CN1977889A - 一种由黄芪、丹参和苦参素制成的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了一种新的治疗肝脏疾病的药物组合物及其制备方法，由黄芪400～10000份、丹参200～6000份、苦参素10～200份制成，也可以由黄芪总皂苷或者黄芪多糖2～200份、丹参总酚酸2～200份、苦参素10～200份制成。可制成任一临床上或药学上可接受的剂型，优选为口服制剂和注射剂。本发明药物组合物有效成分明确，含量确切，共同发挥抗病毒性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝、酒精肝等功效，效果显著，主要用于制备治疗肝脏疾病的药物。制备工艺简便易行，制剂质量高且稳定，适应于工业化大生产。

Description

一种由黄芪、丹参和苦参素制成的药物组合物及其制备方法

1、技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种主要由黄芪或其提取物、丹参或其提取物和苦参素制成的药物组合物，及其制备方法。

2、背景技术

肝炎是一种常见病和多发病，据不完全统计，我国肝炎患者和病毒携带者占总人口的10％。其中以病毒性肝炎为主，病毒性肝炎又可分为：急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎和胆型肝炎。肝炎是一种传染性疾病，由于其流行性广、危害性大、发病率高，是目前国内外公认的疑难病症之一。中国是乙型肝炎的高流行区，有超过40％的人受过乙型肝炎病毒(HBV)感染，有1亿多人口为慢性HBsAg携带者。乙型肝炎治愈率仅为10％，绝大部分转为慢性肝炎，严重的转化为肝腹水、肝癌。其中，肝纤维化的形成和发展是影响预后和病情转危的关键病理变化之一，也是临床慢性肝病治疗中最为复杂的疑难问题。国内外近年来治疗肝炎的药物虽然有许多，但大多疗效并不理想，治疗后病情易反复，且价格又十分昂贵。至今，市场上仍缺少抗肝炎疗效确切，副作用又较小的药物。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)的干燥根。味甘，性温，归肺、脾经，具有补气固表、利尿脱毒、排脓、敛疮生肌的功效。黄芪的主要有效成分为黄芪多糖和黄芪总皂苷。现代药理试验表明，黄芪多糖和黄芪总皂苷均有体外抗乙肝病毒活性，黄芪注射液(主要有效成分为黄芪总皂苷)对刀豆蛋白诱导的小鼠肝脏损伤、硫代乙酰胺所致的大鼠肝损伤、免疫性肝损伤具有一定的保护作用，黄芪多糖有增强机体免疫力等功能。

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bage.的干燥根及根茎。味苦，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。丹参在治疗慢性乙型肝炎方面的作用机理主要包括：(1)凉血解毒抗菌消炎，减轻或消除肝实质炎症，同时帮助肝脏恢复解毒功能；(2)改善肝内血液循环，纠正肝脏的微循环障碍，活血化瘀使肝脾回缩；(3)调整机体免疫功能，消除免疫复合物对肝脏的损害；(4)促进肝细胞再生，抗肝纤维化；(5)恢复肝功能。丹参水溶性成分主要是以丹参素为基本结构的酚酸类化合物，丹参总酚酸化合物具有很强的抗氧化作用，可以清除超氧阴离子和羟自由基，抑制脂质过氧化反应，进而减轻肝损伤。丹参水煎剂能明显降低CCl₄诱导的急、慢性肝损伤大鼠的血清ALT水平，减轻肝细胞变性坏死，促进肝功能恢复，同时减少肝脏胶原沉积。

苦参素为氧化苦参碱(Oxymatrine)与极少量氧化槐果碱(Oxysophocarpine)的混合碱，是从豆科植物苦豆草Sophoro alopecuroides L.的种子苦豆子或豆科植物苦参sophora flarescens Ait.的根中提取的生物碱。苦参素已经作为化学药品上市，并且已收载入《国家药品监督管理局国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准》第16册第363页(国家药典委员会编)，其中规定：按干燥品计算，含氧化苦参碱(C₁₅H₂₄N₂O₂)不得少于98.0％。近几年氧化苦参碱在治疗病毒性肝炎方面的研究主要进展包括：(1)氧化苦参碱具有直接抗乙型肝炎病毒作用；(2)氧化苦参碱能抑制胶原活动度和防治肝纤维化；(3)氧化苦参碱可阻断肝细胞异常凋亡；(4)氧化苦参碱对实验性小鼠肝衰竭具有保护作用。

目前，利用黄芪或其提取物、丹参或其提取物和苦参素的相互作用，配伍组方，制备用于治疗肝脏疾病方面的药物，尚未见报道。

3、发明内容

为了满足临床需要，更好的治疗肝脏疾病，延缓或减少肝炎向肝腹水或肝癌的转化，提高肝炎患者的生命质量，本发明提供了一种主要用于治疗肝脏疾病的药物组合物及其制备方法，主要由黄芪或其提取物、丹参或其提取物和苦参素制成，对四氯化碳、D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤、四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤、酒精诱导小鼠慢性肝损伤均具有显著的保护作用，并且可以显著抑制鸭乙型肝炎病毒，产生了意想不到的效果。

本发明药物组合物由黄芪、丹参和苦参素制成，其重量份数为：黄芪400～10000份、丹参200～6000份、苦参素10～200份，优选为黄芪1000～5000份、丹参500～3000份、苦参素20～100份，进一步优选为黄芪2000份、丹参1500份、苦参素40份。

本发明药物组合物中的黄芪、丹参可以用适宜的溶剂和方法单独或混合提取加工得到提取物，总提取物再与苦参素和药学上可接受的辅料混合制成任一临床上或药学上可接受的剂型。“单独提取”是指，黄芪、丹参每一味药材分别通过不同的工艺单独提取得到提取物，再将各提取物混合得到总提取物。“混合提取”是指，黄芪、丹参两味药材一起提取得到总提取物。所得的总提取物中所含的主要有效成分为黄芪总皂苷和丹参总酚酸，或者为黄芪多糖和丹参总酚酸；主要有效成分的总含量最好不低于50％。

上述黄芪、丹参的提取制备方法中，所用的溶剂是指药学上常用的溶剂，可以是水或乙醇等；所用的方法是指中药提取的一般方法，可以是煎煮法、回流提取法、浸渍法、渗漉法或连续提取法等。例如，黄芪可以用水提醇沉的方法制备得到黄芪总皂苷或黄芪多糖，丹参可以用水提醇沉或乙醇回流提取的方法制备得到丹参总酚酸。本发明提供了黄芪(以总皂苷或多糖为主要有效成分)、丹参(以总酚酸为主要有效成分)的优选提取制备工艺。

原料药的具体制备方法如下：

因为现代药理试验研究表明黄芪总皂苷和黄芪多糖均有抗乙肝病毒和保护药物性肝损伤的作用，所以黄芪的“单独提取”方法因其活性成分的不同可采用不同的提取方法，分别如下：

以总皂苷为主要有效成分的黄芪的优选提取制备工艺，如下：

取黄芪药材，加水煎煮三次，每次1.5小时，第一次加水10倍量，二、三次均为8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液中含醇量为75％，第二次为85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，加于已处理好的大孔吸附树脂柱上，先用2倍体积的水冲柱，再用4倍体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、真空干燥，即得。通过本工艺制备的黄芪总皂苷得率为0.5～2％，总皂苷的含量不低于50％，黄芪甲苷的含量不低于2.0％。

黄芪还可以通过下述工艺提取制备，但不仅限于下述工艺：

工艺一：取黄芪药材，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液中含乙醇量为60％，第二次为85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，减压浓缩、真空干燥，即得。通过本工艺制备的黄芪总皂苷得率为2～4％，总皂苷的含量不低于40％，黄芪甲苷的含量不低于1％。

