザイムＲ１０、０．４Ｍのマンニトール、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡ）中に葉細片を移す。デシケーターを使用して葉細片を暗所で３０分間真空浸潤し、撹拌なしで４時間から終夜、室温において暗所で消化を続ける。プロトプラストを１００μｍのナイロンフィルターにおいて濾過し、３ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いて精製する。プロトプラストを遠心分離し、Ｗ５ｎ溶液（１５４ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭＥＳ、９９１ｍｇ／ｌのグルコース、ｐＨ５．７）を用いて洗浄し、５×１０５／ｍｌの濃度でＷ５ｎ溶液に懸濁する。プロトプラストを氷上に３０分間保って、重力によりチューブの底に沈降させる。Ｗ５ｎ溶液を動かし、プロトプラストを室温でＰ２溶液に再懸濁する。５０μｌのＤＮＡ（１０～２０μｇのプラスミド）、５００μｌのプロトプラスト（２×１０５のプロトプラスト）および５５０μｌのＰＥＧ溶液（４０％ｖ／ｖ、１０ｍｌの４ｇのＰＥＧ４０００、０．２Ｍのマンニトール、０．１ＭのＣａＣｌ２）を１５ｍｌの微量遠心分離チューブ中で穏やかに混合し、混合物を室温で５分間インキュベートする。
プロトプラストをペレット化し、１ｍｌの２Ｘ ８ＥＮ１（８ＥＮ１：ＮＨ４ＮＯ３を含まないＭＳ塩、ＭＳビタミン、０．２％のミオイノシトール、４ｍＭのＭＥＳ、１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１ｍｇ／ｌのＩＡＡ、０．５Ｍのマンニトール、０．５ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１．５％のスクロース）を用いて再懸濁する。形質転換されたプロトプラストを等量の低融点アガロース（ＬＭＡ）を用いてゼリー状にし、０．２ｍｌのプロトプラスト－ＬＡＭを滴下してビーズを形成する。１０ｍｌの８ＥＮ１をビーズに加え、７日目に５ｍｌの８ＥＮ１を取り出し、５ｍｌの８ＥＮ２（０．２５Ｍのマンニトールを含む８ＥＮ１）を加え、さらに７日後（１４日）に、１０ｍｌの８ＥＮ２を取り出し、１０ｍｌの８ＥＮ２を加え、さらに７日後（２１日）に、５ｍｌの８ＥＮ２を取り出し、５ｍｌの８ＥＮ３（３％のスクロースを含みかつマンニトールを含まない８ＥＮ１）を加え、さらに７日後（２８日）に、１０ｍｌの８ＥＮ３を取り出し、１０ｍｌの８ＥＮ３を加える。微小カルスの生育までプロトプラストを２週間保つ。カルスが約５ｍｍに達するまで（通常、約２週）、それをＮＣＭ固体培地に移す。カルスをＴＯＭ－Ｋａｎ固体培地に移して新芽を生育し、形質転換されたタバコ植物を本明細書に記載の方法を使用して再生した。カルスまたは再生植物を、ＮＣＧ遺伝子中の所望の突然変異を有する遺伝子編集事象について試験および選択する。機能欠失型ＮＣＧアレル（例えば、早期終止コドンもしくはフレームシフト）または他の種類の突然変異（例えば、機能獲得もしくは新形質）の両方が生成される。
同様に、ゲノム編集技術（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣｓｍ１媒介性のＣＲＩＳＰＲ編集システム）を使用してＮｉｃ２遺伝子座からのＥＲＦ遺伝子も編集する（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）。機能欠失型ＥＲＦ突然変異（例えば、早期終止コドン）または他の種類の突然変異（例えば、機能獲得もしくは新形質）の両方が生成される。
実施例７：Ｎｉｃ１ｂ領域中のＥＲＦ様遺伝子を抑制しかつ低アルカロイドのタバコを生成するための顕性のリプレッサーの使用
Ｃ末端にＥＲＦ結合両親媒性抑制（ＥＡＲ）モチーフを取り付けることによりＮｉｃ１ｂ領域からの１つまたはそれ以上のＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０、およびＮＣＧ１７）のための顕性のリプレッサーを開発する。転写因子に取り付けられた場合、ＥＡＲモチーフは、転写因子の標的遺伝子の発現を活発に抑止することが示されている（Ｈｉｒａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．３４：７３３－７３９（２００３））。
簡潔に述べれば、ＥＲＦ－ＥＡＲ構築物を構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター）の制御下に置き、それを使用してプロトプラスト形質転換またはアグロバクテリウムにより野生型タバコを形質転換し、それにより、各構築物についてのトランスジェニック株の他に、エンプティベクター（ＶＣ）を用いて形質転換された対照株を生成する。導入遺伝子の発現を検証する。ニコチンレベルおよびニコチン生合成関連酵素（プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、キノリン酸シンターゼ（ＱＳ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＰＩＰファミリーオキシドレダクターゼＡ６２２）ならびにトノプラスト局在化ＭＡＴＥファミリートランスポーターＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２（ＭＡＴＥ１／２）の発現の両方を、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、スペルミジンシンターゼ（ＳＰＤＳ）、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＭＤＣ）、およびＳ－アデノシルメチオニンシンターゼ（ＳＡＭＳ）遺伝子の発現レベルと共に試験する。
