CN103601769A - 一种从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷ⅰ和胡黄连苷ⅱ的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺：胡黄连原料粉碎，用溶剂对原料提取，提取液去除有机溶剂后经大孔树脂吸附后用30～75%乙醇洗脱，洗脱液浓缩，用硅胶吸附，干燥，用乙酸乙酯，无水乙醇洗脱，洗脱液去有机溶剂以水溶解经反相柱层析系统分离得纯度大于90%的胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ单体。本发明的工艺先进，具有高重现性、高纯度、高产率，且工艺系统可靠，可操作性强，特别适宜于大规模工业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药胡黄连的提取物及分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，属于医药技术领域。
背景技术
中药胡黄连为玄参科多年生草本植物胡黄连的干燥根茎，性寒味苦，有清热、除湿、明目、补肝、益胆、杀虫的效用，主治痨热咳嗽、湿热泻痢、小儿疳积、目赤等疾病。上世纪70年代以前，我国胡黄连一直依赖从印度进口。1963年以前，《中国药典》收载的胡黄连均为主产于印度的胡黄连Picrorhiza kurrooa Royle ex Benth。1965年在我国西藏东南部及云南西北部发现了同属植物，定名为西藏胡黄连Picrorhiza scrophulariaeflora Pennell。通过与印度胡黄连的比较，证明两者在生药形态、组织、水浸出物、醇浸出物、苦味度、化学成分等方面非常相似，可以代替印度胡黄连药用。
据文献记载，胡黄连中含有环烯醚萜苷类、葫芦素类、酚苷类，另外还含有少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黄连苷I（Picroside I）、胡黄连苷Ⅱ（Picroside Ⅱ）均属于环烯醚萜苷类化合物。胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ均具有保肝降脂利胆作用和对神经细胞损伤的保护作用。
由于胡黄连中成分复杂，提取中采用不同提取溶剂和提取方式所提取的提取物性质具有较大差异，提取物中胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ以外的杂质的极性及水溶性等差异，对后续经大孔树脂或硅胶柱层析分离效果具有明显的影响。所以本发明采用大孔树脂结合硅胶柱层析的方式将减少提取过程产生的提取物性质差异变化对提取物的性质影响，使分离产物性质更稳定，提取分离纯化工艺系统性更强，重现性更好。
胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ分子结构
发明内容
本发明提供了具有开发药用的胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ的制备方法。
本发明的技术方案：从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，具体方法如下：
（1）将胡黄连原料进行粉碎至粒径为50-200目；
（2）制备胡黄连提取物：按照渗漉法用提取溶剂对胡黄连进行提取，提取溶剂为水、乙醇或者其混合溶液，提取后溶液60-65℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，浓缩液加适量水稀释后上已净化的大孔吸附树脂吸附，用水洗大孔吸附树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用3-7倍柱体积30-75%乙醇洗脱，收集洗脱液，60-65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物；
（3）制备胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品：将胡黄连提取物用95%乙醇--无水乙醇溶解，过滤，滤液拌入拌样用层析硅胶，干燥，加载于分离用层析硅胶柱床顶端，用乙酸乙酯、无水乙醇的混合溶剂洗脱，收集流出液，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品；
（4）制备高纯度胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ：分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.25-0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，湿法上样于反相柱层析系统，反相柱层析系统的填料为硅胶基质或聚苯乙烯/二乙烯基苯基质，即PS/DVB基质，用体积比为1︰100-1︰0的甲醇-水或者乙腈-水混合溶剂洗脱，分段收集流出液，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度高于90%的胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ。
上述从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，所述的胡黄连为玄参科植物胡黄连Picrorrhiza Kurrooa Royleex Benth或西藏胡黄连Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell的根茎。
上述从中胡黄连提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，所述的步骤（2）中所用大孔树脂为非极性或弱极性树脂，其中非极性为苯乙烯型树脂，弱极性树脂为聚苯乙烯-丙烯酸酯型。
上述从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，所用的苯乙烯型树脂为HPD100型大孔树脂，聚苯乙烯-丙烯酸酯型树脂为ME-2型大孔树脂。
上述从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，所述的步骤（3） 所用拌样用层析硅胶的用量为胡黄连提取物1-1.5倍重量，分离用层析硅胶加入量为胡黄连提取物重量的3～10倍重量。
上述从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，所述的步骤（3）所用混合洗脱溶剂为乙酸乙酯、无水乙醇的混合溶剂，梯度或等度洗脱，容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰100-1︰5。
上述从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，所述的步骤（4）中硅胶基质填料Sepax GP-C18、BR-C18、HP-C18、Bio-C18、GP-C8、Bio-C8、GP-C4、Bio-C4、GP-Phenyl、Generik-C18、Generik-C8、Generik-C4、Generik-Phenyl、PolyRP反相层析填料中的一种，PS/DVB基质填料为PolyRP反相层析填料，其粒径为5μm-60μm之间，上样用胡黄连苷Ⅰ粗品和胡黄连苷Ⅱ粗品重量与反相层析填料重量比为1∶100-1∶1200。
上述实验中所采用HPLC检测方法如下：
标准样品液的配制：分别精密称取5mg胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ对照品置于25mL的容量瓶中，加水，超声溶解定容，作为标准样品液，浓度为0.2mg·mL-1，
测试样品液的配制：分别精密称取5mg胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ样品置于25mL的容量瓶中，加水，超声溶解定容，作为测试样品液，浓度为0.2mg·mL-1，
检测条件：
