CN103272007A - 芍药属植物提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种芍药属植物提取物及其制备方法和用途，所述提取物是从芍药属植物（Paeonia）种壳中制得的，其总多酚含量为40%‐90%，总多酚中含有芪类成分，实验研究证明，所述提取物或其药物组合物，可用于真菌感染性疾病、病毒感染性疾病以及癌症等疾病的预防或治疗。

Description

芍药属植物提取物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及一种植物提取物的制药新用途，具体地说，涉及一种芍药属植物及其提取物在制备治疗或预防真菌感染、病毒感染以及癌症类药物中的用途，属于天然药物领域。

背景技术：

芍药属（Paeonia）系毛茛科（Ranunculacea）植物的灌木或草本，全世界约35种，划分为3个组，即牡丹组、北美芍药组和芍药组，其中北美芍药组仅有2种，分布在北美西部；芍药组系属内最大的组，为草本类型，约含25个种，分布在亚欧大陆，我国有7种，2亚种；牡丹组有8种，3亚种，为木本类型，为我国特有种。该属植物多具有鲜艳的花朵，其中牡丹花和芍药花分别被冠以“花王”和“花相”，在我国大部分地区有栽培，同时他们的根部多作为药用，具有保肝、抗炎免疫、抗糖尿病、抗氧化、心血管保护、抗病原微生物、抗癌、中枢神经系统（包括：抗惊厥、抗抑郁、抗中风、提高认知、抗焦虑、治疗帕金森氏综合病等）、止痛和抗骨质疏松等作用。中国药典2010年版收载的中药白芍（RadixPaeoniae Alba）为来源于栽培的芍药或其变种毛果芍药（P.lactiflora var.trichocarpa）的根、赤芍（Radix Paeoniae Rubra）为来源于野生的芍药和川赤芍（P.veitchii）的根、牡丹皮来源为牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的干燥根皮。我国芍药属植物主要品种有凤丹（P.ostii）、牡丹（P.suffruticosa）、紫斑牡丹（P.rockii）、滇牡丹（P.delavayi）、芍药（P.lactiflora）、川赤芍（P.veitchii）、块根芍药（P.intermedia）和新疆芍药（P.sinjiangensis）等。

我国芍药和牡丹栽培面积大，其中仅牡丹栽培面积超过20万亩，芍药栽培面积要更多，每年能收获可观量的种子。芍药属植物除了作为花卉和药材利用外，近年来牡丹籽油作为新资源食品得到利用，牡丹籽油利用的是种仁，但是种壳作为副产品却没有得到有效利用。

据文献报道，芍药属植物种子除含有植物油脂类成分外，还含有低聚芪类（Oligostilbenes）、黄酮类和芍药苷类化合物，且含量较高[何春年,肖伟,李敏,彭勇,许利嘉,谷靖,肖培根.牡丹种子化学成分研究.中国中药杂志,2010,35(11):1428-1431]，但对芍药属植物种壳中的化学成分研究尚未有专门报道，上述成分有否或有多少含量存在于种壳部位尚未知晓。因此，芍药属植物种壳中的化学成分值得进一步深入研究。