実施例８：低ニコチンを含有するタバコ品種の育種
同定されたＮｉｃ１ｂ領域、その中の遺伝子、およびそれと関連付けられる分子マーカーにより補助されて、商業的に許容される葉の品質を有するｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異（例えば、Ｎｉｃ１ｂ領域の完全または部分的な欠失）を含む低アルカロイドのタバコハイブリッド、品種、および株を育種および産生する。ＮＣＧ遺伝子およびマーカーはまた、様々なニコチアナ生殖質、例えば、異なるニコチアナ種またはニコチアナ・タバカム株からの追加のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆアレルをスクリーニングするために使用される。スクリーニングされ得る４３のニコチアナ種、４９のニコチアナ・ルスティカ株、および約６００のニコチアナ・タバカム株の集合物が米国特許第７，７００，８３４号の表８において提供される。
新規のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆアレルを有するとして同定された生殖質は、栽培されたタバコを用いる育種のための供給源材料として使用される。戻し交雑または系統法などの標準的な育種方法と組み合わせた種間または種内ハイブリダイゼーション法は、ドナー供給源からの望ましいｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆまたはｎｉｃ２突然変異体アレルを栽培されたタバコに移入するために使用され得る。例えば、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、または両方の突然変異体アレルを含む低ニコチン品種（例えば、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１などのドナー親）は、望ましい遺伝的背景および耕種学的にエリートの形質を有するエリート高ニコチン品種に交雑される。この交雑からのＦ１子孫植物を任意選択的に、表３において例示される１つまたはそれ以上の分子マーカーについてアッセイする。Ｆ１子孫植物を次に親エリート高ニコチン品種（回帰性親）と戻し交雑する。本明細書に記載および開示される分子マーカーを使用してＢＣ１世代からの植物を遺伝子型判定して、より小さいｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆまたはｎｉｃ２欠失セグメントを有するタバコ植物を選択する。複数ラウンドの戻し交雑（例えば、５～７世代）後に、低アルカロイド形質および回帰性親エリート株からの他の望ましい形質の両方を含む新たなエリートタバコ品種が得られる。この新たなエリートタバコ品種はまた、Ｎｉｃ１ｂおよびＮｉｃ２遺伝子座の辺りの遺伝子組換え事象に起因する低アルカロイド形質と関連付けられるいかなる遺伝学的妨害も含まない。これらの組換え事象は、任意の関連付けられる有害な突然変異からｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆおよびｎｉｃ２突然変異を連鎖させないようにし、したがって、遺伝学的妨害を低減または回避する。上記の育種およびマーカー補助選択戦略を使用して、アルカロイドまたはＴＳＮＡレベルを低減する他の導入遺伝子または天然のアレルとの低ニコチン形質の上乗せ（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｇ）または積重ね（ｓｔａｃｋｉｎｇ）を達成することもできる。
低アルカロイドのタバコハイブリッド、品種、または株は、バーレイ種、ダーク種、熱風乾燥種、メリーランド種もしくはオリエンタル種のタバコとして作製することができ、またはＢＵ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ４８、ＣＵ ２６３、ＤＦ９１１、ガルパオタバコ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ １０、ＫＹ １４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、「Ｐｅｒｉｑｕｅ」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－６、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ ３０９、もしくはＶＡ３５９、Ｍａｒｙｌａｎｄ ６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、ＳｈｉｒｅｙＬＣ、もしくは当該技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の商用のタバコ品種に本質的に由来し得る。
実施例９：Ｎｉｃ１ｂ領域からの追加の遺伝子