工艺二：取黄芪药材，加水煎煮三次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理1次使含乙醇量为60％，冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，并减压浓缩、真空干燥，即得。通过本艺制备的黄芪总皂苷得率为3～5％，总皂苷含量的不低于30％，黄芪甲苷的含量不低于1％。

以多糖为主要有效成分的黄芪的优选提取制备工艺，如下：

取黄芪药材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小时，提取液弃去，取药渣加水提取二次，合并提取液，浓缩至提取液体积与生药材的比例为1.05∶1，加入乙醇沉淀使含醇量达到70％，滤过，得沉淀，沉淀用70％乙醇洗涤，再用适量水溶解，滤过，滤液过大孔树脂，用水洗脱，收集水洗液，将水洗液浓缩至药液体积与药材比例为1∶2.5，加入乙醇使含醇量达到70％，得沉淀，将沉淀用95％乙醇和丙酮洗涤脱水，减压干燥(60℃)，即得。通过本工艺制备的黄芪多糖得率为0.5～2％，多糖的含量不低于50％。

黄芪还可以通过下述工艺提取制备，但不仅限于下述工艺：

工艺一：取黄芪药材，加水回流提取三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.15～1.23，加乙醇使含醇量达80％，静置24小时，滤过，沉淀加水溶解，滤过，再加乙醇使含醇量达85％，静置24小时，滤过，收集沉淀，真空干燥，即得。通过本工艺制备的黄芪多糖得率为2～4％，多糖的含量不低于40％。

工艺二：取黄芪药材，加10倍量80％乙醇提取4小时，提取液弃去，取药渣加水提取二次，每次2小时，每次加水10倍量，合并提取液，滤过，滤液加乙醇使含醇量达85％，滤过，滤液减压浓缩至稠膏状，喷雾干燥，即得。通过本工艺制备的黄芪多糖得率为3～4％，多糖的含量不低于35％。

以总酚酸为主要有效成分的丹参的优选提取制备工艺，如下：

取丹参药材，粉碎成粗粒，加水煎煮三次，第一次2小时，加水12倍量，第二、三次各1.5小时，加水10倍量，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.17～1.20。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75％，第二次使含醇量为85％，各静置24h，回收乙醇至相对密度为1.17～1.20，喷雾干燥，即得。通过本工艺制备的丹参总酚酸得率为1～3％，丹参总酚酸的含量不低于50％，丹酚酸B的含量不低于1.5％。

丹参还可通过下述工艺提取制备，但不仅限于下述工艺：

工艺一：取丹参药材，加水煎煮两次，各2小时，第一次加水12倍量，第二次加水10倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20，加乙醇沉淀使含醇量达75％，静置24h，回收乙醇至相对密度为1.23～1.28(80℃)，真空干燥(50℃)，即得。通过本工艺制备的丹参总酚酸得率2～4％，丹参总酚酸的含量不低于40％，丹酚酸B的含量不低于0.8％。

工艺二：取丹参药材，加85％乙醇回流2小时，滤过，滤液减压回收乙醇至稠膏；药渣加水(10倍量)煎煮1小时，滤过，滤液与上述稠膏合并，减压浓缩至适量，50℃真空干燥，粉碎，过筛，即得。通过本工艺制备的丹参总酚酸得率为3～5％，丹参总酚酸的含量不低于30％，丹酚酸B的含量不低于0.3％。

本发明药物组合物，还可以由黄芪总皂苷或者黄芪多糖代替黄芪、丹参总酚酸代替丹参投料制得，按照提取物相对于药材的得率计算，本发明药物组合物可以有以下两种不同配比，重量份分别为：

配比1：黄芪总皂苷2～200份、丹参总酚酸2～200份、苦参素10～200份，优选为黄芪总皂苷5～100份、丹参总酚酸5～100份、苦参素20～100份，进一步优选为黄芪总皂苷10～40份、丹参总酚酸15～45份、苦参素40份。

配比2：以多糖为主要有效成分的黄芪提取物即黄芪多糖2～200份、丹参总酚酸2～200份、苦参素10～200份，优选为黄芪多糖5～100份、丹参总酚酸5～100份、苦参素20～100份，进一步优选为黄芪多糖10～40份、丹参总酚酸15～45份、苦参素40份。

上述药物组合物中，黄芪总皂苷的主要有效成分为总皂苷，总皂苷的含量不低于30％，最好不低于50％，黄芪甲苷的含量不低于1.0％，最好不低于2.0％；黄芪多糖的主要有效成分的为多糖，多糖的含量不低于35％，最好不低于50％；丹参总酚酸的主要有效成分为总酚酸，总酚酸的含量不低于30％，最好不低于50％，丹酚酸B的含量不低于0.3％，最好不低于1.5％。

黄芪总皂苷、黄芪多糖、丹参总酚酸均可参照前述方法制备。按上述两种配比得到的总提取物中的主要有效成分为黄芪总皂苷和丹参总酚酸，或者为黄芪多糖和丹参总酚酸；主要有效成分的总含量最好不低于50％。

本发明药物组合物，药物组分的用量是经过发明人进行大量摸索总结得出的，各组分用量在上述重量份范围内都具有较好疗效。上述组成，若以克为单位，可以制成10～1000次用量的制剂，如作为水针或粉针，可制成20～2000支，每次用量1～10支。如作为片剂或胶囊剂，可制成40～4000片，每次服用1～10片。上述组成是按重量份作为配比的，如大规模生产可以以千克或吨为单位，小规模生产也可以以克为单位。上述重量份数对于特殊病人，可以相应调整组成的比例，增加或者减少不超过100％。

本发明药物组合物，可以制成任一临床上或药学上可接受的剂型，以口服、鼻吸入或胃肠外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。口服给药时，可制成口服常释剂型(如片、肠溶片、分散片、咀嚼片、口腔崩解片、胶囊、软胶囊、肠溶胶囊等)、缓释控释剂型(如缓释片、控释片、缓释胶囊、控释胶囊等)、口服液体剂(如口服溶液、糖浆等)、滴丸、颗粒剂等；胃肠外给药时，可将其制成注射用的溶液、注射用水或油悬浮剂、栓剂等。优选剂型为注射剂和口服制剂，如粉针、水针、氯化钠注射液、葡萄糖注射液、片、胶囊、软胶囊、颗粒、滴丸、口服液等。

上述药物组合物，可采用现有制药领域中的常规方法生产，必要时可以添加各种药学上可接受的辅料，包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

本发明药物组合物，主要用于制备抗肝脏疾病的药物。药理药效研究表明，黄芪或其提取物黄芪总皂苷或者黄芪多糖、丹参或其提取物、苦参素合并用药对四氯化碳(CCl₄)致小鼠实验性肝损伤、D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝损伤、四氯化碳(CCl₄)诱导大鼠慢性肝损伤、酒精诱导小鼠慢性肝损伤均具有显著的保护作用，并且可以显著抑制鸭乙型肝炎病毒(DHBV)；提示其在治疗病毒性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝、酒精肝方面将有显著疗效。

本发明药物组合物，具有下列优点：

(1)提供了一种新的复方抗肝炎药物，满足临床需要。

(2)对本发明药物组合物中药物组份的用量进行了大量摸索研究，通过不同配比制成的注射液对四氯化碳(CCl₄)致肝损伤小鼠血清ALT和AST水平的影响的研究，筛选出具有显著疗效的重量配比。

