CN103239459A - 一种甾醇类衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

在本发明中公开了一种甾醇类衍生物，并提供了一种甾醇类衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途。甾醇类衍生物包括具有结构式(I)的甾醇类化合物、其药学上可接受的盐、含有所述甾醇类化合物的提取物、或者含有所述甾醇类化合物的组合物。结构式(I)如下：

其中，R₁为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₂为-OH、H、或C1-C3烷基；R₃为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₄为-OH、H、或C1-C3烷基，且R₁、R₂、R₃、R₄中的至少一个为-OH。该具有结构式(I)的化合物能够用以制备抗癌药物，且其所制备的抗癌药物的抗癌效果良好。

Description

一种甾醇类衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途

技术领域

本发明涉及制药领域，具体涉及一种甾醇类衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途。

背景技术

红曲(Monascus-fermented rice)是以大米为原料，经红曲霉(Monascus)发酵制成的一种紫红色米曲。红曲古代称丹曲，是将红曲霉为主的曲母或酒曲接种于米饭上发酵而成，其色赤红，故又名赤曲、红米、红大米、红糟，又因主产于福建等地.故又名福曲、福米等。

红曲是一味食疗兼备的传统中药。早在古代它已被广泛应用于食品着色、酿酒、发酵、中医中药方面。《饮膳正要》有红曲“味甘、平、无毒”“健脾、益气、温中”；《本草纲目》有“甘、温、无毒”，“治女人血痛及产后恶血不净，擂酒饮之良”；《本草衍义补遗》有“活血、消食、健脾暖胃、治赤白下痢、跌打损伤”等记载。

上世纪70年代，日本Endo教授首次从红色红曲霉(Monascus ruber)中分离出生理活性物质莫纳克林K(monacolin K)以来，众多国内外学者在红曲霉代谢产物中不断发现生理活性物质，包括monacolin类化合物，红曲色素，降压成分GABA及抗氧化成分dimerumic acid及最近分离的一些萜类化合物等等。随着现代生物化学与药理学的发展，红曲的降压，降糖，抗肥胖，防治老年痴呆及骨质疏松等功效不断被挖掘。从而使传统的红曲增添了新的内涵。但是由于红曲中成分繁多，人们对红曲中各成分发挥怎样的功效还了解甚少，这在一定程度上限制了红曲的科学使用，阻碍了红曲的广泛应用。

发明内容

本发明从红曲制备物中成功分离得到了一种具有结构式(I)的甾醇类化合物，并提供了一种甾醇类衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途，甾醇类衍生物包括具有结构式(I)的甾醇类化合物、其药学上可接受的盐、含有所述甾醇类化合物的提取物、或者含有所述甾醇类化合物的组合物，所述结构式(I)如下：

(I)

其中，R₁为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₂为-OH、H、或C1-C3烷基；R₃为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₄为-OH、H、或C1-C3烷基，且R₁、R₂、R₃、R₄中的至少一个为-OH。

进一步地，上述甾醇类化合物具有结构式(II)，所述结构式(II)如下：

进一步地，上述甾醇类化合物的制备方法包括以下步骤：取红曲制备物，加入溶剂后进行超声提取，并将提取液减压浓缩得精提物；将所述精提物进行硅胶柱色谱分离，分离过程中采用石油醚和乙酸乙酯对所述精提物进行梯度洗脱，梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为75∶25、50∶50～25∶75、0∶100；取石油醚和乙酸乙酯的体积比为50∶50～25∶75时所得到的洗脱液，以体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液为流动相进行sephadex LH-20凝胶柱层析，经TLC追踪检测合并相同的部分，得到6个部分流分；对第4部分流分进行柱色谱分离，色谱柱为C18反相硅胶柱，流动相为体积比为75∶25甲醇和水混合液，经TLC检测，去除杂质带后收集得到甾醇类化合物。

进一步地，上述制备方法进一步包括：对甾醇类化合物进行硅胶柱纯化处理，用体积比为20∶20∶1的二氯甲烷、乙酸乙酯及甲醇的混合液进行洗脱，去除杂质带后收集得到纯化后的甾醇类化合物。

进一步地，上述超声提取过程中的溶剂为石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，甲醇、或正己烷中的一种或几种，体积为红曲制备物的2-6倍；且/或超声提取过程中提取次数为2-6次，每次的时间为20-40mm；且/或梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为75∶25、50∶50、25∶75、0∶100；取石油醚和乙酸乙酯的体积比为25∶75时所得到的洗脱液进行sephadexLH-20凝胶柱层析。

