CN104168759B - 具有减少量的氨基酸的烟草和用于制造这种品系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包括至少一种氨基酸减少的基因改性烟草植物以及衍生自这种植物的烟草产品，从而与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，加热和/或燃烧时，这种烟草植物或它的一部分产生降低水平的一种化合物，该化合物衍生自所述至少一种氨基酸。在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草品系相比，加热和/或燃烧烟草时，烟草产生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。这些植物可用于改善烟草产品。

Description

具有减少量的氨基酸的烟草和用于制造这种品系的方法
发明领域
本发明涉及通过在M0嵌合阶段选择突变体来制备具有改变表型的植物的方法。本发明的实施方式提供烟草植物，所述烟草植物具有低于平均水平的至少一种氨基酸。这些植物用于开发烟草产品，所述烟草产品在加热和/或燃烧时产生更少量的某些非天然化学物质。
发明背景
在植物中生物合成氨基酸是高度调节的(李(Lea)等，1985，The Biosynthesis ofAmino Acids in Plant(在植物中生物合成氨基酸)，发表于《Chemistry andBiochemistry of the Amino Acids(氨基酸的化学和生物化学)》，G.C.巴勒特(G.C.Barrett)编辑，查普曼希尔(Chapman&Hill)出版，伦敦，第197-226页)。因为对粮食和其它食物中的必需氨基酸的普遍期望，已开发了多种方法来增加植物中氨基酸的含量(参见如G.加力力(G.Galili)和B.A.拉金斯(B.A.Larkins)，1999，Enhancing the Content ofEssential Amino Acids Lysine and Threonine in Plants(增加植物中必需氨基酸赖氨酸和苏氨酸的含量)，发表于《Plant Amino Acids in Biochemistry and Biotechnology(植物氨基酸的生物化学和生物技术)》，B.K.西纳(B.K.Singh)编辑，马斯德克公司(MarcelDekker)出版，纽约，第487-507页)。此外，在烟草中某些氨基酸可以是产生香味和香气的主要来源。
但是，氨基酸在烟草中进行麦拉德反应(Maillard)和斯特克降解(Stecker)，并产生吡嗪和其它含氮化合物，它们中有些可能不是有益的。氨基酸分布不仅影响吡嗪形成的产率，还影响类型(陆G.(Lu，G.)等，1997，《农业食物化学期刊(J.Agric.Food Chem.)》45:233-236；J.陈(J.Chen)和C.-T.何(C.-T.Ho)，1999，农业食物化学期刊(J.Agric.FoodChem.)》47:643-647)。因此，尽管聚焦在增加烟草中氨基酸的水平，还存在生产具有减少量的某些氨基酸的烟草植物、以及衍生自这种植物的烟草产品的需要。某些氨基酸可能与在加热和/或燃烧烟草时可能产生的有害化学物质有联系。例如，烟草的烟雾可包括丙烯酰胺，丙烯酰胺已被国际癌症研究机构(IARC)表征为2A组致癌物质。此外，丙烯腈是在卷烟烟雾中发现的IARC B1组致癌物质。
因此，本领域需要能提供包括减少的特定氨基酸生物合成的植物品系的方法。应设计所述方法，使该方法甚至可用于如烟草的植物物种，所述植物物种较大因此需要大量设施来育种，且具有复杂的基因组并因此可需要大量的突变体筛选事件来分离感兴趣的突变。
发明内容
本发明提供用于制备具有降低水平的至少一种内源氨基酸的植物的方法。在某些方面，本发明包括具有降低水平的至少一种内源氨基酸的烟草植物、或者衍生自这种植物的烟草品系。在某些方面，本发明包括由具有降低水平的至少一种内源氨基酸的烟草植物制备的烟草产品。
在一种实施方式中，本发明包括用于制备改性烟草植物的方法，所述方法包括产生具有降低水平的至少一种内源氨基酸的烟草植物，从而与衍生出该改性植物的未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生衍生自所述至少一种内源氨基酸的降低水平的至少一种化合物。
此外，在某些实施方式中，本发明可包括用于制备改性烟草植物的方法，与未改性的烟草植物相比，所述改性的烟草植物包括降低水平的至少一种内源氨基酸，所述方法包括下述步骤：在包括突变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物至少一种烟草种子；洗涤所述至少一种种子，使其不含突变剂；把所述至少一种M0烟草种子暴露于选择剂；存在选择剂时，使至少一种种子发芽，并种植至少一种M0烟草幼苗；种植该至少一种M0烟草幼苗来产生包括M1烟草种子的至少一种M0烟草植物，其中来自M0烟草植物的M1烟草种子包括至少一种突变的M1烟草种子；以及使所述至少一种突变的M1烟草种子发芽，从而选择与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，包括降低水平的至少一种氨基酸的改性的M1烟草植物。
还在其他实施方式中，本发明可包括改性的烟草植物或它的一部分，与衍生该植物的未改性的烟草植物或它的一部分相比，所述改性的烟草植物或它的一部分包括降低水平的至少一种内源氨基酸。在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的化合物，该化合物衍生自至少一种内源氨基酸。例如，在某些实施方式在中，本发明可包括加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时，包括降低的丙烯酰胺水平和/或丙烯腈水平的改性的烟草植物或它的一部分。
还在其他实施方式中，本发明可包括衍生自本发明的改性的烟草植物的烟草产品，所述烟草产品包括改性的烟草，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，该改性的烟草具有降低水平的至少一种内源氨基酸。在一种实施方式中，与包括未改性的亲代烟草植物或它的一部分的烟草产品相比，烟草产品产生降低水平的化合物，该化合物衍生自至少一种氨基酸。例如，本发明可包括改性的烟草产品，与未改性的烟草相比，加热和/或燃烧烟草产品时，该改性的烟草产品具有降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。
附图简述
通过以下详述、所附权利要求书和附图，本发明的各种特征、方面和优点，以及其他的特征、方面和优点将变得更明显。
图1是根据本发明的一种实施方式的示意图，显示了用于产生具有降低水平的至少一种氨基酸的烟草品系的方法。
图2显示了根据本发明的一种实施方式，以毫克(mg)每克烟草表示的所测天冬酰胺水平和以微克(μg)每烟草颗粒物质总量(TPM)表示的所测丙烯酰胺水平的关系。对照株(10NH-3)显示成正方形；各种实验株显示成菱形符号。
详细描述
在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”、“至少一种”和“该”包括复数的指代物，除非上下文中另有明确的说明。此外，术语“种子”和“幼苗”包括单数和复数指代。提及的“干重量百分数”或者“以干重为基准计”指的是基于干成分的重量(即，除了水以外的所有成分)。
术语“内源”指化合物(如氨基酸)是通过植物正常的生化反应来产生的。这些内源化合物不包括从外部来源添加至植物的化合物(如施加至叶片表面的化合物等)。
术语“非天然的”指不是植物或动物体天然摄入和/或合成的化合物，但该化合物可衍生自内源化合物。在某些情况下，非天然化合物可以是致癌物质。或者，当被某些人类摄入时，非天然化合物可具有其它潜在的危害或不利影响。
如本文所定义，培养基可包括适于生物组织维持或生长的组合物。培养基可包括水、缓冲溶液或生长培养基，例如但不限于本文实施例所述的那些培养基。一般地，与感兴趣的植物生物相容的任意组合物，可适于用作培养基或培养基的部分。
如本文所定义，诱变包括导致DNA序列改变的过程。术语“诱变”指使用突变剂来在个体群中诱导基因突变。待诱变的群可包括植物、植物的部分或种子。对于诱变的群，可根据实验决定用于各类植物组织的诱变化学或辐射，从而可获得低于表现为致死的阀值水平的突变频率或者可重复的无菌性。可基于预期的突变频率，来估计诱变处理后导致的M1代种子的数目或M1植物群的尺寸。
在基因中可诱导的突变类型包括例如点突变、缺失、插入、复制和倒置。诱变可包括转换、翻转、导致移码或核苷酸交联的碱基加入或缺失、以及碱基的改性/取代，从而改变蛋白质和DNA(如转录因子)的结合。还包括由这种突变体和物种间和物种内交叉制造的杂种。
除了本文详细描述的方法以外，在一些实施方式中，可通过把植物细胞种在组织培养液中来诱导诱变，这可导致产生体细胞突变体。或者，可采用为了生产杂交植物而开发的、使用原生质体融合的标准原生质体培育方法，它也可用于产生具有变体基因表达的植物。因此，可从具有变体基因表达的第一和第二植物产生原生质体。可从成功的原生质体融合和再生植物培育愈伤组织。根据本文所述的方法，可确定和选择所得子代杂交植物用于变体基因表达，且可用于本文所述的配种方案。还包括了方法，该方法包括基因工程如定点诱变。
本发明包括的植物还包括下述植物(和/或衍生自这种植物的烟草品系)：该植物可被用非烟草DNA在与产生感兴趣的氨基酸(即，在烟草中降低这种氨基酸的浓度是最终结果)相关的基因不同的位置处进行基因改造。例如，本发明包括下述植物：该植物被基因改造成耐杀虫剂的，且还通过本发明的技术用烟草基因组DNA的诱变改性该植物(例如，在天冬酰胺、天冬酰胺合成酶或其它氨基酸生物合成基因座处，从而成为低天冬酰胺制造者)。在一种实施方式中，本发明的植物包括下述植物：该植物具有与未改性的植物亲代品系基本上相同的抗生素耐药性分布，从而与未改性的植物亲代品系相比，改性的植物不包括新的抗生素耐药性。
突变剂定义为能改变(诱变)细胞中DNA的物质(或处理)。合适的突变剂包括例如化学突变剂和电离辐射。典型的化学突变剂包括，但不限于：甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸、5-溴尿嘧啶、甲基-亚硝基胍、叠氮化钠、吖啶橙、溴化乙锭和移码突变剂如普鲁(proflavin)等。还可通过辐射如UV、X-射线、γ-射线、快速中子辐射等来产生突变。突变剂还包括遗传成分，如病毒载体、转座子(transponson)等，它们可促进把外源DNA插入烟草基因组。
一般地，用突变剂处理的第一代包括M0(或M0)代。然后，后续的代则描述为M1(或M1)(即在突变事件后的一代)、M2(在突变事件后的二代)等。因此，如本文所使用，M0指暴露于突变剂的植物细胞(和由此长成的植物)，而M1指由M0植物自花授粉产生的种子和由该种子长成的植物。M2是自花授粉的M1植物的子代(种子和植物)，M3是自花授粉的M2植物的子代，且M4是自花授粉的M3植物的子代。M5是自花授粉的M4植物的子代。因此，Mn+1(或Mn+1)各为自花授粉的前面的Mn(或Mn)代的子代。