非コーディングＲＮＡを含むいくつかの遺伝子がＮｉｃ１ｂ領域から同定される。それらを表５に列記する。ＥＲＦ１６を除いて、全てのこれらの遺伝子は、ＬＡ ＢＵ２１および低アルカロイドＦ５同胞植物と比較してＴＮ９０および高アルカロイドＦ５同胞植物においてより高い発現レベルを呈する。ＥＲＦ１６は、高アルカロイドおよび低アルカロイド植物において比較的類似したレベルで発現されるようである。実施例４～７に概説したようにこれらの追加の遺伝子をさらに研究する。例えば、過剰発現および抑制の両方のアプローチを採用して、これらの遺伝子の機能を調べかつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２セットのトランスジェニック植物を生成し、１つは全長コーディング配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。さらに、これらの遺伝子の突然変異体アレルを産生するために突然変異アプローチ（ランダム突然変異誘発または標的指向性編集のいずれか）も採用する。
Ｎｉｃ１ｂ領域からまたはその辺りからの選択される遺伝子または配列セグメントの過剰発現からの結果を表１３および図３において提供する。３５Ｓプロモーターを使用して過剰発現を推進する。ＬＡ ＢＵ２１における個々のＴ０形質転換体を同日に鉢植えし、これは、ＥＲＦ１３０についての対照構築物および過剰発現構築物、ＬＡ ＢＵ２１において欠失したＬＡ関連領域（すなわち、配列番号１；注釈付き遺伝子を含有せず「Ｎｉｃ１ｂΔ」として参照される；実施例２を参照）、ｇ３２０８１（ベータ－グルコシダーゼ１８様遺伝子）、およびＥＲＦ１６を含む。植物を鉢植えの１２週後に摘心する。摘心の２週後に植物の頂部から３、４、５、および６つ目の葉から収集したプールされた葉身試料を測定することによりアルカロイドレベルを決定する。４または５つの独立したＴ０植物を各構築物について試験し、総アルカロイドまたは個々のアルカロイドの平均レベルを決定する。図３に示すように、このセットのアルカロイドデータは、ＥＲＦ１６の過剰発現はニコチン産生を促進することを指し示す（対照と比べて７６％の増加）。他の微量アルカロイド（ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンを含む）もまたＥＲＦ１６過剰発現植物において増加しているようであり、これらは全て、対照と比べた７６％の総アルカロイドの増加に寄与する。ニコチンまたはアルカロイドレベルにおける明らかなシフトはＥＲＦ１３０、Ｎｉｃ１ｂΔ配列、またはｇ３２０８１の過剰発現から観察されない。
実施例１０：第７染色体からの複数の転写因子は正常アルカロイドタバコ株と低減アルカロイドタバコ株との間で差次的に発現される
表６に列記されるように、ＢＵ２１とＬＡ ＢＵ２１との間で差次的発現レベルを呈するいくつかの追加の転写因子が第７染色体から同定される。実施例４～７において概説したようにこれらの追加の遺伝子をさらに研究する。例えば、過剰発現および抑制の両方のアプローチを採用して、これらの遺伝子の機能を調べかつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２セットのトランスジェニック植物を生成し、１つは全長コーディング配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。さらに、これらの遺伝子の突然変異体アレルを産生するために突然変異アプローチ（ランダム突然変異誘発または標的指向性編集のいずれか）も採用する。
実施例１１：Ｎｉｃ１ｂ領域からの様々なＥＲＦ遺伝子はニコチン生合成に関与する
実施例４に概説したように、Ｎｉｃ１ｂ領域からまたはその近くの様々なＥＲＦ遺伝子（総称的に「Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ」と称する）を抑制するためにＭＩＲ６１４７骨格を使用して人工マイクロＲＮＡ（「ａｍｉＲＮＡ」）構築物を設計する。一部の人工マイクロＲＮＡは、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを特異的に抑制するために設計される。他のマイクロＲＮＡは、複数のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを同時に標的化するために設計される。一部の例示的な成熟人工マイクロＲＮＡ配列を表２において提供する。
Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ特異的ａｍｉＲＮＡ構築物を用いて形質転換したＴ０植物を、ａｍｉＲＮＡ－ＧＵＳ構築物を有する対応する対照植物と同日に鉢植えする。遺伝子発現研究のための根組織を、より大きい鉢に再鉢植えしながら植物から収集する。摘心の２週後に植物の頂部から３、４、５、および６つ目の葉から収集したプールされた葉身試料を測定することによりアルカロイドレベルを決定する。簡潔に述べれば、内部標準を含有する有機溶媒への液体／液体抽出を使用して約０．５ｇのタバコを抽出し、フレームイオン化検出（ＦＩＤ）を用いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により解析する。結果は、そのまままたは乾燥重量を基準として重量パーセント（Ｗｔ％）として報告され得る。乾燥重量に基づくデータの報告はオーブン揮発分（ＯＶ）の決定を必要とする。他に指定されなければ、本明細書に示す総もしくは個々のアルカロイドレベルまたはニコチンレベルは乾燥重量に基づく（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５またはＱＳ１２Ｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてアクチンを対照として用いるマルチプレックスｑＰＣＲ法を使用して事前の遺伝子発現スクリーニングを行う。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＱＳ １２Ｋ機器においてアクチン対照遺伝子を含む１８の遺伝子を３連で用いて特注のＯｐｅｎＡｒｒａｙにおいて植物の選択サブセットもまたスクリーニングする。
