CN101428090A

CN101428090A - 一种具有明确谱效关系的西藏胡黄连组合物

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Publication number: CN101428090A
Application number: CNA2008100979717A
Authority: CN
Inventors: 关文捷; 谷道昭
Original assignee: CHENGDU SINO-STRONG PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: CHENGDU SINO-STRONG PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2008-05-21
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2028-05-21
Also published as: CN101428090B

Abstract

本项发明涉及一种具有明确谱效关系的西藏胡黄连提取物，具体为提取物中含胡黄连苷I(C₂₄H₂₈O₁₁)和胡黄连苷II(C₂₃H₂₈O₁₃)的含量之和不低于50％；并且在提取物的指纹图谱上，按照总胡黄连苷色谱计算胡黄连苷II与胡黄连苷I的峰面积比应为1.30～2.40。该提取物具有显著的抗肝损伤作用，在抗肝损伤药物领域具有良好的应用前景。

Description

一种具有明确谱效关系的西藏胡黄连组合物

技术领域

本项发明涉及一种天然药物提取物的研究和开发，以及该提取物在制药领域内的应用。

背景技术

胡黄连是玄参科多年生低矮草本植物，是一种常用药材。有清热、除湿、明眼目、补肝、益胆、杀虫的效用。主治痨热咳嗽、湿热泻痢、小儿疳积、目赤等疾病。过去依靠印度、印尼、锡金、尼泊尔等国进口解决国内用药，然而因资源及其他原因，每年进口甚少，远不能满足防病的需要。通过药材普查，发现西藏的聂拉木、吉隆、亚东、措那、洛扎等地均有生长，而且产量较多，为我国中药材填补了一个空白品种。1965年，在我国西藏和云南西北部发现胡黄连(picrorhiza kurrooa)的近缘植物，拟名为西藏胡黄连(picrorhiza scrophlariiflora)，并栽培作为胡黄连的代用品，这样，解决了我国长期依赖进口胡黄连的历史。

从90版《中国药典》开始至今，西藏胡黄连已被载为正品药源，具有清湿热、除骨蒸、消疳积之功效。其主要化学成分是胡黄连苷，国外研究表明，胡黄连提取物有较强的保肝利胆作用。

肝病是我国目前常见病，多发病之一。据调查，我国现有肝炎患者一千多万人，每年因肝病死亡的约三十万人，肝病已成为严重影响我国人口素质，造成重大经济和社会损失的疾病。所以，预防和治疗肝病势在必行。现在许多治疗肝病的药物虽然有一定的疗效，但毒副作用比较大，对肝脏有损害。如果服用不当，会导致病的恶化，所以开发研制疗效好、无毒副作用的药物具有十分重要的意义。

植物来源的药物在肝病治疗中起着重要的作用。印度药草治疗法中报道的许多植物用于治疗肝病。许多印度草药制剂都包含有胡黄连的一种主要成分。

胡黄连在印度用于治疗尿路感染及肝炎等已有上千年的历史，还可用于消化不良、便秘和感染引起的发烧等症。印度学者对胡黄连的肝保护作用进行了深入研究，证实胡黄连对各种肝毒剂如CCl₄、半乳糖胺、扑热息痛、硫代乙酰胺、利福平、酒精等引起的肝损伤有保护作用，抗病毒、利胆作用，促进肝细胞再生。Mehrotra(国外医药，1996：11(6)：259)等从急性和慢性肝炎病人及乙肝表面抗原阳性的病毒携带者取HBSAg阳性的血清做抗HBS样活性测试。证实胡黄连对血清中乙肝病毒活性有很高的抑制作用。

Vaidya(Journal of Postgraduate Medicine，1996(142)：105-108)报道了印度胡黄连根(PK)的颗粒剂(375mg、2次/日)给药2周后对急性病毒性肝炎(HbsAg阳性)及产生很好的治疗效果，胆红素、SGOT和SGDT值明显下降。后证实胡黄连苷I、胡黄连苷II为其主要活性成分。故以胡黄连提取物制成的Picroliv对肝炎治疗有很好的疗效。