如本文所使用，“改性的植物”、或“改性的烟草植物”、或“改性的烟草”包括植物、烟草植物和基因改性(即突变的)的烟草，从而具有与衍生该改性的植物的未改性的植物(如烟草)不同的基因型和表型。
如本文所使用，术语“衍生该改性的植物的未改性的植物”指用来产生突变植物品系的亲代植物品系。如本文所使用，M0代是衍生改性的M1植物的未改性的植物。
如本文所定义，生物体的物理外观包括它的表型，而生物体的基因组成包括它的基因型。杂合子定义成在感兴趣的位置具有不同的等位基因(即，DNA序列)的基因组。例如，杂合子突变将是只在一种等位基因具有突变的序列的植物。因此，对于一基因，杂合子具有两不同的等位基因，它们全部可传承至下一代。纯合子定义成在一或更多基因座具有相同等位基因的生物体。因此，纯合子在感兴趣的位置携带相同的等位基因(例如，两种突变或两种正常的序列)，因此相同的等位基因将传承到所有的子代。
因此，本发明的实施方式提供制备具有降低水平的至少一种内源氨基酸的烟草植物(或者衍生自这种植物的烟草品系)的方法。在一种实施方式中，本发明包括由具有降低水平的至少一种内源氨基酸的烟草植物或它的一部分。在某些实施方式中，本发明包括由具有降低水平的至少一种内源氨基酸的、改性的烟草植物或它的一部分制备的烟草产品。
在本发明的各方法、植物、植物品系、或烟草产品的某些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可降低其它氨基酸的水平(如天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、硒代半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、鸟氨酸、牛磺酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸或缬氨酸)。
已发现在烟草热处理和/或燃烧时(如吸烟)，可产生丙烯酰胺(参见如美国专利公开No.2011/0048434，该文的全部内容通过引用纳入本文)。此外，丙烯腈是在卷烟烟雾中发现的IARC B1组致癌物质。
在某些实施方式中，降低烟草中天冬酰胺的水平，导致衍生自该烟草的烟雾中(即，如加热和/或燃烧含该烟草的烟草产品时)丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化合物形成减少。此外，在某些实施方式中，降低烟草中丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸中至少一种的水平，导致衍生自该烟草的烟雾中(即，如加热和/或燃烧含该烟草的烟草产品时)丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化合物形成减少。此外，通过加热初烤烟草可产生少量的丙烯酰胺和/或丙烯腈。因此，在某些实施方式中，本发明的方法和/或烟草植物可用来产生烟草产品，该烟草产品具有降低的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或由某些氨基酸产生的其它非天然化学物质。
可通过各种方式实施本发明。
在一种实施方式中，本发明包括用于制备改性烟草植物的方法，所述方法包括产生与衍生该改性的植物的未改性的植物相比，具有降低水平的至少一种内源氨基酸的烟草植物。在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的至少一种化合物，该化合物衍生自至少一种氨基酸。
在一种实施方式中，具有降低水平的衍生自氨基酸的化合物是潜在的致癌物质。或者，具有降低水平的衍生自氨基酸的化合物可以是烟草产品的另一类化合物，该化合物潜在的对消费者不利。例如，在某些实施方式中，加热和/或燃烧时，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，烟草植物或它的一部分产生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。或者，可降低其它潜在的不利的化合物。
在一种实施方式中，通过下述步骤来制造改性的烟草：在包括突变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物的至少一种烟草种子；洗涤所述至少一种种子，使其不含突变剂；把所述至少一种种子暴露于选择剂；在选择剂存在下，使至少一种种子发芽并种植至少一种M0烟草幼苗；种植该至少一种M0幼苗，来产生包括至少一种突变的M1烟草种子的至少一种M0烟草植物；以及使所述至少一种突变的M1烟草种子发芽，从而选择与未改性的烟草植物相比，包括降低水平的至少一种氨基酸的至少一种改性的M1烟草植物。
多种氨基酸可以是本发明的方法的目标。在一些实施方式中，具有降低内源水平的氨基酸包括天冬酰胺或者谷氨酸中的至少一种。在一种实施方式中，改性的烟草植物包括降低至少50％水平的天冬酰胺。附加的或可选的，改性的烟草植物包括降低至少40％水平的谷氨酸。
在一种实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。
本发明还可包括用于制备改性烟草植物的方法，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，所述改性的烟草植物具有降低水平的至少一种内源氨基酸。在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的至少一种化合物，该至少一种化合物衍生自具有降低水平的至少一种内源氨基酸。在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，加热和/或燃烧时，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的至少一种化合物，该至少一种化合物衍生自具有降低水平的至少一种内源氨基酸。
例如，在某些实施方式中，本发明可包括用于制备改性烟草植物的方法，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，所述改性的烟草植物包括降低水平的至少一种内源氨基酸，所述方法包括下述步骤：在包括突变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物的一个或多个烟草种子(即，多个种子)(即，至少一种种子)；洗涤所述一个或多个种子，使其不含突变剂；把M0种子暴露于选择剂；在选择剂存在下，使一个或多个种子发芽并种植至少一种M0烟草幼苗(即，多个幼苗)；种植该一个或多个M0幼苗，来产生包括M1烟草种子的至少一种M0烟草植物，其中来自M0烟草植物的M1烟草种子包括至少一种突变的M1烟草种子；以及使至少一种突变的M1烟草种子发芽，从而选择与未改性的烟草植物相比，包括降低水平的至少一种内源氨基酸的至少一种改性的M1烟草植物。在一些实施方式中，所述方法还包括下述步骤：种植所述至少一种M1烟草植物来产生M2烟草种子，其中所述至少一种M2烟草植物是用于突变的纯合子，突变赋予在选择剂存在下生长的能力。在一些实施方式中，可在选择剂存在下种植M0、M1和/或M2。
本发明的各方法、植物和组合物(如烟草产品)可使用各种选择剂。在一个实施方式中，所述选择剂是氨基酸。例如，选择剂可以是亮氨酸。或者，可把其它氨基酸用作选择剂。在一些实施方式中，选择剂是除了赖氨酸和/或苏氨酸以外的氨基酸。
在一种实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。
在一些实施方式中，通过本发明的方法制造的改性的烟草植物包括10NH-18,10NH-23,10NH-27,10NH-34或10NH-9品系中的至少一种，其中根据布达佩斯条约规定的条件，这些品系种子的代表性样品已于2011年12月22日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801大学大道，弗吉尼亚州马纳萨斯，20110-2209)，其中关于这些种子的公共可用性的所有限制会在专利授权后不可撤销地解除。这些保藏种子分配的ATCC获取编号分别是PTA-12339(10NH-23)、PTA-12340(10NH-34)、PTA-12341(10NH-18)、PTA-12342(10NH-27)和PTA-12343(10NH-9)。或者，可通过本发明的方法来制造其它植物，如本文所述的那些。
还在其他实施方式中，本发明可包括改性的烟草植物或它的一部分，与衍生该植物的未改性的烟草植物或它的一部分相比，所述改性的烟草植物或它的一部分包括降低水平的至少一种内源氨基酸。在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的至少一种化合物，该至少一种化合物衍生自具有降低水平的至少一种内源氨基酸。在一种实施方式中，加热和/或燃烧时，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的至少一种化合物，该至少一种化合物衍生自具有降低水平的至少一种内源氨基酸。
在一种实施方式中，改性的烟草植物的基因组包括异源倍体基因组。此外，在一种实施方式中，改性的烟草植物的基因组包括突变，该突变具有耐过量选择剂(如氨基酸)生长的显性表型。在一种实施方式中，改性的烟草基因组包括突变，该突变具有耐亮氨酸存在下生长的显性表型。
在一种实施方式中，与未改性的植物相比，植物可包括减少的内源天冬酰胺和/或谷氨酸。或者，如上所述，可减少其它氨基酸。
氨基酸减少，可导致降低水平的由该氨基酸产生的化合物。在一实施方式中，加热和/或燃烧时，与未改性的烟草植物或它的一部分相比，烟草植物或它的一部分产生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。例如，加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时，与未改性的烟草植物相比，植物或它的一部分可包括降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或99％的丙烯酰胺和/或丙烯腈。
在一种实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。在一些实施方式中，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者可使用本文所述的其它品系。
在其他实施方式中，本发明可包括改性的烟草植物或它的一部分，与衍生该植物的未改性的烟草植物相比，所述改性的烟草植物或它的一部分包括降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈中的至少一种。在一些实施方式中，加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时，与未改性的植物相比，改性的植物包括减少的丙烯酰胺和/或丙烯腈。附加的或可选的，与未改性的植物相比，该植物可包括降低水平的至少一种内源氨基酸。例如，与未改性的植物相比，改性的植物可包括减少的天冬酰胺和/或谷氨酸。