流动相：甲醇∶0.1%磷酸水＝35∶65（V/V）经混合，过滤，脱气后使用；色谱柱：ODS-C18柱4.6×250.0mm，流速：1ml·min-1，进样体积：10μL，检测波长：275nm，胡黄连苷Ⅰ保留时间：为31～32min，胡黄连苷Ⅱ保留时间：为14～15min。
本发明与以往从胡黄连提取胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ专利比较，具有明显的优势是，本发明人采用先进的提取分离纯化技术，同时从中药胡黄连药材中提取有效成分胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ，且均使其含量均超过90％，对于胡黄连药材资源综合利用具有较积极的意义。本发明另一个创新是将反相色谱材料应用于胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ的纯化，将其含量均超过90％。
由于胡黄连中成分复杂，提取中采用不同提取溶剂和提取方式所提取的提取物性质具有较大差异，提取物中胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ以外的杂质的极性及水溶性等差异，对后续经大孔树脂或硅胶柱层析分离效果具有明显的影响。所以本发明采用大孔树脂结合硅胶柱层析的方式将减少提取过程产生的提取物性质差异变化对提取物的性质影响，使分离产物性质更 稳定，提取分离纯化工艺系统性更强，重现性更好。
本发明为开发以胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ为原料的新药提供产业化生产工艺方法。
具体实施方式
以下是本发明涉及的胡黄连苷I和胡黄连苷Ⅱ的制备方法的具体制备例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
（1）取胡黄连（Picrorrhiza Kurrooa Royleex Benth.）原料500g，粉碎至粒径为50目，加10L水渗漉，溶液65℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，浓缩液加6L水稀释后，上已经过净化的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用5倍柱体积35%乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物105g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入105g硅胶，水浴挥干，加载于硅胶柱（315g硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰100～1︰5的混合溶剂梯度洗脱，每200mL流出液为一个流份（流份No.1-No.8，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰100；流份No.9-No.15，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰20；流份No.16-No.30，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰10；流份No.31-No.40，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰5），分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品11.0g和胡黄连苷Ⅱ粗品30.5g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.25g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于Sepax GP-C18柱层析系统（粒径60μm，1.2kg Sepax GP-C18反相硅胶置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的甲醇-水溶液梯度洗脱（时间0-28min，甲醇-水=1︰100～1︰40；时间28-40min，甲醇-水=1︰40；时间40-48min，甲醇-水=1︰40～1︰65；时间48-56min，甲醇-水=1︰65；时间56-60min，甲醇-水=1︰0），在时间28-56min间每收集4min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为92.3%的胡黄连苷Ⅰ5.4g和93.1%的胡黄连苷Ⅱ14.6g。
实施例2
（1）取胡黄连（Picrorrhiza Kurrooa Royleex Benth.）原料500g，粉碎至粒径为100目，加10L水渗漉溶液，提取的溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，浓缩液加8L水稀释后，上已经净化处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg ME-2型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用3倍柱体积75%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物108g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入150g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（340g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰20的混合溶剂等度洗脱，每200mL流出液为一个流分，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品12.6g和胡黄连苷Ⅱ粗品31.1g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.25g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于HP-C18反相硅胶柱层析系统（粒径为30μm，1.2kg HP-C18反相硅胶置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的乙腈-水溶液洗脱（时间0-20min，乙腈-水=1︰100～1︰20；时间20-30min，乙腈-水=1︰20-1︰35；时间30-48min，乙腈-水=1︰35～1︰55；时间48-56min，乙腈-水=1︰55；时间56-60min，乙腈-水=1︰0），在时间20-56min间每收集4min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为90.7%的胡黄连苷Ⅰ5.8g和92.9%的胡黄连苷Ⅱ15.2g。
实施例3
（1）取胡黄连（Picrorrhiza Kurrooa Royleex Benth.）原料500g，粉碎至粒径为50目，加10L95%乙醇渗漉，提取后溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，加9L水稀释后上已经过预处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用7倍柱体积35%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物107g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入155g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（505g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰16的混合溶剂等度洗脱，每250mL流出液为一个流分，收集流 出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品11.3g和胡黄连苷Ⅱ粗品30.8g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于PolyRP反相层析系统（粒径5μm，0.4kg PolyRP反相层析填料置于Φ＝6cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的甲醇-水溶液洗脱（时间0-12min，甲醇-水=1︰100～1︰40；时间12-27min，甲醇-水=1︰40；时间27-39min，甲醇-水=1︰40～1︰65；时间39-45min，甲醇-水=1︰65；时间45-50min，甲醇-水=1︰0），在时间12-45min间每收集3min为一个流份，收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为91.1%的胡黄连苷Ⅰ6.2g和93.2%的胡黄连苷Ⅱ14.7g。