Anklesaria(Drugs of the Future 2001，Picroliv)进行了Picroliv治疗急性病毒性肝炎的双盲试验。选取20名年龄在15～65岁的患者，入选患者症状持续时间不超过15天，其血清中胆红素含量大于5mg％，SGPT超过300U/I。在这项双盲试验中，受试患者接受共为期4周，每天两次的Picroliv(100mg)或安慰剂口服给药。每周进行临床和器官功能检测，以及乙肝表面抗原(HBsAg)检测，如果后者呈阳性，就要在第28天重复检测。试验前，给药组和空白对照组的症状学综合评分相近。但是治疗一周后，Picroliv组的症状得分(下降)和对照组出现了明显的差异(P<0.05)。通过对个体症状和表征的分析发现，Picroliv给药组的厌食、虚弱、恶心、呕吐，全身疼痛和黄疽等症状在给药第7天得到了明显的改善。而安慰剂对照组的这些症状却持续到了第28天。同时还发现血清中胆红素的含量在Picroliv组明显下降。和对照组相比，Picroliv组早期恢复非常明显(P<0.05)。这项试验证实了Picroliv可显著加速乙肝患者康复的能力。

Gaur(Drugs of the Future 2001，Picroliv)也报道了Picroliv对乙型肝炎的治疗作用。14名乙肝患者接受Picroliv(100mg/次，每天两次，给药4周)治疗，通过对临床症状以及肝功能检测(血清胆红素、碱性磷酸酶、蛋白质和SGPT)来评价患者对Picroliv给药的反应。结果发现，在为期4周的试验结束后，这些患者的临床症状都有明显的改变。在肝功能检测中也发现，血清胆红素、碱性磷酸酶和SGPT在试验结束后也逐渐下降，并且未发现任何与服用该药相关的不良反应。

Asthana(Drugs of the Future 2001，Picroliv)进行了Picroliv对健康志愿受试者的安全性试验，对受试者分别给予单次和多次口服Picroliv。单次给药20-300mg后，进行24小时临床监测。受试者的生命参数稳定，给药前后的心电图和实验室参数都在正常范围之内。随后进行一项为期4周的多剂量口服给药试验，其低剂量和高剂量分别是100mg和200mg。在低剂量组中未发现受试者出现不良反应，Picroliv的耐受性良好。在高剂量组的10例患者中，除1例消化不良、另1例轻度便秘外，生命体征、心电图、血液及生化指标上都没有出现明显变化。证实胡黄连口服安全，无明显毒副作用(Drugs of the Future2001，Picroliv)。

目前有关Picroliv的临床研究还在进一步广泛开展中，我国西藏胡黄连与胡黄连为近缘植物，化学成分与胡黄连类似，故有相同的保肝护肝作用，将为我国增加一个治疗肝炎的新品种，造福于肝炎患者。

结合国内外对胡黄连的研究基础，我们对西藏胡黄连进行了深入的研究，并得到了在肝细胞保护方面具有显著活性的提取物。

已经公开的关于胡黄连提取物的资料：

表1.公开的涉及西藏胡黄连的提取物及其相关特征

发明内容

近年来，在天然药物研究领域，不但强调提高成分的含量，更加重视活性，以及对活性相关特征的发现和控制，因此采用指纹图谱技术与活性研究相结合的模式逐渐取代盲目追求提高成分含量的研究方法。

在我们的深入研究中，发现复杂的提取物工艺，尤其是提取步骤众多、工艺繁复的工艺，极易改变提取物的指纹特征，虽然提取物中已知成分的含量满足了要求，但是在活性方面往往存在着严重的缺陷，造成疗效的下降，不稳定，甚至是无疗效。

