CN104497000B - 一种抗烟草花叶病毒植物黄酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗烟草花叶病毒植物黄酮类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗烟草花叶病毒植物黄酮类化合物及其制备方法和应用，属于植物化学技术领域。所述黄酮化合物是从云龙县烟草中分离得到，命名为paranicflavone？A，其分子式为C20H14O5，其结构式如式（Ⅰ）所示：，式（Ⅰ）。本发明植物黄酮类化合物是首次从云龙天登地区的晾晒烟中被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为黄酮类化合物，并表征了其具体结构。试验证明本化合物的相对抑制率为20.6%，对照宁南霉素的相对抑制率31.5%，说明化合物有一定的抗烟草花叶病毒活性。本发明化合物结构简单，人工合成容易实现，化合物的活性好，可作为抗烟草花叶病毒活性的先导性化合物。

Description

一种抗烟草花叶病毒植物黄酮类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种来源于烟草植物的，尤其来源于烟草的黄酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
黄酮(chromone)是一类自然界中广泛存在的生物活性物质，由于植物中黄酮成分结构类型多，立体化学复杂，具有多种生物活性，国内外对该领域的研究十分活跃；无论是天然存在的，还是人工合成得到的黄酮类化合物，都引起了化学家的广泛关注。
本发明涉及的烟草，产自云南省云龙县天登地区，拉丁名parasiticavar.nicotianae，属于茄科烟草属，分布在云南省西部地区，作为一种地方晾晒烟，是烟草工业常用的烟叶原料。该烟草植物富含黄酮类化合物。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种结构新颖的植物黄酮类化合物；第二目的在于提供所述植物黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述植物黄酮类化合物在制备对抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一目的是这样实现的，所述植物黄酮类化合物从烟草中分离得到，paranicflavoneA，其分子式为C20H14O5，其结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)。
本发明第二目的是这样实现的，所述的植物黄酮类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(1)，浸膏提取：将植物样品粉碎到30～50目，以体积百分比浓度为65-75％丙酮水溶液，室温提取2～4次，每次6～10h，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩得水液；
步骤(2)，萃取和硅胶柱层析分离：将步骤(1)得到的水液用乙酸乙酯萃取，分别得到乙酸乙酯层和水溶液层，乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏，然后用200～300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到A-E五部分；
步骤(3)，高效液相色谱分离：步骤(1)中B部分再用体积比为15:1～2:1氯仿-丙酮进行梯度洗脱，得到B1-B6六部分；将B2部分结合高压液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化即得式(Ⅰ)所述的植物黄酮类化合物。
进一步，优选的是步骤(1)中丙酮水溶液的体积百分比浓度为70％。
进一步，优选的是步骤(1)中每次提取时丙酮水溶液的体积与植物样品质量比为8-12L：1Kg。
进一步，优选的是步骤(2)得到的浸膏在经硅胶柱层析前，用浸膏重量1.5～4倍量的95％甲醇溶解，然后用浸膏质量2-4倍的100目硅胶搅拌，至混合均匀，再以3-5倍的硅胶装柱，并将含有浸膏的硅胶上样进行柱层析。
进一步，优选的是步骤(2)所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5。
进一步，优选的是步骤(3)所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为15：1、15：3、15：5、15：6和15：7.5。
进一步，优选的是步骤(3)所述的高压液相色谱分离纯化是采用甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为4：6～6：4，内径×柱长为20×250mm，填料粒径为5μm的C18制备柱为固定相，流速为10～14mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样180～220μL，收集样品的色谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
进一步，优选的是步骤(3)所述的凝胶色谱分离纯化是首先将高压液相色谱分离纯化得到的蒸干物用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即得到式(Ⅰ)所述的植物黄酮类化合物。
进一步，优选的是步骤(3)中凝胶色谱分离纯化使用的是SephadexLH-20凝胶柱。
以上述方法制备的黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：
本发明化合物为黄色；紫外光谱(溶剂为甲醇),λmax(logε)374(3.70),262(3.94),210(4.36)nm；红外光谱(溴化钾压片)νmax3476,1660,1642,1610,1529,1476,1327,1159,1070,985,870cm-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z357.0732[M+Na]+(计算值357.0739)。结合图1和图2所示的1H和13CNMR谱给出一个分子式C20H14O5，不饱和度为14。13CNMR谱图可以看出该化合物含有20个碳原子，C-2(δC163.1),C-3(δC106.0),C-4(δC182.1),C-5(δC136.9),C-6(δC110.2),C-7(δC166.0),C-8(δC112.1),C-9(δC156.9),C-10(δC115.6),C-1′(δC122.9),C-2′(δC131.1),C-3′(δC116.3),C-4′(δC157.3),C-5′(δC116.3),andC-6′(δC131.1)，该化合物是一个黄酮类化合物。1HNMR谱图中含有14个氢原子，包括了低场的活泼氢δH11.13(br.s,OH-4′)，以及δH6.63(s,H-3),δH7.81(d,J＝8.6Hz,H-5),δH6.88(d,J＝8.6Hz,H-6),δH6.80(d,J＝8.6Hz,H-2′andH-6′),δH7.74(d,J＝8.6Hz,H-3′andH-5′),δH6.40(s,H-2″),δH4.37(s,H-4″),δH1.92(s,H-5″),δH11.13(br.s,OH-4′)。