实施例4
（1）取胡黄连（Picrorrhiza Kurrooa Royleex Benth.）原料500g，粉碎至粒径为200目，加10L60%乙醇渗漉，提取后溶液60℃减压浓缩至相60℃时测定对密度为1.1g/cm3，加9L水稀释后上已经过净化的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用6倍柱体积45%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物116g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入175g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（930g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰8的混合溶剂等度洗脱，每250mL流出液为一个流分，收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品10.6g和胡黄连苷Ⅱ粗品31.7g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于PolyRP反相层析系统（粒径为60μm，1.2kg PolyRP反相层析填料置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的乙腈-水溶液洗脱（时间0-22min，乙腈-水=1︰100～1︰20；时间22-34min，乙腈-水=1︰20-1︰35；时间34-46min，乙腈-水=1︰35～1︰55；时间46-58min，乙腈-水=1︰55；时间58-65min，乙腈-水=1︰0），在时间22-58min间每收集4min为一个流份，收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥， 粉碎得纯度为93.0%的胡黄连苷Ⅰ5.7g和93.3%胡黄连苷Ⅱ15.8g。
实施例5
（1）取西藏胡黄连（Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell）原料500g，粉碎至粒径为50目，加10L水渗漉，提取的溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，浓缩液加8L水稀释后，上已经过净化处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用4倍柱体积45%乙醇洗脱，收集洗脱液，60℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物115g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入115g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（345g层析硅胶置于Φ＝8mL的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯==1︰100～1︰5的混合溶剂梯度洗脱，每200mL流出液为一个流份（流份No.1-No.9，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰100；流份No.10-No.17，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰20；流份No.18-No.32，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰10；流份No.33-No.42，无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰5），分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品12.8g和胡黄连苷Ⅱ粗品41.4g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.25g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于Sepax GP-C18反相硅胶柱层析系统（粒径为60μm，1.2kg Sepax GP-C18反相硅胶置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的甲醇-水溶液洗脱（时间0-12min，甲醇-水=1︰100～1︰40；时间12-27min，甲醇-水=1︰40；时间27-39min，甲醇-水=1︰40～1︰65；时间39-45min，甲醇-水=1︰65；时间45-50min，甲醇-水=1︰0），在时间12-45min间每收集3min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为91.9%的胡黄连苷Ⅰ6.7g和92.8%的胡黄连苷Ⅱ24.2g。
实施例6
（1）取西藏胡黄连（Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell）原料500g，粉碎至粒径为100目，加10L水渗漉，提取的溶液65℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，浓缩液加8L水稀释后，上已经过预处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg ME-2型大孔树脂置于Φ ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用7倍柱体积60%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物120g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入145g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（360g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰20的混合溶剂等度洗脱，每200mL流出液为一个流分，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品14.3g和胡黄连苷Ⅱ粗品48.2g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于Sepax GP-C18反相硅胶柱层析系统（粒径为30μm，1.2kg Sepax GP-C18反相硅胶置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的乙腈-水溶液洗脱（时间0-20min，乙腈-水=1︰100～1︰20；时间20-32min，乙腈-水=1︰20-1︰35；时间32-44min，乙腈-水=1︰35～1︰55；时间44-60min，乙腈-水=1︰55；时间60-65min，乙腈-水=1︰0），在时间20-60min间每收集4min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为92.5%的胡黄连苷Ⅰ7.1g和93.3%胡黄连苷Ⅱ25.7g。
