CN114891058A

CN114891058A - 胡黄连葫芦烷型皂苷提取物及其在制备治疗便秘药物中的应用

Info

Publication number: CN114891058A
Application number: CN202210595313.0A
Authority: CN
Inventors: 吉海杰; 郝淑兰; 王晞星; 仝立国; 王若瑜; 王晓玲; 李仲云; 王淑敏
Original assignee: Shanxi Traditional Chinese Medicine Institute (shanxi Provincial Hospital Of Traditional Chinese Medicine)
Current assignee: Shanxi Traditional Chinese Medicine Institute (shanxi Provincial Hospital Of Traditional Chinese Medicine)
Priority date: 2022-05-29
Filing date: 2022-05-29
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2042-05-29
Also published as: CN114891058B; WO2023231582A1

Abstract

本发明属中药新药研究领域，具体公开一种胡黄连葫芦烷型皂苷提取物及其在制备治疗便秘药物中的应用。本发明基于活性导向发现葫芦烷型皂苷为胡黄连泻下有效部位，其中包含以2β‑葡萄糖氧基‑3,16,20,25‑四羟基‑9‑甲基‑19‑去甲羊毛甾为母核结构的10种葫芦烷型四环三萜皂苷，含量之和>50%，不含环烯醚萜类成分。其中化合物2β‑葡萄糖氧基‑3,16,20‑三羟基‑9‑甲基‑19‑去甲羊毛甾‑5,25‑二烯‑22‑酮为一种新发现葫芦烷型四环三萜皂苷。药理研究表明胡黄连葫芦烷型皂苷提取物可促进正常和便秘模型小鼠排便，并增加粪便含水率。可用于制备治疗便秘药物。

Description

胡黄连葫芦烷型皂苷提取物及其在制备治疗便秘药物中的应用

技术领域

本发明属于中药新药研发领域，具体而言，涉及一种胡黄连葫芦烷型皂苷提取物及其在制备治疗便秘药物中的应用。

背景技术

胡黄连作为“胡药”自唐代开始引入并逐渐被中医理论体系吸收，为中医临床清虚热要药，其性寒，味苦，归肝、胃、大肠经，具有清热凉血、燥湿消疳等功效，用于小儿疳热、骨蒸潮热、湿热泻痢、黄疸尿赤、痔疮肿痛等。现代研究已证实胡黄连含有环烯醚萜、葫芦烷型三萜、苯乙醇糖苷和酚苷等化合物，另外还含有酚酸如香草酸、肉桂酸和阿魏酸等，2020年版《中国药典》规定胡黄连含胡黄连苷Ⅰ和苷Ⅱ的总量不得少于9.0%。现代药理学表明胡黄连具有保肝利胆、调节血脂、抗哮喘、抗炎和降血糖等作用，一般研究认为与其所含环烯醚萜类、苯乙醇糖苷类和酚苷类化合物相关。

胡黄连为儿科常用药，有学者在长期的临床实践过程中发现胡黄连免煎剂具有未被传统本草学著作记载的泻下功效（《胡黄连免煎剂的泻下作用》，山西中医，2016年32卷2期），动物研究进一步证实胡黄连药材水煎液亦具有泻下作用（《基于谱效关系分析的胡黄连泻下新功效及其物质基础研究》，山西中医学院，2017年硕士学位论文），通过谱效研究分析明确香草酸为胡黄连泻下活性物质之一（《胡黄连提取物香草酸的新用途》，CN106983737B）。香草酸是植物次生代谢产生的一种酚酸类化合物，作为香料、食品添加剂、防腐剂等用于食品工业，广泛存在于大米、草莓、甘蔗、芒果、小麦等植物中。药理活性研究证实香草酸具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡及抗血小板聚集作用。这就提示除香草酸外，胡黄连中泻下活性成分还需进一步确认。

有文献报道胡黄连可通过调节肠道菌群结构及代谢产物增强胃肠道动力，保护胃肠道黏膜，缓解便秘症状（《基于16S rDNA和GC-MS技术研究胡黄连治疗便秘小鼠的作用机制》，中国中药杂志），但仍未明确胡黄连中泻下的具体成分。

慢性便秘是临床常见的一种消化系统疾病或症状，表现为排便次数减少、粪便干硬和（或）排便困难，严重影响患者生活质量。2016年颁布的罗马Ⅳ诊断体系中与慢性便秘相关的疾病包括功能性便秘、阿片引起的便秘、便秘型肠易激综合征和功能性排便障碍，目前针对不同类型的慢性便秘使用缓泻剂改善症状是治疗的主要措施，主要有（1）容积性泻药如甲基纤维素可通过增加粪便的含水量及容积起到导泻作用；（2）渗透性缓泻药如乳果糖在肠道形成高渗状态，吸收水分，刺激肠道蠕动；（3）刺激性泻药如含蒽醌的植物性泻药作用于肠道神经系统，增强肠道动力；（4）润滑性泻药如甘油可润滑肠壁，软化大便。缓泻剂种类繁多，短期服用可明显改善排便，但长期使用效果不理想或存在致癌风险，例如长期服用含蒽醌泻药会加重便秘，并诱发黑肠病，而长期服用酚酞存在致癌风险，2021年国家药品监督管理局停止酚酞片和酚酞含片在我国的生产、销售和使用。

随着对慢性便秘发病机制的研究不断深入，以促进肠道分泌及调节胆汁酸吸收代谢为策略的创新药物研究方兴未艾，前者代表药物如利那洛肽（商品名令泽舒），为细胞鸟苷酸环化酶C受体（GC-C）激动剂，其通过激活肠上皮细胞GC-C导致胞内cGMP升高，继而开启囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR）促进氯离子和碳酸氢根分泌，增加肠内容物水分，促进排便；后者如日本批准的埃洛比昔巴特（商品名GOOFICE），为胆汁酸转运蛋白（ASBT）抑制剂，其可以通过抑制回肠ASBT对胆汁酸的重吸收，从而增加胆汁酸流向结肠，进而促进肠道分泌更多的水分、促进肠道蠕动，达到改善患者自然排便的效果。目前国内缺乏具有自主知识产权的治疗慢性便秘创新药物，国外厂商在华获批药品价格昂贵，加重国家公共卫生和医疗系统负担。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明将胡黄连提取物经大孔树脂吸附后根据极性差异分成不同洗脱组分，基于活性导向采用动物模型跟踪泻下活性组分，继而结合化学显色鉴别反应、光谱、色谱、质谱及核磁共振等技术证实葫芦烷型皂苷为胡黄连泻下有效部位，进一步经药理学实验证实胡黄连葫芦烷型皂苷提取物具有治疗便秘作用。

本发明提供了一种胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷，白色粉末，分子式C₃₆H₅₈O₁₀，分子量650，化学名为2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,25-二烯-22-酮（化合物Ⅸ），命名为胡黄连葫芦皂苷A，结构式如下

。

本发明还提供了一种胡黄连葫芦烷型皂苷提取物，所述葫芦烷型皂苷提取物含有以2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾为母核结构的10种葫芦烷型四环三萜皂苷，具体为：化合物Ⅰ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅱ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅲ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮、化合物Ⅳ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,22-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯、化合物Ⅴ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮、化合Ⅵ：2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-4,4,9,14-四甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-20-酮、化合物Ⅶ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅷ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯-22-酮、化合物Ⅸ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,25-二烯-22-酮、化合物Ⅹ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮；10个化合物含量之和>50%；不含环烯醚萜类成分。