表７は、人工マイクロＲＮＡを介して選択された個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを抑制する１セットの独立したＴ０形質転換体からのアルカロイドデータを要約する。一部の例外（例えば、１８ＧＨ２０８３）を伴って、人工マイクロＲＮＡを介する個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの抑制は、ＨＩ ＢＵ２１バックグラウンド（すなわち、ｎｉｃ２単一突然変異体）においてニコチンを低減するが、野生型バックグラウンド（例えば、ｔ－ＮＬ Ｍａｄｏｌｅ（ＰｈＰｈ）ＳＲＣ）においてニコチンを低減しない（表７～９）。これは、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの間の冗長性を示唆する可能性があり、そしてまた、ｎｉｃ２単一突然変異体は、ニコチン調節における各個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの役割を評価するためのより感作されたバックグラウンドを提供することを指し示す。ＨＩ ＢＵ２１植物において個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの抑制は、ニコチンレベルを対照植物の約５０％～９０％まで低減する（表７および図４）。ａｍｉＲＮＡ植物において観察されるニコチンの低減は、複数のニコチン生合成遺伝子の低減した遺伝子発現と合致する（表１０）。
Ｔ１植物を産生し、カナマイシン抵抗性分離比、アルカロイドレベル、およびニコチン生合成遺伝子発現についてさらに解析する。交雑を行って複数のａｍｉＲＮＡを単一の植物中にもたらし、複数のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを同時に抑制する。
実施例１２：Ｎｉｃ１ｂおよび／またはＮｉｃ２遺伝子座と関連付けられるＥＲＦ遺伝子をマニピュレートすることによるニコチンレベルのモジュレ―ション
タバコにおいて望ましいニコチンレベルを達成するために、過剰発現または下方調節を介しておよびトランスジェニックまたは突然変異誘発のいずれかのアプローチを通じてＥＲＦ遺伝子の２つの群をマニピュレートする。ＥＲＦの各群は、Ｎｉｃ１ｂ領域またはＮｉｃ２領域の辺りでクラスター化される。ＥＲＦの第１の群は、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含み、これらは、Ｎｉｃ１ｂ領域の辺りでクラスター化されることが本明細書において見出される（個々にＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦおよび総称的にＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ）。表１１およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７、１７４：９９９－１０１１を参照。この第１のＥＲＦ群のコアメンバーは、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含む。この第１の群はまた、ＪＲＥ５Ｌ２を含み得る。ＥＲＦの第２の群は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８（個々にＮｉｃ２＿ＥＲＦおよび総称的にＮｉｃ２＿ＥＲＦｓ）を含み、これらはＨＩ ＢＵ２１（すなわち、ｎｉｃ２単一突然変異体）において欠失しているようである。Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、（１０）：３３９０－４０９（２０１０）を参照。第２の群のコアメンバーは、ＥＲＦ１８９およびＥＲＦ１１５を含む。この第２の群はまた、ＥＲＦ１６３、ＥＲＦ９１Ｌ１、ＥＲＦ１０４ΔＣ、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ１６８、ＥＲＦ１７、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７Ｌ１、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１７Ｌ２ΔＣ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＥＲＦ１０４Ｌ１ΔＣ、およびＥＲＦ１６８Ｌ１ΔＣを含むより大きい群に拡張され得る。表１２およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７、１７４：９９９－１０１１を参照。
トランスジェニックアプローチとしては、ＲＮＡ干渉ベースの遺伝子抑制（例えば、アンチセンス、共抑制、ヘアピンまたは逆位反復ベースのＲＮＡｉ、人工マイクロＲＮＡ、人工トランス作用性低分子干渉（ｔａ－ｓｉ）ＲＮＡ）およびドミナントネガティブ抑制因子（例えば、ＥＲＦ関連両親媒性抑制（ＥＡＲ）モチーフ）が挙げられる。導入遺伝子ベースまたはシス遺伝子ベースの抑制は、単一のＥＲＦ遺伝子に特異的に、またはＥＲＦ遺伝子のサブセットに同時に方向付けられ得る。ドミナントネガティブ抑制因子は、例えば、内因性のＥＲＦコーディング配列とインフレームのＥＡＲモチーフコーディング配列におけるノックインにより、シスジェニックとされ得る。