(3)药理药效研究表明，本发明药物组合物对D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝损伤有显著保护作用，能显著降低血清AST水平，升高血清ALB水平，降低肝指数；对四氯化碳诱导的大鼠慢性肝损伤有显著保护作用，能显著降低血清ALT和AST水平，显著升高血清ALB水平，显著减轻肝纤维化程度和降低纤维化发生率；对酒精诱导的小鼠慢性肝损伤也有显著的保护作用，能显著降低血清血清ALT、AST、TG水平，减轻肝组织病变；可以显著抑制鸭乙型肝炎病毒(DHBV)，高剂量组的效果与阳性对照组的效果相当，并且停药后无反跳现象。产生了意想不到的效果。

(4)本发明药物组合物，可以以黄芪、丹参、苦参素投料，也可以以黄芪总皂苷或者黄芪多糖、丹参总酚酸、苦参素为原料，可制成任一临床上或药学上可接受的剂型。

(5)对本发明药物组合物制成的制剂或所用的提取物，进行了鉴别、含量测定、稳定性研究等，有效成分明确、含量高，制剂稳定性好，便于控制产品质量，保证临床用药安全。

(6)提供了优选的制备工艺，简便易行，且制剂质量高，适应于工业化大生产。

(7)本发明药物组合物药疗效确切，合并用药后用药量减少，具有广阔的应用前景。

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物组合物的有益效果，这些试验例包括本发明药物组合物的药效学试验和稳定性试验。本发明药物组合物具有下列有益效果，但不应将此理解为本发明药物组合物仅具有下列有益效果。

以下试验例中用HDK1代替以黄芪总皂苷、丹参总酚酸、苦参素为主要有效成分的药物组合物，用HDK2代替以黄芪多糖、丹参总酚酸、苦参素为主要有效成分的药物组合物。以下试验例中所用的黄芪总皂苷为 实施例1制备所得，所用的黄芪多糖为 实施例2制备所得，所用的丹参总酚酸为 实施例3制备所得。试验例2～6中所用的HDK1注射液、HDK2注射液为 实施例4制备所得。

试验例1药效学试验——黄芪、丹参、苦参素联合用药对小鼠实验性肝损伤的影响

受试动物健康小鼠，240只，体重20～25g，雌雄兼用，随机分为24组，每组10只。

供试品氯化钠注射液(正常对照组)：250ml∶2.25g，山东长富洁晶药业有限公司

黄芪总皂苷注射液：自制，2ml，含黄芪总皂苷136mg(相当于原药材10g)

黄芪多糖注射液：自制，2ml，含黄芪多糖122mg(相当于原药材10g)

丹参注射液：自制，2ml，含丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)

苦参素注射液：自制，2ml∶200mg

(黄芪+丹参+苦参素)1注射液：自制，见表1-1(以黄芪总皂苷、丹参总酚酸、苦参素为主要有效成分)

(黄芪+丹参+苦参素)2注射液：自制，见表1-1(以黄芪多糖、丹参总酚酸、苦参素为主要有效成分)

给药剂量见表1-1。

试验方法小鼠随机分为24组，每组10只，分别为正常对照组、模型组和各给药组。正常对照组和模型组尾静脉注射生理盐水20ml/kg，每日1次，连续7天；各给药组尾静脉注射给药150mg/kg，每日1次，连续7天。最后一次尾静脉注射2h后，正常对照组腹腔注射花生油10ml/kg，其余各组均腹腔注射0.12％四氯化碳(CCl₄)花生油溶液10ml/kg。16h后断头处死动物，取血清，测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平。断头取血后，肝组织作常规病理组织学检查。

试验结果及结论结果见表1-1。与正常对照组相比较，模型组的血清ALT和AST水平均极显著升高(p＜0.01，p＜0.001)，病理组织学检查发现肝组织明显受损，并出现坏死，说明造模成功。与模型组相比较，各给药组对CCl₄诱导的小鼠肝损伤均具有保护作用，能降低血清ALT和AST水平，减轻肝组织病变和坏死；黄芪总皂苷注射液和黄芪多糖注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤的保护作用较弱，丹参注射液和苦参素注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤具有显著的保护作用(p＜0.05)；黄芪400～10000份、丹参200～6000份、苦参素10～200份制成的(黄芪+丹参+苦参素)1注射液和(黄芪+丹参+苦参素)2注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤均具有极显著的保护作用(p＜0.01)，黄芪1000～5000份、丹参500～3000份、苦参素20～100份制成的注射液的保护作用更好，尤其以黄芪2000份、丹参1500份、苦参素40份制成的注射液的保护作用最好(p＜0.001)。

表1-1黄芪、丹参、苦参素联合用药对CCl₄肝损伤小鼠的影响

(平均值±标准偏差，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	原料药配比	ALT(U/L)	AST(U/L)
					正常对照组	20ml/kg	-	36.21±5.17	253.72±27.63
模型组	20ml/kg	-	255.48±23.94##	414.91±38.76#
					黄芪总皂苷注射液组	150mg/kg	-	197.74±20.17	370.26±24.61
黄芪多糖注射液组	150mg/kg	-	212.37±22.48	381.24±25.53
					丹参注射液组	150mg/kg	-	180.20±17.81*	342.25±28.69*
苦参素注射液组	150mg/kg	-	169.78±16.15*	326.73±31.26*
					(黄芪+丹参+苦参素)1注射液组	150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg	100g+2g+100mg50g+15g+200mg10g+5g+200mg20g+5g+400mg20g+15g+400mg20g+30g+400mg50g+30g+1000mg10g+15g+1000mg4g+60g+2000mg	129.73±14.78**ace112.73±12.34**ace93.21±11.74***bde100.21±11.24**bde84.32±10.96***bde101.24±11.92**bde95.14±12.23***bde108.49±15.17**bde121.32±15.13**ace	312.26±30.04*ace301.17±29.43**ace284.45±25.78**bde289.43±27.16**bde277.17±24.52***bde292.34±26.53**bde286.76±26.47**bde298.65±27.75**ace308.74±29.76*ace
(黄芪+丹参+苦参素)2注射液组	150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg150mg/kg	100g+2g+100mg50g+15g+200mg10g+5g+200mg20g+5g+400mg20g+15g+400mg20g+30g+400mg50g+30g+1000mg10g+15g+1000mg4g+60g+2000mg	121.33±15.02**acf117.43±12.17**acf95.13±12.41***bdf102.10±12.14**bdf86.96±11.32***bdf104.21±12.19**bdf97.26±12.32***bdf110.47±15.91**acf123.23±16.21**acf	316.22±31.24*acf305.27±27.64*acf285.91±27.85**bdf291.20±26.71**bdf280.21±25.42***bdf294.35±25.36**acf287.98±27.64**bdf299.96±25.79**acf313.78±27.93*acf

与正常对照组相比较：^#p＜0.01，^##p＜0.01；与模型组相比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；

与苦参素注射液组相比较：^ap＜0.05，^bp＜0.01；与丹参注射液组相比较：^cp＜0.05，^dp＜0.01；

与黄芪总皂苷注射液组相比较：^ep＜0.01；与黄芪多糖注射液组相比较：^fp＜0.01。

与黄芪总皂苷注射液组相比较，各个配比的(黄芪+丹参+苦参素)1注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤具有极显著的保护作用(p＜0.01)；与黄芪多糖注射液组相比较，各个配比的(黄芪+丹参+苦参素)2注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤具有极显著的保护作用(p＜0.01)。与丹参注射液相比较，各个配比的(黄芪+丹参+苦参素)1注射液和(黄芪+丹参+苦参素)2注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤的保护作用均具有显著的保护作用(p＜0.05，p＜0.01)。与苦参素注射液相比较，各个配比的(黄芪+丹参+苦参素)1注射液和(黄芪+丹参+苦参素)2注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤的保护作用均具有显著的保护作用(p＜0.05，p＜0.01)。

