CN102382156A - 一种地黄苷d标准物质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从中药地黄中提取得到的地黄苷D标准物质及其制备方法。地黄苷D标准物质可由溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、柱色谱法、液-液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备。所制得的地黄苷D标准物质纯度为98～100％(w/w)。

Description

一种地黄苷D标准物质的制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从中药地黄中分离制备地黄苷D标准物质的方法及其质量评价方法。

背景技术

地黄来源于玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根，2010年版《中国药典》一部的成方制剂中有近二百种(194种)选用了地黄，是一种常用大宗中药材。作为我国著名的“四大怀药”道地药材之一，地黄是药用价值很高的滋阴补血类中药，活性作用十分广泛，对免疫、血液、内分泌、心脑血管、神经系统及抗菌、抗炎等方面均有一定的作用。在临床上有鲜用、生用和熟用的不同。鲜地黄与生地黄在性味上有寒与凉之分，鲜地黄的清热生津、止血之功效均胜于生地黄，多用于瘟病伤阴、高热烦渴、吐血、咳血等症，而熟地黄在加工方法上与鲜、生地黄完全不同，所记载的主治功能有更大的区别，主要用于补血、补肾养阴^[1]。

地黄中主要含有环烯醚萜苷类化学成分，药理研究表明环烯醚萜苷类成分为其主要活性成分。

现已从鲜地黄、生地黄、熟地黄、地黄愈伤组织、地黄叶及有病害的地黄中，已分离鉴定了环烯醚萜苷类24个：梓醇、乙酰梓醇、地黄苷A、地黄苷B、jioglutosideA、二氢梓醇、二氢马鞭草苷、8-表番木鳖酸、京尼平苷、jioglutoside B、桃叶珊瑚苷、单蜜力特苷、蜜力特苷、地黄苷D、筋骨草醇、6-O-E-feruloyl ajugol、6-O-P-coumaroyl ajugol、6-O-Z-feruloyl ajugol、6-O-P-hydroxybenzoateajugol、6-O-vanillate ajugol、地黄苷C、氯化梓醇、6-O-(4″-O-α-L-rhamnopyranosyl vanilloyl ajugol和筋骨草苷。非苷环烯醚萜类11个：焦地黄素A、焦地黄素B、焦地黄素C、焦地黄素D、焦地黄素E、地黄素A、地黄素B、地黄素C、地黄素D、焦地黄内酯、焦地黄呋喃。通过比较其来源发现，环烯醚萜类化合物在鲜地黄中均不存在，而是在生地黄和熟地黄中才出现的，说明在加工炮制过程中某些环烯醚萜苷类化合物脱去糖基而发生了一系列的化学变化^[2]。

地黄现有标准品梓醇系我们在国家七五期间及河南省自然基金课题研究成果，已经推广应用于地黄药材。我们^[3]曾对梓醇成分进行分离制备，研究发现但其热稳定性较差，从鲜品加工成生地黄及熟地黄，梓醇的含量降低至原来的1/10。

北川勋^[4]等曾研究了地黄苷成分，发现地黄苷D系三糖苷较稳定，生地、熟地均有较高的含量，经加工炮制过程几乎不分解。

于震^[5]等对地黄苷D进行了滋阴、补血和降血糖作用的实验研究，研究发现：地黄苷D可以使阴虚模型小鼠体重明显增加，血浆cAMP含量明显降低；地黄苷D可以明显升高血虚模型小鼠白细胞数、血小板数、网织红细胞数和骨髓DNA含量和体重；地黄苷D具有降低糖尿病模型小鼠血糖的趋势。

地黄苷D的药效学作用亦与中医传统用药相符合，含量均较高而且比较稳定，比较适宜作为地黄药材及制剂中地黄的质量控制标准物质，同时该成分本身具有比较大的药用价值和较好的应用前景。迄今，未见涉及地黄苷D标准物质制备及其质量评价方法的专利报道。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：115.

[2]刘彦飞，赵宇，武卫红，等.地黄的化学成分及其在加工炮制过程中的变化[J].国外医药·植物药分册，2007，22(3)102-108.

[3]李更生，王慧森，都恒青，等.液相层析法制备地黄活性成分梓醇[J].中成药，1998，20(6)：36.