另外，如图3所示从HMBC谱图中可以看出，H-2″与C-1″,C-2″和C-8,H3-5″,H2-4″和H-2″与C-3″,H2-4″与C-7；如图4所示，ROESY谱图中可以看出H3-5″与H-2″,H-4″与H-5″。因此，该化合物命名为paranicflavoneA。
表1式(Ⅰ)所示化合物的1HNMR和13CNMR数据(溶剂为C5D5N，氘代吡啶)
本发明第三目的是这样实现的，式(Ⅰ)所示植物黄酮类化合物作为制备对抗烟草花叶病毒药物的应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明植物黄酮类化合物是首次从云龙天登地区的晾晒烟中被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为黄酮类化合物，并表征了其具体结构。试验证明本化合物的相对抑制率为20.6％，对照宁南霉素的相对抑制率31.5％，说明化合物有一定的抗烟草花叶病毒活性。本发明化合物结构简单，人工合成容易实现，化合物的活性好，可作为抗烟草花叶病毒活性的先导性化合物。
附图说明
图1为本发明植物黄酮类化合物的核磁共振碳谱(13CNMR)图；
图2为本发明植物黄酮类化合物的核磁共振氢谱(1HNMR)图；
图3为本发明植物黄酮类化合物的HMBC图；
图4为本发明植物黄酮类化合物的ROESY图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明采用硅胶柱层析分离时，同时采用TLC薄层色谱点板跟踪。
实施例1
植物样品采于云南云龙县天登地区，将全株取样3.0kg粉碎到30目，以65％V/V的丙酮水溶液用室温提取2次，每次6小时，每次提取时丙酮水溶液的体积与植物样品质量比为12L：1Kg，提取液合并、过滤，减压浓缩得水液；得到的水液用乙酸乙酯萃取，分别得到乙酸乙酯层和水溶液层，乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏，浸膏用重量比1.5倍的95％甲醇溶解后用2倍的100目硅胶拌样，3倍的200-300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，柱子选择10L，并将含有浸膏的硅胶上样，然后用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到A-E五部分；其中，所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5。
8：2洗脱得到的部分即B部分再用体积比为15:1～2:1氯仿-丙酮进行梯度洗脱，利用薄层层析(TLC)检测合并得到B1-B6五部分；所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为15：1、15：3、15：5、15：6和15：7.5。
15：3洗脱得到的部分即B2部分结合安捷仑1100半制备高压液相色谱分离，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为4：6，内径×柱长为20mm×250mm，5μm的C18制备柱为固定相，流速为10mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样180μL，收集22.4min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得物质再次用甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即可得目标化合物。
实施例2
植物样品采于云南云龙县天登地区，将全株取样3.5kg粉碎到40目，以70％V/V的丙酮水溶液用室温提取4次，每次7小时，每次提取时丙酮水溶液的体积与植物样品质量比为11L：1Kg，提取液合并、过滤，减压浓缩得水液；得到的水液用乙酸乙酯萃取，分别得到乙酸乙酯层和水溶液层，乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏，浸膏用重量2.0倍的95％甲醇溶解后，用2.5倍的100目硅胶拌样，3.5倍的200-300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，柱子选择11L，并将含有浸膏的硅胶上样，然后用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到A-E五部分；其中，所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.6L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5。
8：2洗脱得到的部分即B部分再用体积比为15:1～2:1氯仿-丙酮进行梯度洗脱，利用薄层层析(TLC)检测合并得到B1-B6五部分；所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.6L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为15：1、15：3、15：5、15：6和15：7.5。
15：3洗脱得到的部分即B2部分结合安捷仑1100半制备高压液相色谱分离，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为5：5，内径×柱长为20mm×250mm，5μm的C18制备柱为固定相，流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集20.4min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得物质再次用甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即可得目标化合物。
实施例3
植物样品采于云南云龙县天登地区，将全株取样4.0kg粉碎到50目，以70％V/V的丙酮水溶液用室温提取3次，每次8小时，每次提取时丙酮水溶液的体积与植物样品质量比为10L：1Kg，提取液合并、过滤，减压浓缩得水液；得到的水液用乙酸乙酯萃取，分别得到乙酸乙酯层和水溶液层，乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏，浸膏用重量2.5倍的95％甲醇溶解后，用3.0倍的100目硅胶拌样，4.0倍的200-300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，柱子选择12L，并将含有浸膏的硅胶上样，然后用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到A-E五部分；其中，所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.7L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5。