从上述资料可以看出，所有公开的发明专利中，均未进行有关提取物谱效关系方面的研究，未对提取物指纹特征谱图进行有效控制。

参照上述资料公开的工艺制备西藏胡黄连提取物，并进行指纹分析和活性研究，结果如下：

表2.西藏胡黄连提取物谱效特征分析

来源	工艺	HPLC图谱特征	体外保肝活性
来源	工艺	HPLC图谱特征	体外保肝活性	CN 1457794A	采用乙醇/水混合溶剂回流提取药材；浓缩；乙酸乙酯/乙醇混合溶剂萃取；干燥；丙酮提取，干燥，即得。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为42.1％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝3.1∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05
CN 1458159A	回流或渗漉提取药材(粗提取液)；浓缩；正丁醇、乙酸乙酯或乙酸丁酯萃取；干燥，即得。提取液以大孔吸附树脂进行纯化。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为48.7％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝2.7∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05	CN 1457794A	采用乙醇/水混合溶剂回流提取药材；浓缩；乙酸乙酯/乙醇混合溶剂萃取；干燥；丙酮提取，干燥，即得。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为42.1％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝3.1∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05
CN 1458159A	回流或渗漉提取药材(粗提取液)；浓缩；正丁醇、乙酸乙酯或乙酸丁酯萃取；干燥，即得。提取液以大孔吸附树脂进行纯化。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为48.7％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝2.7∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05	CN 1380297A	乙醇回流提取胡黄连，得到乙醇提取浸膏；浸膏以大孔吸附树脂进行纯化。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为58.2％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝4.8∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05
CN 100343266C	以C1-5低级醇提取，经吸附树脂柱纯化。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为65.5％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝4.3∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05	CN 1380297A	乙醇回流提取胡黄连，得到乙醇提取浸膏；浸膏以大孔吸附树脂进行纯化。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为58.2％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝4.8∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05
CN 100343266C	以C1-5低级醇提取，经吸附树脂柱纯化。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为65.5％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝4.3∶1.0	与空白对照，与活性对照提取物无显著性差异。P<0.05	活性研究对照提取物	西藏胡黄连粗粉，加80％乙醇提取，干燥，即得粗提取物。	含量：胡黄连苷I+胡黄连苷II为17.6％；峰面积比：胡黄连苷II：胡黄连苷I＝1.8∶1.0	与空白对照，P<0.05

从上述数据可以看出，提取物中成分的增加并没有导致活性成分的显著上升，对于西藏胡黄连，提取物中胡黄连苷II和胡黄连苷I的比例是影响活性的关键因素；因此我们对西藏胡黄连提取物中的谱效关系进行了深入的研究。

结合大量的指纹图谱和药效关系的研究，我们发现西藏胡黄连的下述谱效特征：

1、提取物指纹图谱中按照总胡黄连苷色谱计算胡黄连苷II与胡黄连苷I的峰面积比在1.30～2.40范围之内活性最为显著；

2、在维持上述色谱峰面积比例的前提下，含量与活性之间具有明显的量效关系。

胡黄连苷I，Picroside I

胡黄连苷II，Picroside II

因此，在上述规律和指纹图谱的指导之下，我们为具有显著活性的西藏胡黄连提取物拟定的提取工艺如下：

(1)药材提取：以浓度60％～95％(v/v)的乙醇/水混合溶剂，热回流或渗漉提取；

(2)浓缩和干燥：提取液在70℃下减压浓缩，70℃下真空干燥，得到粗提取物干粉；

(3)粗提取物除杂：粗提取物干粉加丙酮提取；丙酮提取液在70℃下减压浓缩，70℃下真空干燥，得到丙酮提取物干粉；

(4)丙酮提取物纯化：丙酮提取物加水溶解，以D101型大孔吸附树脂柱纯化，上样后依次以水，25％乙醇(v/v)，80％乙醇(v/v)进行洗脱，收集80％乙醇洗脱液；

(5)80％乙醇洗脱液的精制：80％乙醇洗脱液70℃下减压浓缩至比重为1.05～1.15，以乙酸乙酯萃取，再以乙酸乙酯-乙醇(9∶1)的混合溶剂萃取；

(6)萃取液干燥：取乙酸乙酯-乙醇混合溶剂萃取液，70℃下减压浓缩，70℃下真空干燥，得到西藏胡黄连提取物。

对上述得到的西藏胡黄连提取物按照下述HPLC法进行指纹图谱分析，图谱中胡黄连苷II与胡黄连苷I的峰面积比应为1.30～2.40。色谱条件为：

(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

(2)流动相：乙腈—水—冰醋酸(18∶82∶0.4)；

(3)检测波长：270nm；

(4)系统适应性：理论板数按胡黄连苷II计应不低于5000。

对上述得到的西藏胡黄连提取物含量分析表明，提取物中含胡黄连苷I(C₂₄H₂₈O₁₁)和胡黄连苷II(C₂₃H₂₈O₁₃)的含量之和不低于50％。

在附图中给出了能体现本项发明的、典型的色谱图。附图1为对照品胡黄连苷I和胡黄连苷II的色谱图；附图2为实施例1中制备得到的，能体现本项发明谱效关系的提取物的色谱图。