制备所述的胡黄连葫芦烷型皂苷提取物的方法，步骤如下：

（1）中药胡黄连水煎煮或有机溶剂回流提取，水提取液直接过大孔吸附树脂吸附，有机溶剂提取液先回收有机溶剂，加水分散后过大孔吸附树脂吸附；

（2）水洗至近无色；

（3）有机溶剂解吸；

（4）洗脱液浓缩，得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物；

（5）将葫芦烷型皂苷粗提物进行柱层析纯化获得胡黄连葫芦烷型皂苷提取物。

所述中药胡黄连为玄参科植物印度胡黄连Picrorrhiza kurroa Royle ex Benth或西藏胡黄连Picrorhiza scrophulariiflora Pennell的根茎。

所述大孔吸附树脂为AB-8、D4020、D101、D860021、HP20的任意一种；所述柱层析为硅胶、氧化铝或ODS柱层析中的任意一种；所述有机溶剂为甲醇或乙醇。

本发明通过提取方法的研究，确定了化合物Ⅰ-化合物Ⅹ为主要成分的胡黄连葫芦烷型皂苷提取物及其制备工艺。10个化合物含量之和>50%；不含环烯醚萜类成分。本制备工艺可以获得上述葫芦烷型三萜皂苷类化合物的含量之和在50％至100％之间的胡黄连葫芦烷型皂苷提取物。本发明建立了化合物Ⅰ-化合物Ⅹ的HPLC含量测定方法。

本发明的另一目的是提供胡黄连葫芦烷型皂苷提取物在制备治疗便秘药物中的应用。药理实验表明胡黄连葫芦烷型皂苷提取物可促进正常小鼠及便秘模型小鼠排便，并明显增加粪便含水率，具有明确泻下作用。

附图说明

图1胡黄连乙醇提取物及各洗脱物HPLC图谱；图中：A为275nm，B为230nm，C为200nm；图2为化合物Ⅸ的红外图谱；图3为化合物Ⅸ的高分辨质谱图；图4为化合物Ⅸ的¹H-NMR图谱；图5为化合物Ⅸ的¹³C-NMR图谱；图6为化合物Ⅸ的关键的¹H,¹H-COSY和HMBC信号；图7为胡黄连葫芦烷型皂苷提取物基峰强度色谱图；图中：A：负离子模式B：正离子模式；图8为胡黄连葫芦烷型皂苷提取物液相色谱图；图9为胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ紫外吸收光谱图；图10为胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷化合物Ⅰ-Ⅹ结构式。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：取西藏胡黄连2公斤，加水煎煮提取3次，每次加水量为20升，煎煮时间为1小时，滤过，合并提取液，过D101大孔吸附树脂吸附，依次用水、体积浓度30%乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液至薄层层析检测不到25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）为止。洗脱液减压回收乙醇，得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物151克。经HPLC检测，其中25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮（Ⅰ）、2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮（Ⅱ）、2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅲ）、2β-葡萄糖氧基-3,16,20,22-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯（Ⅳ）、25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）、2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-4,4,9,14-四甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-20-酮（Ⅵ）、25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮（Ⅶ）、2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯-22-酮（Ⅷ）、2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,25-二烯-22-酮（Ⅸ）、25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅹ）的含量之和为9.5％。将此胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物加入乙酸乙酯进行精制，减压回收乙酸乙酯，得胡黄连葫芦烷型皂苷提取物31克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为51％。取此皂苷提取物进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集皂苷部分，回收溶剂，得精制胡黄连葫芦烷型皂苷提取物18克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为72％，其中25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）的含量为53％，液质联用未检出环烯醚萜苷类成分。

实施例2：取西藏胡黄连2公斤，加无水乙醇加热提取3次，每次10升，回流时间为1小时，滤过，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，加水稀释，过AB-8大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、体积浓度20%乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液至薄层层析检测不到25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）为止。洗脱液减压回收乙醇，得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物168克。将此葫芦烷型皂苷粗提物加入乙酸乙酯进行精制，减压回收乙酸乙酯，得胡黄连葫芦烷型皂苷提取物36克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为56％。取此胡黄连葫芦烷型皂苷提取物进行氧化铝柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集皂苷部分，回收溶剂，得精制胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷提取物23克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为74％，其中其中25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）的含量为57％，液质联用未检出环烯醚萜苷类成分。

实施例3：取西藏胡黄连2公斤，加95%乙醇加热提取3次，每次10升，回流时间为1小时，滤过，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，加水稀释，过HP-20大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、体积浓度30%乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液至薄层层析检测不到25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）为止。洗脱液减压回收乙醇，得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物157克。将此葫芦烷型皂苷粗提物加入乙酸乙酯进行精制，减压回收乙酸乙酯，得胡黄连葫芦烷型皂苷提取物31克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为62％。取此胡黄连葫芦烷型皂苷提取物进行ODS柱层析，用甲醇和水的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集皂苷部分，回收溶剂，得精制胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷提取物18克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为84％，其中其中25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）的含量为68％，液质联用未检出环烯醚萜苷类成分。

实施例4：取印度胡黄连2公斤，加水煎煮提取3次，每次加水量为20升，煎煮时间为1小时，滤过，合并提取液，过D4020大孔吸附树脂吸附，依次用水、体积浓度30%乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液至薄层层析检测不到25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）为止。洗脱液减压回收乙醇，得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物155克。将此胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物加入乙酸乙酯进行精制，减压回收乙酸乙酯，得胡黄连葫芦烷型皂苷提取物33克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为53％。取此皂苷提取物进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集皂苷部分，回收溶剂，得精制胡黄连葫芦烷型皂苷提取物21克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为77％，其中25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）的含量为51％，液质联用未检出环烯醚萜苷类成分。

实施例5：取印度胡黄连2公斤，加无水乙醇加热提取3次，每次10升，回流时间为1小时，滤过，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，加水稀释，过D860021大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、体积浓度30%乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液至薄层层析检测不到25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）为止。洗脱液减压回收乙醇，得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物161克。将此葫芦烷型皂苷粗提物加入乙酸乙酯进行精制，减压回收乙酸乙酯，得胡黄连葫芦烷型皂苷提取物34克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为52％。取此胡黄连葫芦烷型皂苷提取物进行氧化铝柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，TLC检测，收集皂苷部分，回收溶剂，得精制胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷提取物19克，经HPLC检测，其中葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ的含量之和为81％，其中其中25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮（Ⅴ）的含量为60％，液质联用未检出环烯醚萜苷类成分。

实验例1：胡黄连泻下活性组分筛选

1、实验材料：药物与试剂：胡黄连饮片，购自山西省中医院草药房（批号：21010129）；D101大孔吸附树脂购自天津波鸿树脂科技有限公司；乙醇购自北京迪马欧泰科技发展中心。

实验动物：SPF级KM小鼠，雌雄各半，共120只，体重20±2g，生产合格证号：SCXK（京）2014-0013，购自北京华阜康生物科技有限公司。

2、实验方法：胡黄连乙醇提取物制备：称取胡黄连饮片200 g，粉碎过10目筛，加入1500 ml乙醇，加热回流提取1.5 h，过滤，取上清，余下残渣继续提取2次，合并三次滤液，旋转蒸发仪减压浓缩回收乙醇，水浴蒸干，得83.2 g干膏。

大孔树脂洗脱物制备：称取500 g D101大孔吸附树脂置于饱和食盐溶液浸泡18~20 h，蒸馏水洗至无色，再用质量浓度为5%的盐酸浸泡2~4h，放尽后蒸馏水洗至中性，装入直径5 cm玻璃柱内待用。