在一种实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。在一些实施方式中，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，可使用其它品系。
在一些实施方式中，通过突变来产生改性的烟草植物。在一些实施方式中，所述方法可包括下述步骤：在包括突变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物的一个或多个种子；洗涤所述一个或多个种子，使其不含突变剂；把至少一种M0种子暴露于选择剂(如把选择剂添加至土壤，或者添加至培养基，种子至少部分浸没在该培养基中)；在选择剂存在下，使一个或多个种子发芽并种植至少一种M0烟草幼苗；种植该一个或多个M0幼苗，来产生包括M1烟草种子的至少一种M0烟草植物，其中来自M0烟草植物的M1烟草种子包括至少一种突变的M1烟草种子；以及使至少一种突变的M1烟草种子发芽，从而选择改性的M1烟草植物，与衍生该改性的(即M1)植物的未改性的植物(即M0)相比，改性的M1烟草植物包括降低水平的至少一种内源氨基酸。在一些实施方式中，所述方法可包括使M1和/或衍生自至少一种M1植物的M2植物，在包括选择剂的培养基中发芽。在一些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。在另一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可降低其它氨基酸。
还在其它实施方式中，本发明可包括烟草产品，该烟草产品包括来自植物的改性的烟草，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，所述植物具有降低水平的至少一种内源氨基酸。在一些实施方式中，通过本文所述的方法来产生改性的植物。在一种实施方式中，与包括未改性的亲代烟草植物或它的一部分的产品相比，烟草产品产生降低水平的化合物，该化合物衍生自至少一种内源氨基酸。在一种实施方式中，加热和/或燃烧时，与包括未改性的亲代烟草植物或它的一部分的产品相比，烟草产品产生降低水平的化合物，该化合物衍生自至少一种内源氨基酸。
在一种实施方式中，烟草产品中所用改性的烟草的基因组包括异源倍体基因组。此外，在一种实施方式中，改性的烟草植物的基因组包括突变，该突变具有耐过量氨基酸选择剂(例如但不限于亮氨酸)存在下生长的显性表型。
在一些实施方式中，烟草产品可包括改性的烟草，该改性的烟草包括降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。与未改性的烟草相比，加热和/或燃烧时烟草时，可发生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。例如，加热和/或燃烧烟草产品时，与具有来自未改性的植物的烟草的烟草产品相比，植物或它的一部分可包括降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或99％的丙烯酰胺和/或丙烯腈。
在一种实施方式中，烟草包括降低水平的至少一种内源氨基酸。在一些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺和/或谷氨酸。或者可减少其它氨基酸，如丙氨酸和/或谷氨酰胺和/或脯氨酸。或者可减少其它氨基酸，如组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在一种实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。在一些实施方式中，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，可使用其它品系。
在一些实施方式中，本发明还包括烟草产品，该烟草产品包含来自未改性的烟草植物的烟草，与衍生该植物的未改性的烟草相比，该烟草具有降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。在一些实施方式中，通过本文所述的方法来产生改性的植物。在一些实施方式中，本发明还包括烟草产品，该烟草产品包含来自未改性的烟草植物的烟草，加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时，与衍生该植物的未改性的烟草相比，该烟草具有降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。
在一种实施方式中，烟草产品中所用改性的烟草的基因组包括异源倍体基因组。此外，在一种实施方式中，改性的烟草植物的基因组包括突变，该突变具有耐过量氨基酸选择剂(例如但不限于亮氨酸)存在下生长的显性表型。
在一些实施方式中，烟草产品可包括改性的烟草，该改性的烟草包括降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。与未改性的烟草相比，加热和/或燃烧时烟草时，可发生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈。例如，加热和/或燃烧烟草产品时，与具有来自未改性的植物的烟草的烟草产品相比，植物或它的一部分可包括降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或99％的丙烯酰胺和/或丙烯腈。
在一种实施方式中，烟草包括降低水平的至少一种内源氨基酸。在一些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺和/或谷氨酸。或者可减少其它氨基酸，如丙氨酸和/或谷氨酰胺和/或脯氨酸。或者可减少其它氨基酸，如组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在一种实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。在一些实施方式中，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，可使用其它品系。
还在其它实施方式中，本发明包括来自下述至少一种的烟草：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草可包括来自下述至少一种的烟草：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者可使用来自本文所述的其它品系的烟草，或者来自通过本发明的方法制备的品系的烟草。
因此，在一些实施方式中，本发明包括由本发明的植物和烟草品系制造的烟草产品。例如，在一些实施方式中，本发明包括含改性的烟草的烟草产品，该改性的烟草来自与未改性的烟草相比具有降低水平的非天然化学物质的烟草植物。在一些实施方式中，本发明包括含改性的烟草的烟草产品，该改性的烟草来自加热和/或燃烧时烟草时与未改性的烟草相比具有降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或非天然化学物质的烟草植物。此外，本发明的烟草产品可包括含改性的烟草的烟草产品，与衍生该改性的烟草的未改性的烟草相比，所述改性的烟草具有降低水平的至少一种内源氨基酸。在一实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
某些氨基酸的减少可与加热和/或燃烧(如吸烟)烟草时可产生的非天然化学物质的减少相关。
例如，丙烯酰胺是可在卷烟烟雾中发现的致癌物质。在一些实施方式中，降低烟草中天冬酰胺的水平可与烟雾中形成降低水平的丙烯酰胺相关联。因此，在一些实施方式中，本发明的方法和/或烟草植物和/或烟草产品可用来制造烟草产品，加热和/或燃烧时，该烟草产品产生降低水平的丙烯酰胺和/或可由氨基酸火法合成的其它化学物质。
在其他实施方式中，降低丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸中至少一种的水平，可与减少另一种潜在致癌物质丙烯腈相关联。在一种实施方式中，减少谷氨酸可与减少丙烯腈相关联。因此，在一些实施方式中，本发明的方法和/或烟草植物和/或烟草产品可用来制造烟草产品，加热和/或燃烧时，该烟草产品产生降低水平的丙烯腈和/或可由氨基酸火法合成的其它化学物质。
例如，在一些实施方式中，本发明包括用于生产改性的烟草植物的方法，所述改性的烟草植物包括降低水平的内源天冬酰胺，从而加热和/或燃烧时，与未改性的亲代烟草植物或它的部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的丙烯酰胺。
此外，在一些实施方式中，本发明包括用于生产改性的烟草植物的方法，所述改性的烟草植物包括降低水平的内源丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸中的至少一种，从而与未改性的亲代烟草植物或它的部分相比，所述烟草植物或它的一部分产生降低水平的丙烯腈。
例如，在一些实施方式中，本发明的烟草植物和/或产品包括烟草叶或植物的其它部分，进行热处理时，产生约0.33微克(μg)天冬酰胺每毫克干植物重量，或者比衍生该改性的烟草植物的亲代烟草植物，减少了约70％或更多。
此外，在一些实施方式中，从本发明的改性的烟草植物的烟草叶或其它部分产生的烟雾中的丙烯酰胺的量，小于或等于50％的从通常用于烟草产品的植物和/或衍生该改性的烟草植物的植物的其它类烟草叶产生的卷烟烟雾。
例如，在一些实施方式中，本发明的烟草植物和/或产品包括烟草叶或植物的其它部分，进行热处理时，产生小于约0.110微克(μg)谷氨酸每毫克干植物重量，或者比衍生该改性的烟草植物的亲代烟草植物，减少了约40％或更多。
此外，在一些实施方式中，从本发明的改性的烟草植物的烟草叶或其它部分产生的烟雾中的丙烯腈的量，等于约50％的从通常用于烟草产品的植物和/或衍生该改性的烟草植物的植物的其它类烟草叶产生的卷烟烟雾。
如本文所进一步描述，在本发明的各方法、植物和烟草产品的一些实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。或者，可使用其它植物或烟草。
在一些实施方式中，本发明的烟草产品中使用的改性的烟草可包括选自下组的至少一种烟草：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草可包括来自下述至少一种的烟草：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者可使用来自本文所述的其它品系的烟草，或者来自通过本发明的方法制备的品系的烟草。
制备具有降低含量的至少一种氨基酸的烟草的方法