试验结果表明，黄芪、丹参、苦参素合并用药对CCl₄诱导的小鼠肝损伤具有显著的保护作用，并且，相同给药剂量下，各个配比的(黄芪+丹参+苦参素)1注射液和(黄芪+丹参+苦参素)2注射液对CCl₄诱导的小鼠肝损伤的保护作用均优于黄芪总皂苷注射液、黄芪多糖注射液、丹参注射液和苦参素注射液单独使用的效果。提示，黄芪、丹参、苦参素合并用药具有协同作用，在抗肝炎、肝损伤方面有显著作用。

试验例2黄芪、丹参、苦参素联合用药对D-氨基半乳糖(DAG)致小鼠急性肝损伤的作用

受试动物健康小鼠，100只，体重20～25g，雌雄兼用，随机分为10组，每组10只。

供试品氯化钠注射液(正常对照组)：250ml∶2.25g，山东长富洁晶药业有限公司

丹参注射液：自制，2ml，含丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)

苦参素注射液：自制，2ml∶200mg

HDKl注射液：自制，5ml∶482mg，含黄芪总皂苷136mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

HDK2注射液：自制，5ml∶468mg，含黄芪多糖122mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

给药剂量见表1-2。

试验方法小鼠100只，随机分为10组，每组10只，分别为正常对照组、模型组和各给药组。正常对照组和模型组每日尾静脉注射生理盐水20ml/kg，每日1次，连续10天；各给药组按表1-2尾静脉注射给药，每日1次，连续10天。正常对照组在最后一次尾静脉注射1h后，腹腔注射生理盐水；其余各组均腹腔注射100g/L的D-氨基半乳糖500mg/kg。24h后，处死动物取血，离心取血清，测定血清谷草转氨酶(AST)和白蛋白(ALB)水平。处死后，取肝脏，吸去血液，剪去脂肪、系膜，精确称重，计算肝指数。

试验结果及结论结果见表1-2。与正常对照组相比较，模型组的血清AST水平极显著升高(p＜0.01)，血清ALB显著下降(p＜0.05)，肝指数显著升高(p＜0.01)，说明造模成功。与模型组相比较，各给药组对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤均具有保护作用，能降低血清AST水平，升高血清ALB水平，降低肝指数；丹参注射液、苦参素注射液、低剂量HDK1注射液和低剂量HDK2注射液对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用(p＜0.05)，中、高剂量HDK1注射液和HDK2注射液对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤具有极显著的保护作用(p＜0.01，p＜0.001)。

试验结果表明，黄芪、丹参、苦参素合并用药对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用，并且保护作用与给药剂量相关，高剂量组效果最好；各剂量HDK1注射液和HDK2注射液对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的保护作用均优于丹参注射液和苦参素注射液单独使用的效果。提示，黄芪、丹参、苦参素合并用药具有协同作用，在抗急性肝炎、急性肝损伤方面有显著作用。

表1-2黄芪、丹参、苦参素联合用药对D-氨基半乳糖致急性肝损伤小鼠的作用

(平均值±标准偏差，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	AST(U/L)	ALB(g/L)	肝指数(g/100g)
					正常对照组模型组丹参注射液组苦参素注射液组HDK1注射液低剂量组HDK1注射液中剂量组HDK1注射液高剂量组HDK2注射液低剂量组HDK2注射液中剂量组HDK2注射液高剂量组	1ml1ml200mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg	263.4±24.2417.2±38.7##371.6±32.7*359.6±30.4*322.6±30.8*ac301.2±31.6**ac285.7±34.7***bd329.7±32.4*ac310.2±33.4**ac292.3±27.6***bd	28.76±2.9420.32±1.61#21.91±2.34*22.32±2.12*23.76±2.32*ac24.91±2.19**ad26.02±1.95***bd23.32±2.21*ac24.71±2.30**ac25.94±1.99***bd	6.13±0.978.52±0.73##7.21±0.74*7.17±0.71*6.64±0.72*ac6.43±0.77**ad6.21±0.75***bd6.67±0.79*ac6.52±0.78**ac6.36±0.74**bd

与正常对照组相比较：^#p＜0.05，^##p＜0.01；与模型组相比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；

与苦参素注射液组相比较：^ap＜0.05，^bp＜0.01；与丹参注射液组相比较：^cp＜0.05，^dp＜0.01。

试验例3黄芪、丹参、苦参素联合用药对大鼠慢性肝损伤的保护作用

受试动物健康大鼠，100只，体重180～200g，雌雄兼用，随机分为10组，每组10只。

供试品氯化钠注射液(正常对照组)：250ml∶2.25g，山东长富洁晶药业有限公司

丹参注射液：自制，2ml，含丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)

苦参素注射液：自制，2ml∶200mg

HDK1注射液：自制，5ml∶482mg，含黄芪总皂苷136mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

HDK2注射液：自制，5ml∶468mg，含黄芪多糖122mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

给药剂量见表1-3。

试验方法健康大鼠10只，皮下注射花生油3ml/kg，每周2次，共8周，作为正常对照组。其余大鼠，皮下注射40％四氯化碳(CCl₄)花生油溶液3ml/kg，每周2次，共8周，诱导肝纤维化；随后随机分为9组，每组10只，分别为模型组和各给药组。此后，各组按表1-4腹腔注射给药，每日1次，共10周。末次给药24h后，下腔静脉采血，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和白蛋白水平(ALB)；同时，取肝组织作常规病理组织学检查。

试验结果及结论结果见表1-3。与正常对照组相比较，模型组的血清ALT、AST水平均极显著升高(p＜0.01)，血清ALB水平极显著下降(p＜0.01)，病理组织学检查发现试验大鼠出现比较典型的肝纤维化，说明造模成功。与模型组相比较，各给药组对肝纤维化大鼠均具有保护作用，能降低血清ALT和AST水平，升高血清ALB水平，减轻肝纤维化程度和纤维化发生率；丹参注射液、苦参素注射液、低剂量HDK1注射液和低剂量HDK2注射液对肝纤维化大鼠具有显著的保护作用(p＜0.05)；中、高剂量HDK1注射液和HDK2注射液对肝纤维化大鼠具有极显著的保护作用(p＜0.01，p＜0.001)。

表1-3黄芪、丹参、苦参素联合用药对肝纤维化大鼠的影响

(平均值±标准偏差，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	ALT(U/L)	AST(U/L)	ALB(g/L)
					正常对照组模型组丹参注射液组苦参素注射液组HDK1注射液低剂量组HDK1注射液中剂量组HDK1注射液高剂量组HDK2注射液低剂量组HDK2注射液中剂量组HDK2注射液高剂量组	1ml1ml200mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg	44.38±7.21272.26±25.41#176.52±20.13*167.35±21.23*126.78±16.89*ac111.84±15.84**ac94.62±15.78**bd129.53±19.45*ac115.46±15.94**ac99.07±16.75**bd	257.23±27.34423.83±46.27#370.25±35.98*349.92±36.51*317.45±32.35*ac295.74±29.54**ac277.85±28.13***bd320.45±35.68*ac298.76±27.45**ac280.24±26.21***bd	37.43±7.6824.91±5.42#27.25±5.79*29.13±6.03*31.27±5.99*ac32.94±6.47**ad34.81±6.73***bd30.68±5.84*ac31.91±6.24**ac33.17±6.58***bd

