CN110538227A - 一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物及其应用，所述药物组合物按质量百分比包括如下组份：枯草芽孢杆菌粉70‑80％、黄连粉1‑5％、大枣粉10‑20％和土党参粉8％‑20％；本发明通过将益生菌与中药相组合，以筛选得到的枯草芽孢杆菌为主要成分，精选中药组分，优化组分配比，各组分协同增效，标本兼治，共同恢复肠道菌群平衡，快速有效止泻；本发明配方简洁高效，止泻作用显著，无毒副作用，并能够增强免疫力，具备广阔的前景。

Description

一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，主要涉及一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物及 其应用。

背景技术

临床上一般将腹泻分为感染性腹泻和非感染性腹泻2种，其中感染性腹泻 约占80％，对于感染性腹泻，人们习惯于使用抗生素进行治疗。然而由于抗生 素的大量盲目使用，使肠道中有益菌被抑制，肠道的微生态平衡被打破，导致 菌群失调。健康人的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物，这些微生物称为肠道 菌群。肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上 形成一种生态平衡，一旦机体内外环境发生变化，特别是长期应用广谱抗生素， 敏感肠菌被抑制，未被抑制的细菌而乘机繁殖，从而引起菌群失调，其正常生 理组合被破坏，而产生病理性组合、引起临床症状就称为肠道菌群失调症。

枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性好氧菌，在生长过程中迅速消 耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机 酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；另外，枯草芽孢杆菌菌体 自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与机体内 的消化酶类一同发挥作用。枯草芽孢杆菌孢子能够在肠道内复活，生长过程大 量消耗周围环境中的氧气，促进肠道内益生菌(乳酸菌、双歧杆菌及丁酸梭菌 等)的生长，同时抑制大肠杆菌、沙门氏菌等条件性病原菌。因此，利用枯草 芽孢杆菌益生菌，可以治疗菌群失调引起的腹泻。

现有技术中，将枯草芽孢杆菌益生菌用于治疗腹泻一般采用单一或多种菌 种混合，也有添加诸多复杂中药组分共同配制，例如，CN109674870A公开了 一种抗菌促生长中药组合物，由以下重量份的原料组成：枯草芽孢杆菌2-10份； 白头翁提取物5-35份；黄芩提取物5-40份；黄连提取物5-35份；杜仲叶提取 物30-70份；山楂提取物20-50份；陈皮提取物5-35份；秦皮提取物5-35份； 甘草提取物5-30份。该发明能有效解决乳猪、断奶仔猪、育肥猪、禽腹泻问题， 使猪禽腹泻率和死亡率显著下降，主要用于猪、禽，作为混合饲料添加剂，可 直接添加于饲料或养殖场拌料使用。但上述组合物配方复杂，制备工艺繁琐， 成本高昂，不利于推广应用，CN102220261A公开了一种枯草芽孢杆菌与丁酸 梭菌复合菌制剂的制备方法，分别制作含丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌的种子液， 其中菌液浓度均为0.5×10⁸-1.0×10⁸CFU/mL，将得到的微生态制剂与饲料按照 0.5％混合，直接饲喂畜禽，有效降低畜禽的腹泻率及畜禽的死亡率，但上述制 剂仅含有益生菌，无其他有效成分，作用机制单一。CN108272908A公开了一 种治疗腹泻的中药组合物，由土党参、枸杞叶、大枣、山莓根、车前草、野菊 花组成；利用各味中药的综合作用治疗早期和中期腹泻。CN103933500A公开 了一种治疗婴幼儿湿热腹泻药，该腹泻药由以下成分按照一定重量比配比而成： 6-10份的薏仁、3-7份的莲子、2-5份的杨梅、4-8份的白术、2-7份的肉桂、1-3 份的生姜、3.5-6份的马齿苋、2.5-5份的桂圆、1-6份的大枣、5-12份的黄连、 2.5-4份的党参、0.5-3份的车前子、1.5-2份的葛根、0.5-1.5份的山楂和2-3份 的白头翁。但上述组合物仅以中药为主要成分，成分复杂，毒副作用不明，作 用机制单一，无法恢复肠道菌群生态平衡。