取胡黄连乙醇提取干膏80 g，加入500 ml蒸馏水溶解并除去不溶物，上样已预处理好大孔树脂柱充分吸附，纯水洗脱至近无色并Molish反应阴性，依次换10%乙醇液、20%乙醇液、30%乙醇液、40%乙醇液、50%乙醇液、60%乙醇液、70%乙醇液、80%乙醇液和90%乙醇液洗脱大孔树脂，分别收集各洗脱液，水浴蒸干，分别得到42.31 g，6.63 g，11.82 g，9.14 g，4.53 g，3.21 g，0.83 g，0.42 g，0.33 g和0.24 g。

受试药物配制：称取4 g胡黄连乙醇提取物，加入10 ml蒸馏水，配制成0.1g/ml混悬液；另分别称取相当于4 g提取物的各洗脱组分，同法配制成混悬液。

小鼠泻下实验：分组与给药：120只小鼠适应性喂养3天，随机分为空白组、胡黄连乙醇提取物组、水洗脱组、10%乙醇洗脱组、20%乙醇洗脱组、30%乙醇洗脱组、40%乙醇洗脱组、50%乙醇洗脱组、60%乙醇洗脱组、70%乙醇洗脱组、80%乙醇洗脱组和90%乙醇洗脱组，每组10只，雌雄各半。除空白组灌胃给予蒸馏水外，其余各组给予相应药物，灌胃体积20 ml/kg。

观察指标：灌胃给药后将小鼠单笼饲养，笼底铺垫滤纸，连续观察6 h，记录各组出现稀便小鼠只数，按照下列公式计算各组泻下率：泻下率=泻下动物数/该组动物总数X100%。

3、实验结果：本实验以4 g/kg乙醇提取物为对照，系统比较各洗脱物在相当于4g/kg乙醇提取物剂量下对正常小鼠排便及粪便性状的影响。灌胃给药后连续观察6 h，如表1所示，结果表明乙醇提取物组10只小鼠均出现稀便，泻下率100%，同时发现50%和60%乙醇洗脱组可见泻下小鼠，其中灌胃0.16 g/kg的50%洗脱物10只小鼠均出现稀便，泻下率100%。

表1 胡黄连乙醇提取物及各洗脱物对正常小鼠泻下影响（n=10）

实验例2：胡黄连泻下活性组分中化学物质分离、纯化与鉴定研究

1、实验材料：药物与试剂：草夹竹桃苷、香草酸、胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ对照品均购自上海吉至生化科技有限公司；胡黄连乙醇提取物及其大孔树脂不同体积分数乙醇洗脱物；色谱级乙腈，购自北京迪马欧泰科技发展中心。

实验仪器：Bruker AVANCE NEO 500 MHz型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）；ACQUITY UPLC I-CLASS/Xevo G2-XS QTOF液质联用色谱仪（美国Waters公司）；NicoletiN10 MX显微红外成像光谱仪（美国ThermoFisher公司）；Waters制备型高效液相色谱仪：二元梯度输液泵（1525型）配自动进样器（2707型）、紫外可见检测器（2489型），Diamonsil ODS色谱柱（150 mm X 21.2 mm，10 μm）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；EYELASB-1000型旋转蒸发仪（日本Eyela公司）；XS105电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；D101大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）；色谱纯乙腈（美国ThermoFisher公司）；其他试剂均为分析纯（天津市致远化学试剂有限公司）。

2、实验方法：标准物质溶液配制：精密称取草夹竹桃苷、香草酸、胡黄连苷Ⅰ和苷Ⅱ各5 mg，置于容量瓶中，加甲醇适量，超声30 min，放冷，定容至50 ml，过0.22 μm微孔滤膜备用。

供试品溶液配制：精密称取胡黄连乙醇提取物及大孔树脂各洗脱物适量，置于50ml容量瓶中，加甲醇，超声30 min，均制成10 mg/ml溶液，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

高效液相色谱（HPLC-UV）分析条件：色谱柱：Shim-pack C18-ODS色谱柱(250 mm X4.6 mm，5 μm)；流动相：A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈；流速：1.0 ml·min^-1；进样体积：10 μl；柱温：25 ℃；检测波长：200 nm、230 nm及275 nm。流动相梯度洗脱条件为：0-2 min，15%B；2-32 min，15-25%B；32-70min，25%-50%B；70-90min，50-80%B；

半制备反相色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18-ODS色谱柱（150 mm X 21.2 mm，10μm）；流动相：纯水/乙腈为70/30（v/v）；流速：20.0 ml·min^-1；进样体积：1000 μl；检测波长：200 nm。

UPLC-ESI-QTOF/MS分析条件：色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1×100 mm，1.8 μm），流动相为：0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～1.2min，15% A；1.2～6 min，15%→25%A；6～36 min，25%→55%A），流速0.2 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 µL。

质谱条件：XEVO G2-XS ESI离子源，正/负离子模式，锥孔电压40 V，离子源温度100 ℃，脱溶剂温度400 ℃，锥孔气体流量50 L/h，脱溶剂气体流量700 L/h。扫描范围m/ z100～1500，校正液：亮氨酸-脑啡肽，[M+H] 556.2771，[M-H] 554.2615。采用Masslynx4.1工作软件，在MS^E Continuum模式采集质谱数据，扫描速率0.2/s，碰撞能量20V～35V。

3、实验结果：HPLC-UV图谱：如图1所示，环烯醚萜苷、酚苷及酚酸最大吸收波长在280 nm左右，而葫芦烷型四环三萜最大吸收波长在230 nm左右或末端吸收，本发明采用高效液相色谱梯度洗脱结合多波长分析胡黄连各组分中化学物质，样品浓度均为10 mg/ml，进样10 μl。与标准物质比对，275 nm波长（图1A）可见胡黄连乙醇提取物含有草夹竹桃苷（峰1）、香草酸（峰2）、胡黄连苷Ⅱ（峰3）、胡黄连苷Ⅰ（峰4），10%乙醇洗脱物富含草夹竹桃苷，20%和30%乙醇洗脱物均富含香草酸及胡黄连苷Ⅱ，40%乙醇洗脱物富含胡黄连苷Ⅰ，50%及以上洗脱物则检测不到更多化合物，而230 nm波长（图1B）可见50%乙醇洗脱物含有主峰8；200nm波长（图1C）可检测出50%乙醇洗脱物含未知化合物5-11。上述分析结果提示峰5-11可能为50%乙醇洗脱物中泻下活性化合物，有待于进一步分离与鉴定研究。

化合物鉴定结果：50%乙醇洗脱物进一步经乙酸乙酯精制，采用反相高效液相制备柱反复分离、纯化，共鉴定出10种葫芦烷型三萜皂苷，鉴定结果如下：

化合物Ⅰ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；UV光谱显示末端吸收；¹H-NMR(500MHz, CD₃OD) δ：0.88(3H, s)，1.04(3H, s)，1.13(3H, s)，1.22(3H, s)，1.28(3H, s)，2.22(3H, s)；1.42(1H, d, H-15a)，1.75(1H, ddd, H-1a)，1.86(1H, br d, H-8)，1.89(1H, dd, H-15b)，1.92(1H, dd, H-7a)，2.53(1H, ddd, H-7b)，2.58(1H, H-10)，2.59(1H, ddd, H-1b)，3.09(1H, d, H-17)，3.66(1H, d, H-3)，3.76(1H, dd, H-6b’)，3.99(1H, dd, H-6a’)，4.29(1H, ddd, H-2)，4.52(1H, d, H-1’)，4.93(1H, br.t, H-16)，5.68(1H, br.d, H-6)；¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD) δ：28.34(C-1)，77.57(C-2)，77.13(C-3)，42.26(C-4)，141.73(C-5)，121.31(C-6)，25.31(C-7)，44.60(C-8)，35.74(C-9)，38.04(C-10)，32.83(C-11)，30.58(C-12)，49.85(C-13)，49.56(C-14)，46.60(C-15)，72.75(C-16)，69.64(C-17)，19.24(C-18)，29.00(C-19)，211.83(C-20)，31.86(C-21)，27.41(C-28)，26.19(C-29)，18.65(C-30)，102.06(C-1’)，75.23(C-2’)，78.12(C-3’)，71.79(C-4’)，77.92(C-5’)，62.89(C-6’)。ESI-MS/MS(-)m/z：597.43[M+HCOO]^-，551.41[M-H]^-；提示分子量552，分子式为C₃₀H₄₈O₉。经与文献对比，化合物Ⅰ为2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-4,4,9,14-四甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-20-酮。结构式为：