突然変異誘発アプローチとしては、化学的（例えば、ＥＭＳベースのＴＩＬＬＩＮＧ）または物理的（例えば、照射）のいずれかのランダム突然変異誘発およびゲノム編集が挙げられる。本明細書に記載の任意のゲノム編集技術を使用することができ、該技術としては、例えば、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９システム、Ｃｐｆ１システム、またはＣｓｍ１システムが挙げられる。
トランスジェニックまたは突然変異誘発アプローチは、コアメンバーに焦点を当てて、ＥＲＦの第１および第２の群の突然変異体アレルを生成するために使用される。機能欠失型（すなわち、ヌル）アレルおよび弱い突然変異体アレルの両方が産生される。Ｎｉｃ２＿ＥＲＦのレベルまたは活性を、潜在的にはＨＩ ＢＵ２１またはＬＡ ＦＣ５３において見出されるｎｉｃ２突然変異体アレルと類似のレベルまたは活性まで、抑制するためにＮｉｃ２＿ＥＲＦ突然変異体アレルの様々な組合せが産生される。Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦのレベルまたは活性を、潜在的にはＬＩ ＢＵ２１またはＬＡ ＦＣ５３において見出されるｎｉｃ１突然変異体アレルと類似のレベルまたは活性まで、抑制するためにＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異体アレルの様々な組合せが産生される。ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡ ＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１において見出されるものと類似のニコチンおよび総アルカロイドレベルを有する低アルカロイドのタバコ株を産生するために様々なＮｉｃ２＿ＥＲＦおよびＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子における突然変異体アレルのさらなる組合せが生成される、または単一のタバコ植物に移入される。
（表５）第７染色体上のＮｉｃ１ｂ領域またはその近辺からの追加の遺伝子。開始および停止ゲノム位置を参照ＴＮ９０ゲノムに基づいて提供する。配列特定番号（配列番号）を各遺伝子についてゲノムコーディングＤＮＡ配列（適用可能な場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質または他のコードされるＲＮＡ配列について提供する。
Figure 0007479286000011
（表６）正常アルカロイドタバコ株と低減アルカロイドタバコ株との間で差次的発現を呈する第７染色体からの転写因子。開始および停止ゲノム位置を参照ＴＮ９０ゲノムに基づいて提供する。配列特定番号（配列番号）を各遺伝子についてゲノムコーディングＤＮＡ配列（適用可能な場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質または他のコードされるＲＮＡ配列について提供する。
Figure 0007479286000012
（表７）Ｔ０形質転換体のセットは、人工マイクロＲＮＡを介する個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの抑制はＨＩ ＢＵ２１バックグラウンド（すなわち、ｔ－ＨＩ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ｎｉｃ２単一突然変異体）においてニコチンを低減することを実証する。ＭＩＲ６１４７骨格が人工マイクロＲＮＡ（「ａＭＩＲ６１４７」）のために使用される。「％ Ｃｏｎｖ」の列はニコチンからノルニコチンへの変換のパーセントを表す。複数のＴ０ ＧＵＳ対照形質転換体からの平均ニコチンレベルを使用して個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ ａｍｉＲＮＡ Ｔ０形質転換体のそれぞれにおける相対的なニコチンレベルを決定する。植物を当初鉢植えの１６週後に摘心し、アルカロイド分析のために葉試料を２週後に収集する。
Figure 0007479286000013
Figure 0007479286000014
Figure 0007479286000015
（表８）ＨＩ ＢＵ２１バックグラウンド（すなわち、ｔ－ＨＩ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ｎｉｃ２単一突然変異体）において個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを標的化する人工マイクロＲＮＡを用いて形質転換されたＴ０植物の第２のセット。このセットのＴ０植物を当初鉢植えの１５週後に摘心し、アルカロイド分析のために葉試料を２週後に収集する。表７における植物と比較して、これらの植物を１週早く摘心し、これは対照植物において一貫性の欠如を結果としてもたらすことがあり（ニコチンレベルは１．５２％および２．７８％に及ぶ）、したがってａｍｉＲＮＡ植物は一貫したニコチン低減を示さない。表７におけるものと同じセットのａｍｉＲＮＡ構築物を使用する。「％ Ｃｏｎｖ」の列はニコチンからノルニコチンへの変換のパーセントを表す。複数のＴ０ ＧＵＳ対照形質転換体からの平均ニコチンレベルを使用して個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ ａｍｉＲＮＡ Ｔ０形質転換体のそれぞれにおける相対的なニコチンレベルを決定する。