迄今关于芍药属植物种子提取物及所含成分活性的报道主要有以下几个方面：（1）抗氧化作用：牡丹种子中分离的两个黄酮类成分以及芍药种子中7种stilbenes成分（cis‐ε‐viniferin,trans‐resveratrol,trans‐resveratrol‐4′‐O‐β‐D‐glucopranoside,trans‐ε‐viniferin,gnetin H,suffruticosol A,suffruticosol B）具有不同程度的抗氧化活性[Kim,H.J.;Chung,S.K.;Choi,S.W.Lipoxygenase Inhibition and Antioxidative Activity of Flavonoids from Paeoniamoutan Seeds.J.Food Sci.Nutr.1998,3(4),315–319]；（2）抗炎作用：芍药种子中分离的3种酚酸类化合物trans‐resveratrol,cis‐ε‐viniferin,木犀草素和7种stilbenes成分具有不同程度抑制大豆脂氧合酶（SLO）活性，因而认为芍药种子可以作为抗炎药物的来源[H.J.H.Kim,C.Sang,S.W.Choi.Inhibition of tyrosinaseand lipoxygenase activities by resveratrol and its derivatives from seeds of Paeonialactiflora.Nutraceticals and Food,2002,7(4):447]；（3）细胞毒作用：芍药种子中6种stilbenes（cis‐ε‐viniferin,trans‐resveratrol,trans‐ε‐viniferin,gnetin H,suffruticosol A,suffruticosol B）具有细胞毒活性和抗突变活性[Kim,H.J.;Chang,E.J.;Bae,S.J.;Shim,S.M.;Park,H.D.;Rhee,C.H.;Park,J.H.;Choi,S.W.Cytotoxic and Antimutagenic Stilbenes from Seeds of Paeonia lactiflora.Arch.Pharm.Res.2002,25(3),293–299.Kang JH,Park YH,Choi SW,et al.Resveratrolderivatives potently induce apoptosis in human promyelocytic leukemia cells.ExpMol Med.2003,35(6):467-474]；（4）植物蜕皮素拮抗作用：牡丹种子中分离得到三个白藜芦醇三聚体suffruticosol A,suffruticosol B,suffruticosol C，以及白藜芦醇具有良好的蜕皮素拮抗活性[Sarker,S.D.;Whiting,P.;Vladimir_sik,L.D.Identification and Ecdysteroid Antagonist Activity of Three Resveratrol Trimers(Suffruticosols A,B and C)from Paeonia suffruticosa.Tetrahedron1999,55(2),513–524]；（5）抗辐射作用：牡丹种子分离得到的芍药苷类化合物对⁶⁰Co照射HEK293细胞DNA损伤有保护作用[He C.N.,Zhang Y.C.,Peng Y.,Yang J.S.,XiaoP.G.Monoterpene glycosides from the seeds of Paeonia suffruticosa protect HEK293cells from irradiation-induced DNA damage.Phytochem Lett.2012,5(1):128-133]；（6）神经氨酸酶抑制作用：芍药种子中分离得到的四个化合物suffruticosol A、suffruticosol B、trans‐e‐viniferin、trans‐gnetin H对神经氨酸酶有较好的抑制作用，因而对细菌和流感病毒可能有较好的作用[Yuk HJ,Ryu HW,JeongSH,et al.Profiling of neuraminidase inhibitory polyphenols from the seeds ofPaeonia lactiflora.Food Chem Toxicol.2013,55:144‐149]；（7）紫外线防护作用：牡丹籽油在光线紫外区有较强吸收作用，具有一定的防晒作用[张萍.牡丹籽油的制备、纯化、成分分析以及功效评价.2009，首都师范大学硕士论文]。

对于芍药属植物种子种壳部位的化学成分和药理活性，迄今尚未见有相关文献和应用的报道。本发明人曾对芍药属植物种子的化学成分含量进行详细的测定和比较，发现该属种子芍药苷类和芪类成分含量较高[Chun-nian He,Yong Peng,Qin-li Wu,Wei Xiao,Bing Peng,Zhe Wang&Pei-gen Xiao.Simultaneousdetermination of ten stilbenes in the seeds of Paeonia species using HPLC-DAD,Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies,2013,36(12):1708-1724.Chunnian He,Yong Peng,Wei Xiao,Haibo Liu,Pei-gen Xiao.Determination ofchemical variability of phenolic and monoterpene glycosides in the seeds of Paeoniaspecies using HPLC and profiling analysis.Food chemistry.2013,138:2108–2114]，不失为值得利用的一种植物资源。

与此同时，到目前为止，仍然没有一种工艺简便、成本低廉且适合于产业化的芍药属植物种子壳的提取制备方法以及所述提取物在中药和天然药物方面临床应用的相关报道。

发明内容：

本发明提供了一种芍药属植物提取物；

本发明还提供了芍药属植物提取物的制备方法和用途。

本发明所述提取物中总多酚重量百分比为40%‐90%。进一步优选地，总多酚重量百分比为50%‐98%。

所述总多酚中含有芪类成分，其中，suffruticosol A（化合物1）在提取物中重量百分比为1%-16%，suffruticosol B（化合物2）在提取物中重量百分比为2%-45%，suffruticosol C（化合物3）在提取物中重量百分比为0.5%-4%，trans-E-viniferin（化合物4）在提取物中重量百分比为0.5%-15%，gnetin H（化合物5）在提取物中重量百分比为4%-50%。