。

化合物Ⅱ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；熔点：166-168℃；UV光谱显示末端吸收；¹H-NMR(500 MHz, CD₃OD) δ：1.03(3H, s)，1.11(3H, s)，1.14(3H, s)，1.20(3H, s)，1.27(3H, s)，1.37(3H, s)，1.37(3H, s)，1.47(3H, s)；1.88(1H, dd, H-7a)，2.63(1H,d, H-17)，2.48(1H, ddd, H-7b)，3.66(1H, d, H-3)，3.75(1H, dd, H-6b’)，3.98(1H,dd, H-6a’)，4.28(1H, br.d, H-2)，4.52(1H, d, H-1’)，4.46(1H, br.t, H-16)，5.68(1H, br.d, H-6)，2.78(1H, ddd, H-23a)，2.94(1H, ddd, H-23b)；¹³C-NMR(125 MHz,CD₃OD) δ：28.42(C-1)，77.55(C-2)，77.06(C-3)，42.22(C-4)，141.70(C-5)，121.51(C-6)，25.45(C-7)，44.05(C-8)，35.41(C-9)，38.12(C-10)，31.73(C-11)，32.77(C-12)，49.81(C-13)，49.84(C-14)，47.08(C-15)，72.01(C-16)，60.09(C-17)，18.45(C-18)，29.39(C-19)，81.36(C-20)，25.25(C-21)，217.43(C-22)，32.95(C-23)，38.23(C-24)，70.80(C-25)，29.19(C-26)，28.90(C-27)，27.42(C-28)，26.20(C-29)，19.23(C-30)，101.93(C-1’)，75.17(C-2’)，78.06(C-3’)，71.73(C-4’)，77.87(C-5’)，62.87(C-6’)。ESI-MS/MS(-)m/z：713.48[M+HCOO]^-，667.47 [M-H]^-；提示分子量668.9，分子式为C₃₆H₆₀O₁₁。经与文献对比，化合物Ⅱ为2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮。结构式为：

。

化合物Ⅲ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；熔点：156-160℃；UV λ_max(nm)：230；¹H-NMR(500 MHz, CD₃OD) δ：1.03(3H, s)，1.11(3H, s)，1.14(3H, s)，1.20(3H, s)，1.27(3H, s)，1.40(3H, s)，1.40(3H, s)，1.47(3H, s)；1.30(1H, d, H-15a)，1.75(1H, d, H-15b)，1.75(1H, ddd, H-1a)，1.88(1H, ddd, H-7a)，2.45(1H, d, H-17)，2.48(1H, ddd,H-7b)，2.50(1H, ddd, H-1b)，3.68(1H, d, H-3)，3.74(1H, dd, H-6b’)，3.96(1H, dd,H-6a’)，4.28(1H, br.d, H-2)，4.51(1H, d, H-1’)，4.51(1H, br.t, H-16)，5.67(1H,br.d, H-6)，6.87(1H, d, H-24)，7.04(1H, d, H-23)；¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD)δ：28.40(C-1)，77.61(C-2)，77.12(C-3)，42.25(C-4)，141.72(C-5)，121.42(C-6)，25.27(C-7)，44.12(C-8)，35.45(C-9)，38.14(C-10)，31.63(C-11)，32.72(C-12)，49.11(C-13)，49.82(C-14)，47.07(C-15)，72.37(C-16)，60.04(C-17)，18.63(C-18)，29.25(C-19)，81.46(C-20)，25.15(C-21)，205.23(C-22)，121.55(C-23)，155.14(C-24)，71.48(C-25)，29.29(C-26)，28.93(C-27)，27.42(C-28)，26.17(C-29)，19.24(C-30)，102.03(C-1’)，75.27(C-2’)，78.16(C-3’)，71.74(C-4’)，77.97(C-5’)，62.87(C-6’)。ESI-QTOF-MS/MS (-) m/z：711.47[M+HCOO]^-，665.46 [M-H]^-；提示分子量666.8，分子式C₃₆H₅₈O₁₁。经与文献对比，化合物Ⅲ为2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮。结构式为：

。

化合物Ⅳ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；熔点：175-179℃；UV光谱显示末端吸收；¹H-NMR(500 MHz, CD₃OD) δ：0.94(3H, s)，1.03(3H, s)，1.08(3H, s)，1.11(3H, s)，1.18(3H, s)，1.24(3H, s)，1.62(3H, s)，1.77(3H, s)；1.88(1H, dd, H-7b)，2.21(1H,dd, J = 6.6, 14.0 Hz, H-23b)，2.30(1H, br dd, J=6.2, 13.6 Hz, H-23a)，2.39(1H,d, H-17)，2.42(1H, br d, H-7a)，3.37(1H, tr, H-22)，3.60(1H, br, H-3)，3.67(1H,dd, J = 5.4, 11.8 Hz, H-6b’)，3.90(1H, br d, J= 11.8 Hz, H-6a’)，4.28(1H, br d,J=11.3 Hz, H-2)，4.30(1H, d, J=7.8 Hz, H-1’)，4.56(1H, tr, J=7.4 Hz, H-16)，5.23(1H, tr, J=6.9 Hz, H-24)，5.59(1H, br d, J=4.9 Hz, H-6)；¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD)δ：28.5(C-1)，76.6(C-2)，75.7(C-3)，41.6(C-4)，141.6(C-5)，120.0(C-6)，24.7(C-7)，42.9(C-8)，34.5(C-9)，36.9(C-10)，31.3(C-11)，32.1(C-12)，48.8(C-13)，49.4(C-14)，46.1(C-15)，71.7(C-16)，56.9(C-17)，18.5(C-18)，28.0(C-19)，76.6(C-20)，24.5(C-21)，81.1(C-22)，31.5(C-23)，124.3(C-24)，131.8(C-25)，25.9(C-26)，18.0(C-27)，27.2(C-28)，26.2(C-29)，18.1(C-30)，101.3(C-1’)，75.7(C-2’)，78.6(C-3’)，71.7(C-4’)，78.7(C-5’)，62.7(C-6’)。ESI -MS/MS (-) m/z：651.47[M-H]^-，697.48[M+HCOO]^-；分子量652，分子式C₃₆H₆₀O₁₀。经与文献对比，化合物Ⅳ确定为2β-葡萄糖氧基-3,16,20,22-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯。结构式为：