因此，研发一种配方简洁高效，将枯草芽孢杆菌益生菌恢复平衡肠道菌群 的功能与中药益气止泄的作用相结合，相互配合，协同增效，共同调节肠道菌 群并形成良性循环，标本兼治，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足和市场的需求，本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌 粉的药物组合物及其应用，通过将益生菌与中药相组合，以筛选得到的枯草芽 孢杆菌为主要成分，精选中药组分，优化组分配比，各组分协同增效，标本兼 治，共同恢复肠道菌群平衡，快速有效止泻，无毒副作用，并能够增强免疫力， 具备广阔的前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：

第一方面，本发明提供一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物，所述药物 组合物按质量百分比包括如下组份：

枯草芽孢杆菌粉70-80％

黄连粉1-5％

大枣粉10-20％

土党参粉8-20％；

所述药物组合物的百分比之和不超过100％。

枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性好氧菌，在生长过程中迅速消 耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机 酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。因此，利用枯草芽孢杆菌 益生菌，可以治疗菌群失调引起的腹泻。

优选地，所述药物组合物按质量百分比包括如下组份：

枯草芽孢杆菌粉70-75％

黄连粉1-3％

大枣粉10-15％

土党参粉8-15％；

所述药物组合物的百分比之和不超过100％。

优选地，所述枯草芽孢杆菌粉所用的枯草芽孢杆菌命名为Subtilisin-QK， 保藏于国家典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M203078，保藏日 期为2003年11月17日。

优选地，所述枯草芽孢杆菌的菌落总数≥2×10¹¹cfu/g，例如可以是 2×10¹¹cfu/g、2.5×10¹¹cfu/g、3×10¹¹cfu/g、3.5×10¹¹cfu/g或4×10¹¹cfu/g，当枯草芽 孢杆菌的菌落总数大于该数值后，才能在肠道中充分发挥作用。

本发明中，发明人在长期科研实践过程中，筛选得到一株新型的枯草芽孢 杆菌菌株Subtilisin-QK，并进行了保藏，通过将益生菌与中药相组合，以筛选 得到的枯草芽孢杆菌为主要成分，精选中药组分，优化组分配比，各组分协同 增效，标本兼治，共同恢复肠道菌群平衡，快速有效止泻；通过将该菌株与其 他枯草芽孢杆菌对比实验发现该菌株在改善肠道菌群失调引起的腹泻方面有更 好的效果；本发明配方简洁高效，止泻作用显著，无毒副作用，并能够增强免 疫力，具备广阔的前景。

其中，所述枯草芽孢杆菌的质量百分比为70-80％，例如可以是70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。

其中，所述黄连粉的质量百分比为1-5％，例如可以是1％、2％、3％、4％ 或5％。

黄连粉，是一种药物，主要制作材料为黄连，黄连分为毛茛科植物黄连.、 三角叶黄连或云连的干燥根茎三种，分别可称为“味连”、“雅连”、“云连”，多系 栽培，主产于四川、云南、湖南、湖北等地，秋季采挖，除去须根及泥沙，干 燥，有清热燥湿，泻火解毒之功效，能够抗菌、消炎、抗溃疡、抗腹泻等作用。

其中，所述大枣粉的质量百分比为10-20％，例如可以是10％、11％、12％、 13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

大枣，又名红枣，富含蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、B族维生素、维 生素C、维生素P以及钙、磷、铁和环磷酸腺苷等营养成分，味甘，性温，无 毒；具有补虚益气、养血安神、健脾和胃等作用，对慢性肝炎、肝硬化、贫血、 过敏性紫癜等病症有较好疗效；大枣能润心肺、止咳、补五脏、治虚损、除肠 胃癖气，还能安中养脾、平胃气、通九窍、助十二经等。

