CN104844615B

CN104844615B - 一种云南地方晾晒烟中黄酮类化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104844615B
Application number: CN201510170058.5A
Authority: CN
Inventors: 杨光宇; 申钦鹏; 刘春波; 张凤梅; 何沛; 张涛; 司晓喜; 刘志华; 朱瑞芝; 王昆淼; 苏钟璧; 缪明明
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2015-04-11
Filing date: 2015-04-11
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2035-04-11
Also published as: CN104844615A

Abstract

本发明公开了一种结构新颖的黄酮类化合物，该化合物命名为烟草黄酮‑E，其分子式为C₂₁H₁₆O₅，且具有如式(Ⅰ)所示的结构：式(Ⅰ)。本发明还公开了上述化合物的用途，经活性测试表明，其对轮状病毒具有很好的抑制作用。本发明化合物结构新颖，且具有较好的抗毒活性，可作为抗轮状病毒的先导化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。

Description

一种云南地方晾晒烟中黄酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种源于云南地方晾晒烟中黄酮类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

云南地方晾晒烟是烟草的云南特有变种，烟草从明万历末年进入云南，至清乾隆年间成为当地常见的农作物。云南自然条件好，温暖的河谷，冷凉的半山区、山区都适应烟草的生长。而且由于云南气候及地理环境多样，所以烟草在多年的栽培过程中形成了很多个具有地方特色的晾晒烟品种，其中著名的有：罗平八大河烟、师宗五洛河烟、会泽乐业烟、蒙自新安所烟、富源大河烟、大姚赵户冲烟、云龙天登烟、宾川白塔烟、巍山南门烟、南涧乐居烟、腾冲绮罗生烟等。这些晾晒烟在当地常盛产不衰，但其次生代谢产物的研究还从未见报道过。

黄酮(flavone)，是黄酮类化合物的总称，泛指两个具有酚羟基的苯环(A-环与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物。研究表明，黄酮类化合物具有心血管系统活性、抗菌及抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗氧化自由基活性、抗炎、镇痛、抗变态等多种药理活性。同时已有研究证实，其药理作用与化学结构密切相关，为了研究这类化合物的构效关系，可进一步研究和开发更多的黄酮类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从云南地方晾晒烟中分离得到了一种新的黄酮类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗轮转病毒活性。

发明内容

本发明的第一方面在于提供一种结构新颖的的黄酮类化合物，其分子式为C₂₁H₁₆O₅，经过分析化学鉴定，其具有下述结构：

该化合物为橘黄色粉末，本申请人将其命名为：烟草黄酮-E；英文名为：Tobaflavones E。

本发明的第二方面提供了上述第一方面所述的黄酮类化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

a.制备晾晒烟提取物浸膏：以晾晒烟叶片为原料，将其粉碎并用第一溶剂浸泡提取2～4次，每次浸泡12h～72h，将提取液合并，过滤，滤液浓缩后得到所述烟草提取物浸膏；其中所述第一溶剂为浓度为60wt％～100wt％的乙醇、甲醇或丙酮的水溶液，且每次提取用的第一溶剂的重量与晾晒烟叶片的重量比＝1.5～4:1；

b.硅胶柱层析：将上述烟草提取物浸膏用纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮的溶解后，与为烟草提取物浸膏的0.8～2.5重量倍的60～120目硅胶拌样，得到拌样后的混合物；

将为晾晒烟提取物浸膏的2～8重量倍的160～300目硅胶干法装柱后，将拌样后的混合物上样，然后用体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的氯仿-甲醇的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂。收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇的混合溶剂洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；