。

化合物Ⅴ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；熔点125-128℃；UV λ_max(nm)：230；¹H-NMR(500 MHz, CD₃OD) δ：0.94(3H, s)，1.02(3H, s)，1.03(3H, s)，1.10(3H, s)，1.18(3H, s)，1.39(3H, s)，1.54(3H, s)，1.56(3H, s)；2.00(3H, s，OAc)，2.34(1H, d, J =7.2 Hz, H-17)，2.43(2H, br.d, J = 15.3 Hz, H-7)，3.68(1H, dd, J = 10.7, 5.2 Hz,H-6b’)，3.89(1H, d, J = 10.7Hz, H-6a’)，4.29(1H, br.d, J = 10.6 Hz, H-2)，4.43(1H, d, J = 7.7 Hz, H-1’)，4.47(1H, br.t, J = 7.8 Hz, H-16)，5.58(1H, d, J =5.2 Hz, H-6)，6.77(1H, d, J = 15.8 Hz, H-23)，6.95(1H, d, J = 15.8 Hz, H-24)；¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD) δ：28.0(C-1)，76.7(C-2)，75.7(C-3)，41.6(C-4)，141.6(C-5)，120.0(C-6)，24.7(C-7)，42.7(C-8)，34.9(C-9)，37.0(C-10)，30.9(C-11)，32.0(C-12)，49.0(C-13)，49.0(C-14)，46.8(C-15)，71.7(C-16)，60.2(C-17)，18.6(C-18)，20.0(C-19)，80.2(C-20)，25.4(C-21)，204.6(C-22)，122.8(C-23)，149.6(C-24)，79.9(C-25)，26.3(C-26)，26.7(C-27)，27.2(C-28)，26.2(C-29)，18.7(C-30)，101.7(C-1’)，75.5(C-2’)，78.8(C-3’)，71.3(C-4’)，78.6(C-5’)，62.7(C-6’)，21.8(OAC, C-1)，169.8(OAC, C-2)。ESI-MS/MS (-) m/z：707 [M-H]^-，753 [M+HCOO]^-；分子量708，分子式C₃₈H₆₀O₁₂。经与文献对比，化合物Ⅴ确定为25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮。结构式为：

。

化合物Ⅵ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；UV λ_max(nm)：279；¹H-NMR(500 MHz,CD₃OD) δ：0.93(3H, s, H-18)，0.94(3H, s, H-19)，1.03(3H, s, H-28)，1.08(3H, s, H-30)，1.18(3H, s, H-29)，1.43(6H, s, H-26, H-27)，1.94(3H, s, OCOMe)；1.12(3H, d,J=6.7 Hz, H-21)，1.26(1H, d, J=12.8 Hz, H-15b)，1.47(1H, m, H-12b)，1.50(1H, m,H-11b)，1.65(1H, d, J=12.4 Hz, H-1b)，1.72(1H, m, H-15a)，1.73(1H, m, H-11a)，1.76(1H, m, H-8)，1.77(1H, m, H-1a)，1.84(1H, m, H-7b)，1.94(1H, m,H-12a)，1.98(2H, m, H-24a, H-24b)，2.03(1H, dd, J=10.6, 6.4 Hz, H-17)，2.40(1H, m, H-7a)，2.45(1H, m, H-10)，2.56(1H, m, H-23b)，2.68(1H, m, H-23a)，2.71(1H, m, H-20)，3.18(1H, dd, J=9.2,7.8 Hz, H-2’)，3.27(1H, d, J=8.7 Hz, H-4’)，3.30(1H, m, H-5’)，3.37(1H, dd, J=9.2, 8.7 Hz, H-3’)，3.60(1H, br s, H-3)，3.66(1H, dd, J=11.9, 6.0 Hz, H-6’b)，3.89(1H, dd, J=11.9, 2.2 Hz, H-6’a)，3.99(1H, t, J=7.8Hz, H-16)，4.20(1H, m, H-2)，4.42(1H, d, J=7.8 Hz, H-10)，5.58(1H, d, J=5.9 Hz,H-6)；¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD) δ：29.0 (C-1)，77.5 (C-2)，77.1 (C-3)，42.2(C-4)，141.7 (C-5)，121.5 (C-6)，25.4 (C-7)，44.9 (C-8)，35.6 (C-9)，38.0 (C-10)，32.8 (C-11)，31.5 (C-12)，48.8 (C-13)，49.5 (C-14)，47.5 (C-15)，77.5 (C-16)，58.0 (C-17)，17.4 (C-18)，28.4 (C-19)，50.3 (C-20)，17.1 (C-21)，217.6 (C-22)，37.0 (C-23)，35.6(C-24)，83.1 (C-25)，26.2 (C-26)，26.2 (C-27)，27.4 (C-28)，26.2 (C-29)，19.0 (C-30)，22.3(OAC, C-1)，172.5(OAC, C-2)，102.0 (C-1’)，75.2(C-2’)，77.9(C-3’)，71.7(C-4’)，78.1(C-5’)，62.8 (C-6’)。ESI-MS/MS(-)m/z：693.46[M-H]^-；提示分子量694，分子式为C₃₈H₆₂O₁₁。经与文献对比，化合物Ⅵ为25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮。结构式为：

。

化合物Ⅶ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；UV λ_max(nm)：230，275；¹H-NMR(500MHz, CD₃OD) δ：1.03(3H, s)，1.12(3H, s)，1.14(3H, s)，1.20(3H, s)，1.27(3H, s)，1.46(3H, s)，1.52(3H, s)，1.52(3H, s)；1.31(1H, d, H-15a)，1.75(1H, ddd, H-1a)，1.78(1H, d, H-15b)，1.85(H, ddd, H-7a)，1.87(1H, br.d, H-8)，2.03(3H, s, OAc)，2.42(1H, d, H-17)，2.46(H, ddd, H-7b)，2.53(1H, ddd, H-1b)，2.75(1H, ddd, H-23a)，2.92(1H, ddd, H-23b)，3.69(1H, d, H-3)，3.77(1H, dd, H-6b’)，3.99(1H, dd,H-6a’)，4.29(1H, ddd, H-2)，4.48(1H, br.t, H-16)，4.53(1H, d, H-1’)，5.67(1H,br.d, H-6)。¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) δ：28.93(C-1)，77.48(C-2)，77.07(C-3)，42.23(C-4)，141.69(C-5)，121.53(C-6)，25.24(C-7)，44.02(C-8)，35.40(C-9)，38.06(C-10)，32.72(C-11/C-23)，31.71(C-12)，49.74(C-13)，49.60(C-14)，47.08(C-15)，71.95(C-16)，60.29(C-17)，19.18(C-18)，28.42(C-19)，81.40(C-20)，25.50(C-21)，216.89(C-22)，32.72(C-23)，35.89(C-24)，83.07(C-25)，26.29(C-26)，26.18(C-27)，27.42(C-28)，26.20(C-29)，18.50(C-30)，101.97(C-1’)，75.17(C-2’)，78.09(C-3’)，71.67(C-4’)，77.81(C-5’)，62.78(C-6’)，22.32(OAC, C-1)，172.40(OAC, C-2)。ESI-MS/MS (-) m/z：709.47 [M-H]^-；分子量710，分子式C₃₈H₆₂O₁₂。经与文献对比，化合物Ⅶ确定为25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮。结构式为：