进一步地，上述提取物为红曲制备物的提取物。

进一步地，上述提取物包括：(1)上述甾醇类化合物的制备方法中梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比为50∶50～25∶75时所得到的洗脱液；(2)上述甾醇类化合物的制备方法中TLC追踪检测过程中得到的第4部分流分；(3)上述甾醇类化合物的制备方法中TLC检测去除杂质带后收集得到甾醇类化合物；或者(4)上述甾醇类化合物的制备方法中纯化后的甾醇类化合物。

进一步地，上述组合物包含甾醇类化合物、和/或提取物；以及可选地药学上可接受的载体或辅料。

进一步地，上述抗癌药物为抗肝癌药物和抗淋巴瘤药物。

同时，在本发明中还提供了一种体外或体内抑制癌症细胞的方法，包括用癌症抑制剂抑制癌症细胞，癌症细胞抑制剂包括甾醇类衍生物包括具有结构式(I)的甾醇类化合物、其药学上可接受的盐、含有甾醇类化合物的提取物、或者含有甾醇类化合物的组合物，癌症细胞为肝癌细胞或者淋巴瘤细胞。

本发明的有益效果：本发明成功地从红曲制备物中分离得到了一种化合物，该化合物具有结构式(I)中的结构，能够有效地抑制癌细胞(肿瘤细胞)的增殖，且抑制作用且呈浓度-效应关系；从而具有作为预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物的潜力。

附图说明

说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的紫外光谱图；

图2示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的红外光谱图；

图3示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的高分辨质谱图；

图4示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的氢谱图；

图5示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的碳谱图；

图6示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的DEPT信号图；

图7示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的HSQC相关信号图；

图8示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物的HMBC相关信号图；

图9示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株H22细胞生长的抑制作用曲线；

图10示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株HepG2细胞生长的抑制作用曲线；

图11示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肉瘤细胞株S180细胞生长的抑制作用曲线；

图12示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞生长的抑制作用曲线；

图13示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对人单核淋巴瘤细胞THP1细胞生长的抑制作用曲线；以及

图14示出了实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对人组织淋巴瘤细胞U937细胞生长的抑制作用曲线。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

在本发明的一种典型的实施方式中，提供了一种具有结构式(I)的甾醇类化合物或其药学上可接受的盐，结构式(I)如下：

其中，R₁为-OH、＝O(羰基)、H、或C1-C3烷基；R₂为-OH、H、或C1-C3烷基；R₃为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₄为-OH、H、或C1-C3烷基；且R₁、R₂、R₃、R₄中的至少一个为-OH。本发明中，术语“C1-C3烷基”包括甲基、乙基、丙基或异丙基。

优选地，上述甾醇类化合物具有结构式(II)，结构式(II)如下：

经长期研究，发明人从红曲制备物中提取出了具有上述结构式(I)的化合物。本申请中所指“红曲制备物”是指含有红曲的组合物、混合物等，本领域技术人员能够根据物质的成分合理地分析出是否可以作为红曲制备物使用。例如北京北大维信生物科技有限公司生产的血脂康胶囊、市售的红曲粉、以及市售的红曲冻干粉等均可用作红曲制备物。本发明从上述红曲制备物中得到的化合物为一种全新化合物，该结构式中具有甾醇类化合物母核，不饱和键以及双氧桥环状结构，此化合物在红曲提取物中并未见到相关报道。并且发明人对此类化合物的活性进行了进一步研究，惊喜地发现其具有抗癌作用，特别是抗肝癌和淋巴瘤作用。

在本发明的一种典型的实施方式中，上述化合物的制备方法，包括以下步骤：取红曲制备物，加入溶剂后进行超声提取，并将提取液减压浓缩得精提物。将精提物进行硅胶柱色谱分离，柱色谱分离过程中采用石油醚和乙酸乙酯对精提物进行梯度洗脱，梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为75∶25、50∶50～25∶75、0∶100，取石油醚和乙酸乙酯的体积比为50∶50～25∶75时所得到的洗脱液，优选地，梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为75∶25、50∶50、25∶75、0∶100，取石油醚和乙酸乙酯的体积比为25∶75时所得到的洗脱液，以体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液为流动相进行sephadex LH-20柱层析，经TLC追踪检测合并相同的部分，得到6个部分流分。对第4部分流分进行柱色谱分离，色谱柱为C18反相硅胶柱，流动相为体积比为75∶25甲醇和水混合液，经TLC检测，去除杂质带后收集得到甾醇类化合物。TLC检测条件为正相硅胶板∶展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇＝8∶8∶1时Rf值约为0.3，该甾醇类化合物的Rf值约为0.3，收集该Rf值的流分即得到该甾醇类化合物。

