CN111808033B - 一种具有抗菌作用的新化合物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新化合物在制备抗菌药物中的应用，发明还涉及从中药小花清风藤中提取、分离、纯化本化合物的制备方法。药理研究表明该新化合物具有显著的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、球绿假单胞菌、肺炎球菌等具有显著的抑制效果，可用于抗菌药物的制备，该制备方法简单易行，所得化合物纯度高，具有良好的经济效益和应用前景。

Description

一种具有抗菌作用的新化合物的制备方法及应用
技术领域
本发明中医药技术领域，具体为从小花清风藤茎叶中提取分离一种新化合物及含有该化合物的中药提取物或混合物的制备方法和在制备抗菌药物中的用途。
背景技术
小花清风藤为清风藤科清风藤属藤本植物小花清风藤Sabia parviflora Wall.ex Roxb.的干燥茎和叶。贵州产小花清风藤为布依族、苗族的民间药，主要分布在贵州的兴义市、安龙县、册亨县、望谟县等地，其根茎、叶均可入药，有祛风除湿、消炎止痛的作用。
抗菌药物研究是一直是人类健康面临的重大挑战，随着人类生活条件的不断改善，微生物的不断进化衍生，导致抗菌药物耐药性不断出现，致使不断要求新的抗菌药物应用于临床。中药是我国巨大的资源宝库，具有五千余年的临床应用经验，从中药中寻找抗菌药物先导化合物已成为近年来新药研究的重要趋势，本发明应用现代分离技术与波谱分析方法相结合，从小花清风藤中分离出一种具有抗菌作用的新化合物，非常有望开发成具有知识产权的抗菌新药候选药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种新化合物及其在制备抗菌药物中的应用。用这种方法制备的该化合物具有显著抑制各种细菌的生长作用。可用于开发抗菌作用的相关药物。
实施本发明的技术方案如下：
一种具有抗菌作用的新化合物，其特征为：名称为1-去氧-1-(3,4-二氢-7-甲基-2,3-二氧-1(2H)-喹喔啉基)戊糖醇-6-羧酸，其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明提供的一种具有抗菌作用的新化合物其制备方法为：
S1：将小花清风藤的干燥茎和叶用醇溶剂提取，小花清风藤茎叶与醇溶剂质量比为1：（8-15），得取浸膏。
S2：将步骤S1所得浸膏，按体积比1：100加水溶解分散，采用大孔树脂，用水洗脱除去水溶性杂质，流动相洗脱3个柱体积，减压浓缩即得。
S3：将步骤S2所得洗脱部位，经中低压液相色谱、半制备型和制备型高效液相色谱进行分离，得到该化合物。
优选的，制备方法S1步骤所述的醇溶剂为20-90%的乙醇溶液，所述的提取方法包括冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法和连续回流提取法中的一种。
优选的，制备方法S2步骤所述大孔树脂主要从以下型号中选取：HP-20、HP-20SS、SP850、SP700、SP207、AB-8、D101、XDA1、X-5、NKA-2、ADS-2。
优选的，制备方法S2步骤所述大孔树脂色谱所用的洗脱液为丙酮、乙醇、甲醇中的一种溶剂与水混合而成，或为丙酮、乙醇、甲醇中的二种以上溶剂的混合液与水混合而成。
优选的，制备方法S3步骤所述中低压色谱主要包括低压液相制备色谱、中压制备色谱，其中，色谱柱为ODS-C18色谱柱，粒度50μm，流动相为甲醇-水或乙腈-水不同浓度溶液。流速10-100ml/min，一般采用梯度洗脱，0-100%甲醇或乙腈-水，每个梯度洗脱2个柱体积。
优选的，制备方法S3步骤所述的半制备型高效液相色谱为色谱柱10*250mm，5μm，流速为4ml/min，流动相为甲醇水或乙腈水溶液。
优选的，制备方法S3步骤所述的制备型高效液相色谱的流动相条件为色谱柱为20*250mm，5μm，或30*250mm，5μm，流速为10-20ml/min，流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。
上述方法制备的一种新化合物或含有该化合物的中药提取物或混合物在制备抗菌药物中的应用。
上述方法制备的一种新化合物或含有该化合物的提取物或混合物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂等剂型。
附图说明
附图1 为本发明提供一种新化合物的结构式；
附图2为化合物的1H-NMR核磁共振图谱；
附图3为化合物的13C-NMR核磁共振图谱；
附图4为化合物的HSQC核磁共振图谱；
附图5为化合物的HMBC核磁共振图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
制备该化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将小花清风藤茎叶用12倍量的70%乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；
（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用20%乙醇溶解（1：100），过滤后得上清液，上样于HP-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），用水洗脱3个柱体积，除去水溶性杂质，然后用30%乙醇溶液洗脱3个柱体积，合并洗脱液，减压浓缩即得；
（3）取步骤（2）得到的30%乙醇洗脱部位经ODS中低压反相液相色谱柱（50*500mm），MeOH-H2O（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份A～G。E经制备型高效液相色谱，色谱条件为：C18-ODS色谱柱（30mm×250mm，5μm），甲醇-水30:70为流动相，流速15 ml/min，保留时间为55min，最后分离得到所述化合物。
实施例2
制备如式1结构的化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将小花清风藤茎叶用15倍量的50%乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；
（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用20%乙醇溶解（1：100），过滤后得上清液，上样于HP-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），用水洗脱3个柱体积，除去水溶性杂质，然后用30%甲醇溶液洗脱3个柱体积，合并洗脱液，减压浓缩即得；
（3）取步骤（2）得到的30%甲醇洗脱部位经ODS中低压反相液相色谱柱（50*500mm），MeOH-H2O（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份A～G。E经制备型高效液相色谱，色谱条件为：C18-ODS色谱柱（30mm×250mm，5μm），甲醇-水30:70为流动相，流速15 ml/min，保留时间为55min，最后分离得到所述化合物。
实施例3
制备如式1结构的化合物的方法，包括如下步骤：
（1）将小花清风藤茎叶用30倍量的70%乙醇溶液冷浸法提取2次，每次24小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；
（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用20%乙醇溶解（1：100），过滤后得上清液，上样于HP-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），用水洗脱3个柱体积，除去水溶性杂质，然后用30%乙醇溶液洗脱3个柱体积，合并洗脱液，减压浓缩即得；
（3）取步骤（2）得到的30%乙醇洗脱部位经ODS中低压反相液相色谱柱（50*500mm），CH3CN-H2O（10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%）洗脱得到7个馏份A～G。E经制备型高效液相色谱，色谱条件为：C18-ODS色谱柱（30mm×250mm，5μm），甲醇-水30:70为流动相，流速15 ml/min，保留时间为55min，最后分离得到所述化合物。
实施例4结构鉴定
取实施例1制备得到的该化合物利用光谱技术，包括紫外、红外、质谱、核磁共振（UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR）鉴定其结构，再经TOF高分辨质谱精确确定其分子量及分子式。
其解析过程与波谱数据如下：
黄色油状物，易溶于甲醇。Q-TOF-MS 显示分子离子质荷比为m/z 353.0994 ([M-H]-,calcd. 353.0990)，确定其分子式为C15H17N2O8。在1H-NMR谱中可以观察到一个四取代苯环信号δH (7.95, s, 1H and 7.00, s, 1H) 一个胺基信号δH (12.08, s, 1H)，两组亚甲基信号δH (4.33, d , J =9.78 Hz, 1H and 4.16, d , J =2.46 Hz, 1H), (3.57, m,1H and 3.42, m, 1H), 三个次甲基信号δH (3.55, m, 1H , 3.60, m, 1H and 4.05, m,1H)，一个甲基信号δH (2.47, s, 3H)。其13C-NMR显示结构包含16个碳(见表1)，显示结构中存在一个苯环，三个羰基(δC168.9，154.5，155.9)，三个次甲基(δC 68.82，72.96，74.37)，两个亚甲基(δC 45.81，63.69)和一个甲基(δC 21.3)。化合物的1H和13C NMR谱与先前文献报道中的6,7-二甲基-1,4-二氢-2,3-喹喔啉二酮的谱图相似，区别在于化合物中的羰基碳信号[δC 168.9(COOH)]。
在HMBC谱中(δH 7.95/δC 168.9)的交叉峰表明羰基在6位碳处与苯环相连。 (δH2.49/δC134.7，118.0，126.2)表明甲基位于7位碳。(δH 4.33，/δC125.6，155.6)，表明支链连接于苯环的1号位。(δH 4.33/δC125.6，155.6)，表明多羟基支链位于C-1位上。根据以上证据，将化合物鉴定为1-去氧-1-(3,4-二氢-7-甲基-2,3-二氧-1(2H)-喹喔啉基)戊糖醇-6-羧酸。
波谱数据如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例5抗菌活性测试实验
对实施例1所得的化合物进行抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌活性测试。
1实验方法
菌种分别接种于培养基上，37℃培养24h后，从平板中刮取菌落，以无菌生理盐水稀释，用麦氏比浊管测定细菌浓度，配制成1×106 CFU/mL细菌稀释液，从各种细菌稀释管中分别取0.05mL菌液，点种于不同浓度的该化合物平板及不含该化合物的对照平板上，37℃培养24h后观察并记录化合物的MIC值，实验重复3次。
2实验结果
结果显示：化合物对各种细菌均具有显著抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最为显著，MIC值最低，分别为0.34μg/mL。见表2。
表2化合物对各种细菌的抑制效果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。