实施例7
（1）取西藏胡黄连（Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell）原料500g，粉碎至粒径为200目，加10L95%乙醇渗漉，提取后溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，加9L水稀释后上已经过预处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用6倍柱体积35%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物108g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入115g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（540g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰16的混合溶剂等度洗脱，每250mL流出液为一个流分，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品14.8g和胡黄连苷Ⅱ粗品44.4g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.25g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于PolyRP反相层析系统（粒径为10μm，0.6kg PolyRP反相层析填料置于Φ＝6cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的甲醇-水溶液洗脱（时间0-10min，甲醇-水=1︰100～1︰40；时间10-25min，甲醇-水=1︰40；时间25-34min，甲醇-水=1︰40～1︰65；时间34-45min，甲醇-水=1︰65；时间45-50min，甲醇-水=1︰0），在时间10-45min间每收集3min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为92.4%的胡黄连苷Ⅰ6.7g和94.5%胡黄连苷Ⅱ23.2g。
实施例8
（1）取西藏胡黄连（Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell）原料500g，粉碎至粒径为100目，加10L50%乙醇渗漉，提取后溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，加9L水稀释后上已经过预处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用6倍柱体积35%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物112g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入168g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（896g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰8的混合溶剂等度洗脱，每250mL流出液为一个流分，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品13.7g和胡黄连苷Ⅱ粗品43.2g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于PolyRP反相层析系统（粒径为30μm，1.2kg PolyRP反相层析填料置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的乙腈-水溶液洗脱（时间0-20min，乙腈-水=1︰100～1︰20；时间20-32min，乙腈-水=1︰20-1︰35；时间32-44min，乙腈-水=1︰35～1︰55；时间44-60min，乙腈-水=1︰55；时间60-65min，乙腈-水=1︰0），在时间20-60min间每收集4min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为92.7%的胡黄连苷Ⅰ7.0g和93.6%胡黄连苷Ⅱ24.7g。
实施例9
（1）取西藏胡黄连（Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell）原料500g，粉碎至粒径为100目，加10L95%乙醇渗漉，提取后溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，加9L水稀释后上已经过预处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用6倍柱体积35%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物110g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入150g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（900g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰8的混合溶剂等度洗脱，每250mL流出液为一个流分，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品14.2g和胡黄连苷Ⅱ粗品41.9g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于GP-C8反相层析系统（粒径为30μm，1.2kg GP-C8反相层析填料置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的甲醇-水溶液洗脱（时间0-16min，甲醇-水=1︰100～1︰40；时间16-24min，甲醇-水=1︰40；时间24-32min，甲醇-水=1︰40～1︰65；时间32-48min，甲醇-水=1︰65；时间48-55min，甲醇-水=1︰0），在时间16-48min间每收集4min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为95.0%的胡黄连苷Ⅰ6.7g和93.6%胡黄连苷Ⅱ23.2g。
实施例10
（1）取西藏胡黄连（Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell）原料500g，粉碎至粒径为100目，加10L95%乙醇渗漉，提取后溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，加9L水稀释后上已经过预处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用6倍柱体积35%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物117g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入150g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（900g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比 是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰8的混合溶剂等度洗脱，每250mL流出液为一个流分，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品12.6g和胡黄连苷Ⅱ粗品43.3g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，每次上样6～8mL，分批次湿法上样于Generik-C18反相层析系统（粒径为30μm，1.2kg Generik-C18反相层析填料置于Φ＝10cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的甲醇-水溶液洗脱（时间0-20min，甲醇-水=1︰100～1︰40；时间20-28min，甲醇-水=1︰40；时间28-36min，甲醇-水=1︰40～1︰65；时间36-52min，甲醇-水=1︰65；时间52-60min，甲醇-水=1︰0），在时间20-52min间每收集4min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为91.1%的胡黄连苷Ⅰ6.4g和92.7%胡黄连苷Ⅱ23.8g。