优选地，上述制备方法中对甾醇类化合物进行硅胶柱纯化处理，用体积比为20∶20∶1的二氯甲烷、乙酸乙酯及甲醇的混合液进行洗脱，去除杂质带后收集得到纯化后的所述甾醇类化合物。

优选地，上述制备方法的超声提取过程中的溶剂为石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，甲醇、或正己烷中的一种或几种，更为优选地为正己烷。所使用溶剂的体积为红曲制备物的2-6倍。优选地，上述超声提取过程中提取次数为2-6次，每次的时间为20-40min。在该范围内能够合理地兼顾时间与产物含量。

本发明所提供的上述具有结构式(I)的甾醇类化合物除了通过上述提取方法制备以外，还可以通过有机合成的方法制备，本领域技术人员在本发明的教导下，有能力根据现有甾醇类化合物的人工合成方法，制备得出具有结构式(I)的甾醇类化合物。由于该合成方法为本领域的常规方法，在此不再赘述。

在本发明的一种典型的实施方式中，还提供了一种提取物，该提取物包含上述具有结构式(I)的甾醇类化合物。

优选地，该提取物为红曲制备物的提取物。

优选地，该提取物包括：(1)制备具有结构式(I)的甾醇类化合物的梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比为50∶50～25∶75时所得到的洗脱液；(2)制备具有结构式(I)的甾醇类化合物的TLC追踪检测过程中得到的第4部分流分；(3)制备具有结构式(I)的甾醇类化合物的TLC检测去除杂质带后收集得到甾醇类化合物；或者(4)制备具有结构式(I)的甾醇类化合物的纯化后的甾醇类化合物。

在本发明的一种典型的实施方式中，还提供了一种组合物，其包含上述甾醇类化合物、和/或上述提取物；可选地，还包括药学上可接受的载体或辅料。

通常本发明药物组合物含有0.1-90重量％的具有结构式(I)或结构式(II)甾醇类化合物和/或其药学上可接受的盐，或者上述提取物。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将上述甾醇类化合物和/或立体异构体与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用适当的施用形式或剂量形式。

本发明的具有结构式(I)或结构式(II)化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分式具有结构(I)的化合物或其立体异构体与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分的具有结构(I)的化合物或其立体异构体制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明具有结构式(I)或结构式(II)甾醇类化合物，或其可药用盐的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

对组合物而言，可通过改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

当用于上述治疗和/或预防或辅助治疗时，治疗和/或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明具有结构式(I)的化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天，例如介于0.01-100mg/kg体重/天，例如介于0.01-10mg/kg体重/天。

在本发明的一种典型的实施方式中，还提供了一种上述甾醇类化合物或者提取物或者组合物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途；具体地，所述癌症为肝癌或淋巴瘤。

在本发明的一种典型实施方式中，还提供了一种体外或体内抑制癌症细胞的方法，包括用癌症抑制剂抑制所述癌症细胞，癌症细胞抑制剂包括甾醇类衍生物，甾醇类衍生物包括具有结构式(I)的甾醇类化合物、其药学上可接受的盐、含有甾醇类化合物的提取物、或者含有甾醇类化合物的组合物，癌症细胞为肝癌细胞或者淋巴瘤细胞。

以下将结合实施例1具体说明本发明所提供的具有结构式(I)的甾醇类化合物的抗癌效果。

实施例1：

原料：北京北大维信生物科技有限公司生产的血脂康胶囊内装物2kg。

实施例2：

原料：市售红曲粉。

一、采用实施例1和2中原料制备具有结构式(II)的甾醇类化合物的方法：

1)取血脂康胶囊内装物2kg或红曲粉约3kg，以2-6倍体积的正己烷为溶剂超声提取3次，每次20-40分钟，合并提取液，减压浓缩得正己烷精提物84g。

2)取正己烷精提物50g，上硅胶柱色谱分离，用石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱。石油醚-乙酸乙酯的体积比依次为75∶25、50∶50、25∶75、0∶100。