与正常对照组相比较：^#p＜0.01；与模型组相比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；

与苦参素注射液组相比较：^ap＜0.05，^bp＜0.01；与丹参注射液组相比较：^cp＜0.05，^dp＜0.01。

试验结果表明，黄芪、丹参、苦参素合并用药对肝纤维化大鼠具有显著的保护作用，并且保护作用与给药剂量相关，高剂量组效果最好；各剂量HDK1注射液和HDK2注射液对肝纤维化大鼠的保护作用均优于丹参注射液和苦参素注射液单独使用的效果。提示，黄芪、丹参、苦参素合并用药具有协同作用，在抗慢性肝炎、肝纤维化、慢性肝损伤方面有显著作用。

试验例4黄芪、丹参、苦参素联合用药对小鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用

受试动物健康小鼠，100只，体重20～25g，雌雄兼用，随机分为10组，每组10只。

供试品氯化钠注射液(正常对照组)：250ml∶2.25g，山东长富洁晶药业有限公司

丹参注射液：自制，2ml，含丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)

苦参素注射液：自制，2ml∶200mg

HDK1注射液：自制，5ml∶482mg，含黄芪总皂苷136mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

HDK2注射液：自制，5ml∶468mg，含黄芪多糖122mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

给药剂量见表1-4。

试验方法健康小鼠10只，灌胃给予蒸馏水12ml/kg，每天1次，共5周，作为正常对照组。其余小鼠，灌胃给予50％乙醇12ml/kg，每天1次，共5周；随后随机分为9组，分别为模型组和各给药组。此后，各组按表1-4腹腔注射给药，每日1次，共8周。末次给药24h后，下腔静脉采血，测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)水平；同时，取肝组织作常规病理组织学检查。

试验结果及结论结果见表1-4。与正常对照组相比较，模型组的血清ALT、AST、TG水平均显著升高(p＜0.01)，病理组织学检查发现肝组织明显受损，肝细胞脂肪性病变、空泡变性、凋亡等，说明造模成功。与模型组相比较，各给药组对小鼠慢性酒精性肝损伤均具有保护作用，能降低血清血清ALT、AST、TG水平，减轻肝组织病变；丹参注射液、苦参素注射液、低剂量HDK1注射液和低剂量HDK2注射液对小鼠慢性酒精性肝损伤具有显著的保护作用(p＜0.05，p＜0.01)；中、高剂量HDK1注射液和HDK2注射液对小鼠慢性酒精性肝损伤具有极显著的保护作用(p＜0.01，p＜0.001)。

表1-4黄芪、丹参、苦参素联合用药对小鼠慢性酒精性肝损伤的影响

(平均值±标准偏差，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	ALT(U/L)	AST(U/L)	TG(mmol/L)
					正常对照组模型组丹参注射液组苦参素注射液组HDK1注射液低剂量组HDK1注射液中剂量组HDK1注射液高剂量组HDK2注射液低剂量组HDK2注射液中剂量组HDK2注射液高剂量组	1ml1ml200mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg	46.28±7.13267.62±24.57#162.31±20.25*193.32±25.43*127.73±19.68*ac109.43±18.54**bc95.17±18.57**bd130.56±18.76*ac116.70±16.73**bc98.72±15.76**bd	263.27±28.21435.92±47.26#350.89±36.42*397.64±35.43*315.74±33.25*ac299.45±28.71**ac286.34±28.79***bd319.68±30.76*ac303.45±28.32**ac287.38±26.43***bd	1.14±0.433.81±0.51#1.87±0.44*2.24±0.41*1.44±0.36**ac1.33±0.34**bc1.23±0.19***bd1.46±0.37**ac1 36±0.35**bc1.27±0.21***bd

与正常对照组相比较：^#p＜0.01；与模型组相比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；

与苦参素注射液组相比较：^ap＜0.05，^bp＜0.01；与丹参注射液组相比较：^cp＜0.05，^dp＜0.01。

试验结果表明，黄芪、丹参、苦参素合并用药对小鼠慢性酒精性肝损伤具有显著的保护作用，并且保护作用与给药剂量相关，高剂量组效果最好；各剂量HDK1注射液和HDK2注射液对小鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用均优于丹参注射液和苦参素注射液单独使用的效果。提示，黄芪、丹参、苦参素合并用药具有协同作用，在抗酒精性肝损伤方面有显著作用。

试验例5黄芪、丹参、苦参素联合用药抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用

受试动物1日龄北京鸭，雌雄兼用。

供试品注射用阿昔洛韦(阳性对照组)：0.25mg，湖北科益药业股份有限公司

丹参注射液：自制，2ml，含丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)

苦参素注射液：自制，2ml∶200mg

HDK1注射液：自制，5ml∶482mg，含黄芪总皂苷136mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

HDK2注射液：自制，5ml∶468mg，含黄芪多糖122mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

给药剂量见表1-5。

试验方法1日龄北京鸭足静脉注射DHBV-DNA阳性血清，每只0.2ml，感染后7天取血，分离血清，-20℃保存待检。筛选出感染成功的阳性鸭60只，随机分为10组，每组6只，分别为模型组、阳性对照组和各给药组。感染后第13天开始，各组按表1-5静脉注射给药，每天1次，共2周。分别于给药前、给药第7天、给药第14天和停药后第3天，自鸭腿胫静脉抽血，分离血清，-20℃保存待检。用DHBV-DNADot Blot法检测上述鸭血清，以杂交斑点吸光度(OD)值作为标本DHBV-DNA水平值。

试验结果及结论结果见表1-5。与模型组相比较，各给药组对鸭DHBV病毒均有显著抑制作用(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)。给药期间，阳性对照注射用阿昔洛韦对鸭DHBV病毒有极显著的抑制作用(p＜0.001)，但是停药后DHBV水平又升高；给药期间，丹参注射液、苦参素注射液对鸭DHBV病毒均有显著的抑制作用(p＜0.05)，但是停药后苦参素注射液给药组的DHBV水平又明显升高；低剂量HDK1注射液和低剂量HDK2注射液对鸭DHBV病毒均有显著的抑制作用(p＜0.05)，中、高剂量HDK1注射液和HDK2注射液有极显著的抑制作用(p＜0.01)，并且停药后DHBV-DNA水平无明显升高。

表1-5黄芪、丹参、苦参素联合用药对鸭DHBV-DNA的抑制作用

(平均值±标准偏差，n＝6)

组别	剂量(mg/kg)	OD490值
						给药前	给药第7天	给药第14天	给药后3天
		模型组阳性对照组丹参注射液组苦参素注射液组HDK1注射液低剂量组HDK1注射液中剂量组HDK1注射液高剂量组HDK2注射液低剂量组HDK2注射液中剂量组HDK2注射液高剂量组	生理盐水1ml50mg/kg200mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg100mg/kg150mg/kg200mg/kg	1.63±0.061.63±0.041.62±0.051.61±0.041.60±0.061.63±0.041.64±0.031.64±0.071.64±0.051.63±0.04	1.63±0.050.77±0.14***132±0.12*1.27±0.11*1.02±0.10*ac0.91±0.15**ad0.82±0.14**bd1.01±0.12*ac0.92±0.13**ad0.82±0.11**bd					1.64±0.070.73±0.17***1.28±0.12*1.23±0.08*0.98±0.13*ac0.89±0.09**ad0.79±0.13**bd0.98±0.11*ac0.90±0.12**ad0.80±0.15**bd	1.64±0.061.60±0.101.34±0.13*1.42±0.171.05±0.11*ac0.99±0.12**bc0.91±0.11**bd1.02±0.10*ac0.96±0.09**bc0.89±0.13**bd