其中，所述土党参粉的质量百分比为8-20％，例如可以是8％、9％、10％、 11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

土党参为桔梗科植物金钱豹的根，入脾、肺经；具有健脾益气，补肺止咳 之功效，主治虚劳内伤，气虚乏力，心悸，多汗，脾虚泄泻等。

本发明以筛选得到的枯草芽孢杆菌菌株作为主要成分，搭配大枣粉、黄连 粉和土党参粉，以枯草芽孢杆菌活化肠道菌群，抑制病菌生长，以精选中药组 分调理肠道脾胃，增强细胞活性，相互补充促进，共同发挥并增强止泻效果。

本株枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK可以分泌维生素B2、B6、烟酸，根据免疫 学观点可知，B族微生物可以促进人体巨噬细胞和干扰素的活性，激活T、B 淋巴细胞，增强细胞免疫和体液免疫的功效，并且枯草芽孢杆菌自身能够分泌 蛋白酶、α-淀粉酶等酶类，在消化道内同人体消化酶共同作用；同时，枯草芽 孢杆菌产生的酶类可以进一步将大枣粉、黄连粉和土党参粉中的化合物分解为 小分子化合物，促进人体的吸收；进一步的研究发现，在枯草芽孢杆菌培养基 中添加部分的大枣粉、黄连粉和土党参粉能够促进枯草芽孢杆菌的生长；因此， 枯草芽孢杆菌和大枣粉、黄连粉、土党参粉能够起到互相促进的功效。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述药物组合物的方法，将大 枣去核后粉碎，与黄连粉、土党参粉和枯草芽孢杆菌菌粉分别过筛后，混合均 匀，得到所述药物组合物。

优选地，所述过筛的目数为80-100目，例如可以是80目、85目、90目、 95目或100目。

优选地，所述混合的机器为三维混合机。

作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述药物组合物的方法，具体为： 将大枣去核后粉碎，与黄连粉、土党参粉和枯草芽孢杆菌菌粉分别过80-100目 筛后，三维混合机混合均匀，得到所述药物组合物。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的药物组合物用于治疗腹泻的 应用。

优选地，所述腹泻包括肠道菌群失衡造成的腹泻。

健康人的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物，这些微生物称为肠道菌群。 肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一 种生态平衡，一旦机体内外环境发生变化，特别是长期应用广谱抗生素，敏感 肠菌被抑制，未被抑制的细菌而乘机繁殖，从而引起菌群失调，其正常生理组 合被破坏，而产生病理性组合、引起临床症状就称为肠道菌群失调症。

优选地，所述肠道菌群失衡的原因包括抗生素滥用和/或病菌感染。

第四方面，本发明提供了一种药物，所述药物包括如第一方面所述的药物 组合物。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意 一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明提供的药物组合物选用筛选得到的特定的枯草芽孢杆菌，辅以 精选中药组分，优化组分配方，配方简洁高效，各组分协同增效，共同恢复肠 道菌群平衡，标本兼治，快速有效止泻，祛湿健脾，止泻益气，肠道损伤小、 服用方便、止泻作用显著，无毒副作用，安全可靠，并能够增强免疫力，具备 广阔的前景；

(2)本发明提供的方法简单易学，将配方组分粉碎过筛后混合即可得到， 操作简便，易于推广营业。

附图说明

图1是本发明的菌株BLAST结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优 选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1菌株的筛选、鉴定及保藏

1、枯草芽孢杆菌的筛选

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK原始种子批的原始种子从发酵的大豆中由武汉大学王业富教授实验室分离得到，经历了样品采集→微生物 分离→培养→筛选鉴定→阳性结果→菌种鉴定和保藏→生产出发菌等步骤。