。

化合物Ⅷ：白色无定型粉末，易溶于三氯甲烷、乙酸乙酯；UV光谱显示末端吸收。¹H-NMR(500 MHz, CD₃OD) δ：1.03(3H, s)，1.12(3H, s)，1.14(3H, s)，1.20(3H, s)，1.27(3H, s)，1.45(3H, s)，1.70(3H, s)，1.80(3H, s)；1.32(1H, d，H-15a)，1.74(1H, ddd,H-1a)，1.86(H, ddd, H-7a)，1.87(1H, br.d, H-8)，2.44(1H, dd, H-17)，2.47(H,br.dd, H-7b)，2.52(1H, ddd, H-1b)，2.52(1H, H-10)，3.69(1H, d, H-3)，3.76(1H, dd,H-6b’)，3.98(1H, dd, H-6a’)，4.28(1H, ddd, H-2)，4.50(1H, br.t, H-16)，4.52(1H,d, H-1’)，5.35(1H, H-24a)，5.66(1H, br.d, H-6)。¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD) δ：29.0(C-1)，76.1(C-2)，75.7(C-3)，42.2(C-4)，140.3(C-5)，120.1(C-6)，25.3(C-7)，44.1(C-8)，35.5(C-9)，38.1(C-10)，32.8(C-11)，31.7(C-12)，49.8(C-13)，49.0(C-14)，47.1(C-15)，70.6(C-16)，58.8(C-17)，17.8(C-18)，28.4(C-19)，80.0(C-20)，25.5(C-21)，214.7(C-22)，37.1(C-23)，116.9(C-24)，134.0(C-25)，16.8(C-26)，25.8(C-27)，27.5(C-28)，26.2(C-29)，17.1(C-30)，100.6(C-1’)，73.8(C-2’)，76.7(C-3’)，70.3(C-4’)，76.4(C-5’)，61.4(C-6’)。ESI-QTOF-MS/MS (-) m/z：649.44 [M-H]^-；提示分子量650.8，分子式C₃₆H₅₈O₁₀。经与文献对比，化合物Ⅷ确定为2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯-22-酮。结构式为：

。

化合物Ⅸ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯等。UV光谱显示末端吸收。香草醛-浓硫酸反应显棕黄色，Liebermann-Burchard和Molish反应均呈阳性。(-)ESI-MS显示加合离子峰m/z：695.4019 [M+HCOOH]^-（分子量计算值650.4030），分子式C₃₆H₅₈O₁₀。推测该化合物属于三萜糖苷类化合物。如表2所示，从¹H-NMR谱中可观察到两个烯氢信号δ _H5.58 (1H, brd, J = 5.3 Hz)和δ _H4.69 (2H, d, J=7.1 Hz)，10个连氧的亚甲基或次甲基氢信号δ _H4.43 (1H, d, J=7.8 Hz)，δ _H4.39 (1H, t, J=7.5 Hz)，δ _H4.21 (1H, ddd, J=12.1,4.3, 2.3 Hz)，δ _H3.93 (1H, dd, J=11.9, 2.0 Hz)，δ _H3.70 (1H, dd, J=11.9, 5.6Hz)，δ _H3.63 (1H, d, J=2.3 Hz)，δ _H3.38 (1H, m)，δ _H3.31, 3.24 (2H, m)和δ _H3.19(1H, dd, J = 9.3, 7.8 Hz)，7个单峰甲基信号δ _H1.73，1.36，1.18，1.10，1.06，1.03及0.94；结合¹³C-NMR及DEPT谱显示的36个碳信号，在低场区可见羰基信号δ _C216.7，两对烯碳信号δ _C141.7与δ _C121.5及δ _C146.3与δ _C110.5。此外，还显示9个连氧碳信号和7个甲基碳信号，提示化合物Ⅶ含有葫芦烷型四环三萜结构。δ _H4.43 (1H, d, J = 7.8 Hz)为葡萄糖端基上质子信号，再由偶合常数7.8 Hz推断葡萄糖为β构型，同样碳谱中亦可见葡萄糖上的6个碳信号δ _C102.0, 75.2, 78.1, 71.7, 77.8及62.8，其中δ _C102.0为端基碳信号。图2 IR光谱显示该化合物含有OH吸收峰（3444 cm^-1）以及C-H键（2937 cm^-1）、C=O键（1700 cm^-1）、C=C键（1647 cm^-1）的伸缩振动吸收峰。由以上数据可推测化合物Ⅶ为葫芦烷型葡萄糖苷。进一步通过¹H,¹H-COSY和HSQC确定了化合物Ⅶ的平面结构，且同化合物Ⅵ结构高度相似，差别仅在于17位侧链的双键位置为Δ²⁵。关键的HMBC信息也确认了上述结论，即H₃-27与C-24/C-25/C-26相关、H₂-26与C-24/C-27相关、H₂-24与C-22/C-23/C-25/C-26/C-27相关。

综合上述信息，确定化合物Ⅸ的结构为2β-d-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,25-二烯-22-酮，是1个未见报道的新葫芦烷型糖苷类化合物，命名为胡黄连葫芦皂苷A。结构式为：

。

表2 化合物Ⅶ的核磁共振波普数据（500 MHz/125 MHz, CD₃OD）

^a,b信号峰归属可能会互换。

化合物Ⅹ：白色粉末，易溶于氯仿、乙酸乙酯；熔点132-135℃，UV λ_max(nm)：200,230；¹H-NMR(500 MHz, CD₃OD) δ：1.22(3H, s)，1.04(3H, s)，1.64(3H, s)，1.63(3H, s)，1.11(3H, s)，1.27(3H, s)，1.18(3H, s)，2.09(3H, s)；1.38(1H, d, H-15a)，1.75(1H,ddd, H-1a)，1.79(1H, dd, H-15b)，1.86(1H, br d, H-8)，1.89(1H, dd, H-7a)，2.17(1H, d, H-17)，2.48(1H, ddd, H-7b)，2.51(1H, ddd, H-1b)，2.52(1H, H-10)，3.13(1H,dd, H-20)，3.68(1H, d, H-3)，3.76(1H, dd, H-6b’)，3.99(1H, dd, H-6a’)，4.11(1H,br.t, H-16)，4.28(1H, ddd, H-2)，4.52(1H, d, H-1’)，5.67(1H, br.d, H-6)，6.39(1H,d, H-23)，7.07(1H, d, H-24)；¹³C-NMR(125 MHz, CD₃OD) δ：28.97(C-1)，77.57(C-2)，77.13(C-3)，42.26(C-4)，141.68(C-5)，121.50(C-6)，25.37(C-7)，44.97(C-8)，35.59(C-9)，38.03(C-10)，32.84(C-11)，31.44(C-12)，47.05(C-15)，77.40(C-16)，58.48(C-17)，17.36(C-18)，28.43(C-19)，47.02(C-20)，17.80(C-21)，207.46(C-22)，127.58(C-23)，151.06(C-24)，80.92(C-25)，26.73(C-26)，26.60(C-27)，27.44(C-28)，26.19(C-29)，18.87(C-30)，102.03(C-1’)，75.25(C-2’)，78.12(C-3’)，71.78(C-4’)，77.92(C-5’)，62.85(C-6’)，21.84(OAC, C-1)，172.00(OAC, C-2)。ESI-MS/MS(-)m/z：737.52[M+HCOO]^-，691.51[M-H]^-；提示分子量692，分子式为C₃₈H₆₀O₁₁。经与文献对比，化合物Ⅹ为25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮。结构式为：

。

实验例3：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物制备工艺研究

为了从中药胡黄连得到杂质少且含量高的葫芦烷型皂苷提取物，本发明经反复研究最终完成了如下制备工艺。

胡黄连通过水煎煮或有机溶剂回流提取，但由于葫芦烷型三萜皂苷类化合物极性相对较低，水煎煮效率不高，4-6次才能提取完全，因此最好是采用有机溶剂如甲醇、乙醇回流提取，因乙醇安全性好、价格便宜，因此优选乙醇回流提取。