8：2洗脱得到的部分即B部分再用体积比为15:1～2:1氯仿-丙酮进行梯度洗脱，利用薄层层析(TLC)检测合并得到B1-B6五部分；所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.7L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为15：1、15：3、15：5、15：6和15：7.5。
15：3洗脱得到的部分即B2部分结合安捷仑1100半制备高压液相色谱分离，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为5.5：4.5，内径×柱长为20mm×250mm，5μm的C18制备柱为固定相，流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集18.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得物质再次用甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即可得目标化合物。
实施例4
植物样品采于云南云龙县天登地区，将全株取样4.5kg粉碎到50目，以70％V/V的丙酮水溶液用室温提取3次，每次9小时，每次提取时丙酮水溶液的体积与植物样品质量比为8L：1Kg，提取液合并、过滤，减压浓缩得水液；得到的水液用乙酸乙酯萃取，分别得到乙酸乙酯层和水溶液层，乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏，浸膏用重量3.0倍的95％甲醇溶解后，用3.5倍的100目硅胶拌样，4.5倍的200-300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，柱子选择13L，并将含有浸膏的硅胶上样，然后用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到A-E五部分；其中，所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.8L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5。
8：2洗脱得到的部分即B部分再用体积比为15:1～2:1氯仿-丙酮进行梯度洗脱，利用薄层层析(TLC)检测合并得到B1-B6五部分；所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.9L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为15：1、15：3、15：5、15：6和15：7.5。
15：3洗脱得到的部分即B2部分结合结合安捷仑1100半制备高压液相色谱分离，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为5.7：4.3，内径×柱长为20mm×250mm，5μm的C18制备柱为固定相，流速为13mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μL，收集17.2min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得物质再次用甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即可得目标化合物。
实施例5
植物样品采于云南云龙县天登地区，将全株取样5.0kg粉碎到50目，以75％V/V的丙酮水溶液用室温提取3次，每次10小时，每次提取时丙酮水溶液的体积与植物样品质量比为9L：1Kg，提取液合并、过滤，减压浓缩得水液；得到的水液用乙酸乙酯萃取，分别得到乙酸乙酯层和水溶液层，乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏，浸膏用重量4.0倍的95％甲醇溶解后，用4.0倍的100目硅胶拌样，5.0倍的200-300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，柱子选择15L，并将含有浸膏的硅胶上样，然后用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到A-E五部分；其中，所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5。
8：2洗脱得到的部分即B部分再用体积比为15:1～2:1氯仿-丙酮进行梯度洗脱，利用薄层层析(TLC)检测合并得到B1-B6五部分；所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是是氯仿和丙酮体积配比为15：1、15：3、15：5、15：6和15：7.5。
15：3洗脱得到的部分即B2部分结合安捷仑1100半制备高压液相色谱分离，以甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为6：4，内径×柱长为20mm×250mm，5μm的C18制备柱为固定相，流速为14mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样220μL，收集16.1min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得物质再次用甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用SephadexLH-20凝胶柱层析分离，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即可得目标化合物。
实施例6
取实施例1制备的化合物，为黄色。
测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
1)紫外光谱(溶剂为甲醇),max(logε)374(3.70),262(3.94),210(4.36)nm；
2)红外光谱(溴化钾压片)max3476,1660,1642,1610,1529,1476,1327,1159,1070,985,870cm-1；
3)高分辨质谱(HRESIMS，图3)给出准分子离子峰m/z357.0732[M+Na]+(计算值357.0739)。结合1H和13CNMR谱给出一个分子式C20H14O5，不饱和度为14。