2、菌株形态学鉴定

将分离的菌株接种于NA固体培养基，在30℃下培养48h，单菌落浅白不 透明，表面不光滑，边缘不整齐、无光泽，质地均一；将菌落接种于LB液体 培养基，30℃恒温振荡培养18-24小时，培养基变浑浊，表面没有菌膜生成。

革兰氏染色后的镜检结果显示，菌体为革兰氏阳性杆菌，多单生，菌株形 成椭圆形芽孢。

3、枯草芽孢杆菌的分子鉴定

菌株通过平板划线得到单菌落，挑取单菌落于含有2mL TSB的摇菌管中， 置于28℃振荡培养至浑浊；取1mL菌液于离心管中，10000rpm离心3min后 弃上清，加入50μL无菌水，振匀后于95℃保温处理2min，置于0℃冰箱中备 用；

根据文献记载选择通用引物27F和1492R进行菌株基因组的PCR扩增，反 应条件为94℃预变性3min，35循环(94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延 伸100s)，72℃延伸7min，PCR扩增引物如下：

27F(SEQ ID NO:1)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；

1492R(SEQ ID NO:2)：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’.

取5μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳45 min；使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒回收DNA片 段；

菌种鉴定-16SrDNA分析

将回收的片段进行测序，测序结果在GenBank中通过BLAST比对该菌的 16S rRNA序列片段，

根据测序结果整理出待检菌的16SrDNA序列(共1514bp)如下：

SEQ ID NO:3

AGAGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATAC ATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCG GGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACA TAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA CGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGG AAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA GTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTG GGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGT CTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTT CCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT TGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAG TGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTG GGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG ACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATC TGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAAT CGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG TACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGA GGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTG AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA；

将上述测序得到的16SrDNA序列提交到NCBI，比对结果见图1：

由图1可知，待检菌的16SrDNA序列与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis序列 的相似度(maxidentity)为100％，比对序列覆盖范围(query cover)为100％， E值为0，因此鉴定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，鉴定结果可信。

对该株枯草芽孢杆菌进行基因测序，结果如SEQ ID NO:4所示，为一株新 的枯草芽孢杆菌，将该株枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Subtilisin-QK。

SEQ ID NO:4：

GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTT AATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAA GCAGTACAGAAAAGAAATACATTGTTGGATTTAAACAGACAATGAGTGCC ATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGT TCAAAAGCAGTTTAAGTATGTTAACGCAGCCGCAGCAACATTGGATGAAA AAGCTGTAAAAGAATTGAAACAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAA GATCATATTGCACATGAATATGCGCAATCTGTTCCTTACGGCATTTCTCAAA TTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAA GTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTC AGAGGCGGAGCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACG GCAGTTCTCACGGCACACACGTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACA CAATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAACGCATCGTTATATGCAGTAAAAG TTCTTGACTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATTATTAACGGCATTG AGTGGGCTATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGAC CTTCTGGATCTACAGCTCTGAAAACAGTCGTTGATAAAGCAGTTTCCAGC GGTATCGTCGTTGCTGCCGCTGCCGGAAACGAAGGTTCATCGGGCAGCAC AAGCACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACCATTGCGGTAGGTGC GGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGC TTGATGTAATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCA CTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGA GCAGCAGCGCTAATTCTTTCTAAGCATCCGACTTGGACAAACGCGCAAGT CCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATATCTTGGAAACTCTTTCTACTA TGGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCACAATAATAG.