[4]北川勋，西村正，古林安见子.怀庆地黄根茎の成分，药学杂志[日本]，1971，2001，91(5)：593.

[5]于震，王军，李更生，等.地黄甙D滋阴补血和降血糖作用的实验研究[J].辽宁中医杂志，2001，28(4)：240.

发明内容

本发明的目的在于提供一种地黄苷D标准物质的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种地黄苷D标准物质的质量评价方法。

本发明所述的地黄苷D标准物质系从中药地黄中提取分离得到。其结构如下：

本发明所述的地黄苷D标准物质系为黄白色粉末，分子式为C₂₇H₄₂O₂₀，分子量为，熔点196.5～197.2℃，可溶于水、甲醇、乙醇，难溶于氯仿、丙酮。香草醛一浓硫酸显紫棕色，Molish反应为阳性，UV最大吸收：205nm，IR(KBr)cm^-13380(s)、2900(m)、有不饱和氢，1650(m)、1420(m)、有双键氢1240(m)、1080(s)、1050(s)等。¹HNMR δ(D₂O)4.85(2H、d、J＝6Hz、1′，1″H)，4.95(1H、d、J＝6Hz、1′″H)糖上的端基氢质子信号5.30(1H、d、J＝6Hz、1-H)，5.43(1H、d、J＝6Hz、4-H)，5.90(1H、brs、7-H)，6.57(1H、d、J＝6Hz、3-H)环烯醚萜苷母核上的氢质子信号，与文献一致。其¹³C-NMRδ(D₂0)值95.9(1-C)为环烯醚萜苷母核上1位碳信号，144.7(3-C)，104.3(4-C)为3，4位不饱和碳81.3(5-C)，80.4(6-C)，127.9(7-C)，144.0(8-C)为7，8位不饱和碳51.4(9-C)，59.9(10-C)，98.4(1′-C)为糖上1′位的端基碳信号73.0(2′-C)，76.3(3′-C)，69.6(4′-C)，75.9(5′-C)，60.7(6′-C)，96.2(1′′-C)，为糖上1″位的端基碳信号80.1(2″-C)，76.2(3″-C)，69.4(4″-C)，75.7(5″-C)，61.1(6″-C)，102.8(1′″-C)为糖上1′″位的端基碳信号，74.1(2′″-C)，76.5(3′″-C)，69.8(4′″-C)，75.9(5′″-C)，60.6(6′″-C)与Haruh Oshio等报道的rehmannioside D文献数据一致(Haruji Oshio，Hiroyuki Inouye.Iridoid Glycosides of Rehmannia Glutinosa.Phytochemistry 1981；21(1)：133-138)。

本发明所述的地黄苷D标准物质，HPLC法或DSC法测定纯度为98～100％(w/w)。

本发明还提出来所述地黄苷D标准物质制备工艺，它可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备：(1)溶剂提取法；(2)溶剂萃取法；(3)大孔吸附树脂法；(4)柱色谱法；(5)液-液逆流分配色谱法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下步骤：

(1)提取：提取原料中可以采用无氧条件下加热或直接用水蒸气热处理或拌入碳酸钙或氢氧化钡，用来抑制酶的活性和中和植物酸，也可以不灭活直接提取；所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及脂类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂；提取方法可以是浸渍、渗滤、煎煮、回流提取、连续回流提取、超声波提取、微波辅助提取、酶法提取等。

优选的提取工艺为：地黄药材净选后切片，加含0.5％碳酸钙的30％～90％乙醇或甲醇溶液，回流提取2～3次，每次提取1～2小时，溶剂用量为6～12倍量(L/kg)。

(2)除杂：使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合：醇沉剂、各种树脂、101果汁澄清剂、甲壳素类(如壳聚糖)、ZTC天然澄清剂、明胶、鞣酸等。

(3)过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法。

(4)浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等。

(5)干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

当采用溶剂萃取法进行制备时，一般先将提取物混悬于水中，然后用亲脂性有机溶剂(如不同沸程的石油醚、乙醚、己烷等)萃取除去脂溶性杂质，然后用适宜溶剂(如三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等)或这些溶剂的混合物，萃取获得其中的地黄环烯醚萜总苷。

当采用大孔吸附树脂法进行制备时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性等任何一种类型，如D101、DA-201、D301、HPD400、AB-8、S-8、XAD-2等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如D101、AB-8、HPD400等，所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇等。