与模型组相比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001；

与苦参素注射液组相比较：^ap＜0.05，^bp＜0.01；与丹参注射液组相比较：^cp＜0.05，^dp＜0.01。

试验结果表明，黄芪、丹参、苦参素合并用药对鸭DHBV病毒具有显著的抑制作用，并且抑制作用与给药剂量相关，高剂量组的效果最好；各剂量HDK1注射液和HDK2注射液对鸭DHBV病毒的抑制作用均优于丹参注射液和苦参素注射液单独使用的效果。给药期间，高剂量组HDK1注射液和HDK2注射液对鸭DHBV病毒的抑制作用略低于阳性对照组注射用阿昔洛韦的效果，但是，停药后注射用阿昔洛韦组出现明显的反跳现象，而HDK1注射液和HDK2注射液组无明显反跳现象。提示，黄芪、丹参、苦参素合并用药具有协同作用，在抗病毒性肝炎方面有显著作用，并且停药后无反跳现象。

试验例6HDK1注射液、HDK2注射液稳定性试验

供试品HDK1注射液：自制，5ml∶482mg，含黄芪总皂苷136mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

HDK2注射液：自制，5ml∶468mg，含黄芪多糖122mg(相当于原药材10g)、丹参总酚酸146mg(相当于原药材7.5g)、苦参素200mg

考察项目性状、pH值、澄明度、有关物质、标示含量。

长期试验置温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％的条件下放置12个月。分别于第3个月、6个月、9个月、12个月，比较外观后，测试各项指标，将结果与0个月比较；12个月末增加无菌和热原检查。

试验结果温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％的条件下放置12个月，各项指标均无明显变化；长期试验12个月末，热原、无菌检查均符合规定。

结论上述考察结果表明，HDK1注射液、HDK2注射液的各项指标均比较稳定，可以长期储存，适应于工业大生产。

4、具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。

以下实施例中用HDK1代替以黄芪总皂苷、丹参总酚酸、苦参素为主要有效成分的药物组合物，用HDK2代替以黄芪多糖、丹参总酚酶、苦参素为主要有效成分的药物组合物。 实施例4～13中所用的黄芪总皂苷为 实施例1制备所得，所用的黄芪多糖为 实施例2制备所得，所用的丹参总酚酸为 实施例3制备所得。

实施例1黄芪总皂苷的制备以及鉴别和含量测定

黄芪总皂苷的翻备

取黄芪药材，加水煎煮三次，每次1.5小时，第一次加水10倍量，二、三次均为8倍量，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液中含醇量为75％，第二次为85％，每次均冷藏放置，回收乙醇并浓缩至每1ml相当于原药材10g，加于已处理好的大孔吸附树脂柱上，先用2倍体积的水冲柱，再用4倍体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、真空干燥，即得。

分别制备三批黄芪总皂苷，提取物得率见表2-1。

黄芪总皂苷的鉴别

鉴别试验一取本品10mg，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100～120目，5g，内径10～15mm)上，用40％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液；用水洗涤2次，每次20ml；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，紫外光灯(365nm)下显相同的橙黄色荧光斑点。

鉴别试验二取本品10mg，加乙醇30ml，加热回流20分钟，滤过，滤液加0.3％氢氧化钠溶液15ml使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH值至5～6，用乙酸乙酯15ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材2g，同法制成对照药材溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)作为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。

分别对上述三批黄芪总皂苷进行鉴别试验，结果均符合要求。

黄芪总皂苷的含量测定

总皂苷的含量测定

对照品溶液的制备精密称取于105℃干燥至恒重的黄芪甲苷对照品10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含黄芪甲苷干品0.1mg)。

供试品溶液的制备取本品100mg，精密称定，加水25ml使溶解，移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤两次，每次10ml，弃去水液，正丁醇至水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，移至25ml量瓶中，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法精密量取对照品溶液、供试品溶液各1ml，置25ml纳氏比色管，置水浴中蒸干，放冷，加新鲜配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.4ml、高氯酸1.6ml，摇匀，放置5分钟，置沸水浴中显色15分钟，取出，立即置冰浴中冷却至室温，加入8ml冰醋酸，摇匀，在538nm波长处测定吸光度，计算，即得。

黄芪甲苷的含量测定

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32∶68)为流动相；蒸发光散射检测器。理论板数以黄芪甲苷峰计算不低于4000。

对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备精密称取本品40mg，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过Dl01型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点对数方程计算，即得。

分别对上述三批黄芪总皂苷进行含量测定，结果见表2-1。

通过本工艺制备的黄芪总皂苷得率为0.5～2％，总皂苷的含量不低于50％，黄芪甲苷的含量不低于2.0％。

表2-1黄芪总皂苷的含量测定结果和得率

批号	总皂苷含量(％)	黄芪甲苷含量(％)	药材量(kg)	提取物量(g)	得率(％)
						123平均	53.6467.7271.0564.14	2.052.873.122.68	505050	835.2714.9491.3	1.671.430.981.36
13.61g/kg(提取物/药材)

实施例2黄芪多糖的制备以及鉴别和含量测定

黄芪多糖的制备

取黄芪药材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小时，提取液弃去，取药渣加水提取二次，合并提取液，浓缩至提取液体积与生药材的比例为1.05∶1，加入乙醇沉淀使含醇量达到70％，滤过，得沉淀，沉淀用70％乙醇洗涤，再用适量水溶解，滤过，滤液过大孔树脂，用水洗脱，收集水洗液，将水洗液浓缩至药液体积与药材比例为1∶2.5，加入乙醇使含醇量达到70％，得沉淀，将沉淀用95％乙醇和丙酮洗涤脱水，减压干燥(60℃)，即得。

分别制备三批黄芪多糖，得率见表2-2。

黄芪多糖的鉴别

(1)取本品约0.2mg，加水5ml溶解后，加碱性酒石酸铜试液5滴，加热即产生红色沉淀，冷却，滤过，取滤液加盐酸1滴使成酸性，水浴加热10分钟，放冷，调节pH值至中性，加碱性酒石酸铜试液0.5ml，水浴加热即产生红色的氧化亚铜沉淀。

(2)取本品约0.2g，加水2ml溶解后，加5％α-萘酚乙醇溶液0.5ml摇匀，缓缓加入硫酸3ml，两液面交界处显紫红色环。

分别对上述三批黄芪多糖进行鉴别试验，结果均符合要求。

黄芪多糖的含量测定

标准溶液的制备称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。

标准曲线的绘制精密量取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml共6份，分别置25ml量瓶中，加水至2.0ml，并加苯酚溶液(取苯酚300g，铝片0.3g，碳酸氢钠0.15g，混合蒸馏，收集182℃馏分，配制成5％水溶液)1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5分钟，置水浴中加热15分钟，取出，迅速冷却至室温，另以2.0ml水同上平行操作作为空白对照，在490nm波长处测定吸收值，计算回归方程。

测定法取本品0.5g置25ml量瓶中，照标准曲线绘制项下的方法自“加水至2.0ml”起，依法测定吸收值，依回归方程计算多糖的含量。

分别对上述三批黄芪多糖进行含量测定，结果见表2-2。

通过本工艺制备的黄芪多糖得率为0.5～2％，多糖的含量不低于50％。

表2-2黄芪多糖的含量测定结果和得率

批号	多糖含量(％)	药材量(kg)	提取物量(g)	得率(％)
					123平均	53.2167.9860.6460.61	505050	722.1486.8627.0	1.440.971.251.22
12.24g/kg(提取物/药材)