将上述第一洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积比从15:1线性变化至2:1的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱；每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂。将其先后划分成6个部分，其中第二个部分称为第二洗脱液。将上述第二洗脱液用硅胶柱层析继续分离，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱梯度的体积比为从9:1线性变化至5:5；每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂。将其先后划分成5个部分，其中第三部分称为第三洗脱液。

c.高压液相色谱分离：将步骤b得到的第三洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯化，该高压液相色谱采用21.2mm×250mm，5μm的C₁₈色谱柱，流动相为60wt％的甲醇水溶液，流动相流速为12mL/min，紫外检测器检测波长为371nm，第三洗脱液液每次进样60～150μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为28.2min时所对应的洗脱液，称为第四洗脱液，将该第四洗脱液脱除溶剂后即得所述黄酮类化合物。

前述高压液相色谱分离是指使用时压力在5-15Mpa的反相制备色谱。

在优选的实施方案中，本发明还包括以下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相色谱分离之后得到的所述黄酮类化合物再次溶于纯甲醇，并以纯甲醇的为流动相，通过葡聚糖凝胶柱进行层析分离，提到进一步提纯的所述黄酮类化合物。

本发明的第三方面提供了第一方面所述的黄酮类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。

本发明所制备的新型黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发明化合物为橘黄色粉末；紫外光谱(溶剂为甲醇)，λ_max(logε)210(4.28)、260(3.72)、371(3.62)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max 3486、3120、2936、1662、1640、1610、1537、1481、1352、1247、1142、1063、980、876cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 371.0890[M+Na]⁺(计算值371.0895)。结合¹H和¹³C NMR谱给出分子式C₂₁H₁₆O₅，不饱和度为14。紫外、红外和核磁数据(表1)表明，该化合物可能是一个黄酮类化合物。¹H NMR和¹³C NMR谱(表1)显示21个碳原子和16个质子信号(表1)，包括：一个1,4-二取代的苯环信号、一个1,2,3,4-四取代的苯环信号、一个异戊基酮结构片段、一个甲氧基，一个羰基、和一组双键；其中两个苯(C-5～C-10和C-1′～C-6′)、羰基(C-4)和双键(C-2和C-3)构成了黄酮的骨架，异戊基酮(C-1″～C-6″)和甲氧基则为取代基。根据图3-图5，甲氧基氢信号和C-4′的HMBC相关可证实甲氧基取代在黄酮骨架的C-4′位，根据H-2″和C-7、H-4″和C-8、H-6和C-1″的HMBC相关可证实异戊基酮结构片段取代在C-7和C-4位，其中C-4″通过氧原子和C-8相连接，C-1″和C-7相连接，形成了一个苯并7元环。至此，本化合物的结构得以确定。命名为烟草黄酮-E，英文名称为Tobaflavone E。

表1化合物的核磁共振数据

No.	δ_C(m)	δ_H(m,J,Hz)
			2	162.6s
3	105.9d	6.60s
			4	177.1s
5	122.6d	7.34(d)8.2
			6	126.7d	7.44(d)8.2
7	128.5s
			8	156.0s
9	148.5s
			10	130.1s
1′	123.6s
			2′,6′	131.2d	7.64(d)8.8
3′,5′	115.5d	6.79(d)8.8
			4′	161.1s
1″	188.7s
			2″	133.9d	6.44s
3″	152.6s
			4″	72.5t	4.46s
5″	21.5q	1.85s
			6″
7″
			-OMe-7
-OMe-8
			-OMe-4′	56.3q	3.82s
-OMe-6″
			Ar-OH

本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定了为黄酮类化合物，并表征了其具体结构。经对抗轮状病毒的实验，其TC₅₀值为188.2μg/mL、IC₅₀值为8.24μg/mL，治疗指数TI为22.84；其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数18.90；化合物具有很好的抗轮状病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。

附图说明

图1为本发明的黄酮类化合物的核磁共振碳谱；

图2为本发明的黄酮类化合物的核磁共振氢谱；

图3为本发明的黄酮类化合物的HSQC谱；

图4为本发明的黄酮类化合物的HMBC谱；

图5为本发明的黄酮类化合物的主要¹H-¹H COSY和HMBC相关图示。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。所采用的方法未具体说明者，皆为常规方法。