Figure 0007479286000016
Figure 0007479286000017
Figure 0007479286000018
（表９）ｔ－ＮＬ Ｍａｄｏｌｅ （ＰｈＰｈ） ＳＲＣバックグラウンド（すなわち、タバコ疫病抵抗性およびノルニコチンの低減のための３つのニコチンデメチラーゼ遺伝子中の突然変異を有するＮａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ）において個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを標的化する人工マイクロＲＮＡを用いて形質転換されたＴ０植物のセット。このセットのＴ０植物を当初鉢植えの１８週後に摘心し、アルカロイド分析のために葉試料を２週後に収集する。表７における植物と比較して、これらの植物を２週遅く摘心する。一貫したニコチン低減はこのセットの植物において見られず、これは、ｎｉｃ２単一突然変異体は野生型バックグラウンド（例えば、ｔ－ＮＬ Ｍａｄｏｌｅ （ＰｈＰｈ） ＳＲＣ）と比較してニコチン調節における各個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの役割を評価するためのより感作されたバックグラウンドを提供することを指し示す。表７におけるものと同じａｍｉＲＮＡ構築物のセットを使用する。「％ Ｃｏｎｖ」の列はニコチンからノルニコチンへの変換のパーセントを表す。複数のＴ０ ＧＵＳ対照形質転換体からの平均ニコチンレベルを使用して個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ ａｍｉＲＮＡ Ｔ０形質転換体のそれぞれにおける相対的なニコチンレベルを決定する。
Figure 0007479286000019
Figure 0007479286000020
Figure 0007479286000021
（表１０）選択されたＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ人工マイクロＲＮＡ Ｔ０形質転換体における遺伝子発現。「％Ｅｘｐ」は、複数の対照Ｔ０形質転換体に基づく平均発現レベルと比べた発現レベルのパーセントを指す。ニコチン低減は、意図するＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ標的の抑制および複数のニコチン生合成遺伝子（ＰＭＴ１ａ、ＢＢＬａ、Ａ６２２、ＯＤＣ、ＭＡＴＥ２、ＱＰＴ２＿２）の発現の低減と相関する。全ての形質転換体はｔ－ＨＩ Ｂｕｒｌｅｙ ２１のバックグラウンドである。ＮＤは決定されなかったことを意味する。
Figure 0007479286000022
（表１１）Ｎｉｃ１ｂ領域におけるまたはその近くの選択されたＥＲＦ遺伝子。各ＥＲＦ遺伝子のゲノム座標を第７染色体上の開始および停止として示す。ＥＲＦの命名法はＲｕｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＴＯＢＦＡＣ： ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００８， ９：５３に基づく。各Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦのＤＮＡ配列をＴｏｂＦａｃデータセットから得、タバコゲノムデータベースをプローブして注釈付き遺伝子モデル、転写物、および染色体座標の両方を同定するために使用する。配列特定番号（配列番号）を各遺伝子についてゲノムコーディングＤＮＡ配列（適用可能な場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびポリペプチド配列について提供する。
Figure 0007479286000023
（表１２）Ｎｉｃ２領域におけるまたはその近くの選択されたＥＲＦ遺伝子。各ＥＲＦ遺伝子のゲノム座標を第１９染色体上の開始および停止として示す。ＥＲＦの命名法はＲｕｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＴＯＢＦＡＣ： ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００８， ９：５３； Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， （１０）：３３９０－４０９ （２０１０）；およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，， Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１７， １７４：９９９－１０１１に基づく。各Ｎｉｃ２＿ＥＲＦのＤＮＡ配列をＴｏｂＦａｃデータセットまたはＮＣＢＩデータベースから得、タバコゲノムデータベースをプローブして注釈付き遺伝子モデル、転写物、および染色体座標の両方を同定するために使用する。配列特定番号（配列番号）を各遺伝子についてゲノムコーディングＤＮＡ配列（適用可能な場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびポリペプチド配列について提供する。
Figure 0007479286000024