研究发现胡黄连葫芦烷型三萜皂苷类化合物可被大孔吸附树脂吸附，因此采用大孔吸附树脂吸附法可将葫芦烷型三萜皂苷类化合物与多糖、环烯醚萜、酚苷等杂质初步分离。水煎煮液可直接过大孔吸附树脂吸附，而有机溶剂提取液则回收溶剂至一定体积后加水分散后再经大孔吸附树脂吸附，先用低浓度有机溶剂把部分杂质洗脱下来，然后用高浓度有机溶剂把葫芦烷型三萜皂苷类成分洗脱下来，洗脱液经减压或常压浓缩，可得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提取物，此外还含有多糖及酚苷类成分，葫芦烷型皂苷类成分的含量低于50％。上述制备工艺中所述的大孔吸附树脂可选用AB-8、D4020、D101、860021、HP20的一种或具有相同或相似功能的其他厂商牌号的吸附树脂。除杂质洗脱用有机溶剂一般为甲醇、乙醇等有机溶剂与水的混合溶液，优选乙醇水溶液。利用低浓度有机溶剂的水溶液洗脱除杂质时所谓的低浓度是以不把皂苷类化合物洗脱下来为上限，一般不高于30％。

将上述方法所得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提取物，加水分散后用有机溶剂萃取，萃取液减压浓缩，干燥，也可以获得胡黄连葫芦烷型皂苷提取物，其中皂苷类成分的含量有所提高。用来萃取的有机溶剂可以是氯仿、乙酸乙酯等与水不相混溶的溶剂，优选乙酸乙酯。最后将上述方法获得的胡黄连葫芦烷型皂苷提取物进一步进行柱层析纯化可以获得纯度更高的精制胡黄连葫芦烷型皂苷提取物，所述的柱层析可选用硅胶、氧化铝或ODS柱层析。经高效液相色谱检测，其中主要成分包含化合物Ⅰ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅱ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅲ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮、化合物Ⅳ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,22-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯、化合物Ⅴ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮、化合Ⅵ：2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-4,4,9,14-四甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-20-酮、化合物Ⅶ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅷ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯-22-酮、化合物Ⅸ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,25-二烯-22-酮、化合物Ⅹ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮，它们的含量总和在50％至100％之间。同时不含有环烯醚萜苷类成分。

实验例4：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物含量分析方法及质谱检测

利用分光光度法可以测定葫芦烷型皂苷类化合物的总含量，但该方法一方面不准确，另一方面不能较为全面检测到具体皂苷成分，故建立胡黄连葫芦烷型皂苷提取物液质联用分析及HPLC含量测定方法。

药物与试剂：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物，本实验室制备；葫芦烷型四环三萜皂苷化合物Ⅰ-Ⅹ，本实验分离纯化制备，经液相分析鉴定纯度均达到99.2%；质谱级乙腈，购自北京迪马欧泰科技发展中心。

实验仪器：高效液相色谱仪：Agilent Techologies 1200 series；Shim-packC18-ODS色谱柱（250 mm X 4.6 mm，5 μm）；四元泵：G1311A；自动进样器：G1329A；柱温箱：G1316A；DAD二极管阵列检测器：G1315D；HP Chemstation色谱工作站。液质联用仪：ACQUITYUPLC I CLASS-G2-XS QTOF（美国Waters公司）；MassLynx V4.1质谱工作站（美国Waters公司）；ESI离子源。

标准物质溶液配制：精密称取化合物Ⅰ-Ⅹ各5 mg，置于容量瓶中，加甲醇适量，超声30 min，放冷，定容至50 ml，过0.22 μm微孔滤膜备用。

胡黄连葫芦烷型皂苷提取物溶液配制：精密称取胡黄连葫芦烷型皂苷提取物50mg，置于容量瓶中，加甲醇适量，超声30 min，放冷，定容至50 ml，过0.22 μm微孔滤膜备用。

UPLC-ESI-QTOF/MS分析条件：

色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1×100 mm，1.8 μm），流动相为：0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，25%→31% A；6～36 min，31%→50%A；36～38 min，50%→95%A），流速0.2 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 µL。

高效液相色谱条件：色谱柱：Shim-pack C18-ODS色谱柱(250 mm X 4.6 mm，5 μm)；流动相：A为0.1%磷酸水，B为乙腈；流速：1.0 ml·min^-1；进样体积：10 μl；柱温：20 ℃；检测波长：200 nm。梯度洗脱：0～15 min，15%→25% B；15～40 min，25%→30% B；40～50min，30%→30% B；50～65 min，30%→40% B。

液质联用分析结果：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物经超高效液相色谱-四极杆飞行时间串质谱分析，分别得正、负离子模式基峰强度色谱图，如图7所示，参照标准物质峰进行比对，可见葫芦烷型三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ，同时未检测出胡黄连苷Ⅰ和苷Ⅱ等环烯醚萜苷。

液相色谱分析结果：精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μl注入液相色谱仪，如图8所示，可见香草酸和肉桂酸，峰1为化合物Ⅰ，峰2为化合物Ⅱ，峰3为化合物Ⅲ，峰4为化合物Ⅳ，峰5为化合物Ⅴ，峰6为化合物Ⅵ，峰7为化合物Ⅶ，峰8为化合物Ⅷ，峰9为化合物Ⅸ，峰10为化合物Ⅹ。记录各峰面积，经计算化合物Ⅰ-Ⅹ含量之和达到68.1%。液相色谱也未检测出胡黄连苷Ⅰ和苷Ⅱ等环烯醚萜苷类成分。

实验例5：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物对小鼠排便影响研究

药物与试剂：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物（CTTS），本实验室制备；香草酸、肉桂酸购自上海吉至生化科技有限公司；利那洛肽胶囊(令泽舒)，Almac Pharma ServicesLimited，批号W054121，规格290 μg/粒。

实验动物：SPF级KM小鼠，雌雄各半，体重20±2g，生产合格证号：SCXK（京）2014-0013，购自北京华阜康生物科技有限公司。

受试药物配制：分别称取香草酸、肉桂酸各100 mg，加入5 ml蒸馏水，超声10 min，配制成20 mg/ml混悬液；称取适量胡黄连葫芦烷型皂苷提取物，同法配制成5 mg/ml、10mg/ml和20 mg/ml混悬液；取利那洛肽胶囊内容物，蒸馏水研磨，配制成5 μg/ml混悬液。放置4℃，备用。

碳末混悬液的制备：量取80 ml蒸馏水，加入10 g阿拉伯树胶，煮沸，溶解后再加入5 g活性炭；煮沸3次，冷却后定容至100 ml，4 ℃放置，备用。

对正常小鼠排便影响研究：小鼠适应性喂养3天后，随机分为空白组、利那洛肽组（50 μg/kg）、香草酸组（200 mg/kg）、肉桂酸组（200 mg/kg）、胡黄连葫芦烷型皂苷提取物低剂量组（50 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）和高剂量组（200 mg/kg），每组10只，雌雄各半。试验当日各组小鼠均灌胃碳末混悬液（10 ml/kg），30 min后除空白组灌胃给予蒸馏水外，其余各组给予相应药物，灌胃体积10 ml/kg。将小鼠单笼饲养，连续观察12 h，记录每只小鼠首次排黑便时间，收集粪便并称重记录排便量，同时待粪便完全干燥后计算粪便含水量。

对失水燥结便秘模型小鼠排便影响研究：小鼠适应性喂养后连续禁水不禁食72h，以制备失水燥结便秘模型。次日，将模型小鼠随机分为模型对照组、利那洛肽组（50 μg/kg）、香草酸组（200 mg/kg）、肉桂酸组（200 mg/kg）、胡黄连葫芦烷型皂苷提取物低剂量组（50 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）和高剂量组（200 mg/kg），同时设未禁水小鼠为空白组，每组10只，雌雄各半，各组小鼠均灌胃碳末混悬液（10 ml/kg），30 min后除空白组灌胃给予蒸馏水外，其余各组给予相应药物，灌胃体积10 ml/kg。将小鼠单笼饲养，连续观察12 h，记录每只小鼠首次排黑便时间，收集粪便并称重记录排便量，同时待粪便完全干燥后计算粪便含水率。