3)取石油醚-乙酸乙酯为25∶75洗脱得到的提取物3.0g，旋蒸减压浓缩的油状物。用微量二氯甲烷∶甲醇＝1∶1溶解之后，上柱，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)为流动相，进行sephadex LH-20凝胶柱层析，共接收了120个流分，每流分为5mL。经TLC检测合并相同的部分，得到6个部分。分别为1-50；51-75；76-80；81-93；94-110；111-120流分。取第4个部分81-93流分1.55g，旋蒸减压浓缩的油状物，用微量100％甲醇溶解之后，上C18反相硅胶柱，用甲醇-水(75∶25)洗脱，根据TLC检测结果，收集含该化合物的流分，干燥浓缩得到该甾醇类化合物。TLC检测条件为正相硅胶板∶展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇＝8∶8∶1，该甾醇类化合物的Rf值约为0.3，收集该Rf值的流分即得到该甾醇类化合物。为了进一步纯化此化合物，可进一步通过硅胶柱层析纯化、用二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇(20∶20∶1)洗脱，即可得到纯化后的化合物5mg。

二、实施例1和2所制备的化合物结构鉴定方法为：

1.化合物的理化数据

实施例1和2所制备的化合物为无色油状物，其旋光度为[α]²⁵ _D-21.59(c 0.082，CH₂Cl₂∶MeOH＝1∶1)。由图1所示，实施例1所制备的化合物的UV光谱中有最大吸收峰λ_max(CH₂Cl₂∶MeOH)为228.40nm。由图2所示，实施例1所制备的化合物的FT-IR(KBr，cm^-1)光谱：3391(-OH)，2971，2932(饱和碳氢)，1722(C＝C)，1456，1378(偕二甲基)，1043，945(-O-O-)。

2.实施例1和2所制备的化合物分子式的确定

如图3所示，FT-ICR-MS给出的m/z 493.31596[M+H]⁺(calcd.493.31665，err 0.69)，推断为该化合物的分子量为492.31。如图4中¹H-NMR图和图5中¹³C-NMR图所示，共有40个氢信号和28个碳信号。从图7DEPT信号图显示，有6个季碳，10个CH，6个CH₂及6个CH₃。在图5中¹³C-NMR图中，136.9ppm(C-6)和131.8ppm(C-7)处的两个烯碳信号表明，该化合物有一个双键。结合图6HSQC相关信号图与图5¹³C-NMR图分析，67.2ppm，83.8ppm，80.2ppm，84.6ppm，81.0ppm，85.8ppm，73.3ppm，75.6ppm处，存在与氧原子相连的8个碳。结合分子量和图4¹H-NMR图、图5¹³C-NMR图及图6DEPT信号图，如果该化合物拥有8个氧原子的话分子量超过492.31，由此推断该化合物具有7个氧原子和未体现氢谱信号的4个氢原子。从而可以判断上述7个氧原子中，4个氧原子归属为4个羟基，其余3个氧原子以非羟基形式存在。根据上述分析，可以确定该分子中有28个碳原子，44个氢原子及7个氧原子，分子式为C₂₈H₄₄O₇。

3.实施例1和2所制备的化合物结构式的确定：

分析该化合物的碳谱(¹³C-NMR及DEPT)，有28个碳原子并其中6个碳为甲基及2个烯碳。并且，如图1中该化合物的紫外光谱图所示，其与麦角甾醇过氧化物的紫外光谱图非常接近，初步推断该化合物具有麦角甾醇过氧化物的骨架及-O-O-过氧化部分。由此可以得出，3个非羟基氧原子中2个氧原子归属于-O-O-。图7HSQC相关信号图与图8HMBC相关信号图相结合分析，与氧原子相连的8个碳，分别归属为4个羟基相连的4个碳(67.2，73.3，75.6及81.0ppm)、与-O-O-相连的2个碳(80.2和83.8ppm)及第7个氧原子相连的2个碳(84.6和85.8ppm)。从分子式可以计算得其不饱和度为7。从而可以推断：该化合物除了1个双键和过氧化甾醇骨架5个环的6个不饱和处外，还有一个不饱和处而且此处只能是一个环，由此可以判断该环是由第7个氧原子为中心，由C-16(84.6ppm)，C-17(68.5ppm)，C-20(81.0ppm)及C-22(85.8ppm)4个碳原子组成的5元环。这不但满足不饱和度，而且还满足与氧原子相连的碳原子数。进一步分析质谱分析系统给出的分子量及上述分子式，证实了上述分析。综合上述分析可推测该化合物为：5，8-环二氧-16，22-环氧麦角甾-5，7-二烯-3，20，23，25-四醇。