（表１３）ＥＲＦ１３０はそうではないが、ＥＲＦ１６、ＬＡ ＢＵ２１において欠失したＬＡ関連領域（すなわち、注釈付き遺伝子を含有しない「Ｎｉｃ１ｂΔ」として参照される配列番号１；実施例２を参照）、またはｇ３２０８１（ベータ-グルコシダーゼ１８様遺伝子）の過剰発現は、ＬＡ ＢＵ２１においてニコチンおよび総アルカロイドの増加を結果としてもたらす。対照構築物をａｇ－４５ＥＶとして列記する。
Figure 0007479286000025
Figure 0007479286000026

Claims (19)

  1. エチレン応答性因子（ＥＲＦ）遺伝子中に天然に存在しない突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、前記天然に存在しない突然変異がヌル突然変異であり、前記天然に存在しない突然変異が、配列番号：３および３８からなる群より選択される配列に対して１００％の同一性を含む内因性配列内に位置しており、かつ前記天然に存在しない突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の改変されていない対照植物のニコチンレベルの５０％未満まで低減する、タバコ植物またはその部分。
  2. 前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物である、請求項１に記載のタバコ植物またはその部分。
  3. 前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む、請求項２に記載のタバコ植物またはその部分。
  4. 前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子中の１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、請求項２に記載のタバコ植物またはその部分。
  5. 前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の改変されていない対照植物のニコチンレベルの４０％未満のレベルのニコチンを含む、請求項２に記載のタバコ植物またはその部分。
  6. 前記タバコ植物が２．０％未満のニコチンレベルを含む、請求項２に記載のタバコ植物またはその部分。
  7. エチレン応答性因子（ＥＲＦ）遺伝子中に非トランスジェニックかつ天然に存在しない突然変異を含むタバコ植物またはその部分であって、前記非トランスジェニックかつ天然に存在しない突然変異がヌル突然変異であり、前記非トランスジェニックかつ天然に存在しない突然変異が、配列番号：３および３８からなる群より選択される配列に対して１００％の同一性を有する内因性配列内に位置しており、かつ前記非トランスジェニックかつ天然に存在しない突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の改変されていない対照植物のニコチンレベルの５０％未満まで低減する、タバコ植物またはその部分。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタバコ植物の集団。
  9. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
  10. 熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、火力乾燥タバコ、および太陽乾燥タバコからなる群から選択される、請求項９に記載の乾燥タバコ材料。
  11. 請求項９に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
  12. 請求項９に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
  13. シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、請求項１２に記載のタバコ製品。
  14. 無煙タバコ製品である、請求項１２に記載のタバコ製品。
  15. 前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、請求項１４に記載のタバコ製品。
  16. 配列番号：３および３８からなる群から選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物またはその部分であって、前記阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、前記阻害配列が、配列番号：３または３８の少なくとも２１ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物またはその部分。
  17. 前記Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列が、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、およびその組合せからなる群から選択される阻害性ポリヌクレオチドとして転写されることができる、請求項１６に記載のタバコ植物またはその部分。
  18. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性プロモーターからなる群から選択される、請求項１６に記載のタバコ植物またはその部分。
  19. 前記プロモーターが根特異的プロモーターである、請求項１６に記載のタバコ植物またはその部分。
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