本发明的实施方式提供用于制备具有显著降低水平的至少一种内源氨基酸的植物的方法。在一些实施方式中，本发明提供制备具有显著降低水平的至少一种氨基酸的烟草植物(或者衍生自这种植物的烟草品系)的方法。
在一些实施方式中，具有降低水平的内源氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的内源氨基酸是天冬酰胺。附加的或可选的，具有降低水平的内源氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分产生降低水平的一种化合物，该化合物衍生自是降低目标的氨基酸。在一些实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，改性的烟草植物或它的一部分产生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质(如在加热和/或燃烧时)。
因此，在一种实施方式中，本发明包括通过在M0代中选择感兴趣的突变来生产改性的植物(或衍生自该植物的品系)的方法，所述改性的植物包括显著降低的特定氨基酸的改变表型。所述方法可包括在含突变剂的溶液中培育感兴趣的植物的种子或植物组织。所述方法还可包括洗涤种子，使种子不含突变剂。或者，可通过其它方法(如，辐射)诱变种子，然后进行所述方法的后续步骤。
所述方法还可额外地包括使一个或多个种子发芽，并种植至少一种M0幼苗。在一种实施方式中，在这时把选择剂添加至种子。所述方法还可包括把选择剂添加至一个或多个幼苗，其中选择剂选择M0嵌合植物，其中该M0嵌合植物至少部分地包括预先决定的改变表型。所述方法可随后包括种植M0嵌合植物来产生M1种子，其中该M1种子可包括非突变的M1种子和含预先决定的改变表型的至少一种突变的M1种子，且使M1种子发芽从而选择含预先决定的改变表型的M1植物。在一些实施方式中，所述方法还包括种植M1植物来产生M2种子，其中至少一种M2植物是用于产生改变表型的突变的纯合子，并使M2种子发芽以确定至少一种纯合子M1植物。在一些实施方式中，所述方法可包括使M1和/或衍生自M1植物的M2植物，在包括选择剂的培养基和/或土壤中发芽。
在另一种实施方式中，改性的植物(或衍生自该植物的品系)具有降低至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或99％的至少一种氨基酸。在另一种实施方式中，改性的植物包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的至少一种氨基酸。在一实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，烟草植物或它的一部分产生降低水平的一种化合物，该化合物衍生自是降低目标的氨基酸。例如，在一些实施方式中，所述方法包括产生改性的烟草植物，加热和/或燃烧时，与未改性的亲代烟草植物相比，改性的烟草植物产生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。
例如，在一些实施方式中，本发明包括用于生产改性的烟草植物的方法，所述方法包括产生包括降低水平的内源天冬酰胺的烟草植物，从而加热和/或燃烧时，与未改性的亲代烟草植物或它的部分相比，所述改性的烟草植物或它的一部分产生降低水平的丙烯酰胺。
在其他实施方式中，本发明包括用于生产改性的烟草植物的方法，所述方法包括产生包括降低水平的内源丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸内源天冬酰胺中的至少一种的烟草植物，从而加热和/或燃烧时，与未改性的亲代烟草植物或它的部分相比，所述改性的烟草植物或它的一部分产生降低水平的丙烯腈。
对于本发明方法的各种突变，加热和/或燃烧烟草植物或该烟草植物的一部分时，该烟草植物包括至少10％的降低水平的丙烯酰胺。例如，在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，由改性的烟草植物的至少一部分制成的产品或衍生自该植物的烟草品系，包括降低至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或99％的丙烯酰胺。在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，改性的烟草品系包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的丙烯酰胺。
在本发明方法的某些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它选定的氨基酸。例如，烟草植物可包括降低至少10％的谷氨酸水平。此外，在另一种实施方式中，由改性的烟草植物的至少一部分制成的产品或者衍生自该烟草植物的品系，具有降低至少20,30,40,50,60,70,80,90或99％的谷氨酸水平。
此外，在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，由改性的烟草植物的至少一部分制成的产品或衍生自该植物的烟草品系，包括降低至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或99％的丙烯腈。在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，改性的烟草品系包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的丙烯腈。
在用于生产包括降低水平的至少一种氨基酸改性的烟草植物，和/或生产加热和/或燃烧该植物或它的一部分时与未改性的烟草植物相比产生降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质的改性的烟草植物的方法的实施方式中，所述方法可包括以下步骤：在包括突变剂的溶液中培育来自未改性的烟草植物至少一种烟草种子；洗涤所述至少一种种子，使其不含突变剂；把所述至少一种种子暴露于选择剂；使至少一种种子发芽，并把至少一种M0烟草幼苗种植到含选择剂的培养基上；种植该至少一种M0烟草幼苗来产生包括M1烟草种子的至少一种M0烟草植物，其中M1烟草种子包括至少一种突变的M1烟草种子；以及使所述至少一种突变的M1烟草种子发芽，从而选择与未改性的烟草植物相比，包括降低水平的至少一种氨基酸的一种改性的M1烟草植物。在一些实施方式中，所述方法还可包括种植至少一种M1烟草植物来产生M2烟草种子，其中所述至少一种M2烟草植物是用于产生改变表型的突变的纯合子，并使M2烟草种子发芽来确定所述至少一种纯合子M1烟草植物。在一些实施方式中，所述方法还包括使至少一种M1植物和/或衍生自M0或M1植物的至少一种M2植物，在含选择剂的土壤或其它培养基中发芽。
还在本发明的方法的一些实施方式中，在某些发育阶段，如在发芽后的预先决定的时段中，把含至少一种选择剂的培养基添加至M0幼苗。对于烟草(如烟草(Nicotianatabacum))，可在发芽7-14天后把包括至少一种选择剂的培养基添加至M0幼苗。例如，可在发芽约10天后把包括至少一种选择剂的第二培养基添加至M0幼苗。在另一种实施方式中，在M0幼苗生长时，选择可持续的存在。
如本文所进一步描述，可使用本发明的方法改性多种植物。在某些实施方式中，所述植物包括异源倍体基因组。在一些实施方式中，植物是烟草。在一些优选实施方式中，烟草是烟草(Nicotiana)属。更优选地，烟草可包括烟草种(Nicotiana tabacum)。或者，如本文所述，可使用任意属的烟草(Nicotiana)或其混合物。这些成员如美国专利公开No.2006/0185686和2011/0174323所述的那些，上述各文的全部内容通过引用纳入本文。或者，可使用其它烟草。
在一些实施方式中，突变剂是甲磺酸乙酯(EMS)。在一些实施方式中，EMS的最终浓度是0.01-2％。或者，EMS的最终浓度可以是0.05-1％。或者，EMS的最终浓度可以是0.2-0.7％。例如，在一些实施方式中，可使用0.5％的浓度。或者，可使用其它化学突变剂(或辐射)。
在一些实施方式中，突变的种子可悬浮于含选择剂的固化琼脂平板中。在其他实施方式中，种子可悬浮于营养培养基中并施加至半透表面，从而在添加选择剂之前生长。或者，可使用水培或在土壤中进行选择。
因此，本发明的实施方式包括用于植物突变的方法，所述方法包括在M0嵌合阶段的选择步骤。例如，在一方面，本发明包括选择下述植物：该植物包括对大量(如，潜在的致死)的作为选择剂的亮氨酸的抗性。或者，可使用其它选择剂(如，其它氨基酸)。或者，可使用调节氨基酸合成或氨基酸代谢的其它化合物。
在一些实施方式中，选择剂(如亮氨酸)以0.3-20mM的浓度范围存在。或者，选择剂(如亮氨酸)可以0.5-10mM的浓度范围存在。或者，选择剂(如亮氨酸)可以2.0-10.0mM的浓度范围存在。
在一些实施方式中，M0嵌合植物耐选择剂的细胞子群；当于存在选择剂(例如但不限于升高水平的亮氨酸)下种植植物时，这些细胞可赋予整个植物活力。本发明因此无需种植大量的M0植物来产生M1种子，由此大大减少了M1阶段必须筛选的子代数目，为大植物或包括复杂基因组的植物(如烟草)提供了廉价的植物育种方案。本文所述的方法，与下述文献所述用来生产包括显著增加的氨基酸含量的烟草(N.tabacum)品系的选择方法不同：美国专利No.6,730,832、7,173,170和7,825,305，以上各文的全部内容通过引用纳入本文。
本发明的实施方式还可包括衍生自使用本发明的方法产生的改性的植物的种子，其中所述种子能繁衍具有降低水平的至少一种氨基酸的改性的植物。在某些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸可以是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
此外，如本文所详细描述，本发明包括烟草产品，所述烟草产品衍生自使用本发明的方法产生的植物和/或植物品系，如用于嚼烟的烟叶、用于抽吸烟草的烟熏烟叶、以及其它烟草产品。在一些实施方式中，本发明的包括用于减少非天然化合物和/或概述烟草产品香味的方法，该非天然化合物可存在于烟草中和/或加热和/或燃烧时产生，所述方法包括产生具有降低浓度的至少一种氨基酸的改性的烟草植物，混合改性的烟草和未改性的烟草植，以及在烟草产品中包括该混合物。优选地，通过突变烟草种子和选择用于部分突变的嵌合植物，来制备改性的烟草植物。在某些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
因此，本发明的实施方式涉及通过在M0嵌合阶段选择来制备具有改变表型的植物的方法的应用，以及使用所述方法来生产具有降低水平的至少一种氨基酸的植物。突变已用作开发多种作物(包括烟草)的改善的栽培变种的常规育种方法(参见，如A.M.范哈藤(A.M.van Harten)，Mutation Breeding:Theory and Practical Applications(突变育种：理论和实际应用),第1-63页，剑桥大学出版社，纽约，1998)。一般地，使用化学突变剂来开发所需突变的目标植物材料可分为两类：(1)种子和(2)组织或细胞培养。