更进一步地，所述芍药属植物提取物中还含有resveratrol(E)-form（化合物6），cis-E-viniferin（化合物7），cis-suffruticosol D（化合物8），cis-gnetin H（化合物9），trans-suffruticosol D（化合物10）中的一种或数种。

本发明所述芍药属植物提取物，是从凤丹（Paeonia.ostii）、牡丹（P.suffruticosa）、紫斑牡丹（P.rockii）、滇牡丹（P.delavayi）、芍药（P.lactiflora）、川赤芍（P.veitchii）、块根芍药（P.intermedia）和新疆芍药（P.sinjiangensis）等的果实中提取获得。优选的是，从已有大面积栽培的凤丹（Paeonia.ostii）、牡丹（P.suffruticosa）、紫斑牡丹（P.rockii）和芍药（P.lactiflora）植物的种子中提取获得，再进一步地，是从种壳中提取获得。

本发明还提供了芍药属植物提取物的制备方法，其包括以下步骤：

（1）提取：将干燥成熟的芍药属植物的种子，用脱壳机脱壳，种壳进一步粉碎，用水或含水乙醇或含水丙酮提取，原料与提取液重量/体积比为1:5‐100；

（2）浓缩：将步骤（1）得到的提取液经真空浓缩至无醇味或无丙酮味；

（3）大孔吸附树脂或聚酰胺树脂吸附、洗脱：将步骤（2）得到的浓缩液加适量水溶分散后，上大孔吸附树脂或聚酰胺树脂，先用水洗脱，然后用20‐95%的乙醇或丙酮洗脱，洗脱机用量为5‐15倍量树脂柱床体积，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得芍药属植物提取物。

其中步骤（1）中所述的含水乙醇或含水丙酮浓度为20%‐100%，优选乙醇；提取方式为浸渍、渗漉或回流；选用浸渍方式时，以70%乙醇浸渍3次效果为最佳；

步骤（3）中的大孔树脂选自D系列、HPD系列、HP系列、XAD系列或AB‐8型大孔吸附树脂。优选地是：D系列的大孔树脂为D‐101型；HPD系列的大孔树脂为HPD‐500型；HP系列的大孔树脂为HP‐20型；XAD系列的大孔树脂为XAD‐4型。

体内或体外药效学试实验研究结果表明，本发明芍药属植物及提取物均对多种真菌、病毒和癌细胞表现出明显抑制作用，为临床提供了一种新的选择。

本发明提供了所述芍药属植物提取物在制备治疗或预防真菌、病毒感染性疾病以及癌症等药物中的应用。

本发明还提供了一种用于治疗或预防真菌、病毒感染性疾病以及癌症等疾病的药物组合物，其以所述芍药属植物原生药粉或提取物为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体所组成。

所述药物组合物的制剂可以是片剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液、颗粒剂、滴丸、注射剂、凝胶剂、外用洗剂。

根据本发明的上述内容，还可将上述芍药属植物原生药粉或其提取物与其它中药和/或化学药物，共同组成中药复方或中西药复方制剂，并按照常规方法制成口服片剂、胶囊、口服液、注射液、外用洗剂等多种剂型，用于预防或治疗真菌、病毒感染以及癌症等疾病。

实施方案：

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。

《实施例1》牡丹原生药粉的制备

取牡丹（Paeonia suffruticosa）干燥成熟的种子，脱壳机脱壳，获得的牡丹种子壳按常规方法粉碎，过筛，制成粒度为60‐100目的牡丹种子壳细粉，即得牡丹原生药粉。

《实施例2》凤丹提取物的制备

取凤丹（Paeonia ostii）干燥成熟的种子，脱壳机脱壳，获得的牡丹种子壳，称取种壳1000g，粉碎，用70%乙醇10L浸渍24小时，共三次。合并三次滤液，减压浓缩至无醇味，上AB‐8型大孔吸附树脂，先用水洗脱去除糖分等杂质，然后用80%的乙醇洗脱，洗脱液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕褐色粉末状芍药属植物提取物100g，经检测总多酚的重量百分含量为94%，其中6种芪类成分含量分别为：suffruticosol A 9.88%，suffruticosol B 25.10%，suffruticosol C 2.22%，trans-E-viniferin10.03%，trans-suffruticosol D 9.27，gnetin H 32.91%。