本发明中的溶液如果只给出了溶质，没有公开溶剂，则本领域技术人员应该知晓溶剂为水。本发明所用原料不受地区和品种限制，任何来源的地方晾晒烟均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司的烟草原料对本发明做进一步说明。除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

实施例1

所用地方晾晒烟为云南大理云龙天登烟。将晾晒烟取样3.0kg粉碎以70％的丙酮水溶液提取3次，每次提取24h，每次所用70％的丙酮水溶液与晾晒烟的重量比＝1.5:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成烟草提取物浸膏，得烟草提取物浸膏150g。

烟草提取物浸膏用重量为180g的纯甲醇溶解后，用200g的80目粗硅胶拌样，得到拌样后的混合物；

然后用0.8kg的160目硅胶装柱，将拌样后的混合物上样，进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇的混合溶剂作为洗脱剂梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分进一步用体积比从15:1线性变化至2:1的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成6个部分，其中第二个部分用硅胶柱层析继续分离，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱梯度的体积比为从9:1线性变化至5:5，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成5个部分，其中第三部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，该液相色谱使用时压力在5-15Mpa，以60％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为371nm，每次进样75μL，收集停留时间为28.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的黄酮类化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析纯化可得纯品。

实施例2

晾晒烟样品来源于云南楚雄，为大姚赵户冲烟，将烟草取样3.5kg切碎，以95％的乙醇提取3次，每次提取48h，每次所用95％的乙醇与晾晒烟的重量比＝4:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成烟草提取物浸膏，得烟草提取物浸膏140g。

烟草提取物浸膏用重量是其2.0倍量的纯甲醇溶解后，用150g的80目粗硅胶拌样，得到拌样后的混合物；

然后用0.6kg的200目硅胶装柱，将拌样后的混合物上样，进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇的混合溶剂作为洗脱剂梯度洗脱，将其中用体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱进一步用体积比从15:1线性变化至2:1的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成6个部分，其中第二个部分用硅胶柱层析继续分离，洗洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱梯度的体积比为从9:1线性变化至5:5，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成5个部分，其中第三部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，该液相色谱使用时压力在5-15Mpa，以60％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为371nm，每次进样100μL，收集停留时间为28.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的黄酮类化合物。为了进一步提纯，还可以将所得产物用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析分离，即得更高纯度的该黄酮类化合物。

实施例3

所用地方晾晒烟为云南大理云龙天登烟。将晾晒烟取样4.0kg粉碎以100％的甲醇提取2次，每次提取72h，每次所用100％的甲醇与晾晒烟的重量比＝1.5:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成烟草提取物浸膏，得烟草提取物浸膏200g。

烟草提取物浸膏用重量为160g的纯乙醇溶解后，用160g的60目粗硅胶拌样，得到拌样后的混合物；

然后用0.4kg的300目硅胶装柱，将拌样后的混合物上样，进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇的混合溶剂作为洗脱剂梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分进一步用体积比从15:1线性变化至2:1的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成6个部分，其中第二个部分用硅胶柱层析继续分离，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱梯度的体积比为从9:1线性变化至5:5，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成5个部分，其中第三部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，该液相色谱使用时压力在5-15Mpa，以60％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为371nm，每次进样60μL，收集停留时间为28.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的黄酮类化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析纯化可得纯品。

实施例4

所用地方晾晒烟为云南大理云龙天登烟。将晾晒烟取样5.0kg粉碎以60％的甲醇水溶液提取3次，每次提取50h，每次所用60％的甲醇水溶液与晾晒烟的重量比＝3:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成烟草提取物浸膏，得烟草提取物浸膏260g。