实施例3丹参总酚酸的制备以及鉴别和含量测定

丹参总酚酸酸的制备

取丹参药材，粉碎成粗粒，加水煎煮三次，第一次2小时，加水12倍量，第二、三次各1.5小时，加水10倍量，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.17～1.20。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75％，第二次使含醇量为85％，各静置24h，回收乙醇至相对密度为1.17～1.20，喷雾干燥，即得。

分别制备三批丹参总酚酸，得率见表2-3。

丹参总酚酸的鉴别

取本品0.2g，研细，加70％甲醇25ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加70％甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹酚酸B对照品，加70％甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法测定，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

对上述三批丹参总酚酸进行鉴别试验，结果均符合要求。

丹参总酚酸的含量测定

总酚酸的含量测定

对照品溶液的制备称取于105℃干燥至恒重的原儿茶醛对照品1mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液的制备称取本品50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度。精密量取0.1ml，置25ml容量瓶中，加乙醇5ml，加入0.3％十二烷基硫酸钠2ml，0.6％铁氰化钾-0.9％三氧化铁(临用前等量混合)1ml，暗处放置5分钟，加入0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，暗处放置20分钟后，置lena比色池中，720nm处测定。

丹酚酸B的含量测定

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)为流动相，检测波长为286nm。理论板数按丹参素峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1h，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。

对上述三批丹参总酚酸进行含量测定，结果见表2-3。

通过本工艺制备的丹参总酚酸得率为1～3％，总酚酸的含量不低于50％，丹酚酸B的含量不低于1.5％。

表2-3丹参总酚酸的含量测定结果和得率

批号	总酚酸含量(％)	丹酚酸B含量(％)	药材量(kg)	提取物量(g)	得率(％)
						1234平均	56.1162.7367.2863.3662.37	2.122.352.412.282.29	50505050	1179.8991.3745.2964.8	2.361.981.491.931.94
19.41g/kg(提取物/药材)

实施例4HDK注射液的制备

1、处方：

HDK1注射液处方：

黄芪总皂苷    136g(相当于原药材10kg)

丹参总酚酸    146g(相当于原药材7.5kg)

苦参素        200g

聚山梨酯-80   40g

注射用水      加至5000ml

                                 

共制备        1000支

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2注射液处方：

黄芪多糖      122g(相当于原药材10kg)

丹参总酚酸    146g(相当于原药材7.5kg)

苦参素        200g

聚山梨酯-80   20g

注射用水      加至5000ml

                                 

共制备        1000支

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗；

(2)取配液量80％的注射用水，加入聚山梨酯-80搅拌溶解，然后加入处方量的黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素，加热搅拌溶解完全；补加注射用水至全量；

(3)加入配液量0.1％的针剂用活性炭，加热搅拌15分钟；

(4)经砂滤棒过滤脱炭，测定并调节溶液的pH值；

(5)经0.45μm的微孔滤膜精滤；

(6)检查溶液的澄明度，半成品化验；

(7)将溶液灌装、熔封于玻璃安瓿中；

(8)100℃流通蒸汽灭菌30分钟；

(9)趁热将样品放入0.01％的亚甲蓝溶液中检漏；

(10)灯检，成品全检，包装入库。

实施例5注射用HDK的制备

1、处方：

注射用HDK1处方：

黄芪总皂苷    136g(相当于原药材10kg)

丹参总酚酸    146g(相当于原药材7.5kg)

苦参素        200g

聚山梨酯-80   40g

甘露醇        200g

无菌注射用水  加至3000ml

                                  

共制备        1000支

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

注射用HDK2处方：

黄芪多糖        122g(相当于原药材10kg)

丹参总酚酸      146g(相当于原药材7.5kg)

苦参素          200g

聚山梨酯-80     20g

甘露醇          200g

无菌注射用水    加至3000ml

                                  

共制备          1000支

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)首先将配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，胶塞等进行无菌处理；

(2)按照处方量称取原料和辅料；

(3)取配液量80％的无菌注射用水，加入聚山梨酯-80搅拌溶解，然后将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素加入加热搅拌溶解完全，再加入甘露醇加热搅拌溶解完全，补加无菌注射用水至全量；

(4)加入配液量0.1％的针剂用活性炭，加热搅拌15分钟；

(5)经砂滤棒过滤脱炭，测定并调节溶液的pH值；

(6)经0.22μm的微孔滤膜精滤；

(7)检查溶液的澄明度，半成品化验；

(8)分装于抗生素玻璃瓶中，半压塞；将样品放入冻干机中冷冻干燥；-40℃预冻4小时，低温真空干燥-40℃～0℃18小时，然后升温至20℃真空干燥4小时；

(9)冻干结束，压塞，轧盖；

(10)成品全检，包装入库。

实施例6 HDK氯化钠注射液的制备b

1、处方：

HDK1氯化钠注射液处方：

黄芪总皂苷    271g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸    244g(相当于原药材15kg)

苦参素        400g

聚山梨酯-80   80g

氯化钠        900g

注射用水      加至100000ml

                                  

共制备        1000瓶

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2氯化钠注射液处方：

黄芪多糖      245g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸    291g(相当于原药材15kg)

苦参素        400g

聚山梨酯-80   40g

氯化钠        900g

注射用水      加至100000ml

                                     

共制备        1000瓶

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗；

(2)取配液量20％的注射用水，加入聚山梨酯-80搅拌溶解，然后将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素加入加热搅拌溶解完全，将氯化钠用配液量40％的注射用水溶解完全；

(3)合并上述溶液，补加注射用水至全量；

(4)加入配液量0.1％的针剂用活性炭，加热搅拌15分钟；

(5)经砂滤棒过滤脱炭，测定并调节溶液的pH值；

(6)经0.45μm的微孔滤膜精滤；

(7)检查溶液的澄明度，半成品化验；

(8)灌装于100ml的输液瓶中；

(9)115℃热压灭菌30分钟；

(10)灯检，成品全检，包装入库。

实施例7HDK葡萄糖注射液的制备

1、处方：

HDK1葡萄糖注射液处方：

黄芪总皂苷    271g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸    291g(相当于原药材15kg)

苦参素        400g

聚山梨酯-80   80g

葡萄糖        5000g

注射用水      加至100000ml

                                  

共制备        1000瓶

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2葡萄糖注射液处方：

黄芪多糖      245g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸    291g(相当于原药材15kg)

苦参素        400g

聚山梨酯-80   40g

葡萄糖        5000g

注射用水      加至100000ml

                                    

共制备        1000瓶

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗；

(2)取配液量20％的注射用水，加入聚山梨酯-80搅拌溶解，然后将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素加入加热搅拌溶解完全，将葡萄糖用配液量40％的注射用水溶解完全；

(3)合并上述溶液，补加注射用水至全量；

(4)加入配液量0.1％的针剂用活性炭，加热搅拌15分钟；

(5)经砂滤棒过滤脱炭，测定并调节溶液的pH值；

(6)经0.45μm的微孔滤膜精滤；

(7)检查溶液的澄明度，半成品化验；

(8)灌装于100ml的输液瓶中；

(9)115℃热压灭菌30分钟；

(10)灯检，成品全检，包装入库。

实施例8HDK片的制备

1、处方：

HDK1片处方：

黄芪总皂苷            68g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸            73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素                100g

淀粉                  60.0g

预胶化淀粉            50.0g

微晶纤维素            50.0g

2％HPMC50％乙醇溶液   适量

硬脂酸镁              2.0g

羧甲淀粉钠            20.0g

                                        