4、菌株保藏

甘油冷冻保存法

1.用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在LB培养基平皿上划线分离单菌落。

2.平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm 左右。

3.挑取一个单菌落，接种于一个装50mLLB培养基的250mL三角瓶中37℃ 振荡培养16小时，至菌密度OD600为3-5。

4.用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下 观察菌体的形态，及是否有杂菌。

5.按1：1加入900μl 50％无菌甘油和900μl培养好的种子液，混合后分装至 事先灭菌的菌种保存管(2mL/管)-80℃冰箱保存，在保种管上标明批号。

实施例2

将菌落总数为2×10¹¹cfu/g的保藏编号为CCTCCNO：M203078的枯草芽孢 杆菌粉70％、黄连粉1％、大枣粉10％和土党参粉19％过100目筛后混合均匀 得到所述药物组合物。

实施例3

将菌落总数为2.5×10¹¹cfu/g的保藏编号为CCTCCNO：M203078枯草芽孢 杆菌粉70％、黄连粉5％、大枣粉17％和土党参粉8％过80目筛后混合均匀得 到所述药物组合物。

实施例4

将菌落总数为2×10¹¹cfu/g的保藏编号为CCTCCNO：M203078枯草芽孢杆 菌粉75％、黄连粉2％、大枣粉15％和土党参粉8％过100目筛后混合均匀得到 所述药物组合物。

实施例5

将菌落总数为3×10¹¹cfu/g的保藏编号为CCTCCNO：M203078枯草芽孢杆 菌粉71％、黄连粉3％、大枣粉18％和土党参粉8％过100目筛后混合均匀得到 所述药物组合物。

实施例6

将菌落总数为2.5×10¹¹cfu/g的保藏编号为CCTCCNO：M203078枯草芽孢 杆菌粉80％、黄连粉1％、大枣粉10％和土党参粉9％，过100目筛后混合均匀 得到所述药物组合物。

对比例1

与实施例3相比，将保藏编号为CCTCCNO：M203078的枯草芽孢杆菌替 换为枯草芽孢杆菌CGMCC NO.15941。

对比例2

与实施例3相比，除了不加土党参粉，其他条件与实施例3相同。

对比例3

与实施例3相比，除了不加黄连粉，其他条件与实施例3相同。

对比例4

与实施例3相比，除了不加大枣粉，其他条件与实施例3相同。

对比例5

与实施例3相比，除了黄连粉的质量百分比改为10％，相应减少枯草芽孢 杆菌粉的质量百分比外，其他条件与实施例3相同。

对比例6

与实施例3相比，除了土党参粉的质量百分比改为30％，相应减少枯草芽 孢杆菌粉的质量百分比外，其他条件与实施例3相同。

对比例7

与实施例3相比，除了大枣粉的质量百分比改为30％，相应减少枯草芽孢 杆菌粉的质量百分比外，其他条件与实施例3相同。

对比例8

与实施例3相比，除了枯草芽孢杆菌的菌落总数改为1×10¹¹cfu/g外，其他 条件与实施例3相同。

实验检测：

模型建立：昆明种雄性小鼠280只，20±2g，随机分成四组，分别为一组 模型组和13组实验组，每组20只；

氨苄青霉素钠用灭菌生理盐水配制成0.3g/0.5mL，模型组和实验组第一天 灌胃0.3g/0.5mL的氨苄青霉素钠，第二天灌胃0.2g/0.5mL的氨苄青霉素钠， 第三天和之后的灌胃都按照0.1g/0.5mL的剂量灌胃，直至模型组和实验组全部 出现腹泻(小鼠排便不能形成完整的颗粒状，呈现糊便或软便)，第五天造模 完成。

通过将实施例和对比例制备好的药物组合物稀释成枯草芽孢杆菌活菌制剂0.75g/Kg对实验组小鼠进行治疗，模型组小鼠每天灌胃等量的生理盐水，统计 了小鼠在造模后开始治疗后排便对比情况，见表1和表2；

表1

表2

结果可知，本发明提供的药物组合物对抗生素造成的肠道菌群紊乱引起的 腹泻有显著的治疗效果，治疗时间短，其中实施例4的效果最快，两天后即达 到18例颗粒便的结果；而对比例1更换为其他枯草芽孢杆菌，对比例2-4缺少 中药组分，对比例5-7中组分含量超范围，对比例8的菌落总数不达标，最终 的组合物的止泻效果均明显下降，说明本发明提供的组合物各组分缺一不可， 在特定比例范围内相互促进，协调增效，实现高效止泻的作用。