烟草提取物浸膏用重量为300g的纯丙酮溶解后，用650g的120目粗硅胶拌样，得到拌样后的混合物；

然后用2.08kg的300目硅胶装柱，将拌样后的混合物上样，进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇的混合溶剂作为洗脱剂梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分进一步用体积比从15:1线性变化至2:1的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成6个部分，其中第二个部分用硅胶柱层析继续分离，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱梯度的体积比为从9:1线性变化至5:5，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成5个部分，其中第三部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，该液相色谱使用时压力在5-15Mpa，以60％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为371nm，每次进样150μL，收集停留时间为28.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的黄酮类化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析纯化可得纯品。

实施例5

所用地方晾晒烟为云南大理云龙天登烟。将晾晒烟取样3.0kg粉碎以80％的甲醇水溶液提取4次，每次提取12h，每次所用80％的甲醇水溶液与晾晒烟的重量比＝1.5:1，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩成烟草提取物浸膏，得烟草提取物浸膏151g。

烟草提取物浸膏用重量为200g的纯甲醇溶解后，用220g的100目粗硅胶拌样，得到拌样后的混合物；

然后用0.6kg的200目硅胶装柱，将拌样后的混合物上样，进行硅胶柱层析，用体积配比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇的混合溶剂作为洗脱剂梯度洗脱，将其中体积配比为9:1的氯仿-甲醇洗脱部分进一步用体积比从15:1线性变化至2:1的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成6个部分，其中第二个部分用硅胶柱层析继续分离，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱梯度的体积比为从9:1线性变化至5:5，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成5个部分，其中第三部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，该液相色谱使用时压力在5-15Mpa，以60％的甲醇水溶液为流动相，Zorbax SB-C₁₈(21.2×250mm,5μm)制备柱为固定相，流动相流速为12ml/min，紫外检测器检测波长为371nm，每次进样100μL，收集停留时间为28.2min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得本发明所述的黄酮类化合物粗品；该粗品再用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相，用葡聚糖凝胶柱层析纯化可得纯品。

实施例6

取实施例1制备的化合物，为橘黄色粉末。

本发明所制备的新型黄酮类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：本发明化合物为橘黄色粉末；紫外光谱(溶剂为甲醇),λ_max(logε)210(4.28)、260(3.72)、371(3.62)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max 3486、3120、2936、1662、1640、1610、1537、1481、1352、1247、1142、1063、980、876cm^-1；高分辨质谱(HRESIMS)给出准分子离子峰m/z 371.0890[M+Na]⁺(计算值371.0895)。结合图1的¹H NMR和图2的¹³C NMR谱给出分子式C₂₁H₁₆O₅，不饱和度为14。紫外、红外和核磁数据(表1)表明，该化合物可能是一个黄酮类化合物。¹H NMR和¹³C NMR谱(表1)显示21个碳原子和16个质子信号(表1)，包括：一个1,4-二取代的苯环信号、一个1,2,3,4-四取代的苯环信号、一个异戊基酮结构片段、一个甲氧基，一个羰基、和一组双键；其中两个苯(C-5～C-10和C-1′～C-6′)、羰基(C-4)和双键(C-2和C-3)构成了黄酮的骨架，异戊基酮(C-1″～C-6″)和甲氧基则为取代基。根据图3-图5，甲氧基氢信号和C-4′的HMBC相关可证实甲氧基取代在黄酮骨架的C-4′位，根据H-2″和C-7、H-4″和C-8、H-6和C-1″的HMBC相关可证实异戊基酮结构片段取代在C-7和C-4位，其中C-4″通过氧原子和C-8相连接，C-1″和C-7相连接，形成了一个苯并7元环。至此，本化合物的结构得以确定。命名为烟草黄酮-E，英文名称为Tobaflavone E。

实施例7

取实施例2-5制备的化合物，为橘黄色粉末。测定方法与实施例3相同，确认实施例2-5制备的化合物为所述的黄酮类化合物——烟草黄酮-E。

实施例8

取实施例1-5制备的任一黄酮类化合物进行抗轮状病毒活性试验，试验情况如下：

抗轮状病毒采用体外细胞测试法，即样品与病毒同时作用于MA104细胞后，通过Alarmablue法检测样品对病毒感染致细胞死亡的保护作用，从而测定样品对HRV的活性作用。