例如，可用特定的突变剂处理种子，种植存活的种子来产生它们的子代(如赫尔摩斯(Heremans)和雅各布斯(Jacobs)，1995)。从突变的种子生长的代称为M0代，且从M0植物收集的子代是M1代，通常可从M1代选择所需的突变。可通过在选择条件下种植来自M1植物的子代(即，M2代)，进一步选择纯合植物来得到感兴趣的突变。
尽管在组织培养细胞上更加易于进行突变和选择(如卡特-里内特斯(Cattoir-Reynaerts)等，1983；多特桑(Dotson)等，1990；希本德(Hibberd)等，1980)，突变的细胞或组织必须再传代以形成无菌植物。构建用于从感兴趣的基因组的无菌植物传代的系统，是耗时、昂贵的且需要高水平的专业技能。此外，在传代的感兴趣的突变中，因为常染色体的复制，常常发生不期望的体细胞突变。
还使用了基因工程来生产转基因植物。例如，在烟草(烟草(N.tabacum))中细菌AK的表达可导致产生过量的游离苏氨酸(O.沙优尔(O.Shaul)和G.加力力(G.Galili)，1992,Plant Physiol.(植物生理学),100:1157-1163；卡日奇H.(Karchi,H.)等,1993,Plant J.(植物期刊),3:721-727)，在菜籽、大豆和玉米中(法克S.C.(Falco,S.C.)等，1995,Biotechnology(生物技术)13:577-582；法克S.C.(Falco,S.C.)等，1997,SIM News(SIM新闻)47:53-57)。此外，这种方法对技术要求很高，需要把外源DNA引入基因组，且不产生在各种生态系统中繁衍作物所需的多种突变。此外，通过基因工程生产的转基因作物对生态系统的长期稳定性的影响尚未可知(N.C.伊斯兰德(N.C.Ellstrand),2001,Plant Physiol.(植物生理学),125:1543-1545)。最后，转基因作物还没有被公众广泛接受，特别是在欧洲国家。
因此本发明的目的是使用筛选方法，其中筛选至少部分地使用M0植物来进行。现在参考图1，本发明的一方面提供生产具有降低量的至少一种内源氨基酸的烟草(如，烟草(Nicotiana tabacum))品系的方法。在一实施方式中，所述方法包括以下步骤:(a)在包含约0.5％浓度的突变剂甲磺酸乙酯(EMS)4的溶液中，把烟草种子2突变20小时；(b)在水6中洗涤突变的种子；(c)用70％的乙醇对种子2杀菌，随后用20％次氯酸钠(Chlorox)漂白液8在搅拌振荡器10上漂白；(d)用无菌水6冲洗；(e)把种子2悬浮于具有0.1％琼脂(半固体胶体悬浮液)12的营养培养基中；(f)把具有约50种子2的约0.750毫升的悬浮液施加至含选择剂16的固化植物琼脂平板上；(g)使种子发芽，并在25℃下把幼苗18种植到组织培养室中，具有来自冷白光荧光灯的16小时光照时间；(h)把健康的M0幼苗18移植到土壤中，并在温室中生长成M0植物22；以及(i)在田野力种植来自M0植物22的单个M1种子23，并生长成M1植物24；(j)测试M1植物的低于平均水平的至少一种氨基酸(如天冬酰胺)；(k)种植来自具有低水平的至少一种氨基酸的M1植物的M2种子25，并测试M2品系，该品系生产低于平均水平的至少一种氨基酸(如天冬酰胺或其它氨基酸)。这些非嵌合的烟草植物通常是杂合子和纯合子的混合物。基于对氨基酸水平的化学分析，可在田野中增加用于选择烟草品系的额外的选择步骤。
这些改性的植物和/或品系还提供生产杂交品系的基础，利用一或两种亲代、本发明的新颖的品系。所述新颖的品系的克隆(clone)、体细胞无性系(somaclone)和衍生物，也在本发明的范围之内。
在一些实施方式中，通过本发明的方法制造的改性的烟草植物包括10NH-18,10NH-23,10NH-27,10NH-34或10NH-9品系中的至少一种，其中根据布达佩斯条约规定的条件，这些品系种子的代表性样品已于2011年12月22日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801大学大道，弗吉尼亚州马纳萨斯，20110-2209)，其中关于这些种子的公共可用性的所有限制会在专利授权后不可撤销地解除。这些种子分配的ATCC获取编号分别是PTA-12339(10NH-23)、PTA-12340(10NH-34)、PTA-12341(10NH-18)、PTA-12342(10NH-27)和PTA-12343(10NH-9)。或者，通过本发明的方法可制造其它植物。
具有降低水平的至少一种氨基酸的烟草植物
在一些实施方式中，本发明包括具有显著降低水平的至少一种内源氨基酸的植物。在一些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的内源氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，加热和/或燃烧时，烟草植物或它的一部分产生降低水平的一种化合物，该化合物衍生自所述氨基酸。例如，当热处理植物或它的一部分时，本发明的烟草植物具有降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。
如本文所进一步描述，可改性多种植物。在某些实施方式中，所述植物包括异源倍体基因组。在一些实施方式中，植物是烟草。在一些优选实施方式中，烟草是烟草(Nicotiana)属。更优选地，烟草可包括烟草种(Nicotiana tabacum)。或者，在一些实施方式中，可使用任意属的烟草(Nicotiana)或其它类的烟草。这些烟草如美国专利公开No.2006/0185686和2011/0174323所述，以上各文的全部内容通过引用纳入本文。或者，可使用其它烟草。
例如，在一些实施方式中，本发明可包括烟草植物，该烟草植物包括改性的烟草植物，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，所述改性的烟草植物具有降低水平的丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸中的至少一种。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
附加的或可选的，本发明可包括与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，包括降低水平的至少一种氨基酸的烟草植物，其中所述改性的烟草植物的基因组包括具有突变的异源倍体基因组，该突变具有耐选择剂如氨基酸(如亮氨酸或另一种氨基酸)存在下生长的显性表型。附加的或可选的，本发明可包括改性的烟草植物，与衍生该植物的未改性的烟草相比，改性的烟草植物包括降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质(如，加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时)，其中所述改性的烟草植物的基因组包括具有突变的异源倍体基因组，该突变具有耐选择剂如氨基酸(如亮氨酸或另一种氨基酸)存在下生长的显性表型。
本发明包括的植物(如烟草植物)还包括下述植物(和/或衍生自这种植物的烟草品系)：该植物可被用外源(如非烟草)DNA在与产生感兴趣的氨基酸(即，在烟草中降低这种氨基酸的浓度是最终结果)相关的基因不同的位置处进行基因改造。例如，本发明包括下述烟草植物：该烟草植物被基因改造成耐杀虫剂的，且还用突变的烟草基因组DNA(如在天冬酰胺、用于具有降低的天冬酰胺的植物的天冬酰胺合成酶、或者其它氨基酸生物合成或代谢基因座)把该烟草植物改性成低天冬酰胺生产者和/或加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时包括降低量的丙烯酰胺和/或丙烯腈。
因此，本发明的实施方式包括与衍生该改性的烟草植物的未改性的亲代烟草植物和/或烟草品系相比，具有降低量的至少一种氨基酸的改性的烟草植物，或者衍生自这种植物的烟草品系，其中所述改性的烟草植物的基因组由下述组成或主要由下述组成：植物DNA。优选地，所述改性的烟草植物的基因组由下述组成或主要由下述组成：烟草DNA。甚至更优选地，与降低目标氨基酸(如在天冬酰胺和/或用于具有降低的天冬酰胺的植物的天冬酰胺合成酶、或者其它氨基酸生物合成或代谢基因座)的生物合成和/或代谢相关的改性的烟草植物的基因由下述组成或主要由下述组成：烟草基因组DNA。
本发明还包括与衍生该改性的烟草植物的未改性的亲代烟草品系相比，具有降低量的至少一种氨基酸和/或降低量的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质(如加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时)的改性的烟草植物和/或衍生自这种植物的烟草品系，其中所述改性的烟草植物具有由下述组成或主要由下述组成：与未改性的亲代品系相同的抗生素耐药性。在某些实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸可以是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
又在另一方面，本发明的包括与未改性的亲代烟草植物相比，具有低于平均量的至少一种氨基酸的改性的烟草植物，或者衍生自该植物的烟草品系，其中所述改性的烟草植物的基因组由下述组成或主要由下述组成：植物DNA，或者其中通过使烟草基因组DNA的突变和选择具有感兴趣的突变的M0植物的步骤来生产所述改性的烟草植物。例如，本发明的包括与未改性的亲代烟草植物或烟草品系相比，具有低于平均量的至少一种氨基酸的改性的烟草植物和/或衍生自该植物的烟草品系，其中与降低目标氨基酸(如天冬酰胺和/或用于具有降低的天冬酰胺的植物的天冬酰胺合成酶)的生物合成和/或代谢相关的改性的烟草植物的基因由下述组成或主要由下述组成：烟草基因组DNA。更优选地，所述改性的烟草植物的天冬酰胺基因由下述组成或主要由下述组成：烟草基因组DNA。
在另一方面，本发明包括与未改性的亲代烟草品系相比，具有减少量的至少一种氨基酸的改性的烟草植物和/或衍生自该植物的烟草品系，其中通过使烟草基因组DNA的突变和选择具有感兴趣的突变的M0植物来生产烟草植物。在一种实施方式中，通过下述步骤来生产烟草植物：突变一个或多个烟草种子；把M0种子暴露于选择剂；在选择剂(如亮氨酸)存在下使突变的一个或多个种子发芽，并种子至少一种M0幼苗；种植至少一种嵌合的M0植物来产生M1种子，其中来自M0植物的M1种子可包括未突变的M1种子和至少一种突变的M1种子；以及使M1种子在培养基中发芽，以选择突变的M1植物。在一些实施方式中，制备改性的植物的方法包括以下步骤：种植M1烟草植物来产生M2种子，其中至少一种M1植物是用于突变的纯合子，突变赋予在增加的选择剂(亮氨酸)存在时生长的能力；以及使M2种子发芽，来确定至少一种纯合子M2植物。在一些实施方式中，所述方法可包括使至少一种M1植物和/或衍生自M1植物的至少一种M2植物，在含选择剂的培养基(或土壤)中发芽。