根据临床需要上述西藏胡黄连提取物可以制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂或粉针剂等产品应用于临床。

具体实施方式

实施例1

胡黄连提取物的制备

1.取胡黄连药材13kg，粉碎，备用。

2.将胡黄连粗粉，装入小型多能提取罐中，加入8倍量(V/W)85％乙醇，加热回流提取2小时，放出提取液，过滤。同法再提取2次，合并提取液至浓缩罐中，真空浓缩(温度：60℃；真空度：0.08MPa)至相对密度1.10～1.20g/ml，60℃减压干燥，得乙醇粗提物。

3.将粗提物粉碎，加入6倍量(V/W)丙酮，室温搅拌提取3次，每次20分钟，过滤，弃去不溶物，合并丙酮提取液，60℃减压干燥，得丙酮纯化物。

4.用10倍量(V/W)水溶解丙酮纯化物，溶液分别上D101大孔吸附树脂柱，先用4倍树脂床体积的水和4倍树脂床体积的25％乙醇洗涤树脂柱，再用4倍树脂床体积的80％乙醇洗脱，收集洗脱液。

5.真空浓缩(温度：60℃；真空度：0.08MPa)洗脱液至密度1.1，用0.2倍体积(V/V)的乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃取液，收集水相，再用0.6倍量(V/V)的乙酸乙酯—乙醇混合液(9∶1)萃取水相5次，收集有机相(乙酸乙酯-乙醇混合液)；有机相萃取液浓缩(温度：60℃；真空度：0.08MPa)至干，得胡黄连提取物。

6.收率8.5％。

实施例2

西藏胡黄连提取物的质量控制

【制发】参照发明部分。

【性状】本品为浅黄色至浅棕黄色粉末，味极苦。

【鉴别】(1)取本品粉末0.1g，加水5ml，振摇使溶解，加5％的三氯化铁乙醇溶液2滴，有暗绿色沉淀生成。

(2)取本品粉末0.1g，加水5ml，振摇使溶解，加5％的α—萘酚乙醇溶液2滴，摇匀，生成黄白色浑浊，缓缓沿管壁加硫酸溶液0.5ml，两液接界处显紫色环，振摇后颜色变深，加水稀释生成暗紫色沉淀。

(3)取本品，加甲醇溶解制成每1ml含5mg溶液，作为供试品溶液；另取胡黄连苷I、II对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色普法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一以含2％氢氧化钠0.4％羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以氯仿—甲醇—水(80∶40∶10)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，并以氨蒸气饱和，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱图中，在与对照品相应位置上显相同颜色的荧光斑点；喷以2％对二甲基氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，在80℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

【检查】胡黄连苷元峰面积比按【含量测定】项下的总胡黄连苷色谱计算，胡黄连苷II与胡黄连苷I的峰面积比应为1.30～2.40。

水分照干燥失重检查法(中国药典2000年版一部附录IX G)，于60℃减压干燥，减失重量不得过5％。

炽灼残渣照炽灼残渣检查法(中国药典2000年版一部附录IX J)依法检查，不得超0.5％。

重金属照重金属检查法(中国药典2000年版一部附录IX E)依法检查，不得过百万分之二十。

【含量测定】照高效液相色谱法测定。

色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈—水—冰醋酸(18∶82∶0.4)为流动相；检测波长为270nm。理论板数按胡黄连苷II计算应不低于5000。

对照品溶液的制备分别精密称取胡黄连苷I和胡黄连苷II对照品适量，加流动相制成每1ml含胡黄连苷I 50μg和胡黄连苷II 100μg的混合溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取本品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理30分钟，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置于10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品以干燥品计，含胡黄连苷I(C₂₄H₂₈O₁₁)和胡黄连苷II(C₂₃H₂₈O₁₃)的含量之和计，不得少于50％。