实施例11
（1）取西藏胡黄连（Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell）原料500g，粉碎至粒径为100目，加10L95%乙醇渗漉，提取后溶液60℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，加9L水稀释后上已经过预处理的大孔吸附树脂柱（2.5kg HPD100型大孔树脂置于Φ＝10cm的玻璃柱内）吸附，用水洗大孔树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用6倍柱体积35%乙醇洗脱，收集洗脱液，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物115g；
（2）将胡黄连提取物用95%乙醇溶解，过滤，滤液拌入150g层析硅胶，水浴挥干，加载于分离用层析硅胶柱（900g层析硅胶置于Φ＝8cm的玻璃柱内）顶端，用容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰8的混合溶剂等度洗脱，每250mL流出液为一个流分，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ粗品13.1g和胡黄连苷Ⅱ粗品40.6g；
（3）分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，取适量分批次湿法上样于Generik-C4反相层析系统（粒径为10μm，0.6kg Generik-C4反相层析填料置于Φ＝6cm的不锈钢柱内），用体积比为1︰100～1︰0的甲醇-水溶液洗脱（时间0-12min，甲醇-水=1︰100～1︰36；时间12-27min，甲醇-水=1︰36；时 间27-33min，甲醇-水=1︰36～1︰50；时间33-48min，甲醇-水=1︰50；时间48-55min，甲醇-水=1︰0），在时间12-48min间每收集3min为一个流份，分段收集流出液，取适量测定胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ含量，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度为93.2%的胡黄连苷Ⅰ6.8g和93.5%胡黄连苷Ⅱ23.5g。
Claims (7)
1.从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于，具体方法如下：
（1）将胡黄连原料进行粉碎至粒径为50-200目；
（2）制备胡黄连提取物：按照渗漉法用提取溶剂对胡黄连进行提取，提取溶剂为水、乙醇或者其混合溶液，提取后溶液60-65℃减压浓缩至60℃时测定相对密度为1.01g/cm3，浓缩液加适量水稀释后上已净化的大孔吸附树脂吸附，用水洗大孔吸附树脂柱，洗至近无色，并且molish反应阴性，用3-7倍柱体积30-75%乙醇洗脱，收集洗脱液，60-65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得胡黄连提取物；
（3）制备胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品：将胡黄连提取物用95%乙醇--无水乙醇溶解，过滤，滤液拌入拌样用层析硅胶，干燥，加载于分离用层析硅胶柱床顶端，用乙酸乙酯、无水乙醇的混合溶剂洗脱，收集流出液，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于50%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品；
（4）制备高纯度胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ：分别将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ粗品用水溶解为0.25-0.5g·mL-1的溶液，过0.45μm的微孔滤膜，湿法上样于反相柱层析系统，反相柱层析系统的填料为硅胶基质或聚苯乙烯/二乙烯基苯基质，即PS/DVB基质，用体积比为1︰100-1︰0的甲醇-水或者乙腈-水混合溶剂洗脱，分段收集流出液，将胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ纯度大于90%流份分别合并，回收溶剂，干燥，粉碎得纯度高于90%的胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ。
2.根据权利要求1所述的从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于所述的胡黄连为玄参科植物胡黄连Picrorrhiza Kurrooa RoyleexBenth或西藏胡黄连Picrorrhiza scrophulariaeflora Pennell的根茎。
3.根据权利要求1所述的从中胡黄连提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于所述的步骤（2）中所用大孔树脂为非极性或弱极性树脂，其中非极性为苯乙烯型树脂，弱极性树脂为聚苯乙烯-丙烯酸酯型。
4.根据权利要求3所述的从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于所用的苯乙烯型树脂为HPD100型大孔树脂，聚苯乙烯-丙烯酸酯型树脂为ME-2型大孔树脂。
5.根据权利要求1所述的从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于所述的步骤（3）所用拌样用层析硅胶的用量为胡黄连提取物1-1.5倍重量，分离用层析硅胶加入量为胡黄连提取物重量的3～10倍重量。
6.根据权利要求1所述的从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于所述的步骤（3）所用混合洗脱溶剂为乙酸乙酯、无水乙醇的混合溶剂，梯度或等度洗脱，容积百分比是无水乙醇︰乙酸乙酯=1︰100-1︰5。
7.根据权利要求1所述的从胡黄连中提取分离纯化胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ的制备工艺，其特征在于所述的步骤（4）中硅胶基质填料Sepax GP-C18、BR-C18、HP-C18、Bio-C18、GP-C8、Bio-C8、GP-C4、Bio-C4、GP-Phenyl、Generik-C18、Generik-C8、Generik-C4、Generik-Phenyl、PolyRP反相层析填料中的一种，PS/DVB基质填料为PolyRP反相层析填料，其粒径为5μm-60μm之间，上样用胡黄连苷Ⅰ粗品和胡黄连苷Ⅱ粗品重量与反相层析填料重量比为1∶100-1∶1200。
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