4.实施例1和2所制备的化合物的结构式如下：

三、实施例1所制备的化合物的抗癌效果数据：

1实验材料

1.1细胞株

H22购于韩国细胞株银行，首尔，韩国。

S180，HepG-2，YAC-1，Thp1，U937及B16-F10购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2药品

实施例1和2所制备的具有结构式(II)的化合物。

1.3试剂

MTT为购于Amresco公司；RPMI1640和双抗购于Sigma公司；胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；其它试剂均为国产分析纯。

2实验方法

取对数生长期的癌细胞，以2×10⁴个/孔，接种于96孔培养板，加入药物至药物终浓度为：500，250，125，62.5，31.25，15.625及7.8125μg/mL，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养72h后加入MTT 10μL/孔，于37℃避光孵育4h，去除培养液，加入150μLDMSO或酸化异丙醇，振荡5min后，于570nm波长测定OD值。重复3次，设空白对照。各种细胞株所用培养基都相同，均为含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)的RPMI1640培养基。

3细胞存活率计算公式

细胞存活率＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％。

4实施例1所制备的化合物的体外抗癌(肝癌及淋巴瘤)活性

4.1体外抗肝癌活性

4.1.1小鼠肝癌细胞株H22

图9为实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株H22细胞生长的抑制作用曲线。由图9可以看出，采用实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株H22进行体外抗癌(肝癌)活性测试时，该具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株H22的生长有抑制作用，且呈浓度-效应关系。其IC₅₀值约为200μg/mL，表明对小鼠肝癌细胞增殖有较好的抑制作用。

4.1.2小鼠肝癌细胞株HepG2

图10为实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株HepG2细胞生长的抑制作用曲线。由图10可以看出，采用实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株HepG2进行体外抗癌(肝癌)活性测试时，该具有结构式(II)的化合物对小鼠肝癌细胞株HepG2的生长有抑制作用，且呈浓度-效应关系。其IC₅₀值约为400μg/mL，表明对小鼠肝癌细胞增殖有较好的抑制作用。

4.1.3小鼠肉瘤细胞株S180(肝组织中生长的肉瘤)

图11为实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肉瘤细胞株S180细胞生长的抑制作用曲线。由图11可以看出，采用实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠肉瘤细胞株S180进行体外抗癌(小鼠肉瘤)活性测试时，该具有结构式(II)的化合物对小鼠肉瘤细胞株S180的生长有抑制作用，且呈浓度-效应关系。其IC₅₀值约为460μg/mL，表明对小鼠肉瘤细胞增殖有较好的抑制作用。

4.2体外抗淋巴瘤活性

4.2.1小鼠淋巴瘤细胞YAC-1

图12为实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞生长的抑制作用曲线。由图12可以看出，采用实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对小鼠淋巴瘤细胞YAC-1进行体外抗癌(淋巴瘤)活性测试时，该具有结构式(II)的化合物对小鼠淋巴瘤细胞YAC-1的生长有抑制作用，且呈浓度-效应关系。其IC₅₀值约为350μg/mL，表明对小鼠淋巴瘤细胞增殖有较好的抑制作用。

4.2.2人单核淋巴瘤细胞THP1

图13为实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对人单核淋巴瘤细胞THP1细胞生长的抑制作用曲线。由图13可以看出，采用实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对人单核淋巴瘤细胞THP1进行体外抗癌(淋巴瘤)活性测试时，该具有结构式(II)的化合物对人单核淋巴瘤细胞THP1的生长有抑制作用，且呈浓度-效应关系。其IC₅₀值约为400μg/mL，表明对人单核淋巴瘤细胞增殖有较好的抑制作用。

4.2.3人组织淋巴瘤细胞U937

图14为实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对人组织淋巴瘤细胞U937细胞生长的抑制作用曲线。由图14可以看出，采用实施例1所制备的具有结构式(II)的化合物对人组织淋巴瘤细胞U937进行体外抗癌(淋巴瘤)活性测试时，该具有结构式(II)的化合物对人组织淋巴瘤细胞U937的生长有抑制作用，且呈浓度-效应关系。其IC₅₀值约为320μg/mL，表明对人组织淋巴瘤细胞增殖有较好的抑制作用。