在另一种实施方式中，改性的植物(或衍生自该植物的品系)具有降低至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或99％的至少一种氨基酸。在另一种实施方式中，改性的植物包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的至少一种氨基酸。在一实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在本发明的各植物的某些实施方式中，加热和/或燃烧烟草植物或该烟草植物的一部分时，改性的烟草植物包括降低至少10％的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质水平。此外，在其他实施方式中，加热和/或燃烧植物或植物的一部分时(如来自本发明的改性的烟草植物的叶子的烟雾中)，改性的烟草植物或衍生自该植物的烟草品系具有降低至少20,30,40,50,60,70,80,90或99％的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，改性的烟草植物或它的一部分包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。
此外，对于各植物和/或烟草品系，本发明的实施方式可包括能繁衍改性的植物和/或品系的种子，所述改性的植物和/或品系具有降低量的至少一种氨基酸和/或加热和/或燃烧植物或它的一部分时具有减少的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。本文公开了这些种子、这些种子的保藏。
因此，在一些实施方式中，本发明提供烟草植物和/或衍生自这种植物的烟草品系，它们已经被突变从而产生降低水平的(即，浓度)的至少一种氨基酸。
在一些实施方式中，这些新颖的品系在干燥的叶片中产生0.332-0.810微克(μg)天冬酰胺每毫克干重量的烟草。与未改性的烟熏烟草(N.tabacum)亲代相比，这可表示约1.2-3.35倍的天冬酰胺降低，亲代通常产生最多约1.158微克(μg)天冬酰胺每毫克干重量的烟草。特定氨基酸的绝对量可取决于烟叶的加工，或者烟草的发育阶段。
在一些实施方式中，这些新颖的品系在干燥的叶片中产生<0.11微克(μg)谷氨酸每毫克干重量的烟草。与未改性的烟熏烟草(N.tabacum)亲代相比，这可表示约1.3倍的谷氨酸降低，亲代通常产生最多约0.15微克(μg)每毫克干重量的烟草。特定氨基酸的绝对量可取决于烟叶的加工，或者烟草的发育阶段。
或者，这些新颖的品系在干燥的叶片中可产生0.358微克(μg)谷氨酰胺每毫克干重量的烟草。与未改性的烟熏烟草(N.tabacum)亲代的约0.9微克(μg)每毫克干重量的烟草的对照相比，这可表示约2.5倍的谷氨酸降低。特定氨基酸的绝对量可取决于烟叶的加工，或者烟草的发育阶段。
或者，这些新颖的品系在干燥的叶片中可产生约0.5微克(μg)丙氨酸每毫克干重量的烟草。与未改性的烟熏烟草(N.tabacum)亲代相比，这可表示约1.25倍的丙氨酸降低，亲代通常产生最多约0.63微克(μg)每毫克干重量的烟草。特定氨基酸的绝对量可取决于烟叶的加工，或者烟草的发育阶段。
或者，这些新颖的品系在干燥的叶片中可产生5微克(μg)脯氨酸每毫克干重量的烟草。与未改性的烟熏烟草(N.tabacum)亲代相比，这可表示约1.4倍的脯氨酸降低，亲代通常产生最多约7.1微克(μg)每毫克干重量的烟草。特定氨基酸的绝对量可取决于烟叶的加工，或者烟草的发育阶段。
在一种实施方式中，改性的烟草植物是烟草种(Nicotiana tabacum)。在一些实施方式中，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草植物可包括下述中的至少一种：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者可使用本文所述的其它品系。
本发明的烟草产品
在一些实施方式中，本发明包括由具有显著降低水平的至少一种内源氨基酸的植物制成的产品。
在一实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸可以是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在一种实施方式中，与未改性的亲代烟草植物或它的一部分相比，加热和/或燃烧时，烟草植物或它的一部分产生降低水平的一种化合物，该化合物衍生自是降低目标的氨基酸。例如，在一些实施方式中，热处理和/或燃烧植物或它的一部分时，植物和/或由该植物制成的产品具有降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。
例如，在一些实施方式中，本发明可包括含来自改性的烟草植物的改性的烟草的烟草产品，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，该改性的烟草植物具有降低水平的天冬酰胺。附加的或可选的，在一些实施方式中，本发明可包括含来自改性的烟草植物的改性的烟草的烟草产品，加热和/或燃烧烟草时，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草相比，该改性的烟草植物具有降低水平的丙烯酰胺。
附加的或可选的，本发明可包括含来自改性的烟草植物的改性的烟草的烟草产品，与衍生该改性的烟草植物的未改性的烟草植物相比，该改性的烟草植物具有降低水平的至少一种氨基酸，其中改性的烟草植物的基因组包括异源倍体基因组。在一种实施方式中，改性的烟草可包括突变，该突变具有耐亮氨酸(或另一种选择剂)存在下生长的显性表型。在一实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸可以是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
附加的或可选的，本发明可包括由改性的烟草植物制成的烟草产品，加热和/或燃烧烟草植物或它的一部分时，与衍生该改性植物的未改性的烟草植物相比，改性的烟草植物包括降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质水平，其中所述改性的烟草植物的基因组包括具有突变的异源倍体基因组，该突变具有耐亮氨酸(或另一种选择剂)存在下生长的显性表型。
在另一种实施方式中，与未改性的烟草相比，烟草产品具有降低至少10,20,30,40,50,60,70,80,90或99％的至少一种氨基酸。在另一种实施方式中，烟草产品包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的至少一种氨基酸。在一实施方式中，具有降低水平的氨基酸是下述中的至少一种：丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和/或丝氨酸。在一种实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。附加地或替代地，具有降低水平的氨基酸可以是谷氨酸。或者，可减少其它氨基酸。
在一些实施方式中，加热和/或燃烧烟草时，烟草产品包括降低至少10％的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质水平。此外，在另一实施方式中，加热和/或燃烧烟草时，烟草产品包括降低至少20,30,40,50,60,70,80,90或99％的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，烟草产品包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。
在本发明产品的实施方式中，具有降低水平的氨基酸是天冬酰胺。或者，可减少其它选定的氨基酸。例如，烟草产品可包括降低至少10％的天冬酰胺水平。此外，在另一种实施方式中，由改性的烟草植物的至少一部分制成的产品或者衍生自该烟草植物的品系，具有降低至少20,30,40,50,60,70,80,90或99％的天冬酰胺水平。
在一些实施方式中，加热和/或燃烧产品是，产品可包括降低至少10％的丙烯酰胺水平。例如，在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，由改性的烟草植物的至少一部分制成的产品或衍生自该植物的烟草品系，包括降低至少20,30,40,50,60,70,80,90或99％的丙烯酰胺。在另一种实施方式中，加热和/或燃烧时(如在由烟草产生的烟雾中)，由改性的烟草植物制成的产品包括降低至少1.2,1.5,2,4,6,8,10,20,50或100-倍的丙烯酰胺。
如本文所进一步描述，可改性多种烟草植物来产生本发明的产品。在某些实施方式中，所述植物包括异源倍体基因组。在一些实施方式中，植物是烟草。在一些优选实施方式中，烟草是烟草(Nicotiana)属。更优选地，烟草可包括烟草种(Nicotiana tabacum)。或者，在一些实施方式中，在本发明的烟草产品中可使用任意属的烟草(Nicotiana)或其它类的烟草。这些烟草如美国专利公开No.2006/0185686和2011/0174323所述，以上各文的全部内容通过引用纳入本文。或者，本发明的烟草产品可使用其它烟草和混合物。此外，包括烟草(Nicotiana)的所有物种内和物种间杂种。
在本发明的一些实施方式中，可评估植物的不同部分和/或单个烟草级别烟雾中的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质水平。例如，在一些实施方式中，上部茎等级可产生比下部茎等级更多的丙烯酰胺。此外，白肋(burley)和东方(oriental)等级可产生比烟熏等级更多的丙烯酰胺。
在一些实施方式中，本发明提供热处理的烟草组合物。如本文所使用，涉及烟草的术语“加热的”、“加热”或者“热处理”指烟草材料已在升高的温度下(如在至少约60℃的温度下、更典型至少约100℃)热处理足以改变烟草组合物的特征或性质的时间，如至少约10分钟。在某些情况下，热处理改变烟草组合物的化学或感官特征(如味道和香气)。本发明的热处理过程可以是常规烟草处理过程的改性版本，例如用来形成调味和芳香化合物(如麦拉德反应产物)的过程、用来对烟草组合物进行巴氏杀菌(pasteurization)的过程、制备烟草盒制品的过程、重组烟草过程(如烟草盒带和造纸重组烟草过程)、烟草提取过程、重新排序的过程、烘烤过程中、蒸汽过程和干燥过程。
可使用本发明的烟草植物和/或烟草品系来产生的加热的或热处理的烟草产品如美国专利公开No.2011/0048434所述，该文的全部内容通过引用纳入本文。因此，本发明的热处理的烟草组合物可用作用于吸烟制品的添加剂，或作为无烟烟草组合物，例如散装湿鼻烟、散装干鼻烟、嚼烟、颗粒化的烟草片、挤出或成形的烟条、片、棒、或杆、细碎地研磨粉末、细碎的或研磨的粉块或组分的聚集体、薄片状片、模压加工过的烟草片、含烟草的口香糖片、带状薄膜卷、易溶于水或分散于水中的薄膜或带，或胶囊状材料。