实施例3

西藏胡黄连提取物的抗肝损伤作用

表3.西藏胡黄连提取物对四氯化碳造模小鼠肝损伤的保护作用

注：“^ΔΔ”表示与空白对照组比较P<0.01。

“^*”“^**”表示与模型组比较P<0.05；P<0.01。

从表中数据分析得知，造模后模型组除TB和HBDH外，其余各指标均有显著性改变，尤其是目前临床肝功能检测项目中最灵敏指标TBA的显著性升高，表明造模成功。各西藏胡黄连提取物给药组(10-40mg/kg)对肝功能指标有不同的改善作用，主要表现为10mg/kg组降低LDH、HBDH水平(P<0.05)；20mg/kg组改变TB水平(P<0.05)；降低AST、ALT活性(P<0.05)。

阳性药联苯双酯主要改变ALT水平，改变P/O比值，降低TB血清浓度，与文献报道基本一致。而中药成份的阳性药益肝灵本次实验在该剂量下(40mg/kg)表现欠佳。

实施例4

西藏胡黄连提取物的抗肝损伤作用

表4.连续i.g不同剂量的西藏胡黄连及联苯双酸对异硫氰酸苯酸所诱发小鼠肝损伤的影响

注：与模型组比^*P<0.05、^**P<0.01、^***P<0.001

表5.连续静注不同剂量的西藏胡黄连对异硫氰酸苯致肝损伤小鼠体重、肝重、肝系数的影响

注：与给药前比ΔP<0.05，与模型组比*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

从表5可见，连续静注胡黄连片原料12、24、48、96mg/(kg·d)7d外其它剂量对异硫氰酸酯所致肝损伤小鼠的体重影响不明显，但对肝重、肝系数有不同程度的抑制作用，除12mg/(kg·d)的肝重、肝系数无统计意义外，其余各组抑制均较模型组有显著差异，而联苯双酯无此作用，也表明胡黄连片原料对异硫氰酸苯酯所致肝损伤的保护作用较强。

实施例5、西藏胡黄连提取物片剂的制备

制法：取西藏胡黄连提取物粉碎，过100目筛备用；取处方量的乳糖、微晶纤维素和淀粉分别过80目筛，与处方量胡黄连提取物细粉混合均匀，再过80目筛；用3％PVPk30的50％乙醇溶液制成软材，用20目筛网制粒，于60℃通风干燥；用16目筛网整粒后，加入处方量的羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁，混合均匀，压成1000片，包薄膜衣，即得。

实施例6、胡黄连提取物粉针剂的制备

制法：按照上述处方，将提取物和右旋糖苷溶于注射用水中，加入活性炭4g，100℃煮沸15min，静置24小时；过滤，加稀盐酸调节pH至7.0；分装于10ml西林瓶中，每支4mL；置入冻干机冻干，冷冻温度为-40℃，5小时；升华温度-15℃～-20℃，共24小时；40℃干燥2小时；压盖密封。

Claims

1、一种西藏胡黄连提取物，其特征在于制备工艺中包括下述步骡：

(2)提取液浓缩和干燥：提取液在70℃下减压浓缩，70℃下真空干燥，得到粗提取物干粉；

(4)丙酮提取物纯化：丙酮提取物加水溶解，以D101型大孔吸附树脂柱色谱纯化，上样后依次以水，25％乙醇(v/v)，80％乙醇(v/v)进行洗脱，收集80％乙醇洗脱液；

(5)80％乙醇洗脱液的精制：80％乙醇洗脱液70℃下检验浓缩至比重为1.05～1.15，以乙酸乙酯萃取，再以乙酸乙酯-乙醇(9∶1)的混合溶剂萃取；

2、根据权利1所述的西藏胡黄连提取物，其特征在于提取物按照下述HPLC法进行指纹图谱分析，图谱上按照总胡黄连苷色谱计算胡黄连苷II与胡黄连苷I的峰面积比应为1.30～2.40。分析条件为：

(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

(2)流动相：乙腈—水—冰醋酸(18∶82∶0.4)为流动相；

(3)检测波长：270nm；

(4)系统适应性：理论板数按胡黄连苷II计算应不低于5000。

3、根据权利要求1所述西藏胡黄连提取物，其特征在于含胡黄连苷I(C₂₄H₂₈O₁₁)和胡黄连苷II(C₂₃H₂₈O₁₃)的含量之和不低于50％。

4、一种含有权利要求1所述提取物制成的药剂，其特征在于所述药剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂。

5、一种根据权利要求1所述西藏胡黄连提取物在制备抗肝损伤药物领域内的应用。