优选的地黄苷D标准物质树脂纯化工艺为：选用AB-8、HPD400、D 101等中等极性、弱极性或非极性大孔吸附树脂作为纯化树脂，地黄甲醇提取物上样液浓度0.1～1.0g/mL，吸附流速1～6BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，0～20％乙醇洗脱1～4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1～6BV/h，用20％～90％乙醇洗脱3～6倍树脂体积进行解吸，解吸流速为1～6BV/h。

当采用柱色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法初步纯化后的产物，所用的固定相可以是硅胶、氧化铝、聚酰胺、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex LH-20系列)、C-8、C-18、活性碳、纤维素等，所用的洗脱液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等组成的混合溶剂。

当采用液-液逆流分配色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法初步纯化后的产物。一般先将提取物混悬于水中，然后用亲脂性有机溶剂(如不同沸程的石油醚、乙醚、己烷等)萃取除去脂溶性杂质，然后用适宜溶剂(如三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等)或这些溶剂的混合物，萃取获得其中的地黄环烯醚萜总苷，进一步得到地黄苷D标准物质。

该提取物具有滋阴、补血和降血糖的作用，可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、酒剂、注射剂、饮料等。

本发明质量评价方法可以包括以下含量测定方法的任一种。

1、高效液相色谱(HPLC)法

色谱条件：色谱柱：YWG-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(2∶98)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：203nm；柱温：30℃。

测定结果：采用归一化法，计算地黄苷D标准物质纯度。

2、差示扫描量热(DSC)法

仪器：pyris I型差示量热扫描仪。

操作方法：升温速率：5℃·min^-1；起始平衡温度：50℃；终止温度：300℃。

准确称取地黄苷D标准物质约4mg于铝制坩埚内，使样品尽可能平铺在坩埚的底部，压紧，将死体积减至最小。用冲压模将坩埚密封，放入量热池内进行实验。

测定：设置升温程序后，开始测定，记录样品的熔化曲线，利用计算机分析程序进行数据分析。

本发明在国家自然科学基金(基金号：30873442)和河南省自然科学基金项目(编号：0511043800)资助下完成。

附图说明：

图1为地黄苷D标准物质¹HNMR谱

图2为地黄苷D标准物质¹³CNMR谱

具体实施方式

用以下的实施例对本发明作具体说明，但本发明并不局限于下列实施例包含的内容。

实施例1

(1)环烯醚萜总苷的提取

取鲜地黄块根2Kg，净选，切薄片，加0.5％碳酸钙拌匀，用甲醇16L回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收甲醇，得甲醇提取浸膏约400g。取甲醇提取浸膏加500mL水稀释，加入大量乙醚脱脂，水层继用正丁醇提取3次，每次500mL，合并正丁醇提取物，减压回收正丁醇，加少量水溶解，滤除不溶物，水液通过硅藻土和活性炭的混合柱脱色，继通过D101大孔吸附树脂柱

吸附，以水5000mL洗脱，弃去水液，再用50％乙醇3000mL洗脱，合并洗脱液，减压浓缩至干，得地黄环烯醚萜总苷。

(2)地黄苷D粗分离制备

取1Kg柱层析用硅胶H(粒度160目)置烘箱中，控制温度105℃以下，2～3小时后取出放置室温备用。

将处理好的硅胶H，用石油醚调成浆状，排出空气一次性装入层析柱中，启动低压泵以20～22mL/min流量的石油醚冲柱0.5小时，然后补加部分硅胶H，重新启动低压泵，冲柱1小时至硅胶层不再下沉为止。将地黄环烯醚萜总苷用洗脱液溶解后，加入适量薄层硅胶H，搅匀，赶出气泡，置入柱顶，压实。启动低压泵，依次以石油醚、乙酸乙酯-乙醇(8∶2)、乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶0.5)为洗脱液梯度洗脱，收集洗脱液200mL/份，进行薄层检查，合并含地黄苷D的组分，减压回收溶剂并浓缩至干，得淡棕色粉末，即地黄苷D粗品。