共制备                1000片

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2片处方：

黄芪多糖              61g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸            73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素                100g

淀粉                  60.0g

预胶化淀粉            50.0g

微晶纤维素            50.0g

2％HPMC50％乙醇溶液   适量

硬脂酸镁              2.0g

羧甲淀粉钠            20.0g

                                    

共制备                1000片

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素粉碎过100目筛备用；

(2)按照处方量称取原料和辅料；

(3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用；

(4)将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸、苦参素、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素混合均匀，加入2％HPMC50％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材；

(5)过20目筛制颗粒；颗粒在60℃的条件下烘干；

(6)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁和羧甲淀粉钠，过18目筛整粒，混合均匀；

(7)取样，半成品化验；

(8)按照化验确定的片重压片；

(9)成品全检，包装入库。

实施例9HDK胶囊的制备

1、处方：

HDK1胶囊处方：

黄芪总皂苷            68g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸            73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素                100g

淀粉                  50.0g

预胶化淀粉            60.0g

微晶纤维素            40.0g

2％HPMC50％乙醇溶液   适量

硬脂酸镁              1.0g

                                      

共制备                1000粒

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2胶囊处方：

黄芪多糖              61g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸            73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素                100g

淀粉                  50.0g

预胶化淀粉            60.0g

微晶纤维素            40.0g

2％HPMC50％乙醇溶液   适量

硬脂酸镁              2.0g

                                     

共制备                1000片

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参索粉碎过100目筛备用；

(2)按照处方量称取原料和辅料；

(3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用；

(4)将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸、苦参素、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素混合均匀，加入2％HPMC50％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材；

(5)过20目筛制颗粒；

(6)颗粒在60℃的条件下烘干；

(7)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁，过18目筛整粒，混合均匀；

(8)取样，半成品化验；

(9)按照化验确定的装量装入胶囊；

(10)成品全检，包装入库。

实施例10HDK软胶囊的制备

1、处方：

HDK1软胶囊处方：

黄芪总皂苷    68g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸    73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素        100g

大豆油        400g

大豆磷脂      20g

蜂蜡          12g

                            

共制备        1000粒

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2软胶囊处方：

黄芪多糖      61g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸    73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素        100g

大豆油        400g

大豆磷脂      20g

蜂蜡          12g

                             

共制备        1000粒

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素粉碎过100目筛，备用；

(2)处方量的大豆油和大豆磷脂、蜂蜡加热熔融，混匀，放冷；

(3)加入黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素，研匀，过胶体磨；

(4)取样，半成品化验；

(5)压制成软胶囊；

(6)成品全检，包装入库。

实施例11HDK滴丸的制备

1、处方：

HDK1滴丸处方：

黄芪总皂苷    68g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸    73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素        100g

聚乙二醇6000  600g

                            

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2滴丸处方：

黄芪多糖      61g(相当于原药材5kg)

丹参总酚酸    73g(相当于原药材3.75kg)

苦参素        100g

聚乙二醇6000  600g

                                                         

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)聚乙二醇6000在水浴中加热熔融；

(2)聚乙二醇6000全部熔融后加入黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素，搅拌溶解；

(3)过60目筛过滤；

(4)保持60℃滴入冷至10℃以下的液体石蜡中制成丸；

(5)成品全检，包装入库。

实施例12HDK颗粒的制备

1、处方：

HDK1颗粒处方：

黄芪总皂苷            271g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸            291g(相当于原药材15kg)

苦参素                400g

糖粉                  1150.0g

矫味剂                适量

2％HPMC50％乙醇溶液   适量

                                    

共制备                1000包

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2颗粒处方：

黄芪多糖            245g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸           291g(相当于原药材15kg)

苦参素               400g

糖粉                 1150.0g

矫味剂               适量

2％HPMC50％乙醇溶液   适量

                                   

共制备                1000包

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)将蔗糖粉碎过100目筛备用，黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素粉碎过100目筛备用；

(2)按照处方量称取原料和辅料；

(3)将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸、苦参素与糖粉、矫味剂以等量递加的方法混合均匀，加入2％HPMC50％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材；

(4)过20目筛制颗粒；

(5)颗粒在60℃的条件下烘干；

(6)干颗粒过18目筛整粒；

(7)取样，半成品化验颗粒中主药的含量，确定装量；

(8)包装；成品全检，包装入库。

实施例13HDK口服液的制备

1、处方：

HDK1口服液处方：

黄芪总皂苷    271g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸    291g(相当于原药材15kg)

苦参素        400g

苯甲酸钠      40g

甜菊甙        30g

水            加至15000ml

                                 

共制备        1000支

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为63.22％。

HDK2口服液处方：

黄芪多糖      245g(相当于原药材20kg)

丹参总酚酸    291g(相当于原药材15kg)

苦参素        400g

苯甲酸钠      40g

甜菊甙        30g

水            加至15000ml

                                  

共制备        1000支

注：中药总提取物中主要有效成分总含量为61.57％。

2、具体步骤：

(1)将黄芪总皂苷(或者黄芪多糖)、丹参总酚酸和苦参素加入配液量60％的水中加热搅拌溶解完全；

(2)将苯甲酸钠和甜菊甙用配液量20％的水溶解完全；

(3)合并上述溶液，补加水至全量；

(4)过0.8μm的微孔滤膜过滤；

(5)半成品化验；

(6)灌装；成品全检，包装入库。

Claims (10)

1、一种药物组合物，其特征在于，该组合物主要由下列重量份的原料药制成：黄芪400～10000份、丹参200～6000份、苦参素10～200份。

2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，各原料药的重量份为：黄芪1000～5000份、丹参500～3000份、苦参素20～100份。

3、如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，各原料药的重量份为：黄芪2000份、丹参1500份、苦参素40份。

4、如权利要求1～3所述的任一药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的黄芪、丹参可以用适宜的溶剂和方法单独或混合提取加工得到提取物，总提取物再与苦参素和药学上可接受的辅料混合加工制成任一临床上或药学上可接受的剂型。

5、如权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的总提取物中所含的主要有效成分为黄芪总皂苷和丹参总酚酸，或者为黄芪多糖和丹参总酚酸，所含的主要有效成分的总含量不低于50％。

6、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该组合物还可由下列原料药制成：黄芪总皂苷或者黄芪多糖、丹参总酚酸和苦参素，其重量份为：黄芪总皂苷2～200份、丹参总酚酸2～200份、苦参素10～200份，或者为：黄芪多糖2～200份、丹参总酚酸2～200份、苦参素10～200份。

7、如权利要求6所述的药物组合物，其特在于，各原料药的重量份为：黄芪总皂苷5～100份、丹参总酚酸5～100份、苦参素20～100份，或者为：黄芪多糖5～100份、丹参总酚酸5～100份、苦参素20～100份。

8、如权利要求7所述的药物组合物，其特在于，各原料药的重量份为：黄芪总皂苷10～40份、丹参总酚酸15～45份、苦参素40份，或者为：黄芪多糖10～40份、丹参总酚酸15～45份、苦参素40份。

9、如权利要求6～8所述的任一药物组合物，其特征在于，所述的黄芪总皂苷中总皂苷的含量不低于30％、黄芪甲苷的含量不低于1.0％，黄芪多糖中多糖的含量不低于35％，丹参总酚酸中总酚酸的含量不低于30％、丹酚酸B的含量不低于0.3％。

10、如权利要求1～3、6～8所述的任一药物组合物，其特征在于，该组合物可与药学上可接受的辅料混合制成任一临床上或药学上可接受的剂型。