由上述测试结果可见，本申请通过从红曲制备物中提取得到具有结构式(I)的化合物，此化合物的结构式并未见到相关报道，为新化合物。经过相关实验研究发现，此化合物具有抗癌作用，为制备抗癌药物，特别是抗肝癌药物、抗淋巴瘤药物提供了一种全新的化合物，这无疑是广大癌症患者的福音。

虽然本申请仅对实施例1提供的化合物制备方法，及抗癌效果进行了详细描述，并未对每一种具有结构式(I)化合物的制备方法及涵盖作用进行描述，但是基于相似结构化合物具有相似性能的原理，本领域技术人员完全能够了解其他化合物的制备方法及其具有的抗癌作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甾醇类衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物中的用途，其特征在于，所述甾醇类衍生物包括具有结构式(I)的甾醇类化合物、其药学上可接受的盐、含有所述甾醇类化合物的提取物、或者含有所述甾醇类化合物的组合物，

所述结构式(I)如下：

其中，R₁为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₂为-OH、H、或C1-C3烷基；R₃为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₄为-OH、H、或C1-C3烷基，且R₁、R₂、R₃、R₄中的至少一个为-OH。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甾醇类化合物具有结构式(II)，所述结构式(II)如下：

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述甾醇类化合物的制备方法包括以下步骤：

取红曲制备物，加入溶剂后进行超声提取，并将提取液减压浓缩得精提物；

将所述精提物进行硅胶柱色谱分离，分离过程中采用石油醚和乙酸乙酯对所述精提物进行梯度洗脱，梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为75∶25、50∶50～25∶75、0∶100；

取石油醚和乙酸乙酯的体积比为50∶50～25∶75时所得到的洗脱液，以体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇的混合液为流动相进行sephadex LH-20凝胶柱层析，经TLC追踪检测合并相同的部分，得到6个部分流分；

对第4部分流分进行柱色谱分离，色谱柱为C18反相硅胶柱，流动相为体积比为75∶25甲醇和水混合液，经TLC检测，去除杂质带后收集得到所述甾醇类化合物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述制备方法进一步包括：

对所述甾醇类化合物进行硅胶柱纯化处理，用体积比为20∶20∶1的二氯甲烷、乙酸乙酯及甲醇的混合液进行洗脱，去除杂质带后收集得到纯化后的所述甾醇类化合物。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述超声提取过程中的溶剂为石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，甲醇、或正己烷中的一种或几种，体积为所述红曲制备物的2-6倍；且/或所述超声提取过程中提取次数为2-6次，每次的时间为20-40min；且/或梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为75∶25、50∶50、25∶75、0∶100；取石油醚和乙酸乙酯的体积比为25∶75时所得到的洗脱液进行sephadex LH-20凝胶柱层析。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述提取物为红曲制备物的提取物。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的提取物包括：

(1)权利要求3中梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比为50∶50～25∶75时所得到的洗脱液；或者

(2)权利要求3中TLC追踪检测过程中得到的第4部分流分；或者

(3)权利要求3中TLC检测去除杂质带后收集得到所述甾醇类化合物；或者

(4)权利要求4中纯化后的所述甾醇类化合物。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物包含所述甾醇类化合物、和/或所述提取物；以及可选地药学上可接受的载体或辅料。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗癌药物为抗肝癌药物和抗淋巴瘤药物。

10.一种体外或体内抑制癌症细胞的方法，包括用癌症抑制剂抑制所述癌症细胞，其特征在于，所述癌症细胞抑制剂包括甾醇类衍生物，所述甾醇类衍生物包括具有结构式(I)的甾醇类化合物、其药学上可接受的盐、含有所述甾醇类化合物的提取物、或者含有所述甾醇类化合物的组合物，

所述结构式(I)如下：

其中，R₁为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₂为-OH、H、或C1-C3烷基；R₃为-OH、＝O、H、或C1-C3烷基；R₄为-OH、H、或C1-C3烷基，且R₁、R₂、R₃、R₄中的至少一个为-OH；

所述癌症细胞为肝癌细胞或者淋巴瘤细胞。

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