《实施例3》芍药提取物的制备

取芍药（Paeonia lactiflora）干燥成熟的种子，脱壳机脱壳，获得的芍药种子壳，称取种壳1000g，粉碎，用95%乙醇24L渗漉，渗漉液减压浓缩至无醇味，上D‐101型大孔吸附树脂，先用水洗脱去除糖分等杂质，然后用95%的乙醇洗脱，洗脱液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕褐色粉末状芍药属植物提取物100g，经检测总多酚的重量百分含量为96%，其中6种芪类成分含量分别为：suffruticosol A10.26%，suffruticosol B 35.54%，suffruticosol C 2.62%，trans-E-viniferin5.03%，trans-suffruticosol D 7.46%，gnetin H 30.82%。

《实施例4》胶囊剂的制备

所述胶囊剂按下列配方制备（所用含量均为重量百分含量）：

将凤丹提取物与淀粉混匀，加入8%淀粉浆制软材，经20目筛制粒，于60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后混匀，填充到空胶囊中。每粒装80mg，用于肝癌、肺癌及白血病等癌症患者，口服，每日3次，每次1片，一月为一疗程。

《实施例5》片剂的制备

所述片剂按下列配方制备（所用含量均为重量百分含量）：

将芍药提取物粉末、微晶纤维素、部分羧甲基淀粉钠混匀，加入PVP‐k30的乙醇溶液制软材，经20目筛制粒，于60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后混匀，压片，包衣，每片重70mg，用于肝癌、肺癌及白血病等癌症患者，口服，每日3次，每次1片，一月为一疗程。

《实施例6》复方片剂的制备

取芍药提取物50g，半枝莲提取物40g，白花蛇舌草50g，按照常规方法，加入相应辅料，制成片剂或胶囊，每粒装160mg，用于肝癌、肺癌及白血病等癌症患者，口服，每日3次，每次1片，一月为一疗程。

以下通过芍药属植物药效试验进一步说明本发明的有益效果

《实施例7》凤丹提取物体外对5种真菌的抗真菌活性作用

测试菌株：白色念珠菌（Candida albican ATCC64550）、热带念珠菌（Candidatropicalis032）、克柔氏念珠菌（Candida krusei09‐1681）、皮肤癣菌（Trichophytonrubrum ATCC40051）、须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes10‐0060）（购自中国科学院微生物研究所）。

测试方法：采用美国临床实验室标准化委员会制定的真菌敏感性测定方案和微量稀释法，对上述菌株进行最低抑菌浓度（MIC）测定。向96孔板每孔中加入100μL的RPMI1640培养基，再向第一孔中加入100μL凤丹提取物储备液（浓度为80μg/mL，用0.1%的无菌吐温20配制），然后进行二倍性稀释，使96孔板从第2至第11孔的凤丹提取物浓度范围为40μg/mL‐0.078μg/mL。再接种100μL菌悬液（浓度为1×10³cfu/mL），使每孔体积为200μL，第12孔加入200μL的RPMI1640培养基，作为培养基对照孔，第13孔加入100μL的RPMI1640培养基和接种100μL的菌悬液作为生长对照孔，96孔板加盖并用Parafilm密封以减少孵育过程中水分的蒸发，皮肤真菌置于28℃恒温培养箱中孵育72h，Candida spp.置于37℃恒温培养箱中孵育48h。眼观无菌生长孔所含最低药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC），实验重复3次（表1）。

表1凤丹提取物对5种受试菌株的最小抑菌浓度（MIC，μg/mL）

实验表明，本发明对白色念珠菌、热带念珠菌、克柔氏念珠菌、皮肤癣菌和须癣毛癣菌均有显著作用，对浅表真菌感染和深度真菌感染均有开发价值。《实施例8》芍药提取物体外抑制乙肝病毒（HBV）的作用

药品及试剂：芍药提取物，由中国医学科学院药用植物研究所亲缘学研究室提供，棕褐色粉末；HBV‐DNA克隆转染人肝癌细胞的HepG2.2.15，购自中国医学科学院肿瘤细胞库。

实验方法：在长满HepG2.2.15的培养瓶内加0.25%胰蛋白酶，37℃消化3～4min，加培养液吹打，1∶3传代，2d长满。消化后计数，配制成1×105/ml个细胞接种于24孔培养板，1ml/孔，37℃，5%CO2培养24h，细胞长成单层后进行以下实验。