用于本发明的烟草产品的烟草可变化，且本发明的方法通常可用于野生烟草或已以一些方式被基因改性的烟草。例如，本发明的烟草产品所用的烟草可以包含大多数类型的烟草，例如：烟熏烟、白肋烟、晒干烟(例如，东方烟或者印度卡努尔(Indian Kurnool)、马里兰烟、深色烟、深色烤烟、深色风干烟(例如，passanda烟、cubano烟、jatin烟和bezuki烟)或者微风干烟(例如，北威斯康星烟(North Wisconsin)与galpoa烟)和黄花烟，以及其他罕见的或特种烟或者甚至是绿色或者未熟化的烟草。代表性东方烟包含katerini烟、prelip烟、komotini烟、xanthi烟以及yambol烟。
本发明所用的烟草产品包括用于以无烟形式使用的烟草组合物，且可包括单一类型的烟草(如，以所谓的“纯净等级(straight grade)”形式)。例如，烟草产品中的烟草可以仅仅包含基因改性的烟熏烟(例如，所有的烟草可以包含或者衍生自烟熏烟草叶片或者烟熏烟草叶片与烟熏烟草茎的混合物)。烟草产品中的烟草还可具有所谓的“混合的”的形式。例如，本发明的烟草产品中的烟草可以包含本发明的烟熏烟、白莱烟(例如，Malawi白莱烟)以及东方烟(例如，包含或者衍生自烟草叶片或者烟草叶片与烟草茎的混合物的烟草)的份或者块的混合物。例如，以干重计，代表性混合物可以含有约30至约70份的白莱烟(例如，叶片或者叶片和茎)与约30至约70份的本发明的基因改性的烟熏烟(例如，茎、叶片或者叶片和茎)。以干重计，其他示例性烟草混合物包含约75份的烟熏烟、约15份的白莱烟以及约10份的东方烟；或者包含约65份的烟熏烟、约25份的白莱烟以及约10份的东方烟；或者包含约65份的烟熏烟、约10份的白莱烟以及约25份的东方烟。其他示例性烟草掺混物包含约20至约30份的东方烟以及约70至80份的烟熏烟。或者，可使用其它烟草或烟草混合物，如在美国专利公开No.2006/0185686和2011/0174323中所述的那些，以上各文的全部内容通过引用纳入本文。或者，可使用其它混合物。
烟草产品中烟草的相对量可改变。优选地，以干重为基准计，烟草产品中的烟草的量可在至少约10百分数或者至少约25百分数的范围。在某些情况下，以干重计，烟草产品中的其他组分的量可能超过约40％。以干重计，烟草产品烟草材料范围通常为约10至约60重量％，更常见的为约20至约40重量％。例如，烟草产品可包括额外的调味剂、填料、粘合剂、缓冲剂、色素和加湿剂。
本发明的烟草产品可制造成各种制造制品。对于无烟烟草产品，本发明的烟草组合物可成形为所需的产品形状。用来成形烟草产品的方法和设备取决于所需的形状。例如，烟草产品可具有下述形式：压缩烟草颗粒、多层挤出片、挤出或成形的棒或杆、具有一种烟草制剂被不同类烟草制剂环绕的组合物、带状膜卷、易溶于水或分散于水的膜或带、或者胶囊状材料，该胶囊状材料具有外鞘(如可以是本质上透明、无色、半透明或高度着色的柔软或硬质外鞘)和含烟草或烟草调味料的内部区域。
本发明的烟草产品可用作制造吸烟制品的添加剂。本发明的烟草可结合进入烟草混合物、代表性卷烟组分或由该组分制造的代表性卷烟。例如，本发明的烟草叶可结合进入吸烟制品，作物可抽吸材料填充物的一部分。或者，本发明的烟草可包含进入卷烟滤嘴(例如，在滤嘴棒、滤嘴棒外包纸(plug wrap)、或接装纸(tipping paper))或包含进入卷烟包头纸(wrapping paper)，优选的在内表面，在卷烟制造过程中。
在本发明的烟草产品的某些实施方式中，所得吸烟制品的特征在于使用时在主流烟雾中具有降低水平的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。例如，相对于未处理的对照制品(即，比较性的吸烟制品，但不包括本发明的基因改性的烟草)，吸烟制品特征在于在主流烟雾中具有降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更多的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。换句话说，使用相同的吸烟设备和相同的吸烟条件下(如ISO 3308:1991和ISO4387:1991所述的吸烟设备和吸烟条件，以上标准通过引用纳入本文)抽吸时，与未改性的对照吸烟制品相比，本发明的吸烟制品(如包含本发明的基因改性烟草组合物的卷烟)以重量计在主流烟雾中可产生减少量的丙烯酰胺和/或丙烯腈和/或其它非天然化学物质。
例如，在一些实施方式中，本发明提供由已突变的烟草制成的产品，从而产生降低水平(浓度)的丙烯酰胺。具体来说，当抽吸时，这些新产品可在干燥的叶片中产生0.038-0.045微克(μg)丙烯酰胺每毫克干重量的烟草。与未改性的、通常产生最多约0.067微克(μg)每毫克干重量的烟草的烟熏烟草相比，这可表示约1.8-1.5倍的丙烯酰胺降低。产生的丙烯酰胺的绝对量可取决于烟叶的加工、植物的发育阶段和/或初烤方案。
此外，在一些实施方式中，本发明提供由已突变的烟草制成的产品，从而产生降低水平(浓度)的丙烯腈。具体来说，当抽吸时，这些新产品可在干燥的叶片中产生0.146微克(μg)丙烯腈每毫克干重量的烟草。与未改性的、通常产生最多约0.331微克(μg)每毫克干重量的烟草的烟熏烟草相比，这可表示多达2.2倍的丙烯腈降低。产生的丙烯酰胺的绝对量可取决于烟叶的加工、植物的发育阶段和/或初烤方案。
在一些实施方式中，本发明的烟草产品中使用的改性的烟草可包括选自下组的至少一种烟草：10NH-5、10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者，改性的烟草可包括来自下述至少一种的烟草：10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34或10NH-9品系。或者可使用来自本文所述的其它品系的烟草，或者来自通过本发明的方法制备的品系的烟草。
参考下文的非限制性例子，将更好的理解本发明。
实施例1-烟草的突变
本发明用来制备具有降低量的某些氨基酸的多种烟草(N.tobacum)品系。
前面描述了制备具有增加的苏氨酸的EMS突变的育种品系(参见，美国专利No.6,730,832)。用0.5％EMS突变来自代表性烟熏烟草(即Sp227)的种子，并把该种子称为M0。为了产生具有减少的氨基酸浓度的烟草，把多种(即，约10分开的)等份的Sp227烟草(N.tabacum)种子在包含约0.5％浓度的甲磺酸乙酯(EMS)的溶液中培育20小时。同时使用K326种子和未突变的Sp227种子作为对照。然后，用MiliQ水(用NANO纯净II系统纯化；爱荷华州迪比克的百纳斯德/斯莫因公司(Barnstead/Thermolyne)把处理的种子洗涤30分钟，并在搅拌振荡器上用70％的乙醇杀菌30秒，随后用20％Clorox漂白20分钟。
然后，在包含不同水平亮氨酸(2-10mM)的组织培养基中筛选M0突变群。因此，用无菌MiliQ水洗涤至少5次后，用1/2穆拉什格斯固格培养基(Murashige和Skoog Salt)(MSS)+1.5％蔗糖、5克植物琼脂和选择剂(亮氨酸)，把种子(约50种子每平板)悬浮于固化植物琼脂平板中。MSS培养基如美国专利No.7,173,170的表1所述；描述这种培养基的全部内容通过引用纳入本文。使种子在25℃的组织培养室中发芽，具有使用冷白光荧光灯(赛维尼亚(Sylvania)，马萨诸塞州丹弗斯市)的16小时光照时间，强度为约80μE m-2s-1。10天后，除去生长培养基，并把包含2-5mM浓度亮氨酸的相同培养基添加至幼苗。然后，把存活的植物移植到土壤中，并种植在温室中，以使耐高水平亮氨酸的烟草(N.tabacum)品系发育。
拯救在富亮氨酸培养基上选择的存活的M0小植株，并转移到生长室内的土壤。然后，把这些M0植物转移到温室，并收集来各植物的自花授粉的种子并称为M1。在正常的田野条件下种植M1品系。根据传统的操作烟熏各M1品系。
隔离和表征被选作能在大量亮氨酸下生长的EMS突变育种品系。从各烟熏烟叶除去中脉，并进行烟叶加工，制造烟丝填料。分析上部和中部茎叶的氨基酸、烟碱(nicotine)、还原糖和糖总量。这些分析的结果见表1-6。与对照相比，具有降低水平的天冬酰胺的烟草品系(如，10NH-5,10NH-18和10NH-23)在表1中用粗体表示。可知多种烟草品系还具有降低的其它氨基酸。
表1
烟熏初烤上部茎叶(丙氨酸-甘氨酸)
Figure GDA0002207682650000341
表2
烟熏初烤上部茎叶(组氨酸-丝氨酸)
Figure GDA0002207682650000351
表3
烟熏初烤上部茎叶(苏氨酸-缬氨酸、氨基酸总量、烟碱和糖)
表4
烟熏初烤中部茎叶(丙氨酸-甘氨酸)
表5
烟熏初烤中部茎叶(组氨酸-丝氨酸)
Figure GDA0002207682650000381
表6
烟熏初烤中部茎叶(苏氨酸-缬氨酸、氨基酸总量、烟碱和糖)
Figure GDA0002207682650000391
实施例2-具有减少的天冬酰胺的烟草产生减少的丙烯酰胺
使用如美国专利申请公开No.US 20070006888所述的实验室设备制备用于测试的卷烟。使用单一等级的烟熏烟叶(中部和上部茎)来制造卷烟，并测试它的丙烯酰胺和丙烯腈。此外，测试市售烟草混合物作物对照，通过切割市售卷烟的混合物并用这种混合物制造卷烟，来决定测试的精确性和精准性。
从各烟草抽吸3根卷烟，并用瑟路琳(Cerulean)SM 450吸烟设备(瑟路琳(Cerulean)，林佛木材东(Linford Wood East)，英国MK14 6LY)。把设备的空气流动调节至ISO条件(ISO 3308:常规分析卷烟抽吸设备-定义和标准条件(Routine analyticalcigarette smoking machine-definitions and standard conditions)；参考编号ISO3308:1991(E)国际标准化组织(International Organization for Standards)，瑞典日内瓦，1991；ISO 4387:卷烟-使用常规分析抽吸设备测定干燥颗粒物质的总量和不含烟碱的量(Cigarette–Determination of total and nicotine free dry particulate matterusing a routine analytical smoking machine)；参考编号ISO4387:1991(E)国际标准化组织(International Organization for Standards)，瑞典日内瓦，1991)。