13CNMR谱图可以看出该化合物含有20个碳原子，C-2(δC163.1),C-3(δC106.0),C-4(δC182.1),C-5(δC136.9),C-6(δC110.2),C-7(δC166.0),C-8(δC112.1),C-9(δC156.9),C-10(δC115.6),C-1′(δC122.9),C-2′(δC131.1),C-3′(δC116.3),C-4′(δC157.3),C-5′(δC116.3),andC-6′(δC131.1)，该化合物是一个黄酮类化合物。1HNMR谱图中含有14个氢原子，包括了低场的活泼氢δH11.13(br.s,OH-4′)，以及δH6.63(s,H-3),δH7.81(d,J＝8.6Hz,H-5),δH6.88(d,J＝8.6Hz,H-6),δH6.80(d,J＝8.6Hz,H-2′andH-6′),δH7.74(d,J＝8.6Hz,H-3′andH-5′),δH6.40(s,H-2″),δH4.37(s,H-4″),δH1.92(s,H-5″),δH11.13(br.s,OH-4′)。
另外从HMBC谱图中可以看出，H-2″与C-1″,C-2″和C-8,H3-5″,H2-4″和H-2″与C-3″,H2-4″与C-7；ROESY谱图中可以看出H3-5″与H-2″,H-4″与H-5″。因此，该化合物命名为paranicflavoneA。
实施例7
取实施例1制备的化合物，为黄色。测定方法与实施例6相同，确认实施例1制备的化合物为所述的黄酮类化合物——paranicflavoneA。
实施例8
取实施例2制备的化合物，为黄色。测定方法与实施例6相同，确认实施例2制备的化合物为所述的黄酮类化合物——paranicflavoneA。
实施例9
取实施例3制备的化合物，为黄色。测定方法与实施例6相同，确认实施例3制备的化合物为所述的黄酮类化合物——paranicflavoneA。
实施例10
取实施例4制备的化合物，为黄色。测定方法与实施例6相同，确认实施例4制备的化合物为所述的黄酮类化合物——paranicflavoneA。
实施例11
取实施例5制备的化合物，为黄色。测定方法与实施例6相同，确认实施例5制备的化合物为所述的黄酮类化合物——paranicflavoneA。
实施例12
实施例1～5所制备的任一黄酮化合物的抗烟草花叶病毒活性检测：
本发明活性检测采用半叶法。
在药剂的质量浓度均为50μg/L时，对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，洒去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的搪瓷衙内加盖玻璃，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑。每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。
XI％＝(CK-T)/CK×100％
X：相对抑制率(％)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
结果表明本化合物的相对抑制率为20.6％，对照宁南霉素的相对抑制率31.5％，说明化合物有一定的抗烟草花叶病毒活性。

Claims (8)

1.一种植物黄酮类化合物，其特征在于从烟草中分离得到，命名为paranicflavoneA，其分子式为C20H14O5，其结构式如式(Ⅰ)所示：
2.权利要求1所述的植物黄酮类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(1)，浸膏提取：将植物样品粉碎到30～50目，以体积百分比浓度为65-75％丙酮水溶液，室温提取2～4次，每次6～10h，合并提取液，过滤，得滤液，减压浓缩得水液；所述的植物样品为产自云南省云龙县天登地区的烟草；
步骤(2)，萃取和硅胶柱层析分离：将步骤(1)得到的水液用乙酸乙酯萃取，分别得到乙酸乙酯层和水溶液层，乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏，然后用200～300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用氯仿-丙酮梯度洗脱，得到A-E五部分；
步骤(3)，高效液相色谱分离：步骤(2)中B部分再用体积比为15:1～2:1氯仿-丙酮进行梯度洗脱，得到B1-B6六部分；将B2部分结合高压液相色谱分离纯化及凝胶色谱分离纯化即得式(Ⅰ)所述的植物黄酮类化合物；
其中，步骤(2)所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是氯仿和丙酮体积配比为9：1、8：2、7：3、6：4和5：5；
步骤(3)所述的梯度洗脱程序为：洗脱时，洗脱液流量为每秒一滴，每0.5-1.0L洗脱液进行减压浓缩，当浓缩浸膏质量小于1g，即更换梯度；其梯度依次是氯仿和丙酮体积配比为15：1、15：3、15：5、15：6和15：7.5。
3.根据权利要求2所述植物黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中丙酮水溶液的体积百分比浓度为70％。
4.根据权利要求2所述植物黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中每次提取时丙酮水溶液的体积与植物样品质量比为8-12L：1Kg。
5.根据权利要求2所述植物黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)得到的浸膏在经硅胶柱层析前，用浸膏重量1.5～4倍量的95％甲醇溶解，然后用浸膏质量2-4倍的100目硅胶搅拌，至混合均匀，再以3-5倍的硅胶装柱，并将含有浸膏的硅胶上样进行柱层析。
6.根据权利要求2所述植物黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)所述的高压液相色谱分离纯化是采用甲醇-水为流动相，甲醇与水的体积比为4：6～6：4，内径×柱长为20×250mm，填料粒径为5μm的C18制备柱为固定相，流速为10～14mL/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样180～220μL，收集样品的色谱峰，多次累加后蒸干，得到蒸干物。
7.根据权利要求6所述植物黄酮类化合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)所述的凝胶色谱分离纯化是首先将高压液相色谱分离纯化得到的蒸干物用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，分离时按照接收液体积计算，接收第120-150mL洗脱液，然后浓缩，即得到式(Ⅰ)所述的植物黄酮类化合物；所述的步骤(3)中凝胶色谱分离纯化使用的是SephadexLH-20凝胶柱。
8.权利要求1所述植物黄酮类化合物作为制备对抗烟草花叶病毒药物的应用。
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