芍药提取物用维持液配制成该药物的最大无毒浓度溶液，按倍比稀释法稀释后，分别加入24孔培养板，每药物每浓度三孔，37℃，5%CO2培养，每3d换原浓度药液培养，第8d时收集培养液，‐20℃冰冻保存。用ELISA法分别检测HBsAg（乙肝表面抗原）和HBeAg（乙肝e抗原）的水平，读取OD450nm值并计算抗原抑制百分率(%)。实验结果见表2。

表2芍药提取物对乙肝病毒（HBV）的抑制作用

实验结果表明，在最大无毒浓度下，芍药提取物在HepG2.2.15培养中对HBsAg和HBeAg有明显抑制作用，且有浓度依赖性。

《实施例9》凤丹提取物体外抑制5种肿瘤细胞的作用

药品及试剂：凤丹提取物，由中国医学科学院药用植物研究所亲缘学研究室提供，棕褐色粉末；结肠癌细胞HCT‐116、肝癌细胞Bel‐7402、胃癌细胞BGC823、肺腺癌细胞A549和卵巢癌细胞A2780等5种人源癌细胞，购自中国医学科学院肿瘤细胞库。

实验方法：采用MTT法：牡丹提取物用二甲基亚砜（DMSO）配成1g/mL溶液，4℃保存备用，临用时培养液稀释成所需浓度。对于对数生长期的贴壁肿瘤细胞中加入胰酶，消化后，加入培养液(10%小牛血清的RPMI1640)，得细胞悬液(50000个/mL)，取96孔培养板，每孔接种100μL，培养24h。按实验组和对照组分别更换得等体积不同浓度培养液，各设(6‐8)个平行孔，相同条件下培养1‐2d。弃去上清液，每孔加入100μL新鲜配制的含0.2mg/mLMTT的无血清培养液，继续培养4h后，加入150μL DMSO溶解、振荡、混匀，酶标法495nm下测定所得溶液光密度值，带入公式求得各位点肿瘤细胞生长抑制率，代入由回归曲线，求得半数杀伤浓度IC50。实验结果见表3。

表3牡丹提取物对5种人源肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50，μg/mL）

实验结果表明，牡丹提取物对5种人源癌细胞：HCT‐116、Bel‐7402、BGC823、A549和A2780均有较强的抑制作用。

Claims (8)

1.一种芍药属植物种壳提取物，其特征是，所述提取物源自芍药属植物种壳，其含有重量比40%‐90%的主要成分总多酚。

2.权利要求1所述的提取物，其特征是，所述芍药属植物为：凤丹（Paeonia.ostii）、牡丹（P.suffruticosa）、紫斑牡丹（P.rockii）、滇牡丹（P.delavayi）、芍药（P.lactiflora）、川赤芍（P.veitchii）、块根芍药（P.intermedia）、新疆芍药（P.sinjiangensis）。

3.权利要求1所述的提取物，其特征是，总多酚中含有芪类成分，其在提取物中重量比分别为：suffruticosol A 1%-16%，suffruticosol B 2%-45%，suffruticosolC 0.5%-4%，trans-E-viniferin0.5%-15%，gnetin H 4%-50%。

4.制备权利要求1所述提取物的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

a、将芍药属植物种子外壳粉碎后，用水或含水乙醇或含水丙酮提取，原料与提取溶剂重量体积比为1:5‐100；

b、将提取液经真空浓缩至无醇味或无丙酮味；

c、将上述浓缩液加水分散后上大孔树脂柱或聚酰胺树脂，先用水洗脱，然后用20%‐100%乙醇或丙酮洗脱；

d、将洗脱液浓缩、干燥，即得芍药属植物种壳提取物。

5.权利要求1所述提取物在制备治疗或预防真菌、病毒感染性疾病以及癌症等药物中的应用。

6.一种药物组合物，其特征是：所述的组合物是以芍药属植物种壳原生药粉或种壳提取物为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体组成。

7.权利要求6所述组合物，其制剂可以是片剂、胶囊剂、软胶囊、口服液、颗粒剂、滴丸、注射剂、外用洗剂、喷雾剂、凝胶剂。

8.权利要求6或7所述组合物在制备治疗或预防真菌、病毒感染性疾病以及癌症等药物中的应用。