在一单一方案中进行抽吸，使用35毫升的抽吸量、2秒抽吸和60秒抽吸间隔(如ISO所述)。使用前面描述的步骤来分析丙烯酰胺(S.C.莫尔德瓦努(S.C.Moldoveanu)和A.R.捷拉迪(A.R.Gerardi),烟草、替代烟草产品和卷烟烟雾中丙烯酰胺的分析(Acrylamideanalysis in tobacco,alternative tobacco products,and cigarette smoke)，色谱科学期刊(J.Chromatogr.Sci.)，49:234-242,2011)。所有的分析都重复三次(包括抽吸)。
表7和8总结了烟草的天冬酰胺、烟碱(烟碱(Nic))、还原糖和糖总量水平的分析结果。示例数据见表7。可知多种品系(如10NH-5,10NH-18和10NH-23)具有显著降低水平的天冬酰胺(ASN)。
表7
烟熏上部茎烟草中关键组分的水平
Figure GDA0002207682650000411
进一步分析来自3组卷烟的烟雾的一氧化碳(CO)、颗粒物质总量(TPM)和丙烯酰胺。一组是用市售烟草的混合物制备的对照。已发现测试步骤的精确水平是相对标准偏差(RSD)小于5％(数据未显示)。第二组(表8)包括用上部茎烟草制备的卷烟，且第三组(表9)包括用中部茎烟草制备的卷烟。同时对于上部或下部茎样品以及相同样品的复制品而言，分析是随机的。下文分别给出了各组的结果，是3个独立分析的平均值。至于市售混合物，分析TPM和丙烯酰胺时，复制品显示小于5％的相对标准偏差(RSD％)。
表8
烟雾分析结果，包括在烟熏上部茎烟草的丙烯酰胺水平
与对照相比，具有降低比例的丙烯酰胺/TPM水平的烟草(如10NH-5,10NH-18和10NH-23)以粗体表示。
表9
烟雾分析结果，包括在烟熏中部茎烟草的丙烯酰胺水平
Figure GDA0002207682650000431
表8和9的结果表明各种EMS改性的烟草导致在卷烟烟雾中形成一个范围的丙烯酰胺水平。在3种上部茎烟草和一种中部茎烟草(数据未显示)发现，多种烟草品系(10NH-5,10NH-18,和10NH-23)的烟雾中具有降低水平的丙烯酰胺。
用单因素学生T-检验分析了来自上部茎样品的数据。已发现各植物都与对照显著不同(表8)。如表8所示，通过不同字母(如A、B、C等)表示的样品具有统计学差异的丙烯酰胺平均值。
这些结果表明可使用植物的突变改性来实现在卷烟烟雾中减少丙烯酰胺。图2表明通过改性植物中的氨基酸含量，实现了增加或降低的丙烯酰胺水平。因此，对于上部茎烟草而言，可观察到天冬酰胺水平和烟雾中丙烯酰胺之间具有优异的相关性。对照株(10NH-3)显示成正方形；各种实验株显示成菱形符号。
实施例3-具有减少的丙烯腈的烟草
表10和11提供用上部茎烟草(表10)制造的卷烟的丙烯腈(ANI)水平结果，以及用中部茎烟草(表11)制造的卷烟的丙烯腈(ANI)水平结果。根据已经出版的方法测试丙烯腈(S.C.莫尔德瓦努(S.C.Moldoveanu)，2010,Beitr.Tabakforsch.Int.,24:145-156)。同样，同时对于上部或下部茎样品以及相同样品的复制品而言，分析是随机的。下文分别给出了各组的结果，是3个独立分析的平均值。至于市售混合物，分析TPM和丙烯腈时，复制品显示小于5％的相对标准偏差(RSD％)。用EMS突变烟草制造的上部茎卷烟的卷烟抽吸口数、CO、TPM和丙烯腈见表10，且对于中部茎的那些见表11。
表10
烟雾分析结果，包括在烟熏上部茎烟草的丙烯腈水平
Figure GDA0002207682650000441
最小值 0.146
表11
烟雾分析结果，包括在烟熏中部茎烟草的丙烯腈水平
Figure GDA0002207682650000451
最小值 0.252
可知与对照相比，对于上部茎烟叶而言，来自一种EMS突变植物产生的最低丙烯腈水平只是亲代水平的47％，对于中部茎烟叶而言，最低的丙烯腈水平只是亲代水平的59％。用单因素学生T-检验分析了来自上部茎样品的数据。已发现各植物都与对照显著不同(表10)。如表10所示，通过不同字母(如A、B、C等)表示的样品具有统计学差异的丙烯腈平均值。表10中，具有减少的丙烯腈和丙烯酰胺的3种品系(10NH-5,10-NH-18,和10NH-23)用斜体表示。此外，品系10NH-27,10NH-34和10NH-9具有较低的丙烯腈水平。进行了其它工作，试图确定用于产生丙烯腈的主要氨基酸前体。表12显示了表1-3中以毫克/克烟草给出的上部茎烟叶中的氨基酸水平，与丙烯腈/TPM(微克/毫克)之间的相关系数R。表13显示了对于中部茎烟草的相同结果，其分析结果在表4-6中给出。基于分析方法的定量限(LOQ)，有些用于氨基酸的结果报告成“低于的”。因为相关性计算需要数字，在真实水平未知时，对氨基酸使用LOQ值。
表12
上部茎烟草中的氨基酸水平(毫克/克)，与丙烯腈/TPM(微克/毫克)之间的相关系数R
Figure GDA0002207682650000461
表13
中部茎烟草中的氨基酸水平(毫克/克)，与丙烯腈/TPM(微克/毫克)之间的相关系数R
Figure GDA0002207682650000462
Figure GDA0002207682650000471
从表12和13可知，对于上部茎烟草和中部茎烟草的相关系数而言，谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸具有更高的R值。已证明谷氨酸是形成丙烯腈的贡献者。
因此，本发明的方法使用快速和经济的突变方法来开发具有降低水平的至少一种氨基酸的植物品系。在一实施方式中，植物是烟草。本发明提供一种方法，借助该方法允许突变的烟草种子在选择条件下发芽，并随后选择嵌合植物，该嵌合植物至少部分的包括耐高浓度亮氨酸的表型。本发明包括的是具有减少的天冬酰胺和/或谷氨酸的改性的烟草品系。加热和/或燃烧时，这种烟草分别形成减少量的潜在致癌物质丙烯酰胺或丙烯腈。这些基因改性的烟草品系可用作种质以开发具有改变的氨基酸分布的新烟草变种，和/或与其它烟草株混合以制备具有改善的味道和香气的混合物。
本文引用的所有文献通过引用全文纳入本文。

Claims (2)

1.一种烟草产品，其包含来自10NH-18、10NH-23、10NH-27、10NH-34和10NH-9品系中至少一种的烟草。
2.如权利要求1所述的烟草产品，其特征在于，包含来自10NH-18、10NH-23品系中至少一种的烟草。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9485953B2 (en) * 2012-07-19 2016-11-08 R.J. Reynolds Tobacco Company Method for treating tobacco plants with enzymes
AU2016318423B2 (en) * 2015-09-09 2022-01-20 Philip Morris Products S.A. Plants with reduced asparagine content
BR112019009137A2 (pt) * 2016-11-10 2019-07-16 British American Tobacco Investments Ltd composição, dispositivo, cartucho e método para gerar um meio inalável
CN111019955B (zh) * 2019-12-19 2022-06-10 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草蛋白zr-1及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090123626A1 (en) * 2007-09-28 2009-05-14 J.R. Simplot Company Reduced acrylamide plants and foods
US20110023178A1 (en) * 2001-09-10 2011-01-27 Reynolds Technologies, Inc. High threonine producing lines of nicotiana tobacum and methods for producing
US20110048434A1 (en) * 2009-06-02 2011-03-03 R. J. Reynolds Tobacco Company Thermal treatment process for tobacco materials

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060185686A1 (en) 2004-08-23 2006-08-24 Lawrence Robert H Jr Nicotiana diversity
WO2006130367A2 (en) 2005-06-01 2006-12-07 R. J. Reynolds Tobacco Company Apparatus and methods for manufacturing cigarettes
CN101663396B (zh) * 2007-04-20 2013-07-31 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 新颖的天冬酰胺酶变体及其用途
BRPI0810481B1 (pt) * 2007-04-20 2022-05-17 Dsm Ip Assets B.V. Asparaginases, sequência de ácido nucléico, constructo de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para a produção de uma asparaginase e composição
US8955523B2 (en) 2010-01-15 2015-02-17 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived components and materials

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110023178A1 (en) * 2001-09-10 2011-01-27 Reynolds Technologies, Inc. High threonine producing lines of nicotiana tobacum and methods for producing
US20090123626A1 (en) * 2007-09-28 2009-05-14 J.R. Simplot Company Reduced acrylamide plants and foods
US20110048434A1 (en) * 2009-06-02 2011-03-03 R. J. Reynolds Tobacco Company Thermal treatment process for tobacco materials

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