实验结果：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物对正常小鼠排便影响研究：本次实验以正常小鼠评价胡黄连葫芦烷型皂苷提取物的泻下作用，以利那洛肽为阳性对照，同时设香草酸和肉桂酸对照组。各组小鼠灌胃水或受试物液后连续观察12 h，如表3所示，利那洛肽组小鼠首粒黑便时间较空白组显著缩短（P＜0.05），排便粒数与粪便含水率显著增加（P＜0.05，P＜0.05）；香草酸和肉桂酸组小鼠在首粒黑便时间、排便粒数和粪便含水率与空白组比较均无明显变化；胡黄连葫芦烷型皂苷提取物三个剂量组与空白组比较呈剂量依赖性少首粒黑便时间，并增加排便量和粪便含水率，中剂量组（100 mg/kg）排便量和粪便含水率较空白组均明显增加（P＜0.05，P＜0.05）。

表3 胡黄连葫芦烷型皂苷提取物对正常小鼠排便影响（n=10）

注：^#P＜0.05，^##P＜0.01与空白组比较

胡黄连葫芦烷型皂苷提取物对失水燥结便秘模型小鼠排便影响研究：本次实验以禁水不禁食72 h复制的失水燥结便秘模型小鼠评价胡黄连葫芦烷型皂苷提取物的泻下作用，以利那洛肽为阳性对照，同时设香草酸和肉桂酸对照组。造模结束后各组小鼠灌胃水或受试物液后连续观察12 h，如表4所示，模型组小鼠首粒黑便时间与空白组比较显著延长（P＜0.01），排便量与粪便含水率较空白组均显著减少（P＜0.01，P＜0.001）；而利那洛肽、香草酸和肉桂酸对照组小鼠三个指标与模型组比较均无明显改善；胡黄连葫芦烷型皂苷提取物三个剂量组与模型组比较呈剂量依赖性减少首粒黑便时间，并增加排便量和粪便含水率，中剂量组（100 mg/kg）排便量和粪便含水率较模型组均明显增加（P＜0.05，P＜0.05）。

表4 胡黄连葫芦烷型皂苷提取物对失水燥结便秘模型小鼠排便影响（n=10）

注：^##P＜0.01, ^###P＜0.001与空白组比较；*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001与模型组比较

胡黄连葫芦烷型皂苷提取物100 mg/kg可促进正常小鼠排便，首粒黑便时间减少及排便量增加，同时粪便含水率增加；进一步采用失水燥结便秘模型小鼠证实100 mg/kg胡黄连葫芦烷型皂苷提取物同样减少首粒黑便时间，并增加排便量和粪便含水率，而香草酸（200 mg/kg）和肉桂酸200 mg/kg）对两种模型小鼠排便均无明显作用。

实验例6：胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷化合物对失水燥结便秘模型小鼠排便影响

药物与试剂：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物（CTTS）及化合物Ⅰ-Ⅹ，本实验室制备；利那洛肽胶囊(令泽舒)，Almac Pharma Services Limited，批号W054121，规格290 μg/粒。

受试药物配制：分别称取葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ化合物适量，加入5 ml蒸馏水，超声10 min，分别配制成5 mg/ml、10 mg/ml混悬液；称取适量胡黄连葫芦烷型皂苷提取物，同法配制成10 mg/ml混悬液；取利那洛肽胶囊内容物，蒸馏水研磨，配制成5 μg/ml混悬液。放置4℃，备用。

分组及给药：小鼠适应性喂养后连续禁水不禁食72 h，以制备失水燥结便秘模型。次日，将模型小鼠随机分为模型对照组、利那洛肽组（50 μg/kg）、胡黄连葫芦烷型皂苷提取物组（100 mg/kg）、及化合物Ⅰ-Ⅹ低剂量组（50 mg/kg）和高剂量（100 mg/kg），同时设未禁水小鼠为空白组，每组10只，雌雄各半，除空白组灌胃给予蒸馏水外，其余各组给予相应药物，灌胃体积10 ml/kg。将小鼠单笼饲养，连续观察12 h，收集每只小鼠粪便，称重，待完全干燥后计算粪便含水率。

实验结果：各组小鼠灌胃水或受试物后连续观察12 h，如表5所示，模型组小鼠排便量与粪便含水率较空白组均显著减少（P＜0.001，P＜0.001）；而利那洛肽50 μg/kg治疗组小鼠与模型组比较均无明显改善；胡黄连葫芦烷型皂苷提取物100 mg/kg治疗组与模型组比较均显著增加（P＜0.001，P＜0.001）。胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷化合物Ⅰ-Ⅹ的高剂量组（100 mg/kg）小鼠排便量与粪便含水率与模型组比较均显著增加。

表5胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷Ⅰ-Ⅹ对失水燥结便秘模型小鼠排便影响（n=10）

注：^###P＜0.001与空白组比较；*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001与模型组比较。

Claims

1.一种胡黄连葫芦烷型四环三萜皂苷，其特征在于：白色粉末，分子式C₃₆H₅₈O₁₀，分子量650，化学名为2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,25-二烯-22-酮，即化合物Ⅸ，命名为胡黄连葫芦皂苷A，结构式如下：

。

2.一种胡黄连葫芦烷型皂苷提取物，其特征在于：含有以2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾为母核结构的10种葫芦烷型四环三萜皂苷，具体为：化合物Ⅰ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅱ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅲ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,25-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮、化合物Ⅳ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20,22-四羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯、化合物Ⅴ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮、化合Ⅵ：2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-4,4,9,14-四甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-20-酮、化合物Ⅶ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5-烯-22-酮、化合物Ⅷ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,24-二烯-22-酮、化合物Ⅸ：2β-葡萄糖氧基-3,16,20-三羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,25-二烯-22-酮、化合物Ⅹ：25-乙酰氧基-2β-葡萄糖氧基-3,16-二羟基-9-甲基-19-去甲羊毛甾-5,23-(E)-二烯-22-酮；10个化合物含量之和>50%；不含环烯醚萜类成分。

3.制备权利要求2所述的胡黄连葫芦烷型皂苷提取物的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)中药胡黄连水煎煮或有机溶剂回流提取，水提取液直接过大孔吸附树脂吸附，有机溶剂提取液先回收有机溶剂，加水分散后过大孔吸附树脂吸附；

(2)大孔吸附树脂水洗脱至近无色；

(3)有机溶剂解吸，收集洗脱液；

(4)浓缩得胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物；

(5)将胡黄连葫芦烷型皂苷粗提物经柱层析纯化获得葫芦烷型皂苷提取物。

4.根据权利要求3所述的制备胡黄连葫芦烷型皂苷提取物的方法，其特征在于：所述中药胡黄连为玄参科植物印度胡黄连Picrorrhiza kurroa Royle ex Benth或西藏胡黄连Picrorhiza scrophulariiflora Pennell的根茎。

5.根据权利要求3所述的制备胡黄连葫芦烷型皂苷提取物的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为AB-8、D4020、D101、D860021、HP20的任意一种；所述柱层析为硅胶、氧化铝或ODS柱层析中的任意一种；所述有机溶剂为甲醇或乙醇。

6.权利要求2所述的胡黄连葫芦烷型皂苷提取物在制备治疗便秘药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：胡黄连葫芦烷型皂苷提取物与药学上可接受的辅料组成药物组合物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物组合物形成的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、贴剂或贴膏剂。