(3)地黄苷D的纯化

将样品用12％甲醇溶液(v/v)溶解，进行中压液相仪制备，每次进样180mg，以甲醇-水(12∶88)为洗脱剂，流速20～24mL/min，纸速1～2格/min双波长配合TLC检测，收集25mL/份，分离得到地黄苷D收集部分，减压浓缩至近干，加50％甲醇(1∶1)溶解，0.45μm的滤膜过滤，备用。

在室温下，将Sephadex LH-20葡聚糖凝胶溶胀于50％甲醇溶剂中24小时，使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75％，上层溶剂占25％，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内

1.2ba压力下装柱，平衡后加入样品溶液，50％甲醇洗脱，线性流速为5cm/h。收集地黄苷D成分，减压浓缩，真空干燥，得黄白色粉末。HPLC法测定地黄苷D纯度为99.17％，DSC法测定地黄苷D纯度为98.53％。

实施例2

(1)环烯醚萜总苷的提取

取鲜地黄块根2Kg，净选，切薄片，加甲醇12L回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，减压回收甲醇，得甲醇提取浸膏约380g。取甲醇提取浸膏加500mL水稀释，加入大量乙醚脱脂，水层继用正丁醇提取3次，每次500mL，合并正丁醇提取物，减压回收正丁醇，加少量水溶解，滤除不溶物，水液通过硅藻土和活性炭的混合柱脱色，继通过D101大孔吸附树脂柱

以水5000mL洗脱，弃去水液，再用50％乙醇3000mL洗脱，合并洗脱液，减压浓缩至干，得地黄环烯醚萜总苷。

(2)地黄苷D粗分离制备

取1Kg柱层析用硅胶H(粒度240目)置烘箱中，控制温度105℃以下，2～3小时后取出放置室温备用。

将处理好的硅胶H，用石油醚调成浆状，排出空气一次性装入层析柱中，启动低压泵以20～22mL/min流量的石油醚冲柱0.5小时，然后补加部分硅胶H，重新启动低压泵，冲柱1小时至硅胶层不再下沉为止。将地黄环烯醚萜总苷用洗脱液溶解后，加入适量薄层硅胶H，搅匀，赶出气泡，置入柱顶，压实。启动低压泵，依次以石油醚、乙酸乙酯-乙醇(8∶2)、乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶0.5)为洗脱液梯度洗脱，收集洗脱液200mL/份，进行薄层检查，含地黄苷D的组分合并，减压回收溶剂并浓缩至干，得淡棕色粉末，即地黄苷D粗品。

(3)地黄苷D的纯化

将样品用20％甲醇溶液(v/v)溶解，进行中压液相仪制备，每次进样180mg，以甲醇-水(20∶80)为洗脱剂，流速20～24mL/min，纸速1～2格/min双波长配合TLC检测，收集25mL/份，分离得到地黄苷D收集部分，减压浓缩至近干，加甲醇(1∶1.2)溶解，0.45μm的滤膜过滤，备用。

在室温下，将Sephadex LH-20葡聚糖凝胶溶胀于甲醇溶剂中24小时，使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75％，上层溶剂占25％，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内

1.2ba压力下装柱，平衡后加入样品溶液，50％甲醇洗脱，线性流速为8cm/h。收集地黄苷D成分，减压浓缩，真空干燥，得黄白色粉末。HPLC法测定地黄苷D纯度为99.35％，DSC法测定地黄苷D纯度为98.26％。

实施例3

(1)环烯醚萜总苷的提取

取鲜地黄块根2Kg，净选，切成厚度为1～2mm的薄片，立即将其加热至40～50℃，保温100～120min；或直接用水蒸气热处理90min，加乙醇2L以5000rpm转速匀浆15min，常规过滤匀浆液，残渣加50％乙醇16L室温浸渍3次，合并匀浆滤液和浸渍液，减压浓缩近干，加500mL水稀释，加入乙醚脱脂，水层继用正丁醇提取3次，每次500mL，合并正丁醇提取物，减压回收正丁醇，加少量水溶解，滤除不溶物，水液通过硅藻土和活性炭的混合柱脱色，继通过D101大孔吸附树脂柱