Claims (5)

1.一种具有抗菌作用的新化合物，其特征为：名称为：1-去氧-1-(3,4-二氢-7-甲基-2,3-二氧-1(2H)-喹喔啉基)戊糖醇-6-羧酸；其结构式如下：
Figure 866445DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述的一种具有抗菌作用的新化合物的制备方法，其特征为：具体步骤为：
S1将小花清风藤的干燥茎和叶用乙醇溶液提取，小花清风藤茎叶与乙醇溶液质量比为1：（8-15），提取液浓缩得浸膏；
S2将步骤S1所得粗浸膏，按体积比1：100用20%乙醇溶液溶解分散，过滤后得上清液，上样于HP-20型大孔树脂，样品树脂按照1：3的体积比填充，用水洗脱3个柱体积，除去水溶性杂质，流动相洗脱3个柱体积，合并洗脱液，减压浓缩即得；
S3将步骤S2所得洗脱部位，经中低压液相色谱和制备型高效液相色谱进行分离，得到该化合物；
步骤S2中所述大孔树脂色谱的流动相为30%的乙醇溶液或者30%的甲醇溶液；
所述中低压色谱的色谱柱为ODS-C18色谱柱，粒度50μm，流动相为甲醇-水或乙腈-水不同浓度溶液，流速10-100ml/min，采用梯度洗脱，0-100%甲醇或乙腈-水，每个梯度洗脱2个柱体积；
所述制备型高效液相色谱的流动相条件为色谱柱为20*250mm，5μm，或30*250mm，5μm，流速为10-20ml/min，流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。
3.如权利要求2所述的一种具有抗菌作用的新化合物的制备方法，其特征为： S1步骤所述的乙醇溶液的浓度为20-90%，所述的提取方法为冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法中的一种。
4.权利要求1所述的一种具有抗菌作用的新化合物在制备抗菌药物中的应用。
5.一种药物组合物，其特征为：包含如权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体，将其制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂。
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