副作用实验：

实验检测过程中，实验组小鼠在治疗过程中，体力充沛，活力十足，活泼 程度及反应速度优于模型组小鼠，说明本发明提供的组合物无毒副作用，安全 可靠，甚至有增强免疫力的功能。

综上所述，本发明提供了一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物及其应用， 通过将益生菌与中药相组合，以筛选得到的枯草芽孢杆菌为主要成分，精选中 药组分，优化组分配比，各组分协同增效，标本兼治，共同恢复肠道菌群平衡， 快速有效止泻；本发明配方简洁高效，止泻作用显著，无毒副作用，并能够增 强免疫力，具备广阔的前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明 并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原 料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。

序列表

<110> 湖北真福医药有限公司

<120> 一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物及其应用

<130> 20190618

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1514

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

agagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcgaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtagc cgta 1514

<210> 4

<211> 1149

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120

gttggattta aacagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180

gaaaaaggcg gaaaggttca aaagcagttt aagtatgtta acgcagccgc agcaacattg 240

gatgaaaaag ctgtaaaaga attgaaacaa gatccgagcg ttgcatatgt ggaagaagat 300

catattgcac atgaatatgc gcaatctgtt ccttacggca tttctcaaat taaagcgccg 360

gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420

attgactctt ctcatcctga cttaaacgtc agaggcggag caagcttcgt accttctgaa 480

acaaacccat accaggacgg cagttctcac ggcacacacg tagccggtac gattgccgct 540

cttaataaca caatcggtgt tctgggcgta gcgccaaacg catcgttata tgcagtaaaa 600

gttcttgact caacaggaag cggccaatac agctggatta ttaacggcat tgagtgggct 660

atttccaaca atatggatgt tatcaacatg agccttggcg gaccttctgg atctacagct 720

ctgaaaacag tcgttgataa agcagtttcc agcggtatcg tcgttgctgc cgctgccgga 780

aacgaaggtt catcgggcag cacaagcaca gtcggctacc ctgcaaaata tccttctacc 840

attgcggtag gtgcggtaaa cagcagcaac caaagagctt cattctcaag cgcaggttct 900

gagcttgatg taatggctcc tggcgtgtcc atccaaagca cacttcctgg aggcacttac 960

ggtgcttaca acggaacgtc aatggcgact cctcacgttg ccggagcagc agcgctaatt 1020

ctttctaagc atccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca 1080

acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140

caataatag 1149

Claims (10)

1.一种含有枯草芽孢杆菌粉的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物按质量百分比包括如下组份：

枯草芽孢杆菌粉70-80％

黄连粉1-5％

大枣粉10-20％

土党参粉8-20％；

所述药物组合物的百分比之和不超过100％。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物按质量百分比包括如下组份：

枯草芽孢杆菌粉70-75％

黄连粉1-3％

大枣粉10-15％

土党参粉8-15％；

所述药物组合物的百分比之和不超过100％。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌粉所用的枯草芽孢杆菌命名为Subtilisin-QK，保藏于国家典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M203078，保藏日期为2003年7月8日。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的菌落总数≥2×10¹¹cfu/g。

5.一种制备如权利要求1-4中任一项所述药物组合物的方法，其特征在于，将大枣去核后粉碎，与黄连粉、土党参粉和枯草芽孢杆菌菌粉分别过筛后，混合均匀，得到所述药物组合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述过筛的目数为80-100目。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，将大枣去核后粉碎，与黄连粉、土党参粉和枯草芽孢杆菌菌粉分别过80-100目筛后，混合均匀，得到所述药物组合物。

8.一种如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物用于治疗腹泻的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述腹泻包括肠道菌群失衡造成的腹泻。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肠道菌群失衡的原因包括抗生素滥用和/或病菌感染。