(a)药物的细胞毒性检测

MA104细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的样品液，继续培养3天后，更换含Alamarblue的培养液，继续培养2～3小时后检测其530/590nm(激发波长为530nm，发射波长为590nm)处的荧光值，从而检测样品对MA104细胞的毒性，并计算半数细胞毒浓度(TC₅₀)。

(b)药物抗轮状病毒作用检测

MA104细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，100TCID50的病毒液和不超过20％细胞毒性的梯度浓度药物溶液同时加到MA104细胞上，继续培养4-6天后，更换含Alamarblue的培养液继续培养2～3小时后检测其530/590nm(激发波长为530nm，发射波长为590nm)处的荧光值，并计算半数抑制浓度(IC₅₀)。(c)根基TC₅₀/IC₅₀计算化合物的治疗指数。

结果表明，本发明化合物的TC₅₀值为188.2μg/mL、IC₅₀值为8.24μg/mL，治疗指数TI为22.84；其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数18.90；化合物具有很好的抗轮状病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.如式（Ⅰ）所示黄酮类化合物，该化合物命名为烟草黄酮-E，其分子式为C₂₁H₁₆O₅，且具有下述结构：

（Ⅰ）。

2.权利要求1所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a. 制备烟草提取物浸膏：以晾晒烟叶片为原料，将其粉碎并用第一溶剂浸泡提取2~4次，每次浸泡12 h~72 h，将提取液合并，过滤，滤液浓缩后得到所述烟草提取物浸膏；其中所述第一溶剂为浓度为60 wt%~100 wt%的乙醇、甲醇或丙酮的水溶液，且每次提取用的第一溶剂的重量与晾晒烟叶片的重量比= 1.5~4:1；

b. 硅胶柱层析：将步骤a得到的烟草提取物浸膏用纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮溶解后，与为烟草提取物浸膏的0.8~2.5重量倍的60~120目硅胶拌样，得到拌样后的混合物；

将为烟草提取物浸膏的2~8重量倍的160~300目硅胶干法装柱后，将拌样后的混合物上样，然后用体积比依次为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5的氯仿-甲醇的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集其中用体积比为9:1的氯仿-甲醇的混合溶剂洗脱时得到的洗脱液，称为第一洗脱液；

将上述第一洗脱液用硅胶层析柱继续分离，用体积比从15:1线性变化至2:1的氯仿-丙酮的混合溶剂作为洗脱剂进行梯度洗脱，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成6个部分，其中第二个部分称为第二洗脱液；将上述第二洗脱液用硅胶柱层析继续分离，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱梯度的体积比为从9:1线性变化至5:5，薄层层析色谱跟踪，将其先后划分成5个部分，其中第三部分称为第三洗脱液；

c. 高压液相色谱分离：将步骤b得到的第三洗脱液通入高压液相色谱进行分离纯化，该高压液相色谱采用21.2 mm × 250 mm，5 μm的C₁₈色谱柱，流动相为60 wt%的甲醇水溶液，流动相流速为12 mL/min，紫外检测器检测波长为371 nm，第三洗脱液液每次进样60~150 μL，收集每次进样后色谱峰保留时间为28.2 min时所对应的洗脱液，称为第四洗脱液，将该第四洗脱液脱除溶剂后即得所述黄酮类化合物。

3.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述高压液相色谱分离是指使用时压力在5-15 Mpa的反相制备色谱。

4.根据权利要求2所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，还包括以下进一步提纯的步骤：将在所述高压液相色谱分离之后得到的所述黄酮类化合物再次溶于纯甲醇，并以纯甲醇的为流动相，通过葡聚糖凝胶柱进行层析分离，得到进一步提纯的所述黄酮类化合物。

5.权利要求1所述的黄酮类化合物在制备抗轮状病毒药物中的应用。