以水5000mL洗脱，弃去水液，再用50％乙醇3000mL洗脱，合并洗脱液，减压浓缩至干，得地黄环烯醚萜总苷。

(2)地黄苷D粗分离制备

取1Kg柱层析用硅胶H(粒度160目)置烘箱中，控制温度105℃以下，2～3小时后取出放置室温备用。

将处理好的硅胶H，用石油醚调成浆状，排出空气一次性装入层析柱中，启动低压泵以20～22mL/min流量的石油醚冲柱0.5小时，然后补加部分硅胶H，重新启动低压泵，冲柱1小时至硅胶层不再下沉为止。将地黄环烯醚萜总苷用洗脱液溶解后，加入适量薄层硅胶H，搅匀，赶出气泡，置入柱顶，压实。启动低压泵，依次以石油醚、乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶0.5)为洗脱液梯度洗脱，收集洗脱液200ml/份，进行薄层检查，合并地黄苷D组分，减压回收溶剂并浓缩至干，得淡棕色粉末，即地黄苷D粗品。

(3)地黄苷D的纯化

将样品用25％甲醇溶液(v/v)溶解，进行中压液相仪制备，每次进样180mg，以甲醇-水(25∶75)为洗脱剂，流速20～24mL/min，纸速1～2格/min双波长配合TLC检测，收集25mL/份，分离得到地黄苷D收集部分，减压浓缩至近干，加甲醇(1∶1.2)溶解，0.45μm的滤膜过滤，备用。

在室温下，将Sephadex LH-20葡聚糖凝胶溶胀于甲醇层析溶剂中24小时，使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75％，上层溶剂占25％，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内

1.2ba压力下装柱，平衡后加入样品溶液，甲醇洗脱，线性流速为2cm/h。收集地黄苷D成分，减压浓缩，真空干燥，得黄白色粉末。HPLC法测定地黄苷D纯度为99.29％，DSC法测定地黄苷D纯度为98.98％。

Claims (9)

1.一种地黄苷D标准物质，其特征在于该标准物质由中药地黄中提取获得。

2.如权利要求1所述的地黄苷D标准物质，其特征在于地黄为市售地黄、熟地黄饮片或玄参科植物地黄的新鲜、干燥块根、加工炮制品。

3.如权利要求1所述的地黄苷D标准物质，其特征在于地黄苷D标准物质纯度为98～100％(w/w)。

4.如权利要求1～3所述的地黄苷D标准物质，其特征在于采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、柱色谱法、液-液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备。

5.如权利要求4所述的地黄苷D标准物质制备方法，其特征在于在使用这些方法进行制备时，包括以下一个或几个步骤：

提取：提取原料中可以采用无氧条件下加热或直接用水蒸气热处理或拌入碳酸钙或氢氧化钡，用来抑制酶的活性和中和植物酸，也可以不灭活直接提取；所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及脂类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂；提取方法可以是浸渍、渗滤、煎煮、回流提取、连续回流提取、超声波提取、微波辅助提取、酶法提取等；

除杂：使用或不使用以下任一种澄清剂或其组合：醇沉剂、各种树脂、101果汁澄清剂、甲壳素类(如壳聚糖)、ZTC天然澄清剂、明胶、鞣酸等；

过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法；

浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等；

干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

6.如权利要求4所述的地黄苷D标准物质制备方法，其特征在于当使用大孔吸附树脂时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性等任何一种类型，如D101、DA-201、D301、HPD400、AB-8、S-8、XAD-2等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如D101、AB-8、HPD400等，所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇等。

7.如权利要求4所述的地黄苷D标准物质制备方法，其特征在于：选用AB-8、HPD400、D101等中等极性、弱极性或非极性大孔吸附树脂作为纯化树脂，地黄甲醇提取物上样液浓度0.1～1.0g/mL，吸附流速1～6BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，0～20％乙醇洗脱1～4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1～6BV/h，用20％～90％乙醇洗脱3～6倍树脂体积进行解吸，解吸流速为1～6BV/h。

8.如权利要求4所述的地黄苷D标准物质制备方法，其特征在于：当采用柱层析法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法初步纯化后的产物，所用的柱填料可以是硅胶、氧化铝、聚酰胺、葡聚糖(Sephadex系列或SephadexLH-20系列)、C-8、C-18、活性碳、纤维素等，所用的洗脱液因填料的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等组成的混合溶剂。

9.如权利要求1所述的地黄苷D的应用，其特征在于具有滋阴、补血和降血糖作用的该单体物质，可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、酒剂、注射剂、饮料等。

Images